Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie receptorów ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu de novo poprzez transdukcję retrowirusową centralnego hemiłańcucha

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54697

⸱

25 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy nowatorską metodę generowania specyficznych dla antygenu receptorów limfocytów T (TCR) poprzez parowanie TCRα lub TCRβ istniejącego TCR, posiadającego swoistość antygenową będącą przedmiotem zainteresowania, z komplementarnym półłańcuchem repertuaru obwodowych receptorów limfocytów T. Generowane de novo TCR zachowują swoistość antygenową z różnym powinowactwem.

Streszczenie

Receptory limfocytów T (TCR) są wykorzystywane klinicznie do kierowania specyficzności limfocytów T na nowotwory jako obiecująca metoda immunoterapii. Dlatego klonowanie TCR specyficznych dla różnych antygenów związanych z nowotworem było celem wielu badań. Aby wywołać skuteczną odpowiedź limfocytów T, TCR musi rozpoznać docelowy antygen z optymalnym powinowactwem. Jednak klonowanie takich TCR było wyzwaniem, a wiele dostępnych TCR ma nieoptymalne powinowactwo do pokrewnego antygenu. W tym protokole opisujemy metodę klonowania de novo TCR specyficznych dla antygenu o wysokim powinowactwie przy użyciu istniejących TCR poprzez wykorzystanie koncentracji na półłańcuchu. Wiadomo, że w przypadku niektórych TCR każda półłańcuch TCRα lub TCRβ nie przyczynia się w równym stopniu do rozpoznawania antygenu, a półłańcuch dominujący jest określany jako półłańcuch centryczny. Wykazaliśmy, że łącząc centryczny półłańcuch z przeciwłańcuchami różniącymi się od oryginalnego przeciw-łańcucha, jesteśmy w stanie utrzymać swoistość antygenu, jednocześnie modulując jego siłę oddziaływania dla pokrewnego antygenu. W ten sposób potencjał terapeutyczny danego TCR można poprawić poprzez optymalizację parowania między półłańcuchami centrycznymi i przeciwnymi.

Wprowadzenie

(TCR) są heterodimerycznymi adaptacyjnymi receptorami immunologicznymi wyrażanymi przez limfocyty T, składającymi się z łańcucha TCRα i TCRβ. Są one generowane w wyniku somatycznego przegrupowania segmentów genu V(D)J, co daje bardzo zróżnicowany repertuar zdolny do rozpoznawania praktycznie nieograniczonych konfiguracji kompleksów HLA/peptydowych. Klinicznie limfocyty T zmodyfikowane do ekspresji klonotypowych TCR specyficznych dla antygenów związanych z nowotworem wykazały skuteczność w różnych nowotworach1. Jednak wiele TCR sklonowanych w tym celu nie ma wystarczającego powinowactwa do antygenu będącego przedmiotem zainteresowania, co ogranicza ich zastosowanie terapeutyczne.

Tutaj opisujemy metodę przezwyciężenia tego ograniczenia dla istniejących TCR-ów poprzez wykorzystanie skoncentrowania na łańcuchu. Doniesiono, że jeden hemichain TCR może odgrywać bardziej dominującą rolę w rozpoznawaniu docelowego antygenu2, tutaj określanego jako centryczność. Analizy struktury krystalicznej wykazały, że jeden centryczny półłańcuch TCR może odpowiadać za większość śladu na kompleksie MHC/peptyd3,4. Korzystając z tej koncepcji, wykazaliśmy wcześniej, że SIG35α TCRα może łączyć się z różnorodnym repertuarem łańcuchów TCRβ i utrzymywać reaktywność wobec peptydu MART127-35 prezentowanego przez HLA-A25. Podobne wyniki uzyskano w przypadku TAK1 TCR, w którym centryczny hemiłańcuch TCRβ sparował się z różnymi łańcuchami TCRα i utrzymał reaktywność dla peptydu WT1235-243 prezentowanego przez HLA-A246. Zarówno MART1, jak i WT1 są antygenami związanymi z nowotworem. Skoncentrowanie na łańcuchu zastosowano również do badania rozpoznawania antygenu niezmiennych TCR niezmiennych naturalnych zabójców (iNKT) ograniczonych przez CD1d, poprzez sparowanie niezmiennego łańcucha TCRα Vα24-Jα18 (Vα24i) ludzkich TCR iNKT z różnymi łańcuchami Vβ11 TCRβ7.

We wszystkich przypadkach udało nam się wygenerować de novo repertuar TCR, transdukując centralny hemichain TCR do limfocytów T krwi obwodowej, gdzie wprowadzony hemichain sparował się z endogennymi przeciwłańcuchami TCRα lub TCRβ. W istocie, centralny półłańcuch służy jako przynęta, którą można wykorzystać do identyfikacji odpowiednich przeciw-łańcuchów, które po sparowaniu ze sobą tworzą TCR, które utrzymują interesującą specyficzność antygenową, ale różnią się powinowactwem. Z tych nowych repertuarów byliśmy w stanie wyizolować klonotypowe TCR o zwiększonej sile interakcji z docelowym antygenem w porównaniu z wcześniej istniejącymi TCR. Dlatego uważamy, że ta metoda przyspieszy proces identyfikacji optymalnych TCR do zastosowań klinicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie konstruktu retrowirusowego kodującego hemiłańcuch zainteresowania TCR

  1. Linearyzuj wektor pMX, aby umożliwić wstawienie genu TCR w kolejnych krokach. Trawić plazmidowe DNA enzymami restrykcyjnymi EcoRI i NotI w temperaturze 37 °C przez 3 godziny (Tabela 1)8.
  2. Przeprowadzić elektroforezę strawionego plazmidu na 1,2% żelu agarozowym. Obciąć pasmem około 4,500 par zasad (bps) i eluować w 30 μl sterylnej wody za pomocą dostępnych na rynku zestawów do ekstrakcji żelu9.
  3. Zaprojektuj startery 5' i 3' dla interesującego genu TCR, które kodują również 15-20 bps nakładających się na miejsce trawienia EcoRI i NotI wektora pMX, odpowiednio8.
  4. Amplifikacja genu TCR za pomocą starterów. Przeprowadzić elektroforezę produktu PCR i eluować pasmo o długości około 1 000 bps, jak opisano w kroku 1.2.
  5. Sklonować gen TCR do strawionego wektora, łącząc każdy fragment liniowy z dostępnym na rynku odczynnikiem do mieszania głównego zespołu plazmidu i inkubując w temperaturze 50 °C przez 1 godz.
    UWAGA: Zapoznaj się z protokołem producenta, aby uzyskać informacje na temat względnych objętości każdego komponentu. Ta metoda montażu opiera się na technice pierwotnie opisanej przez Gibsona i wsp.Rozdział 10.
  6. (Opcjonalnie) Oznacz gen TCR, aby oznaczyć transdukowane komórki skróconą formą receptora ludzkiego czynnika wzrostu nerwów (ΔNGFR, aminokwasy 1-277)11 oddzielone miejscem rozszczepienia furyny, łącznikiem seryna-glicyna i sekwencjami 2A12,13. Zaprojektuj startery kodujące sekwencje kodujące sekwencje nakładające się na końce fragmentów i złóż plazmid zgodnie z opisem w krokach 1.3-1.5.
    UWAGA: Sekwencje te można znaleźć w odnośnikach11-13.
  7. Przekształć chemicznie kompetentną E. coli za pomocą zmontowanego plazmidu zgodnie z protokołem producenta14. Bakterie przekształcone w nasiona na płytkach agarowych (20 mg/ml bulionu lizogenicznego (LB), 15 mg/ml agaru i 1 μg/ml ampicyliny) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 18 godzin.
  8. Wyhodować pojedynczą kolonię bakterii w 50 ml pożywki LB (20 mg/ml LB i 1 μg/ml ampicyliny) przez 16 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 200 rund na minutę.
  9. Oczyść plazmidy za pomocą dostępnych na rynku zestawów midiprep zgodnie z protokołem producenta. Rozcieńczyć plazmid do stężenia około 1 μg/μl.
    UWAGA: Protokół oczyszczania plazmidu opiera się na metodzie ekstrakcji alkalicznej15.

2. Generowanie stabilnej linii komórek pakujących

UWAGA: Zarówno ogniwa 293GPG, jak i PG13 są przylegające. Komórki hodowlane w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnione 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i 50 μg/ml gentamycyny. Hodowla komórek 293GPG z 1 μg/ml tetracykliny przed transfekcją. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 pomiędzy wszystkimi etapami.

  1. Transfekcyjna komórka pakowania 293GPG16 hodowana w kolbie T75 z wektorem kodującym hemiłańcuch otrzymanym w kroku 1.9, przy użyciu dostępnego w handlu odczynnika do transfekcji zgodnie z protokołem producenta17. UWAGA: Transfekcja ogniw 293GPG przy 50-60% zbiegu.
  2. Odessać pożywkę dla komórek 293GPG i dodać 10 ml świeżej pożywki DMEM 1 dzień po transfekcji.
  3. Zbierz przejściowo wyprodukowanego wirusa z transfekowanych komórek 293GPG 2 dni po kroku 2.2, przenosząc pożywkę hodowlaną do strzykawki i przechodząc przez filtr 0,45 μm.
    UWAGA: Wirus może być użyty natychmiast lub przechowywany w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
  4. Hodowla 1 x 105 komórek PG13 w kolbie T25. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Po jednym dniu odessać pożywkę hodowlaną i dodać 1,5 ml wirusa pochodzącego z 293GPG z kroku 2.3 i 1,5 ml pożywki DMEM wraz z 8 μg/ml polibrenu.
  5. Zmieniaj pożywkę zgodnie z opisem w kroku 2.4 raz dziennie przez 4 dni, aby ustalić stabilną linię komórkową pakującą PG13 wytwarzającą retrowirusa kodującego półłańcuch TCR.
  6. Odessać pożywkę i zastąpić świeżą pożywką DMEM dla linii komórkowych PG13 24 godziny po ostatniej infekcji w celu dalszej hodowli.
    UWAGA: Zamrażaj lub subkulturuj komórki, odłączając je 0,05% roztworem trypsyny-EDTA.
  7. Aby wytworzyć wirusa z transdukowanych linii komórkowych PG13, należy wyhodować 2 x 106 komórek w kolbie T75 z 10 ml pożywki DMEM i zebrać wirusa zgodnie z opisem w kroku 2.3 trzy dni po wysianiu komórek.
    UWAGA: Wirusa najlepiej użyć od razu, ale może być przechowywany w temperaturze -80 °C przez okres do dwóch miesięcy.

3. Aktywacja i transdukcja ludzkich limfocytów T

UWAGA: Próbki ludzkie są pobierane i wykorzystywane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalną komisję etyczną. Hodowla pierwotnych komórek ludzkich w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionej 10% surowicą ludzką zamiast FCS i 50 μg/ml gentamycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 pomiędzy wszystkimi etapami.

  1. Wyizolować ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) przez separację gradientu gęstości zgodnie z protokołem producenta18.
  2. Aktywuj limfocyty T w celu indukowania proliferacji wymaganej do infekcji retrowirusowej. Hodowla 2 x 107 świeżych lub rozmrożonych PBMC na basenik na płytce 6-dołkowej, w 5 ml pożywki RPMI ze 100 j.m./ml rekombinowanej ludzkiej interleukiny-2 (rhIL-2) i 50 ng/ml przeciwciała monoklonalnego anty-CD3 (klon OKT3).
  3. Trzy dni po stymulacji zebrać limfocyty T przez pipetowanie i odwirować przy 350 x g przez 4 min. Odrzucić supernatant i wysiać 0,5-1 x 106 limfocytów T na basenik na 24-dołkową płytkę zawieszoną w 1 ml wirusa PG13 z kroku 2.7 i 1 ml pożywki RPMI uzupełnionej 200 j.m./ml rhIL-2. Płytka wirówkowa o ciśnieniu 1.000 x g i temperaturze 32 °C przez 1 godzinę.
  4. Po 24 godzinach zebrać limfocyty T przez pipetowanie i odwirować przy 350 x g przez 4 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml wirusa PG13 z kroku 2.7 i 1 ml pożywki RPMI uzupełnionej 200 j.m./ml rhIL-2. Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie 6 infekcji.
    UWAGA: Liczba zakażeń powinna być zoptymalizowana w zależności od miana wirusa wytwarzanego przez pakowanie linii komórkowej. W razie potrzeby należy przechodzić limfocyty T, usuwając 20-30% komórek każdego dnia, aby zapobiec przerostowi.
  5. Po 24 godzinach od ostatniego zakażenia pobrać limfocyty T metodą pipetowania i odwirować w sile 350 x g przez 4 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI ze 100 j.m./ml rhIL-2 w celu dalszej hodowli.
  6. 2-3 dni po kroku 3.5 wybarwić limfocyty T multimerem HLA w temperaturze 4 °C przez 30 min, a następnie przeciwciałami monoklonalnymi anty-ludzkimi CD3 i koreceptorami (mAb) w temperaturze 4 °C przez 15 min. Analizować za pomocą cytometrii przepływowej. Użyć nieistotnego multimeru i/lub nietransdukowanych komórek jako kontroli ujemnych (ryc. 1-3)19.
  7. Jeśli wprowadzony centralny półłańcuch jest łańcuchem TCRα, przeanalizuj użycie Vβ komórek dodatnich multimeru de novo za pomocą dostępnego na rynku panelu przeciwciał specyficznych dla Vβ za pomocą cytometrii przepływowej20.

4. Klonowanie De Novo TCR Kontr-półłańcuchy

  1. Posortuj populację dodatnią multimerem de novo w kroku 3.6 za pomocą sortowania komórek wspomaganego przepływem.
  2. Wyizolować RNA z posortowanych limfocytów T przy użyciu metody ekstrakcji kwasowym tiocyjanianem guanidyny, fenolem i chloroformem21,22,
    UWAGA: RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C, ale powinno być używane do generowania cDNA tak szybko, jak to możliwe.
  3. Zsyntetyzuj bibliotekę cDNA z wyekstrahowanego RNA przy użyciu dostępnych na rynku zestawów do PCR z odwrotną transkryptazą zgodnie z protokołem producenta23,24.
  4. W przypadku klonowania przeciwłańcuchów TCRβ należy zaprojektować gen Vβ i startery specyficzne dla regionu stałego TCRβ, jak określono w kroku 3.7, i sklonować pełnej długości geny TCRβ, jak opisano w krokach 1.3-1.9. Zobacz krok 4.5, jeśli przeciw-łańcuch to TCRα, w przeciwnym razie przejdź do kroku 5.1.
  5. Dostępne na rynku przeciwciała specyficzne dla Vα są ograniczone, dlatego nie można określić użycia genu Vα za pomocą cytometrii przepływowej. Klonuj przeciwłańcuchy TCRα poprzez szybką amplifikację końców cDNA (RACE)25, używając dostępnych na rynku zestawów 5' RACE6.
    1. Zsyntetyzuj cDNA zgodne z 5' RACE z RNA wyekstrahowanego w kroku 4.2 zgodnie z protokołem producenta.
    2. Wykonaj 1. rundę PCR zgodnie z opisem w Tabeli 2.
    3. Przeprowadzić elektroforezę produktu PCR i eluować pasmo o długości około 1 100 bps, jak opisano w kroku 1.2.
    4. Przeprowadzić drugą rundę PCR zgodnie z opisem w Tabeli 3, używając produktu 1 rundy PCR jako szablonu.
      UWAGA: Sekwencje starterów pokazane w Tabeli 3 zostały zaprojektowane do klonowania do wektora pMX trawionego przez EcoRI i NotI.
    5. Przeprowadzić elektroforezę produktu PCR i eluować pasmo około 1,000 bps, jak opisano w kroku 1.2.
    6. Sklonuj geny TCRα do strawionego wektora pMX EcoRI i NotI i oczyść plazmidy zgodnie z opisem w krokach 1.5-1.9.

5. Rekonstrukcja nowych klonów TCR specyficznych dla antygenu

UWAGA: Hodowla komórek Jurkat 76 i kolejnych linii komórkowych w pożywce RPMI uzupełniona 10% FCS i 50 μg/ml gentamycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 pomiędzy wszystkimi etapami.

  1. Transdukuj komórki Jurkat 7626 (lub równoważną linię ludzkich komórek T TCR -/-) za pomocą centrycznego półłańcucha TCR przy użyciu wirusa 293GPG wyprodukowanego w kroku 2.3. W przypadku Jurkat 76 wysiewać 5 x 104 komórek na basenik na płytce 24-dołkowej z 1 ml wirusa i 1 ml pożywki RPMI. Płytka wirówkowa o ciśnieniu 1.000 x g i temperaturze 32 °C przez 1 godzinę.
  2. 24 godziny po zakażeniu zebrać transdukowane hemichain komórki Jurkat 76 za pomocą pipetowania i odwirowywać przy 350 x g przez 4 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w świeżej pożywce RPMI do dalszej hodowli.
  3. Oczyść transdukowane komórki, jeśli hemichain jest znakowany molekularnie 2-3 dni po kroku 5.2, poprzez barwienie mAb anty-NGFR sprzężonym z fluoroforem, a następnie sortowanie komórek wspomagane przepływem lub wspomagane magnetycznie (opcjonalnie)27.
  4. Postępując zgodnie z krokami od 2.1 do 2.3, wyprodukuj wirusa 293GPG kodującego przeciwłańcuch TCR sklonowany z kroków 4.4 lub 4.5.
  5. Aby w pełni odtworzyć TCR, należy wydedukować linię komórek T stabilnie wyrażającą centryczny hemiłańcuch TCR wygenerowany w krokach 5.1-5.3 za pomocą wirusa z kroku 5.4. Wykonaj transdukcję zgodnie z opisem w krokach 5.1-5.2.
  6. Oczyść transfektanty CD3+ za pomocą sortowania komórek wspomaganego magnetycznie anty-CD3 zgodnie z protokołem producenta, 2-3 dni po kroku 5.527.
  7. Aby potwierdzić swoistość antygenu, wybarwić transfektanty wyrażające klonotypowe TCR składające się z centrycznego półłańcucha TCR w połączeniu z różnymi przeciwłańcuchami, z przeciwciałami anty-CD3 i / lub koreceptorami oraz multimerem HLA, 3-5 dni po oczyszczeniu CD3. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 4-5)19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Bez wcześniejszej wiedzy o tym, który półłańcuch jest łańcuchem centralnym, łańcuchy TCRα i TCRβ należy sklonować i przetransdukować oddzielnie do limfocytów T krwi obwodowej, co zostało wykonane w przypadku reaktywnego na HLA-A24/WT1 TCR TAK1 (Rycina 1). Transdukcja TAK1β doprowadziła do wyraźnie wyższej częstotliwości występowania limfocytów T specyficznych dla antygenu. I odwrotnie, transdukcja niecentrycznego półłańcucha nie spowodowałaby de novo limfocyty T ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pierwszym warunkiem skutecznego zastosowania tej metody jest osiągnięcie wystarczającej wydajności transdukcji pierwotnych limfocytów T z hemiłańcuchem będącym przedmiotem zainteresowania. Z naszego doświadczenia wynika, że połączenie PG13 jako linii komórkowej pakowania i pMX jako wektora retrowirusowego skutkuje stabilną i wydajną ekspresją wprowadzonego genu w ludzkich pierwotnych limfocytach T. Komórki pakujące PG13 można klonować pojedyncze komórki w celu wybrania komórek pakowania o wysokim mianie w celu poprawy wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

University Health Network złożyła wniosek patentowy związany z tą metodologią, w którym N.H., M.N. i T.O. są wymienieni jako wynalazcy. Pozostali autorzy nie mają finansowych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant NIH R01 CA148673 (NH); Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); Dotacja na katalizator BioCanRX (NH); Fundacja Księżniczki Małgorzaty na rzecz walki z rakiem (MOB, NH); Stypendium dla absolwentów Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (TG); Stypendium podyplomowe Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (TG); Prowincja Ontario (TG, MA); oraz Guglietti Fellowship Award (TO). Monomery HLA i CD1d zostały uprzejmie dostarczone przez zakład rdzeniowy NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsin-EDTABisent Bioproducts325-043-CL
Komórki 293GPGGenerowane przez Ory et al. (ref 8)
AgarBisent Bioproducts800-010-CG
AgarozaBisent Bioproducts800-015-CG
Sól sodowa ampicylinyBisent Bioproducts400-110-IG
ChloroformBioShopCCL402
Deoksynukleotyd (dNTP) Mieszanina roztworówNew England BiolabsN0447L
DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronianLife Technologies11995065
EcoRINew England BiolabsR0101S
wirowąBS353
Surowica bydlęca płoduLife Technologies12483020
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-02
FiltrCorning4312200,45 mm porowa membrana SFCA
Anty-ludzki CD271 (NGFR) mAbBiolegend345104klon ME20.4
Sprzężony z FITC anty-ludzki mAb CD3Biolegend300440klon UCHT1
GentamycynaLife Technologies15750078
Gibson Assembly Master MixNew England BiolabsE2611Lużywany do wieloczęściowego składania DNA
Pentamer HLA-A2Proimmunezależy od peptydu antygenowegoMultimer HLA-A2 / MART1 został zakupiony od Proimmune
Monomery HLA/CD1dNIH Tetramer Core Facilitymultimeryzować monomery zgodnie z protokołem dostarczonym przez OŚRODEK rdzeniowy NIH tetramerów
Ludzka surowica ABValley BiomedicalHP1022
ludzkie mikrogranulki CD3Miltenyi Biotec130-050-101
IOTest Beta Mark TCR V beta Repertuar KitBeckman CoulterIM3497
Jurkat 76 komórekWygenerowane przez Heemskerk et al. (ref 10)
LB BulionBisent Bioproducts800-060-LG
LS MACS kolumnaMiltenyi Biotec130-042-401
NEB 5-alpha Kompetentny E. coliNew England BiolabsC2987I
NEBuffer 3.1New England BiolabsB7203Sużywany do trawienia EcoRI i NotI
NotI NewEngland BiolabsR0189S
NucleoBond Xtra MidiMacherey-Nagel740410używany do oczyszczania plazmidu
Anty-ludzki mAb CD8 sprzężony z PC5Beckman CoulterB21205klon B9.11
Komórki PG13ATCCCRL-10686
Pakiet buforowy Phusion HFNew England BiolabsB0518S
Phusion  Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BiolabsM0530L
pMX wektor retrowirusowyCell BiolabsRTV-010
polibrenSigma-AldrichH-9268
Proleukina (rekombinowana ludzka interleukina-2)Novartisby Rx Tylkorównoważny produkt można kupić w Sigma-Aldrich
Oczyszczone przeciwciało anty-ludzkie CD3Biolegend317301klon OKT3, używany do stymulacji limfocytów T
RPMI 1640Life Technologies11875119
SA-PELife TechnologiesS866używany do multimeryzacji monomerów z rdzenia tetramerowego NIH
SMARTer RACE 5'/3'  ZestawClontech634858
Sterylna wodaBisent Bioproducts809-115-LL
SuperScript III System syntezy pierwszej niciInvitrogen18080051do syntezy cDNA
StrzykawkaBD30160410 ml, końcówka ślizgowa
Chlorowodorek tetracyklinySigma-AldrichT7660
TransIT-293Mirus BioMIR 2700używany do transfekcji komórek 293GPG
TRIzol ReagentLife Technologies15596026
EZ-10 Zestaw do ekstrakcji żelu DNA z kolumną

Bibliografia

  1. Maus, M. V., et al. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).
  2. Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. J.Exp.Med. , 195, 991-1001 (2002).
  3. Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).
  4. Shimizu, A., et al. Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection. Sci. Rep. 3, 3097(2013).
  5. Nakatsugawa, M., et al. Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR. J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).
  6. Ochi, T., et al. Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy. Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).
  7. Chamoto, K., et al. CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors. J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).
  8. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235(2015).
  9. Beshiri, M. L., et al. Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets. J. Vis. Exp. (41), e2101(2010).
  10. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  11. Johnson, D., et al. Expression and structure of the human NGF receptor. Cell. 47 (4), 545-554 (1986).
  12. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6, e18556(2011).
  13. Yang, S., et al. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition. Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).
  14. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253(2007).
  15. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  16. Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).
  17. Imataki, O., et al. IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells. J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).
  18. Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673(2011).
  19. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848(2011).
  20. Butler, M. O., et al. Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells. Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34(2011).
  21. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  22. Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis. J. Vis. Exp. (30), e1470(2009).
  23. Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).
  24. Hirano, N., et al. Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity. Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).
  25. Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. 5' end cDNA amplification using classic RACE. Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).
  26. Heemskerk, M. H., et al. Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region. Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).
  27. Yan, H., et al. Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).
  28. Padovan, E., et al. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. 262 (5132), 422-424 (1993).
  29. Johnson, L. A., et al. transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes. J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).
  30. Chinnasamy, N., et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Receptor limfocytów Tcentralność półłańcuchaswoistość antygenowaklonowanie TCRcytometria przepływowakomórki Jurkatlimfocyty T z krwi obwodowejmultimer HLAprodukcja wirusa
Generowanie receptorów ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu de novo poprzez transdukcję retrowirusową centralnego hemiłańcucha
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.