Próba CARA) to półilościowa, średnio przepustowa metoda oceny aktywności badanych agentów przeciwko prątkom, które się replikują, nie replikują, lub jedno i drugie. CARA pozwala na szybką ocenę aktywności zależnej od czasu i stężenia oraz identyfikuje parametry, które należy realizować za pomocą testów jednostek tworzących kolonie (CFU).
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja testu resazuryny agarowej z węglem drzewnym do półilościowego, średnioprzepustowego oznaczania liczby prątków
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Istnieje pilna potrzeba odkrycia i rozwoju leków przeciwinfekcyjnych, które skracają czas leczenia gruźlicy (TB). Mycobacterium tuberculosis, czynnik etiologiczny gruźlicy, jest oporny na szybką i długotrwałą chemioterapię ze względu na obecność pałeczek wykazujących fenotypową oporność na leki. Test naobecność węglu iesazuryny (CARA) został opracowany jako narzędzie do charakteryzowania aktywnych cząsteczek odkrytych w wyniku wysokoprzepustowych kampanii przesiewowych przeciwko replikującym się i niereplikującym M. tuberculosis. Włączenie węgla aktywnego do bakteriologicznego podłoża agarowego pomaga złagodzić wpływ przenoszenia związków i eliminuje konieczność wstępnego rozcieńczania komórek przed wykryciem na mikropłytkach CARA. Po 7-10 dniowym okresie inkubacji w temperaturze 37 °C, redukcja rezazuryny przez mikrokolonie prątków rosnące na powierzchni dołków mikropłytkowych CARA pozwala na półilościową ocenę liczby bakterii za pomocą fluorometrii. CARA wykrywa około 2-3 log10 różnicy w liczbie bakterii i przewiduje minimalne stężenie bakteriobójcze prowadzące do ≥99% zabicia bakterii (MBC≥99). CARA pomaga określić, czy cząsteczka jest aktywna na prątki, które się replikują, nie replikują, czy też oba te elementy. Eksperymenty pilotażowe z wykorzystaniem CARA ułatwiają określenie, jakie stężenie badanego czynnika i czas ekspozycji na związek wymagają dalszej oceny za pomocą testów jednostki tworzącej kolonie (CFU). Ponadto CARA może przewidzieć, czy replikujące się substancje czynne są bakteriobójcze czy bakteriostatyczne.
Wprowadzenie
Mycobacterium tuberculosis, czynnik etiologiczny gruźlicy, może przetrwać w organizmie gospodarza w stanie utajonym, który jest oporny na zwalczanie antybiotyków. Uważa się, że fenotypowa (niegenetyczna) oporność M. tuberculosis podczas infekcji jest częściowo spowodowana populacjami niereplikujących się pałeczek1,2. Osoby utrzymujące się w klasie I wykazujące fenotypową oporność na leki powstają w wyniku rzadkich mechanizmów stochastycznych w dużych populacjach komórek wrażliwych na leki3,4. Osoby utrzymujące się na długo utrzymujące się w klasie II stają się niereplikujące się pod wpływem czynników odporności gospodarza, w tym stresu zewnętrznego w mikrośrodowiskach napotkanych podczas infekcji. Niedawno opracowaliśmy model in vitro niereplikującej się trwałości klasy II, aby naśladować warunki, z którymi boryka się M. tuberculosis w aktywowanych makrofagach i ziarniniakach. Model wielostresowy trwałości klasy II obejmuje warunki, które spowalniają wzrost, takie jak źródło węgla w kwasach tłuszczowych i całkowicie zatrzymują wzrost, takie jak łagodna kwasowość (pH 5,0), niedotlenienie (1%O2) oraz tlenek azotu i inne reaktywne produkty pośrednieazotu 5-9. Badania przesiewowe na dużą skalę z wykorzystaniem tego wielostresowego modelu niereplikacji i innych modeli niereplikujących klasy II dały różnorodne cząsteczki, których aktywność jest skierowana przeciwko stanowi niereplikującemu5-7,9-18. Te same niereplikujące się badania przesiewowe ujawniły również kategorię cząsteczek, które wykazują aktywność zarówno przeciwko replikującym, jak i niereplikującym się pałeczkom, określaną jako "podwójne substancje aktywne"7,10,12,19,20.
Odkrycie leku przeciwbakteryjnego w fazie hit-to-lead pociąga za sobą obszerną charakterystykę cząsteczek kandydujących w celu wyboru potencjalnych źródeł do rozszerzenia trafienia, wstępną charakterystykę farmakologiczną, identyfikację celu i wstępne badania skuteczności in vivo. Na wczesnym etapie leki przeciwinfekcyjne klasyfikuje się na podstawie ich bakteriostatycznego lub bakteriobójczego mechanizmu działania, a jeśli są bakteriobójcze, to czy zabicie bakterii zależy od czasu i/lub stężenia. Test jednostki tworzącej kolonię (CFU) jest klasyczną, złotą metodą standardu w odpowiedzi na te pytania. W teście CFU bakterie są poddawane działaniu czynnika testowego, po czym podwielokrotności są usuwane, seryjnie rozcieńczane, a podwielokrotności rozcieńczeń rozprowadza się na stałym podłożu bakteriologicznym i inkubuje, aby umożliwić wzrost komórek, które przeżyły. Na koniec wylicza się kolonie bakterii. Test CFU wymaga dużej liczby płytek mikromiareczkowych do rozcieńczenia komórek i płytek Petriego zawierających agar do zliczenia kolonii, które przeżyły. Test CFU dla wolno rosnących prątków jest utrudniony przez ich powolny czas generacji (18-24 godziny), który wymaga około 3 tygodni, aby kolonie pojawiły się na płytkach. Ponadto przestrzeń w inkubatorach jest często ograniczona w specjalistycznych obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3.
Chociaż są uciążliwe, testy CFU są złotym standardem do scharakteryzowania wpływu niereplikujących się i podwójnie aktywnych cząsteczek na prątki. Testy niereplikujące są obarczone wysokimi wskaźnikami wyników fałszywie dodatnich, ponieważ wiele z nich jest sprzężonych z testami replikującymi w celu oceny żywotności komórek6-8. Na przykład związek, który ma silną aktywność przeciwko replikacji M. tuberculosis ("substancja czynna replikująca") może nie zabijać podczas testu bez replikacji, ale nadal może zabijać dzięki przeniesieniu z fazy niereplikacji testu do fazy odzyskiwania testu, która jest przeprowadzana w warunkach sprzyjających replikacji ("warunki replikacji"). Przenoszenie związków dodatkowo komplikuje analizę podwójnie aktywnych cząsteczek, utrudniając rozróżnienie, czy aktywność była replikująca, niereplikująca, czy podwójna.
Aby rozwiązać problemy opisane powyżej, opracowaliśmy test CARA, który umożliwia szybkie, półilościowe liczenie gatunków prątków, takich jak M. tuberculosis, M. bovis BCG i M. smegmatis7 (Rysunki 1 i 2). W roztworach buforowych in vitro węgiel aktywny szybko sekwestruje większość standardowych leków stosowanych w leczeniu gruźlicy7. Węgiel aktywny w mikropłytkach CARA wiąże związki, które mogą przenosić się z mikropłytki testowej, a ta cecha CARA eliminuje wymóg seryjnego rozcieńczania zawartości studzienki testowej przed wyliczeniem7,21,22. Liczbę mikrokolonii prątków na powierzchni agaru mikropłytek CARA szacuje się przez dodanie resazuryny, niebieskiego barwnika, którego zredukowana forma, rezorufina, jest różową cząsteczką, której fluorescencję mierzy się za pomocą spektrofotometrii23. Mikropłytki CARA inkubuje się przez 1-2 dni w przypadku M. smegmatis i 7-10 dni w przypadku wolno rosnących prątków, takich jak M. tuberculosis i M. bovis BCG. CARA ma wąski zakres dynamiki wynoszący ~2-3 log10 różnicy w CFU. W przypadku zastosowania zamiast testu CFU, pojedyncza mikropłytka CARA zastępuje około pięciu 96-dołkowych płytek używanych do seryjnych rozcieńczeń i 120 trójfazowych płytek agarowych używanych do posiewu. Interpretacja danych CARA pomaga w kierowaniu kolejnymi badaniami poprzez określenie, które czasy inkubacji i stężenia związków należy przetestować w bardziej pracochłonnych testach opartych na CFU.
Protokół
1. Przygotowanie mikropłytek CARA
- W autoklawie 900 ml agaru Middlebrook 7H11 zawierającego 0,2% glicerolu i 0,4% węgla aktywnego należy umieścić w autoklawie 900 ml agaru Middlebrook 7H11 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 litra lub alternatywnie 450 ml w szklanej zlewce o pojemności 1 l. Umieścić duże mieszadło nadające się do sterylizacji w autoklawie w kolbie lub zlewce. Przykryj otwór kolby lub zlewki folią aluminiową i przymocuj do szkła taśmą do autoklawu.
- Chłodny w dotyku (około 55-65 °C) na magnetycznej płycie mieszającej ustawionej na niską prędkość, aby utrzymać węgiel drzewny w zawiesinie.
- Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać aseptycznie w okapie bezpieczeństwa biologicznego wyposażonym w magnetyczną płytkę mieszającą.
- Usuń folię. Dodać 100 ml suplementu OADC (suplement OADC po zastosowaniu w dawce 10% daje końcowe stężenie pożywki wynoszące 0,2% dekstrozy, 0,5% albuminy, 0,085% NaCl, 0,0005% kwasu oleinowego i 0,4 mg/ml katalazy) do 2 l kolby Erlenmeyera lub 50 ml OADC do 1 l zlewki i kontynuować mieszanie.
- W przypadku korzystania z kolby Erlenmeyera wlać około 25-40 ml węgla drzewnego 7H11-OADC do sterylnego zbiornika na odczynnik. W przypadku korzystania ze zlewki nie jest konieczne używanie zbiornika na odczynnik.
- Napełnić 96-dołkową mikropłytkę 200 μl/studzienkę węgla drzewnego 7H11-OADC ze zbiornika odczynnika lub zlewki. Pracuj szybko, aby uniknąć zestalenia się agaru i wprowadzenia pęcherzyków. Unikaj rozpryskiwania stałego podłoża na zewnątrz studni, ponieważ może to być źródłem zanieczyszczenia grzybiczego. Używając pipety wielokanałowej, użyj jednego zestawu 12 końcówek filtrujących do przeniesienia węgla drzewnego 7H11-OADC do 8 rzędów (AH) płytki 96-dołkowej.
UWAGA: Podłoże szybko krzepnie. Aby uniknąć zatkania końcówek pipet, należy je często wymieniać. - Alternatywnie, mikropłytki CARA można nalewać za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej p1000 z końcówkami filtrującymi, które pomagają w przygotowaniu wielu płytek.
UWAGA: Ze względu na małą objętość dołków na mikropłytki, agar w mikropłytkach CARA zestala się w ciągu kilku minut od nalania. - Umieść stosy mikropłytek CARA w zamykanych torebkach foliowych, aby uniknąć wyschnięcia.
- Przechowywać mikropłytki CARA w temperaturze 4 °C.
2. Konfiguracja testów replikujących i niereplikujących MIC90
- Zaszczepić M. tuberculosis, M. bovis BCG lub M. smegmatis przy OD580 0,01-0,1 i rozwinąć do środkowej fazy logarytmicznej (OD580 ~ 0,5) w Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 zawierający 0,2% glicerolu, 0,2% dekstrozy, 0,5% albuminy i 0,085% NaCl) lub 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 zawierający 0,2% glicerolu i 10% suplementu OADC).
- Hodować M. tuberculosis i M. bovis BCG jako ~20 ml stojących kultur w kolbach do hodowli komórkowych, a M. smegmatis z wytrząsaniem w okrągłodennych polipropylenowych probówkach okrągłodennych (4 ml hodowli) lub stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml (10-20 ml hodowli). Inkubować chorobotwórcze prątki w temperaturze 37 °C z 20%O2 i 5% CO2 oraz M. smegmatis w temperaturze 37 °C z 20%O2 .
- Skonfiguruj eksperyment w stylu minimalnego stężenia hamującego (MIC90) w warunkach replikacji i niereplikacji (ryc. 2).
UWAGA: Czynniki testowe są zwykle oznaczane w duplikatach lub poczwórnych duplikatach, aby umożliwić testowanie odpowiednio 4 lub 2 związków na 96-dołkową mikropłytkę. Na przykład na płytce 96-dołkowej jeden czynnik testowy można oznaczyć w wierszach A-D, a drugi w wierszach E-H. DMSO (nośnik) znajduje się w kolumnach 1, 2 i 12, a seria rozcieńczeń badanego czynnika biegnie od kolumny 3 (najniższe stężenie) do kolumny 11 (najwyższe stężenie). Testy typu MIC90 zazwyczaj wykorzystują 2-krotne serie rozcieńczeń. Dostępnych jest wiele niereplikujących się modeli dla prątków14-16,18,24,25, a w celach ilustracyjnych używamy modelu wielostresowego bez replikacji6,8,9.- Do testu replikacji rozmieścić 200 μl komórek w 7H9-ADN przy OD580 0,01 do wszystkich studzienek 96-dołkowej płytki z przezroczystym dnem poddanej działaniu kultury tkankowej.
- W przypadku testu niereplikującego należy dwukrotnie przemyć komórki w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) zawierającej 0,02% tyloksapolu i ponownie zawiesić komórki w pożywce niereplikującej (0,05% KH2PO4, 0,05%MgSO4, 0,005% cytrynian żelazowo-amonowy, 0,0001% ZnCl2, 0,1% NH4Cl, 0,5% BSA, 0,085% NaCl, 0,02% tyloksapol, 0,05% maślan; pH dostosowane do 5,0 z 2 N NaOH).
- Rozcieńczyć komórki do OD580 0,1 w pożywce niereplikującej i dodaćNaNO2 ze świeżo przygotowanego 1 M materiału do końcowego stężenia 0,5 mM.
- Rozprowadzić 200 μl komórek o średnicy zewnętrznej580 0,1 do wszystkich studzienek 96-dołkowej płytki z czystym dnem, poddanej działaniu kultur tkankowych.
UWAGA: Przygotować rozcieńczenia związków jako 100-krotne roztwory podstawowe w DMSO. Tak więc typowa płytka MIC badająca wpływ cząsteczki przy końcowym stężeniu 0,4-100 μg/ml wymagałaby roztworów podstawowych 0,04-10 mg/ml w DMSO.
- Dodać 2 μl rozcieńczeń badanego czynnika 1 do rzędów A-E i 2 μl rozcieńczeń badanego czynnika 2 do rzędów E-H. Dokładnie wymieszaj.
- Dodać 2 μl kontroli nośnika (zwykle DMSO) do studzienek kontrolnych, kolumny 1, 2, 12 (rzędy A-H). Dokładnie wymieszaj.
- Dla każdego doświadczenia należy uwzględnić co najmniej jedną kontrolę dodatnią, taką jak ryfampicyna, w dawce od 0,004 do 1 μg/ml (test replikujący) i/lub 0,08 do 20 μg/ml (test niereplikujący).
UWAGA: Zaleca się stosowanie 6-bromo-1H-indazol-3-aminy9 w stężeniu od 0,1 do 25 μg/ml jako związku kontrolnego, który ma selektywną, zależną od NaNO2 aktywność w wielostresowym modelu niereplikacji. - W przypadku testów replikacyjnych inkubować mikropłytki w temperaturze 37 °C przy 20%O2 i 5% CO2 przez 7 dni (M. tuberculosis i M. bovis BCG) lub 1-48 godzin (M. smegmatis). W przypadku wielostresowego modelu niereplikacji inkubować mikropłytki przez 7 dni w temperaturze 37 °C przy 1%O2 i 5% CO2 (M. tuberculosis i M. bovis BCG).
3. Inokulacja mikropłytek CARA
- W punktach, w których CARA będzie używana jako odczyt, należy ostrożnie ponownie zawiesić zawartość studzienki na płytce testowej typu MIC90 za pomocą pipety wielokanałowej p200 ustawionej na 50-75 μl. Pipetę w górę i w dół co najmniej 5-10 razy i delikatnie obracać zawartość studzienki okrężnymi ruchami za pomocą końcówek do pipet.
- Przenieść 10 μl zawartości basenika testowego na mikropłytkę CARA. Upewnij się, że kolejność zawartości studzienki na płytce testowej jest zgodna z kolejnością zawartości studzienki na mikropłytce CARA. Unikaj rozpryskiwania się podczas przenoszenia i upewnij się, że 10 μl zostało dostrzeżone w środku studzienek na mikropłytki CARA. Upewnij się, że 10 μl wchłania się do mikropłytki CARA.
UWAGA: Nie są wymagane żadne rozcieńczenia przed nakrapianiem komórek na mikropłytkach CARA. - Zwiąż stosy mikropłytek CARA taśmą klejącą, a następnie umieść je w zamykanej plastikowej torbie. Inkubować mikropłytki CARA w temperaturze 37 °C z 20%O2 (M. smegmatis) lub 1%O2 i 5% CO2 (M. tuberculosis i M. bovis BCG).
- Dla M. tuberculosis i M. bovis BCG, testy replikujące: inkubować przez 7 dni; dla M. tuberculosis i M. bovis BCG testować bez replikacji, inkubować przez 10 dni; dla M. smegmatis, próby replikujące, inkubować przez 1-2 dni; dla M. smegmatis, testy niereplikujące, inkubować 2-3 dni.
UWAGA: Czasy są szacunkowe i mogą być odpowiednio modyfikowane dla różnych warunków replikacji, niereplikacji i naprężeń.
4. Opracowanie mikropłytek CARA
- Mikropłytki CARA należy rozwijać, gdy na ujemnych (nośnikowych) studzienkach kontrolnych widoczny jest film wzrostu bakterii lub większe, makroskopowe kolonie.
UWAGA: Po długotrwałej inkubacji studzienki mikropłytkowe CARA często wydają się suche i zalecamy wstępne zwilżenie zawartości studzienki sterylnym PBS. Ma to na celu zapobieżenie wchłanianiu resazuryny przez węgiel drzewny, co może prowadzić do niskiej fluorescencji lub zmienności między studniami. - Używając pojedynczego zestawu 12 końcówek p200 z pipetą wielokanałową, dozuj 40 μl sterylnego PBS wzdłuż boku studzienek i pozwól PBS rozprowadzić się po górnej części mikrokolonii agarowych/bakteryjnych.
- Przygotować odczynnik wywołujący CARA, mieszając 5 mg rezazuryny (0,01% końcowej) i 50 ml 5% Tween80 w PBS. Filtr wirowy i sterylny.
UWAGA: Alternatywny odczynnik wywołujący CARA można przygotować, mieszając komercyjnie przygotowany płynny roztwór rezazuryny w stosunku 1:1 (vol/vol) z 10% Tween80 w PBS. - Dodać 50 μl świeżo przygotowanego odczynnika wywołującego CARA do każdego dołka mikropłytki CARA za pomocą 12-kanałowej pipety. Płytki kołysane kilka razy w przód iw tył, aby pomóc rozprowadzić odczynnik po agarze i macie bakteryjnej w każdej studzience.
- Umieścić płytki w zamykanej plastikowej torbie i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut w przypadku M. smegmatis i 45–60 minut w przypadku M. tuberculosis lub M. bovis BCG.
UWAGA: Jeśli studzienki kontrolne pojazdu nie zmienią koloru na różowy w ciągu pierwszej godziny, płytki można ponownie zapakować i inkubować przez dłuższy czas. - Przed odczytem fluorescencji należy umieścić mikropłytki CARA w okapie bezpieczeństwa biologicznego na 15 minut w temperaturze pokojowej ze zdjętymi pokrywkami. W przypadku korzystania ze spektrofotometrów BSL3 poza szafą bezpieczeństwa biologicznego, przyklej naklejkę PCR o jakości optycznej na płytce i szczelnie zamknij, delikatnie dociskając powierzchnię naklejki miękkim ręcznikiem papierowym.
- Określić fluorescencję za pomocą odczytu od góry ze wzbudzeniem przy 530 nm i emisją przy 590 nm. Nie ma potrzeby zaślepiania płyty.
5. Analiza danych
- Wykreślić stężenie inhibitora na osi X w skali logarytmu10 i fluorescencję na osi Y w skali liniowej. Użyj wykresu punktowego z zastosowaniem dopasowania krzywej, takiego jak "nachylenie logarytmu inhibitora a zmiennej odpowiedzi (4 parametry)". Wykreśl punkty danych jako średnie± błąd standardowy.
Wyniki
Przewidywane wyniki CARA opisano na Rysunku 2 i zestawiono w Tabeli 1. W przypadku komórek replikujących się test CARA jest przeprowadzany równolegle ze standardowym oznacczeniem MIC90, a w przypadku testów z komórkami niereplikującymi się test CARA jest przeprowadzany równolegle z dostosowanym oznaczeniem MIC90, połączonym z fazą odrostu. Stężenie badanego związku, przy którym fluorescencja CARA nie wzrasta powyżej poziomów tła, stanowi CARA-MBC≥99 (Rysunek 3a). Indeks dolny „≥99” wskazuje, że CARA-MBC dostarcza szacunkowego stężenia badanego związku, które powoduje bakteriobójstwo na poziomie ≥2 log10 (redukcja o ≥99%).
MIC w bulionie90 test nie pozwala odróżnić działania bakteriobójczego od bakteriostatycznego i rozstrzygnięcie tej kwestii wymaga przeprowadzenia testu CFU. Zwyczajowo przyjmuje się, że próg odróżniający działanie bakteriobójcze od bakteriostatycznego w przypadku wolno rosnących prątków wynosi około 2-3 log10 eliminować przez ponad 7 dni7,26Ponieważ zakres dynamiczny CARA wynosi również od 2 do 3 log.10 zabicie, CARA może dostarczyć szacunkowej oceny aktywności bakteriobójczej lub bakteriostatycznej. CARA łatwo identyfikuje niektóre substancje aktywne replikujące jako bakteriostatyczne ze względu na to, że związki te nie obniżają fluorescencji CARA do poziomu tła (Rysunek 2). Jednak niektóre związki o działaniu bakteriostatycznym wobec replikujących *M. tuberculosis* wykazują silny efekt poantybiotykowy, co oznacza, że nadal hamują odrastanie bakterii w fazie regeneracji, nawet w przypadku braku przeniesienia związku. Efekt ten może być trudny do zidentyfikowania w teście CARA. Podejrzewa się, że związki wywierają efekt poantybiotykowy, jeśli wykazują tzw. „okno statyczne”, zdefiniowane jako >4-krotny przesunięcie w prawo między krzywymi MIC a CARA (Rycina 3b). Okno statyczne wskazuje, że cząsteczka aktywna przeciwko replikującym M. tuberculosis może być bakteriostatyczne zamiast bakteriobójczego. W niektórych przypadkach okna statyczne są widoczne dopiero po analizie powiększonej osi Y dla fluorescencji CARA (Rycina 3c i 3D).
Dane CARA i MIC90 są zazwyczaj przedstawiane wspólnie (Rysunek 4). Reprezentatywne dane dla cząsteczek aktywnych wobec bakterii replikujących i niereplikujących, badanych metodą MIC90 oraz CARA, przedstawiono na Rysunku 4. Wyróżnia się 4 główne klasy aktywności cząsteczek: 1) bakteriobójcze wobec bakterii replikujących (na przykładzie izoniazydu, Rysunek 4a); 2) bakteriostatyczne wobec bakterii replikujących (na przykładzie linezolidu, Rysunek 4b); 3) bakteriobójcze wobec bakterii niereplikujących (na przykładzie oksyfenbutazonu, Rysunek 4c); oraz 4) aktywne wobec bakterii replikujących (bakteriostatyczne lub bakteriobójcze) i bakteriobójcze wobec bakterii niereplikujących (na przykładzie PA-824, Rysunek 4d). Co istotne, Rysunki 4a i 4b pokazują, że choć izoniazyd i linezolid wydają się wykazywać aktywność przeciwko bakteriom niereplikującym w teście MIC90, metoda CARA sugeruje, że są one nieaktywne w badanych warunkach braku replikacji. Aby sprawdzić użyteczność CARA w przewidywaniu wpływu cząsteczki zależnego od czasu i stężenia, replikujące M. smegmatis poddano działaniu rosnących stężeń rifampicyny (Rysunki 5a-d), a w różnych odstępach czasu między 1 a 24 h naniesiono alikwoty na płytki CARA. Dane te wskazały, że rifampicyna wywarła wpływ już po 1 h (Rysunek 5a), wykazała zwiększoną aktywność bakteriobójczą między 3 a 24 h (Rysunki 5b-d) i zabiła ≥2-3 log10 przy stężeniu ~10 μg/ml do 24 h (Rysunek 5d). Podobny eksperyment z czterema powtórzeniami dla kontroli nośnika oraz 9 stężeń leku w 4 punktach czasowych byłby niemożliwy do przeprowadzenia za pomocą standardowego testu CFU.
Zatem CARA odgrywa rolę w odkrywaniu leków jako szybki mechanizm o średniej przepustowości, służący do identyfikacji profilu aktywności cząsteczki. Przewidywania CARA powinny być rygorystycznie oceniane przy użyciu standardowego testu CFU. Dodatek 0,4% węgla aktywnego do szalek Petriego podczas analizy CFU może pomóc w poprawie korelacji z danymi CARA i może skutkować dokładniejszymi zliczeniami CFU, przy czym skala korekty jest zazwyczaj proporcjonalna do potencji związku21,22.
Rysunek 1: CARA jako narzędzie predykcyjne w odkrywaniu leków. Ten schemat podsumowuje użyteczność CARA jako etapu pośredniego między przesiewaniem leków (przesiewanie jednopunktowe, wybór wybranych związków i testy zależności dawka-odpowiedź) a czasochłonnymi badaniami optymalizacji trafień do związków wiodących (testy CFU i identyfikacja celu). [Zaadaptowano za zgodą Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Schemat analizy MIC90 w bulionie oraz CARA z przewidywanymi wynikami. Wyniki MIC90 i CARA przedstawiono dla 8 możliwych poziomów aktywności. Kodowanie kolorystyczne dla dołków mikropłytki MIC90 to biały (brak wzrostu) i brązowy (wzrost), a dla mikropłytek CARA czarny (brak fluorescencji) i różowy (fluorescencja rezorufiny). Dane są hipotetyczne. [Zaadaptowano za zgodą z Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Specjalistyczne terminy i definicje dotyczące CARA. Minimalna stężenie bakteriobójcze cząsteczki skutkujące poziomem tła fluorescencji CARA to CARA-MBC≥99 (a). W warunkach replikacji przesunięcie CARA-MBC≥99 o ≥4-krotność w prawo względem MIC90 często wskazuje na aktywność bakteriostatyczną i określane jest jako „okno statyczne” (b). W przypadku cząsteczek o silnym efekcie poantybiotykowym okna statyczne mogą być trudne do zaobserwowania (c) i wymagają rozszerzenia osi Y (fluorescencja CARA), aby były widoczne (d). Dane są hipotetyczne. [Zaadaptowano za zgodą Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 4: Przykładowe wyniki MIC90 i CARA dla wybranych związków. Dane dla MIC90 (kolor czerwony) i CARA (kolor niebieski) przedstawiono dla (a) izoniazydy (INH), (b) linezolidu, (c) oksyfenbutazonu oraz (d) PA-824. Dziki szczep M. tuberculosis H37Rv eksponowano na związki przez 7 dni w standardowych warunkach replikacji lub w modelu wielostresowym braku replikacji7-9. Analizy MIC90 oraz CARA przeprowadzono zgodnie z opisem na Rycini 2. [Zaadaptowano za zgodą z Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Aktywność ryfampicyny zależna od dawki i czasu. Niepatogenny, szybko rosnący szczep M. smegmatis był poddany działaniu zwiększających się stężeń ryfampicyny w warunkach replikacji, a próbki pobierano do analizy CARA w 1. (a), 3. (b), 6. (c) i 24. (d) godzinie. [Adaptowano za zgodą z Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Tabela 1: Podsumowanie przewidywanych wyników na Rysunku 2. [Zaadaptowano za zgodą Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.
Dyskusja
CARA został pierwotnie opracowany w celu złagodzenia wąskiego gardła w postępujących niereplikujących się lub podwójnie aktywnych cząsteczkach7. CARA służy jako etap pośredni między potwierdzeniem stężenie-odpowiedź pierwotnych trafień przesiewowych a testami CFU (ryc. 1). Ponieważ pojedyncza płytka CARA może zastąpić wiele płytek do mikromiareczkowania wymaganych do przygotowania seryjnych rozcieńczeń oraz płytek Petriego zawierających agar używanych do liczenia bakterii, które przeżyły, CARA zapewnia prosty sposób szybkiej oceny aktywności cząsteczki i testowania wielu zmiennych jednocześnie, w tym stężenia związku i czasu ekspozycji na związek.
W teście CFU, oprócz seryjnych rozcieńczeń, które często wahają się do 106-krotnie, płytka agarowa zazwyczaj rozcieńcza cząsteczki o dodatkowe ~800-krotne (10 μl na 8 ml w trójstylowej płytce Petriego). Nasz dwuetapowy, wielostresowy test przesiewowy dla związków aktywnych na niereplikującym się M. tuberculosis ma 5-krotny współczynnik przeniesienia, to znaczy związek obecny w fazie niereplikacji testu jest obecny w jednej piątej pierwotnego stężenia w fazie wzrostu (replikacji) testu6-9. CARA łagodzi skutki przenoszenia poprzez sekwestrację małych cząsteczek za pomocą węgla aktywnego. Większość leków przeciwgruźliczych i kandydatów klinicznych wiąże węgiel aktywowany szybko i całkowicie, z wyjątkiem aminoglikozydu streptomycyny7. Włączenie węgla aktywnego do płytek agarowych do testów CFU zapobiegło zahamowaniu wzrostu bakterii lub zabiciu bakterii przez przenoszenie TMC207 i PA-8247,21,22. Tak więc, dzięki włączeniu węgla aktywnego do agaru bakteriologicznego, CARA nie jest zależna od seryjnych rozcieńczeń komórek i czynnika testowego.
CARA może pomóc w przewidywaniu bakteriostatycznego lub bakteriobójczego wpływu replikujących się substancji czynnych oraz bakteriobójczego wpływu niereplikujących się substancji czynnych. Ogólnie rzecz biorąc, CARA jest stosowany równolegle ze standardowymi testami MIC90 . Moc predykcyjna CARA wynika z porównania wyników MIC90 i CARA (Rysunek 2 i Tabela 1). W przypadku stosowania do badania środków przeciwprątkowych, CARA może dokładnie przewidywać aktywność, która jest replikująca bakteriobójcza (Figura 4a), replikująca bakteriostatyczna (Figura 4b), niereplikująca bakteriobójcza (Figura 4c) lub podwójnie aktywna (Figura 4d). CARA pozwala również na prostą ocenę aktywności związku zarówno w dawce, jak i czasie. Same testy CFU wymagają wiele wysiłku i materiału, aby ocenić aktywność związku w szerokim zakresie dawek i czasów, ale zadanie staje się wykonalne, gdy wyniki CARA zawężają zakres warunków do tych, w których związek jest wyraźnie aktywny (ryc. 5).
Chociaż CARA jest przydatna w badaniu działania środków przeciwinfekcyjnych na prątki, test ma ograniczenia. CARA ma wąski zakres dynamiki (2-3 log10) i może nie być odpowiedni w warunkach, w których przewiduje się, że nie może dojść do zabicia bakterii więcej niż 2 do 3 log10 . Przewidywania CARA wymagają dalszych badań przy użyciu bardziej rygorystycznej i dokładnej metody liczenia liczby bakterii, takiej jak test CFU. Działanie niektórych leków przeciwinfekcyjnych, takich jak PAS, po antybiotykoterapii może zmylić CARA jako narzędzie predykcyjne do rozróżniania związków o działaniu bakteriobójczym i bakteriostatycznym przeciwko replikacji M. tuberculosis7.
Istnieją dwa zalecenia dotyczące poprawy jakości CARA. Po pierwsze, należy szybko wlać mikropłytki CARA, zanim agar zastygnie, zachowując dokładność objętościową i unikając rozpryskiwania się na zewnątrz mikrostudzienek. Niezależnie od wymaganej liczby płytek, zalecamy przygotowanie partii od 0,5 do 1 litra pożywki, aby pomóc w utrzymaniu pożywki w postaci płynnej przez czas wymagany do nalewania płytek. Częsta wymiana końcówek podczas napełniania mikropłytek medium pozwala uniknąć stosowania częściowo zatkanych końcówek. Po drugie, należy zminimalizować sztuczną zmienność fluorescencji między powtórzeniami. Mikrokolonie prątków, w szczególności prątków chorobotwórczych, takich jak M. tuberculosis, często rosną nieregularnie. Na przykład mikrokolonie rosnące na powierzchni agaru mogą różnić się wielkością, kształtem, wysokością lub mogą sięgać do wewnętrznych ścian studzienek na mikropłytkach. Jednym z wyzwań jest równomierne pokrycie wszystkich pałeczek odczynnikiem rozwijającym. Kolejną przeszkodą jest to, że po długotrwałej inkubacji w temperaturze 37 °C stałe podłoże bakteriologiczne mikropłytek CARA może stać się suche i podatne na wchłanianie rozwijającego się odczynnika. Ponieważ węgiel aktywny może wiązać rezazurynę i gasić fluorescencję7, może wystąpić różnica między studniami ze względu na suche studzienki absorbujące roztwór rozwijający rezazurynę i fluorescencję resazuryny hartowanej węglem aktywnym. Wstępne zwilżenie powierzchni wszystkich studzienek mikropłytkowych CARA PBS bezpośrednio przed dodaniem odczynnika wywołującego łagodzi oba te problemy — rozwijający się odczynnik dotrze równomiernie do wszystkich kolonii prątków, a resazuryna pozostaje bezpiecznie nad węglem aktywnym. CARA może mieć zastosowanie w identyfikacji i charakterystyce fenotypów mutantów prątków lub w średnioprzepustowych testach odkrywania leków dla innych gatunków bakterii.
Oświadczenia
Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by ujawnić.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Kristin Burns-Huang za fachową recenzję manuskryptu oraz J. Davidowi Warrenowi (Weill Cornell Medical College) za pomoc chemiczną podczas opracowywania CARA. Praca ta była wspierana przez TB Drug Accelerator Program Fundacji Billa i Melindy Gatesów, Program Abby i Howarda P. Milsteinów w Medycynie Translacyjnej oraz Jednostkę Badawczą NIH TB (U19 AI111143). Zakład Mikrobiologii i Immunologii jest wspierany przez Fundację Williama Randolpha Hearsta. SSK było wspierane przez NIH grant K08AI108799.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Middlebrook 7H9 | Beckton Dickinson | 271310 | |
| Middlebrook 7H11 | Beckton Dickinson | 298810 | |
| Middlebrook OADC | Beckton Dickinson | 212351 | |
| BSA, szok termiczny | Roche | 3118958001 | |
| węgiel aktywny | Sigma | C5510 | |
| PBS, Dulbecco's Ca2+ i Mg2+ wolne | Life Technologies / Invitrogen | 14190-144 | |
| tween 80 | Sigma | P8074 | |
| tyloxapol | Sigma | T8761 | |
| azotyn sodu | Sigma | 2252 | |
| ryfampicyna | Sigma | R3501 | |
| 6-bromo-1H-indazol-3-amina | Alfa Aesar | H34095 | |
| fosforan potasu monobasic | Sigma | P0662 | |
| siarczan magnezu, siedmiowodny | Sigma | M1880 | |
| cytrynian żelazowo-amonowy | Sigma | F5879 | |
| siarczan, siedmiowodny | Sigma | Z0251 | |
| chlorek amonu | Sigma | A9434 | |
| kwas masłowy, płyn | Sigma | B103500 | |
| rezazuryna w proszku | Sigma | R7017 | |
| chlorek sodu | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Przygotowany roztwór rezazuryny | Naklejki Invitrogen | DAL1100 | |
| PCR | Denville | B1212-5 | |
| Urządzenia molekularne | M5 | ||
| 96-dołkowe, mikropłytki poddane hodowli tkankowej | Zbiorniki odczynników Corning | 3595 | |
| VWR | 89094-678 | ||
| Zamykane torby foliowe | VWR | 395-94602 | |
| 14 ml Probówki okrągłodenne z polipropylenu Corning | |||
| Stożkowa probówka wirówkowa o pojemności 50 ml | Corning | 352070 | |
| 75 cm2 Kolba do hodowli komórkowych | Corning | 431464U | |
| przezroczysta, z płaskim dnem Mikropłytka 96-dołkowa | Costar | 3595 | |
| Prism 6 do http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | GraphPad |
Bibliografia
- Nathan, C. Fresh approaches to anti-infective therapies. Sci. Transl. Medicine. 4 (140), 140-142 (2012).
- Gomez, J. E., McKinney, J. D. M. tuberculosis persistence, latency, and drug tolerance. Tuberculosis (Edinb). 84, 29-44 (2004).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. Lancet. , 497-500 (1944).
- Bryk, R., et al. Selective killing of nonreplicating mycobacteria. Cell Host Microbe. 3, 137-145 (2008).
- Gold, B., et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drug sensitizes Mycobacterium tuberculosis to endogenous and exogenous antimicrobials. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16004-16011 (2012).
- Gold, B., et al. Rapid, semi-quantitative assay to discriminate among compounds with activity against replicating or non-replicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 6521-6538 (2015).
- Gold, B., Warrier, T., Nathan, C. Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology. Parish, T., Roberts, D. 1285, Springer. 293-315 (2015).
- Warrier, T., et al. Identification of Novel Anti-mycobacterial Compounds by Screening a Pharmaceutical Small-Molecule Library against Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Infect. Dis. , 580-585 (2015).
- Zheng, P., et al. Synthetic Calanolides with Bactericidal Activity Against Replicating and Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Chem. Chem, J. .M. ed. , (2014).
- Darby, C. M., et al. Whole cell screen for inhibitors of pH homeostasis in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 8, e68942(2013).
- Darby, C. M., Nathan, C. F. Killing of non-replicating Mycobacterium tuberculosis by 8-hydroxyquinoline. J. Antimicrob. Chemother. 65, 1424-1427 (2010).
- de Carvalho, L. P., Darby, C. M., Rhee, K., Nathan, C. Nitazoxanide Disrupts Membrane Potential and Intrabacterial pH Homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. ACS Med. Chem. Lett. 2, 849-854 (2011).
- Xie, Z., Siddiqi, N., Rubin, E. J. Differential antibiotic susceptibilities of starved Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4778-4780 (2005).
- Grant, S. S., et al. Identification of novel inhibitors of nonreplicating Mycobacterium tuberculosis using a carbon starvation model. ACS Chem. Biol. 8, 2224-2234 (2013).
- Zhang, M., et al. Streptomycin-starved Mycobacterium tuberculosis 18b, a drug discovery tool for latent tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 56, 5782-5789 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem. Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Cho, S. H., et al. Low-oxygen-recovery assay for high-throughput screening of compounds against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 51, 1380-1385 (2007).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 92, 453-488 (2012).
- Rebollo-Lopez, M. J., et al. Release of 50 new, drug-like compounds and their computational target predictions for open source anti-tubercular drug discovery. PLoS One. 10, e0142293(2015).
- Tasneen, R., et al. Contribution of the nitroimidazoles PA-824 and TBA-354 to the activity of novel regimens in murine models of tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 129-135 (2015).
- Grosset, J. H., et al. Assessment of clofazimine activity in a second-line regimen for tuberculosis in mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 188, 608-612 (2013).
- Shiloh, M. U., Ruan, J., Nathan, C. Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay. Infect. Immun. 65, 3193-3198 (1997).
- Wang, F., et al. Identification of a small molecule with activity against drug-resistant and persistent tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E2510-E2517 (2013).
- Wayne, L. G., Hayes, L. G. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence. Infect. Immun. 64, 2062-2069 (1996).
- Barry, A. L., et al. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents: approved guideline. 19, National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1999).
Przedruki i uprawnienia
