Artykuł metodologiczny

Zaburzenia krążących miRNA w zespole jelita drażliwego wykryte za pomocą multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54693

⸱

30 listopada 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Digestive Disorders Unit, National Institute of Nursing Research, National Institutes of Health, DHHS, 2National Institutes of Health Research Scholar, Howard Hughes Medical Institute, 3Internal Medicine, Medical School, University of Michigan

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy użycie multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości, która określa ilościowo ekspresję genów poprzez kodowanie kreskowe i liczenie cząsteczek w substratach biologicznych bez potrzeby amplifikacji. Wykorzystaliśmy platformę do ilościowego określenia ekspresji mikroRNA (miRNA) we krwi pełnej u osób z zespołem jelita drażliwego i bez niego.

Streszczenie

Test platformy ekspresji genów pozwala na solidną i wysoce powtarzalną kwantyfikację ekspresji do 800 transkryptów (mRNA lub miRNA) w jednej reakcji. Test miRNA zlicza transkrypty poprzez bezpośrednie obrazowanie i cyfrowe zliczanie cząsteczek miRNA, które są znakowane kolorowymi fluorescencyjnymi zestawami sond z kodami kreskowymi (sonda reporterowa i sonda wychwytująca). Kody kreskowe są hybrydyzowane bezpośrednio z dojrzałymi miRNA, które zostały wydłużone przez ligowanie unikalnego znacznika oligonukleotydowego (miRtag) do końca 3'. Odwrotna transkrypcja i amplifikacja transkrypcji nie są wymagane. Sondy reporterowe zawierają sekwencję sześciu pozycji kolorów wypełnionych kombinacją czterech kolorów fluorescencyjnych. Cztery kolory w sześciu pozycjach są używane do konstruowania sekwencji kolorowych kodów kreskowych specyficznych dla genu. Przetwarzanie po hybrydyzacji jest zautomatyzowane na zrobotyzowanej stacji przygotowawczej. Po hybrydyzacji nadmiar sond jest wypłukiwany, a struktury trójdzielne (sonda wychwytująca-sonda reporterowa miRNA) są mocowane do szkiełka pokrytego streptawidyną za pomocą sondy wychwytującej znakowanej biotyną. Obrazowanie i liczenie kodów kreskowych odbywa się za pomocą analizatora cyfrowego. Unieruchomione miRNA z kodami kreskowymi są wizualizowane i obrazowane za pomocą mikroskopu i kamery, a unikalne kody kreskowe są dekodowane i zliczane. Kontrola jakości danych (QC), normalizacja i analiza są ułatwione dzięki specjalnie zaprojektowanemu oprogramowaniu do przetwarzania i analizy danych, które towarzyszy oprogramowaniu testowemu. Test wykazuje wysoką liniowość w szerokim zakresie ekspresji, a także wysoką czułość. Przygotowanie próbki i testu nie obejmuje reakcji enzymatycznych, odwrotnej transkrypcji ani amplifikacji; ma kilka kroków; i jest w dużej mierze zautomatyzowany, co zmniejsza efekty badaczy i skutkuje wysoką spójnością i odtwarzalnością techniczną. W tym miejscu opisujemy zastosowanie tej technologii do identyfikacji krążących zaburzeń miRNA w zespole jelita drażliwego.

Wprowadzenie

Zespół jelita drażliwego (IBS) jest najczęstszą diagnozą ambulatoryjną w gastroenterologii, dotyka 10 - 15% ogólnej populacji i stanowi znaczne obciążenie dla służby zdrowia. Obecnie nie ma ogólnie przyjętych biomarkerów diagnostycznych IBS (tj. diagnoza opiera się na objawach klinicznych i wyklucza inne zaburzenia organiczne, takie jak nowotwór przewodu pokarmowego, choroby zapalne jelit i infekcje przewodu pokarmowego). Podczas badania profili ekspresji genów w typowych warunkach z subkliniczną histopatologią, takich jak IBS, potrzebna jest wysoka czułość i dokładność (odtwarzalność), ponieważ zaburzenia w profilach ekspresji genów są często subtelne1-3. miRNA zostały zidentyfikowane zarówno jako cele diagnostyczne, jak i funkcjonalne w IBS4,5, a my jesteśmy szczególnie zainteresowani oceną ich wykorzystania jako krążących biomarkerów zaburzeń biologicznych związanych z IBS3,4,6,7. Kliniczne wykorzystanie krążących biomarkerów cieszy się obecnie zainteresowaniem ze względu na łatwość i minimalnie inwazyjny charakter pobierania od pacjentów źródła biomarkerów (np. krwi obwodowej).

Testy platformy ekspresji genów, ze względu na ich unikalną chemię i usprawniony, w większości zautomatyzowany przepływ pracy, zapewniają platformę mikromacierzy, która zapewnia szeroki i konfigurowalny zasięg (800 celów w jednej reakcji) transkryptomu do ukierunkowanego odkrywania. Zapewniają również wysoką precyzję i liniowość w szerokim spektrum poziomów ekspresji w kwantyfikacji celów transkryptomicznych. Test nie wymaga odwrotnej transkrypcji RNA, amplifikacji powstałego cDNA ani żadnych innych reakcji enzymatycznych. W ten sposób potencjalne błędy wynikające z dużej liczby cykli amplifikacji z gatunków RNA o niskiej liczebności lub rzadkich wariantach splicingu są redukowane przez proces liczenia cyfrowego. Oznacza to, że w testach można stosować szeroką gamę typów próbek, takich jak oczyszczony całkowity RNA (tj. mRNA + miRNA), RNA z próbek zatopionych w parafinie utrwalonym w formalinie (FFPE), a także surowe lizaty tkankowe i komórkowe.

RNA będące przedmiotem zainteresowania są wykrywane za pomocą pary sond (sondy przechwytującej i reporterowej), z których każda zawiera sekwencję specyficzną dla celu, która rozpoznaje odpowiadający jej region na docelowym RNA. Aby zapewnić wykrycie krótkich RNA (tj. miRNA), dojrzała sekwencja miRNA jest wydłużana poprzez wyżarzanie unikalnego znacznika oligonukleotydowego (miRtag) do końca 3' cząsteczki. W celu zapewnienia swoistości sekwencji stosuje się oligonukleotyd pomostowy, który jest komplementarny w stosunku do części zarówno dojrzałego docelowego miRNA, jak i miRtag specyficznego dla miRNA. Sondy wychwytujące i reporterowe ligują odpowiednio do końców 3' i 5' dojrzałego kompleksu miRNA-miRtag. Sondy wychwytujące mają etykietę biotyny na końcu 3', która pozwala im przymocować się do powierzchni szkiełka pokrytego streptawidyną, mocując kompleks sondy wychwytującej - sondy miRNA-miRtag-reporter do szkiełka. Prąd elektryczny jest następnie wykorzystywany do orientacji kompleksu na powierzchni szkiełka, co pozwala na wizualizację fluorescencyjnych kodów kreskowych przenoszonych przez sondę reporterową na końcu 5' za pomocą mikroskopu i kamery CCD. Kody kreskowe są zliczane i dekodowane, co daje liczbę określonych docelowych miRNA. Fluorescencyjny kod kreskowy składa się z sześciu pozycji, które mogą być zajęte przez jeden z czterech kolorów fluorescencyjnych, które można wykorzystać do skonstruowania ponad 4,000 kombinacji kolorów i kodów kreskowych, z których każda koduje określony RNA.

Przygotowanie próbki (np. oczyszczanie RNA lub przygotowanie lizatu komórkowego/tkankowego), jak również hybrydyzacja sond wychwytujących i reporterowych, odbywa się na stanowisku badawczym. Dwanaście próbek można multipleksować na jednym szkiełku. Po nocnej hybrydyzacji całe dalsze przygotowanie próbki jest wykonywane przez zrobotyzowaną stację przygotowawczą. Załadowane preparaty są następnie przesyłane do analizatora cyfrowego w celu obrazowania, liczenia, dekodowania i przetwarzania danych. Uzyskane w ten sposób dane są importowane do dołączonego oprogramowania, gdzie są dalej przetwarzane z wysokim stopniem kontroli użytkownika. Unikalna chemia, proste przygotowanie, zautomatyzowany charakter, prosty typ danych (zliczenia) i ogólnie usprawniony przepływ pracy testu ułatwiają precyzyjną kwantyfikację ekspresji genów, co czyni go użytecznym narzędziem w badaniu krążących profili ekspresji miRNA i sygnatur w warunkach funkcjonalnych, takich jak IBS.

Protokół

Opisane tutaj badania zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board of the National Institutes of Health (Clinicaltrial.gov # NCT00824941).

1. Pobieranie próbek krwi pełnej

  1. Próbki krwi pełnej (2,5 ml) należy pobrać od uczestników badania poprzez nakłucie żyły w probówkach do pobierania krwi zawierających roztwór stabilizujący RNA (co pozwala na długotrwałe przechowywanie) i przechowywać je w temperaturze -80 °C do czasu oczyszczenia RNA.

2. Całkowite oczyszczanie RNA

  1. Rozmrażać i inkubować probówki z krwią przez 2 godziny, a następnie odwirowywać je za pomocą odchylanego rotora przez 10 minut przy 5 000 x g. Usunąć supernatant ostrożnie przelewając go lub pipetując do probówki odpływowej, uważając, aby nie naruszyć osadu.
  2. Umyj osad, dodając 4 ml wody wolnej od RNaz, dokładnie załóż nakrętkę i mieszaj, aż osadka widocznie się rozpuści. Wirować za pomocą wirnika z odchylanym kubełkiem o sile 5 000 x g przez 10 minut i usunąć supernatant, jak opisano w kroku 2.1.
  3. Dodać 350 μl buforu BM1 (w zestawie) do osadu. Wiruj osad, aż zostanie widocznie rozpuszczony i przenieś go do 2-mililitrowej probówki do przetwarzania w celu automatycznej ekstrakcji całkowitego RNA.
  4. Wykonaj automatyczne oczyszczanie wewnątrzkomórkowego RNA, w tym miRNA, z krwi pełnej za pomocą dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji RNA, który można zautomatyzować za pomocą zrobotyzowanego systemu ekstrakcji RNA.
    UWAGA: Zastosowany przez nas zautomatyzowany system robotyczny może przetwarzać dwanaście próbek jednocześnie, a protokół oczyszczania RNA zajmuje 3 godziny.
    1. Załaduj wstępnie załadowane końcówki pipet, probówki wirówkowe, i odczynniki dostarczone w zestawie do oczyszczania RNA do zrobotyzowanego systemu ekstrakcji RNA.
    2. Wybierz protokół "Blood miRNA Part A" z menu wyboru protokołu i uruchom run.
      UWAGA: Zapoznaj się z materiałami uzupełniającymi, aby zapoznać się z opisem zautomatyzowanych procedur.
    3. Gdy robot wypełni część A protokołu automatycznego oczyszczania miRNA, opróżnij pojemnik na odpady i wyjmij zużyte tworzywa sztuczne i pojemniki na odczynniki z systemu robota.
    4. Zamknij pokrywki wszystkich probówek do mikrowirówek zawierających eluowany RNA i umieść je w adapterze do wytrząsania. Wybierz "Blood miRNA Part B" z menu wyboru protokołu, aby inkubować próbki w temperaturze 65 oC przez 5 minut.
    5. Gdy robot zakończy uruchamianie części B protokołu oczyszczania miRNA, natychmiast usuń próbki i schłodź je na lodzie.
  5. Określić ilościowo i ocenić jakość oczyszczonego RNA za pomocą spektrofotometru.
    UWAGA: Zgodnie z zaleceniami protokołu dotyczącymi testu miRNA, wymagane jest minimalne stężenie 33 ng/μl, a wszystkie próbki powinny spełniać lub przekraczać stosunek 280/260 wynoszący 1,9 i minimalny stosunek 260/230 wynoszący 1,8, aby zapewnić brak znacznego zanieczyszczenia organicznego, które może wpływać na wydajność testu (patrz odniesienie 17).
  6. Przechowywać próbki w temperaturze -80 oC.

3. Przygotowanie próbki miRNA

  1. Normalizuj 12 próbek RNA do 33 ng/μl za pomocą wody wolnej od nukleaz.
  2. Przygotować rozcieńczenie 1:500 kontrolnych miRNA dostarczonych w zestawie testowym, używając wody wolnej od nukleaz. Trzymaj na lodzie.
  3. Przygotuj mieszankę wzorcową do wyżarzania: połącz 13 μl buforu do wyżarzania (w zestawie), 26 μl odczynnika miRtag (w zestawie) i 6,5 μl kontrolnych miRNA (przygotowanych w kroku 3.2) za pomocą pipet 10 i 20 μl.
  4. Za pomocą pipety o pojemności 10 μl dodać 3,5 μl mieszanki wzorcowej do wyżarzania i 3 μl próbki RNA (tj. 100 ng) do każdej z dwunastu probówek z paskami o pojemności 0,2 ml. Przesuń, aby wymieszać, odwirować za pomocą mini wirówki stołowej (2 000 x g) i umieścić w termocyklerze (94 oC przez 1 min, 65 oC przez 2 minuty i 45 oC przez 10 minut; trzymać w temperaturze 48 oC).
  5. Przygotować główną mieszankę do ligacji, łącząc 3 μl buforu do ligacji (w zestawie) i 19,5 μl glikolu polietylenowego (PEG; w zestawie) za pomocą pipety o pojemności 20 μl. Dodać 2,5 μl głównej mieszanki ligacyjnej do każdej z probówek z paskami z kroku 3.4 za pomocą pipety 10 μl.
    1. Delikatnie wymieszać, odwirować za pomocą stołowej mini mikrowirówki (2 000 x g) i wrócić do termocyklera w temperaturze 48 oC na 5 minut. Po 5 minutach, używając pipety o pojemności 10 μl, dodać 1 μl ligazy bezpośrednio do każdej probówki w termocyklerze i inkubować je w temperaturze 48 oC przez 3 min, 47 oC przez 3 min, 46 oC przez 3 min, 45 oC przez 5 min i 65 oC 10 min; trzymać w temperaturze 4 oC.
  6. Wyjmij probówki z termocyklera, delikatnie je wymieszaj, odwiruj za pomocą mini wirówki stołowej (2 000 x g) i dodaj 1 μl enzymu czyszczącego ligację (w zestawie). Inkubować probówki w termocyklerze (37 oC przez 1 godzinę i 70 oC przez 10 minut; utrzymywać w temperaturze 4 oC). Użyj pipety o pojemności 10 μl.
  7. Wyjmij probówki i za pomocą pipety o pojemności 100 μl dodaj 40 μl wody wolnej od nukleaz, wymieszaj i odwiruj za pomocą miniwirówki stołowej (2 000 x g).

4. Hybrydyzacja miRNA

  1. Rozmrozić zestawy sond reporterowych i wychwytujących (w zestawie) na lodzie i odwirować je za pomocą miniwirówki stołowej (2 000 x g).
  2. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl dodaj 130 μl buforu hybrydyzacyjnego do probówki z zestawem kodów reporterowych (130 μl), aby utworzyć główną mieszankę hybrydyzacji. Wymieszaj i odwiruj za pomocą miniwirówki stołowej (2 000 x g).
    UWAGA: Sondy reporterowe i przechwytujące są specyficzne i standardowe dla każdego miRNA zawartego w panelu. Można zaprojektować niestandardowe panele oraz zaprojektowane przez użytkownika zestawy przechwytywania i sondowania.
  3. Do 12 nowych probówek z paskami o pojemności 0,2 ml dodaj 20 μl głównej mieszanki hybrydyzacji za pomocą pipety o pojemności 20 μl.
  4. Denaturować próbki miRNA z kroku 3.7 w temperaturze 85 oC przez 5 minut i schłodzić je na lodzie. Dodaj 5 μl do każdej z probówek z kroku 4.3 za pomocą pipety 10 μl.
  5. Zaprogramuj termocykler na 65 oC przy temperaturze obliczonej objętościowo 30 μl i podgrzewanej pokrywie na ustawienie czasu na zawsze (nie programuj go tak, aby zmniejszał się do 4 oC na koniec pracy).
  6. Za pomocą pipety o pojemności 10 μl dodać 5 μl sondy wychwytującej do każdej probówki, wymieszać, odwirować za pomocą miniwirówki stołowej (2 000 x g) i natychmiast umieścić w termocyklerze w temperaturze 65 oC. Inkubować nie krócej niż 12 godzin i nie dłużej niż 30 godzin.

5. Stacja przygotowawcza i analizator cyfrowy

  1. Załaduj stację przygotowawczą.
    1. Otwórz drzwi stacji i załaduj płytki z odczynnikami (w zestawie), wkład (w zestawie), końcówki do pipet (w zestawie), przygotowane próbki w dwunastu probówkach z paskami o pojemności 0,2 ml i dwanaście pustych probówek z paskami o pojemności 0,2 ml (w zestawie). Zdjąć nakrętki z tubką z paskiem i pokrywę płytki odczynnika. Zamknij drzwi stacji przygotowawczej i uruchom odpowiedni test z panelu sterowania.
      UWAGA: Przetwarzanie po hybrydyzacji jest takie samo, niezależnie od uruchamianego testu. Wszystkie odczynniki i wyroby z tworzyw sztucznych są wstępnie zapakowane i nie wymagają żadnego przygotowania, poza doprowadzeniem ich do temperatury pokojowej i odwirowaniem 96-dołkowych płytek zawierających odczynnik przy 2,000 x g przez 2 minuty. Wszystkie komponenty są ładowane w jasno określonych pozycjach na stacji przygotowawczej. Zapoznaj się z materiałami uzupełniającymi, aby zapoznać się z opisem zautomatyzowanych procedur.
  2. Wizualizuj i licz kody kreskowe unieruchomionych i zorientowanych kompleksów trójstronnych.
    1. Wyjmij wkład ze stacji przygotowawczej, zapieczętuj go dostarczonymi szkiełkami nakrywkowymi i umieść w analizatorze cyfrowym w gnieździe nad optyką kamery.
    2. Wybierz odpowiedni test (test panelowy miRNA) i wersję testu wskazaną w zestawie testowym i uruchom program.
      UWAGA: Następnie analizator cyfrowy wykonuje obrazy pola widzenia dla każdej pozycji próbki na czterech długościach fal wzbudzenia, co pozwala na odczyt i dekodowanie fluorescencyjnych kodów kreskowych. Zliczane są określone kody kreskowe, odpowiadające określonemu miRNA.
    3. Eksportuj pliki danych na USB lub bezpośrednio na serwer za pośrednictwem łącza internetowego.

6. Przetwarzanie i analiza danych

  1. Kliknij zakładkę "Surowe dane" i wybierz "Importuj pliki RCC". Wybierz folder zawierający pliki RCC (pliki danych surowych) z USB.
  2. Kliknij "Dalej", zaznacz wszystkie pola kontroli jakości i kliknij "Importuj".
  3. Kliknij zakładkę "Nowe badanie". Nazwij i opisz badanie, a następnie zapisz.
  4. W nowym badaniu wybierz zakładkę "Nowy eksperyment" oraz nazwij i opisz nowy eksperyment. Kliknij "Dalej" i wybierz folder RLF z lewego panelu, który zawiera odpowiednie pliki danych pierwotnych, które zostały przesłane. Po wybraniu kliknij "Zachowaj wybrane", a następnie kliknij "Dalej".
  5. W razie potrzeby dodaj adnotacje i kliknij "Dalej".
  6. Wybierz metodę odejmowania tła; można wybrać kontrolę ujemną, odejmowanie pustego pasa ruchu lub odejmowanie zdefiniowane przez użytkownika. Po wybraniu kliknij "Dalej".
    UWAGA: Określ najbardziej odpowiednie podejście do korekcji tła w oparciu o parametry techniczne i kontekst biologiczny badania.
    UWAGA: Zliczanie jest mniej precyzyjne w przypadku celów o niskiej liczebności. Na potrzeby badania, które tutaj opisujemy, dane zostały najpierw przetworzone bez korekty tła w celu zbadania parametrów QC i zbadania zmienności liczby miRNA o różnej obfitości w kontrpróbach technicznych. Dane zostały następnie ponownie przetworzone przy użyciu progu tła wynoszącego 25 zliczeń.
  7. Wybierz normalizację "Top 100", a następnie kliknij "Dalej".
  8. Aby uzyskać dane dotyczące współczynnika, wybierz parametry współczynnika, a następnie kliknij "Dalej".
  9. Kliknij "Zakończone".
  10. Kliknij nazwany eksperyment w lewym okienku, aby wyświetlić menu rozwijane zawierające "Surowe", "Znormalizowane", "Zgrupowane", "Dane proporcji" i "Dane analizy".
  11. Kliknij "Surowe dane" i obserwuj raport kontroli jakości w prawym okienku. Obserwuj flagę obok próbek, które nie przechodzą domyślnych parametrów kontroli jakości. Utwórz nowe "Badanie", które nie zawiera oznaczonych próbek i ponownie przetwarzaj zgodnie z opisem, lub po prostu wyklucz oznaczone próbki kontroli jakości z kroku analizy danych, wybierając opcję "Wyklucz próbki według flagi QC/normalizacji".
    1. Eksportuj "surowe", "znormalizowane" lub "zgrupowane" pliki danych w CVS lub innym kompatybilnym formacie pliku do analizy w innym oprogramowaniu statystycznym lub mikromacierzowym.
  12. Wybierz opcję "Znormalizowane dane" w lewym okienku i wybierz próbki, które mają zostać uwzględnione w analizie w prawym okienku.
  13. Kliknij "Analiza" i wybierz żądany typ analizy (np. "Mapa cieplna", "Wykres skrzypiec", "Wykres pudełkowy", "Wykres punktowy" lub "Wykres histogramu"). Zaznacz żądane pola kryteriów wykluczenia (np. wyklucz próbki lub geny odstające, wyklucz próbki według flag kontroli jakości, wyklucz geny kontrolne i/lub wyklucz sondy normalizacyjne z analizy danych).
  14. W razie potrzeby należy wybrać poszczególne próbki, które mają zostać wyłączone z analizy.
  15. Wybierz poszczególne geny, które mają zostać wykluczone lub włączone do analizy zgodnie z potrzebami.
  16. Wybierz parametry dla wybranej manipulacji statystycznej lub wizualizacji danych i kliknij "Zakończ".

Wyniki

Perturbacje transkrypcyjne w zaburzeniach funkcjonalnych mogą być subtelne i aby wiarygodnie wykryć te niewielkie zmiany w ekspresji, ilościowe oznaczenie ekspresji genów musi być precyzyjne. System analizy platformy ekspresji genów redukuje szum techniczny dzięki wysokiemu stopniowi automatyzacji, a zastosowana w nim unikalna chemia pozwala na uzyskanie wysokoprecyzyjnych danych o ekspresji genów. Powtórzenia techniczne przedstawione na Rysunku 1 wykazują wysoką powtarzalność w ilościowym oznaczaniu ekspresji zarówno endogennych (niebieskie kropki), jak i wirusowych miRNA (pomarańczowe kropki; geny konstytutywne reprezentowane są przez żółte kropki), co jest możliwe dzięki zastosowaniu tej metody. Przy użyciu tej metody można zidentyfikować jako cele zainteresowania w IBS wirusowe (Rysunek 2a) i endogenne (Rysunek 2b) miRNA, które wykazują odchylenie od oczekiwanej ekspresji, zdefiniowanej na podstawie zdrowych uczestników badania. Należy zauważyć, że nie jest jasne, czy wykryte tutaj wirusowe miRNA pochodzą z genów wirusowych zintegrowanych z ludzkim genomem, czy z ładunku wirusowego. Ponieważ analiza obejmuje jedynie dojrzałe miRNA z jednonukleotydową swoistością, hybrydyzacja krzyżowa z podobnymi ludzkimi miRNA endogennymi jest mało prawdopodobna. Niemniej jednak różnice w stacjonarnych poziomach tych cząsteczek są interesujące jako biomarkery. Precyzja tej metody pozwala na wykrycie perturbacji wśród celów o niskiej ekspresji, ponieważ dokładne wykrywanie tych transkrypciów nie jest zagłuszane przez transkrypcje bardziej obfite. Można również wiarygodnie zaobserwować subtelne perturbacje. Rysunki 3 i 4 przedstawiają niektóre z tych perturbacji w krążących miRNA w IBS i podtypach IBS w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych, a Rysunki 5 i 6 (oba zaadaptowane z 3) pokazują dwa najistotniej różnicowo podwyższone miRNA (Rysunek 5: miRNA 342-3p, Rysunek 6: miRNA 150) u uczestników z IBS. Rysunek 6 stanowi przykład graficznego przedstawienia wyników wygenerowanych przez powiązane oprogramowanie.

Wykres rozrzutu, analiza ekspresji miRNA, wartości Log2, porównanie ludzkich wirusowych miRNA, regresja liniowa.
Rysunek 1: Znormalizowane liczby z dwóch powtórzeń technicznych. Powtórzenia techniczne wykonane na dwóch oddzielnych kartridżach wykazują wysoką korelację liniową (r2 = 0,90, y = 1,03x - 0,4) w zakresie znormalizowanych liczebności miRNA (znormalizowanych do 10 najsilniej eksponowanych miRNA) (log2 liczebności na osiach x i y). Wykres rozrzutu zawiera dane dla endogennych ludzkich miRNA w kolorze niebieskim (654 miRNA), endogennych wirusowych miRNA w kolorze pomarańczowym (80 miRNA) oraz genów housekeepingowych w kolorze żółtym (8 genów). Endogenne wirusowe miRNA były dostępne w wcześniejszych wersjach testu (tutaj zastosowano wersję 1,4), lecz nie są już zawarte w standardowym teście, choć są dostępne jako dodatki niestandardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres rozrzutu przedstawiający porównanie korelacji między wirusowymi a ludzkimi cząsteczkami miRNA; dane dla IBS-C w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych.
Rysunek 2: Znormalizowane liczby wirusowych i endogennych ludzkich miRNA w zespole jelita drażliwego z zaparciami (IBS-c)C) kontra Zdrowe grupy kontrolne. Zaburzenia w (a) wirusowy (pomarańczowy) i (b) endogenne ludzkie miRNA (kolor niebieski) są widoczne w tym przykładzie, gdzie liczbę miRNA (po transformacji log2) u uczestników z IBS-C (oś y) zestawiono w analizie regresji z liczbą miRNA (po transformacji log2) u zdrowych osób z grupy kontrolnej (oś x). Większość miRNA wykazuje bardzo podobny poziom ekspresji w obu populacjach, jednak niektóre znacząco odbiegają od tej korelacji. Odchylenia te są widoczne zarówno w przypadku rzadkich, jak i obficie eksponowanych celów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres wyników LDA dla mikroRNA; porównanie hsamiR w grupie HC i IBS, analiza danych, skala logarytmiczna.
Rycina 3: miRNA wykazują istotną i jednolitą różnicową ekspresję w IBS w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych. Różnicowo wyrażone miRNA w IBS zostają ujawnione przy użyciu metody wielkości efektu analizy dyskryminacyjnej liniowej, która łączy testy istotności statystycznej z weryfikacją spójności w obrębie kategorii. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy porównujący wyniki LDA dla IBS-D i IBS-C z analizą ekspresji miR-663b, miR-342-3p i genów.
Rysunek 4: miRNA wykazują istotną i jednorodną różnicową ekspresję w podtypach IBS w porównaniu z grupami kontrolnymi osób zdrowych. Wykazano różnicową ekspresję miRNA w podtypach IBS (-D: biegunka, -C: zaparcia) w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych, stosując metodę wielkości efektu analizy dyskryminacyjnej (linear discriminant analysis effect size), która łączy testy istotności statystycznej z weryfikacją spójności wewnątrz kategorii. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres pudełkowy przedstawiający liczebność miR-342-3p; podtypy IBS w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych; uwzględnia wartości odstające i ekstrema.
Rysunek 5: Różnicowa ekspresja miRNA-342-3p. Przewlekły ból brzucha o nieznanej etiologii jest głównym objawem zespołu jelita drażliwego (IBS). Wykres pudełkowy pokazuje, że miR-342-3p (znormalizowane liczności na osi y), miRNA powiązane z przewlekłym bólem pęcherza o nieznanej etiologii, występowało w krążeniu w wyższych licznościach we wszystkich podtypach IBS w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych. Słupki reprezentują zakres wartości bez elementów odstających, pudełka zakres międzykwartylowy, a niebieski kwadrat medianę liczności. Zmodyfikowano z 3. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wykres skrzypcowy porównujący ekspresję miR-150; zdrowi vs IBS; log2 liczby odczytów; analiza wizualizacji danych.
Rysunek 6: Różnicowa ekspresja miRNA-150. Wykres skrzypcowy wykazujący, że u uczestników z IBS poziom krążącego miR-150 był znacząco wyższy w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych (na osi y wartości log2 z liczb zapisu). Krzywe wskazują częstotliwość występowania liczby zapisów w danej kategorii, a pionowe paski reprezentują 1st oraz 3B&R kwartyle, a czerwony kwadrat oznacza medianę liczby. Zmodyfikowano z 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Kluczowe kroki w ramach protokołu

W szczególności w przypadku testu miRNA bardzo ważne jest, aby nie używać nieoczyszczonych lizatów (mogą one być stosowane w testach mRNA i białek), ponieważ odczynniki nie zostały zoptymalizowane do stosowania z lizatami, a reakcje przygotowania próbki mogą zostać zahamowane. Ponadto zanieczyszczenia przenoszone z etapów lizy i oczyszczania RNA (np . związki guanidyny, etanol i fenole) mogą hamować reakcje ligacji i oczyszczania próbki. Dobrej jakości RNA ma zatem kluczowe znaczenie dla czułości i dokładności testu miRNA.

Używanie termocyklera z podgrzewaną pokrywą ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia właściwej kontroli temperatury w celu optymalizacji wydajności wszystkich etapów reakcji. Podczas kroku 3.5.1 ważne jest, aby nie wyjmować pasków z termocyklera w celu utrzymania temperatury podczas dodawania ligazy. Usunięcie pasków w celu dodania ligazy zakłóci reakcję. Podczas wykonywania etapów hybrydyzacji bardzo ważne jest, aby unikać energicznego potrząsania, pipetowania lub trzepania podczas mieszania odczynników w probówkach, ponieważ może to spowodować ścinanie sond reporterowych. Aby zapewnić optymalną wydajność i spójność, ważne jest, aby dokładnie wymieszać odczynniki w probówkach poprzez delikatne trzepanie. Po wymieszaniu należy zawsze odwirować reakcje i używać nowej końcówki pipety za każdym razem, gdy dozowany jest odczynnik, aby zapewnić dokładne pipetowanie i uniknąć przypadkowego zanieczyszczenia krzyżowego.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów

Zestawy kodów można dostosować tak, aby zawierały tylko interesujące Cię obiekty. W ten sposób można zrównoważyć koszty, aby umożliwić testowanie dużych zestawów próbek podczas dalszego badania lub walidacji biosygnatury. Niestandardowe sondy mogą być zaprojektowane dla genów lub celów, które nie są dostępne w menu a la carte . Czułością dla mniej licznych celów lub RNA o niskim stężeniu można manipulować, pozwalając na dłuższy czas hybrydyzacji i/lub stosując cyfrowe zliczanie o wyższej rozdzielczości.

W naszym badaniu wykorzystaliśmy predefiniowany panel 800 docelowych miRNA z całkowitym RNA z krwi pełnej; jednak testy można dostosować tak, aby zawierały mniej miRNA, jeśli potrzebne jest bardziej ukierunkowane podejście. W ciągu jednego dnia można przygotować łącznie 24 próbki, rozmieszczone w dwóch zestawach po 12 sztuk, ponieważ dwa wkłady można wygodnie przejść przez przetwarzanie po hybrydyzacji na zrobotyzowanej stacji przygotowawczej i zobrazować na analizatorze cyfrowym następnego dnia. Rozłożone w czasie przetwarzanie próbek w partiach po 12 sztuk jest ważne dla standaryzacji czasu hybrydyzacji. Kartridże, które zostały zobrazowane, mogą być zapisane i przechowywane w temperaturze 4 oC w celu ponownego zeskanowania, jeśli analizy danych sugerują, że skanowanie w wyższej rozdzielczości może poprawić wykrywanie rzadszych miRNA. Wykrywanie rzadszych cząsteczek można również poprawić poprzez dłuższą hybrydyzację próbek; jednak przedłużona hybrydyzacja może powodować przesycenie i może poprawić wyniki tylko wtedy, gdy początkowe stężenia RNA są niskie (jak w przypadku RNA pochodzącego z pęcherzyków zewnątrzkomórkowych). Czułość i precyzja platformy pozwalają na wiarygodne zliczanie miRNA o stosunkowo niskiej liczebności.

Ograniczenia techniki

Opisana platforma do oznaczania ekspresji genów może pomieścić tylko do 800 celów na macierz. W związku z tym nie nadaje się do badań całego transkryptomu miRNA/całego transkryptomu. Za pomocą platformy można wykryć tylko znane, opisane i określone cele, więc nie nadaje się ona do odkrywania nowych gatunków molekularnych. Inne metody, takie jak RNASeq lub inne tradycyjne metody mikromacierzy, są bardziej odpowiednie do badań eksploracyjnych całego transkryptomu.

Znaczenie techniki w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod

IBS charakteryzuje się kombinacją objawów, w tym głównie bólem brzucha; nadwrażliwość trzewna; oraz zmiany w rytmie wypróżnień, takie jak częste biegunki, zaparcia lub kombinacja obutych czynników 9,10. Objawy IBS nie mają znanej przyczyny organicznej, a pacjenci nie wykazują klinicznie istotnego stanu zapalnego, histopatologicznych zaburzeń tkanek przewodu pokarmowego ani markerów ogólnoustrojowych9-12. Badania sugerują, że dysregulacja biologiczna w IBS jest subtelna, subkliniczna i niejednorodna, a wspólne tematy pojawiają się wokół stanu zapalnego i funkcji immunologicznej10. W związku z tym musieliśmy kontrolować zmienność wprowadzoną przez eksperymentatora i użyć platformy, która byłaby w stanie niezawodnie wykrywać subtelne zaburzenia w ekspresji genów. Unikalne atrybuty testu i systemu standaryzują przetwarzanie próbek i ograniczają obsługę eksperymentatorów poprzez automatyzację, zmniejszając rozbieżności techniczne w celu uzyskania wysoce powtarzalnych danych. Funkcje te pozwalają na prowadzenie ukierunkowanych badań i generowanie wysoce precyzyjnych i powtarzalnych danych. Pozwala to na wykrywanie subtelnych perturbacji i perturbacji wśród celów o niskiej ekspresji, które mogą zostać przeoczone lub zalane sygnałami bardziej obfitych celów przy użyciu metod opartych na intensywności lub wzmocnieniu. Mikromacierze oparte na PCR i metody RNAseq są realną alternatywą dla korzystania z opisanej platformy i mogą być atrakcyjne jako alternatywa, gdy wymagana jest wyższa przepustowość lub gdy celem jest scharakteryzowanie całego transkryptomu lub poszukiwanie nowych cząsteczek. Jednak alternatywy mogą nie działać tak dobrze w dokładnym i czułym wykrywaniu i ilościowym określaniu rzadkich celów i subtelnych zakłóceń.

Przyszłe zastosowania lub wskazówki po opanowaniu tej techniki

Krążąca ekspresja miRNA u uczestników IBS wykazała szereg perturbacji, które okazały się zarówno znaczące, jak i spójne w ramach kategorii. Zidentyfikowane miRNA były związane z odpowiednimi szlakami i stanami patologicznymi, w tym z funkcjonalnym stanem bólu (miR-342-3p: przewlekły ból pęcherza)8 i stanem zapalnym (miR-150)13. Przykładowe badanie opierało się na kohorcie eksploracyjnej wykorzystanej do zdefiniowania celów i systemów zainteresowania. Następnie skonstruowano bardziej ukierunkowaną, mniejszą macierz miRNA, obniżając koszt na próbkę i umożliwiając analizę znacznie większych kohort w opłacalny sposób w celu walidacji i udoskonalenia sygnatur i biomarkerów. System testowania platformy ekspresji genów zapewnia równowagę między tradycyjnym eksploracyjnym charakterem mikromacierzy a bardziej ukierunkowanym, opartym na hipotezach gromadzeniem danych w celu udoskonalenia i przetestowania sygnatur molekularnych i biomarkerów14-16. Metoda zostanie wykorzystana do zbadania zaburzeń molekularnych i białkowych w modelach in vivo i in vitro , w których opisane docelowe miRNA są eksperymentalnie nadmiernie eksprymowane lub hamowane. Nowe testy pozwalają na jednoczesną kwantyfikację mRNA i białek bezpośrednio z lizatów komórkowych i tkankowych. Ponadto, optymalizując oczyszczanie określonych frakcji krwi obwodowej i wydalin (np. moczu) oraz dostosowując i optymalizując niektóre parametry testu, badane będą profile molekularne i sygnatury frakcji o niskich stężeniach cząsteczkowych (np . frakcji egzosomalnych).

Oświadczenia

W.A.H., S.K.A., N.H.F. i R.M.P. posiadają patent amerykański (nr. PCT/US14/38638) dla krążącej sygnatury miRNA IBS pochodzącej z badań opisanych w niniejszym dokumencie.

Podziękowania

Autorzy dziękują za finansowanie przez Departament Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych, Narodowe Instytuty Zdrowia, Narodowy Instytut Badań Pielęgniarskich oraz Wydział Badań Wewnętrznych dla Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; Intramural Research Training Awards dla Nicolaasa H. Fourie, Ralpha M. Peace'a, Sarah K. Abey i Leeanne B. Sherwin; oraz specjalne wsparcie od Burroughs Wellcome Fund dla Howarda Hughesa-NIH Research Scholara Ralpha M. Peace'a.

Opinie wyrażone w niniejszym dokumencie oraz interpretacja i raportowanie tych danych są obowiązkiem autora (autorów) i nie powinny być postrzegane jako oficjalne zalecenie, interpretacja lub polityka National Institutes of Health lub rządu Stanów Zjednoczonych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stacja przygotowawcza nCounterNanostringN/ANiezbędny
analizator cyfrowy nCounterNanostringN/ANiezbędny
spektrofotometrNanoDropND-1000Może używać odpowiedniego odpowiednika
Wirówka DowolnaNie dotyczyMoże używać odpowiedniego odpowiednika
MiniMicroWirówkaDowolnaNie dotyczyMoże używać odpowiednie
równoważne pipety (1,000, 100, 20, 10 µ l)DowolnaNie dotyczyMoże użyć odpowiedniego odpowiednika
QiacubeQiagen9001292Może użyć odpowiedniego równoważnego
zestawu miRNA krwi PAXgeneQiagen763134Może użyć odpowiedniego odpowiednika
probówek do krwi PAXgeneVWR77776-026Może użyć odpowiedniego równoważnego
zestawu do oznaczania miRNA dla ludzi nCounterNanostring150625Essential
nCounter Master KitNanostring100050Niezbędny
nSolverNanostringN/ANiezbędny

Bibliografia

  1. Aerssens, J., et al. Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).
  2. Akbar, A., et al. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, 923-929 (2008).
  3. Fourie, N. H., et al. Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome. Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).
  4. Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome. Gut. 59, 775-784 (2010).
  5. Zhou, Q., Verne, G. N. miRNA-based therapies for the Irritable Bowel Syndrome. Expert Opin Biol Ther. 11, 991-995 (2011).
  6. Orlova, I. A., et al. MicroRNA modulation in complex regional pain syndrome. J Transl Med. 9, 1-11 (2011).
  7. Park, C. -K., et al. Extracellular MicroRNAs Activate Nociceptor Neurons to Elicit Pain via TLR7 and TRPA1. Neuron. 82, 47-54 (2014).
  8. Gheinani, A. H., Burkhard, F. C., Monastyrskaya, K. Deciphering microRNA code in pain and inflammation: lessons from bladder pain syndrome. Cell Mol Life Sci. 70, 3773-3789 (2013).
  9. Drossman, D. A., et al. Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders. , 3rd edn, Degnon Associates, Inc. (2006).
  10. Chey, W. D., Kurlander, J., Eswaran, S. Irritable bowel syndrome: A clinical review. JAMA. 313, 949-958 (2015).
  11. Del Valle-Pinero, A. Y., Sherwin, L. B., Anderson, E. M., Caudle, R. M., Henderson, W. A. Altered vasoactive intestinal peptides expression in irritable bowel syndrome patients and rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol. 21, 155-163 (2015).
  12. Henderson, W. A., et al. Inverse relationship of interleukin-6 and mast cells in children with inflammatory and non-inflammatory abdominal pain phenotypes. World J Gastrointest Pathophysiol. 3, 102-108 (2012).
  13. Pekow, J. R., Kwon, J. H. MicroRNAs in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 18, 187-193 (2012).
  14. Veldman-Jones, M. H., et al. Flexible Molecular Subtyping of Clinical DLBCL Samples Using the NanoString nCounter System. Clin Cancer Res. 21, 2367-2378 (2015).
  15. Lee, J., et al. Nanostring-Based Multigene Assay to Predict Recurrence for Gastric Cancer Patients after Surgery. PLoS ONE. 9, e90133(2014).
  16. Lohavanichbutr, P., et al. A 13-gene signature prognostic of HPV-negative OSCC: discovery and external validation. Clin Cancer Res. 19, 1197-1203 (2013).
  17. nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , NanoString Technologies, Inc. Available from: http://www.nanostring.com/media/pdf/MAN_nCounter_miRNA_Expression_Assay.pdf (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Multipleksowa ekspresja gen woznaczanie ilo ciowe mikroRNAzliczanie cyfroweekstrakcja RNAtest hybrydyzacyjnyautomatyczne oczyszczaniedetekcja biomarker w

Powiązane artykuły