Method Article

LED Thermo Flow — połączenie optogenetyki z cytometrią przepływową

DOI:

10.3791/54707

⸱

December 30th, 2016

 ,  ,  , 
1Max-Planck Institute for Immunobiology und Epigenetics, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine (SGBM), University of Freiburg, 3Centre for Biological Signaling Studies, BIOSS, University of Freiburg, 4Albert-Ludwigs-Universität, 5Institute for Biology III (Mol. Immunology), Albert-Ludwigs-Universität

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optycznie kontrolowane substancje są potężnymi narzędziami do badania szlaków sygnałowych. Aby poszerzyć spektrum możliwych eksperymentów, opracowaliśmy urządzenie do badania substancji kontrolowanych optycznie w czasie rzeczywistym za pomocą cytometrii przepływowej: LED Thermo Flow.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narzędzia optogenetyczne pozwalają na izolowane, funkcjonalne badania prawie każdej cząsteczki sygnałowej w ramach złożonych szlaków sygnałowych. Główną przeszkodą jest kontrolowane dostarczanie światła do próbki komórki, stąd najpopularniejszymi narzędziami do badań optogenetycznych są analizy komórkowe oparte na mikroskopii oraz eksperymenty in vitro. Cytometr przepływowy ma wiele zalet w porównaniu z mikroskopem, w tym możliwość szybkiego pomiaru tysięcy komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki. Jednak nie jest jeszcze szeroko stosowany w optogenetyce. Tutaj prezentujemy urządzenie, które łączy w sobie moc optogenetyki i cytometrii przepływowej: LED Thermo Flow. Urządzenie to oświetla ogniwa o określonych długościach fal, natężeniu światła i temperaturach podczas pomiarów cytometrii przepływowej. Można go zbudować przy niskich kosztach i używać z większością popularnych cytometrów przepływowych. Aby zademonstrować jego użyteczność, scharakteryzowaliśmy kinetykę fotoprzełączania białek Dronpa in vivo i w czasie rzeczywistym. Protokół ten może być dostosowany do prawie wszystkich substancji kontrolowanych optycznie i znacznie rozszerza zestaw możliwych eksperymentów. Co ważniejsze, znacznie uprości odkrywanie i opracowywanie nowych narzędzi optogenetycznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narzędzia optogenetyczne zyskują na popularności, częściowo dlatego, że mogą być używane do rozszyfrowywania połączeń szlaków sygnałowych1-4. Opierają się one na zdolności białek fotoaktywowanych do zmiany ich konformacji i powinowactwa wiązania po oświetleniu światłem. Fuzja tych białek z elementami sygnałowymi pozwala na specyficzną regulację pojedynczego gracza w złożonych wewnątrzkomórkowych szlakach sygnałowych5-12. W związku z tym szlak sygnałowy może być badany z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Większość badań optogenetycznych opartych na komórkach wykorzystuje metody oparte na mikroskopii w połączeniu z hodowlą w obecności światła, a następnie analizą biochemiczną11,12. Natomiast cytometr przepływowy pojedynczo izoluje komórki wzdłuż kapilary i mierzy wielkość komórki, ziarnistość i intensywność fluorescencji. Metoda ta ma duże zalety w porównaniu z mikroskopią lub metodami biochemicznymi, w tym możliwość analizy tysięcy żywych komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki w bardzo krótkim czasie. Dlatego pożądane jest połączenie optogenetyki z cytometrią przepływową.

O ile nam wiadomo, nie ma ustalonego protokołu dla optogenetycznej cytometrii przepływowej. Powszechnie akceptowaną procedurą jest ręczne oświetlanie komórek spoza rurki reakcyjnej za pomocą latarek. Jednak ręczne oświetlenie w cytometrze przepływowym wymaga, aby światło przeszło przez rurkę reakcyjną i, w przypadku obrazowania żywych komórek, przez cylindryczną, podgrzewaną komorę wodną. Powoduje to znaczne rozproszenie światła i utratę światła. Co więcej, natężenie światła zapewniane przez oświetlenie ręczne nie jest odtwarzalne między eksperymentami (kąt, odległość itp.) i istnieje praktyczne ograniczenie liczby długości fal w jednym eksperymencie.

Konstruując urządzenie LED Thermo Flow, byliśmy w stanie przezwyciężyć te ograniczenia. Za pomocą tego urządzenia komórki mogą być oświetlane określonymi długościami fal w sposób kontrolowany temperaturą podczas pomiarów cytometrii przepływowej. Pozwala to na uzyskanie precyzyjnych i powtarzalnych ilości światła w eksperymentach i pomiędzy nimi.

Aby zademonstrować użyteczność naszego urządzenia in vivo, zarejestrowaliśmy sygnał fluorescencyjny Dronpa w komórkach B Ramosa podczas fotoprzełączania. Limfocyty B Ramosa pochodzą z ludzkiego chłoniaka Burkitta. Dronpa to białko fluorescencyjne, które występuje jako monomer, dimer lub tetramer. W postaci monomerycznej jest niefluorescencyjny. Oświetlenie światłem o długości fali 400 nm indukuje dimeryzację i tetrameryzację oraz sprawia, że białko Dronpa staje się fluorescencyjne. Proces ten można odwrócić poprzez oświetlenie światłem o długości fali 500 nm. Białko Dronpa zostało wykorzystane do kontrolowania funkcji i lokalizacji białek sygnałowych4,13.

Tutaj wyraziliśmy białko Dronpa-Linker-Dronpa w komórkach B Ramosa, aby zbadać fotoprzełączanie Dronpa w cytometrze przepływowym. Korzystając z naszego urządzenia, udało nam się sprawnie i powtarzalnie fotoswitch Dronpa, jednocześnie rejestrując jego intensywność fluorescencji w czasie rzeczywistym. Metoda ta zapewnia znaczne korzyści w porównaniu z obecnymi protokołami oświetlenia z oświetleniem ręcznym i znacznie poszerza repertuar eksperymentalny narzędzi optogenetycznych i związków klatkowych. Korzystanie z naszego urządzenia znacznie uprości i przyspieszy odkrywanie i opracowywanie nowych narzędzi optogenetycznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i budowa urządzenia

  1. Eksperymenty pilotażowe
    UWAGA: Wymagane natężenie światła dla określonego narzędzia optogenetycznego i typu komórki może się znacznie różnić. Eksperymenty pilotażowe z prototypami są przydatne do oszacowania minimalnego niezbędnego natężenia światła. Narzędziem optogenetycznym wykorzystanym w poniższych eksperymentach jest konstrukt fuzyjny Dronpa-Linker-Dronpa. Sekwencja Dronpa została uzyskana komercyjnie (patrz Lista materiałów). Długi łącznik został sklonowany pomiędzy dwiema sekwencjami Dronpa, aby umożliwić ekspresjonowanemu konstruktowi utworzenie wewnątrzcząsteczkowych (i międzycząsteczkowych) dimerów. Opisane poniżej kroki można dostosować do wielu innych narzędzi optogenetycznych lub substancji kontrolowanych optycznie.
    1. Transdukować limfocyty Ramosa B za pomocą konstruktu zawierającego Dronpa-Linker-Dronpa zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi transdukcji przy użyciu supernatantu zawierającego retrowirusy z komórek pakujących. Zbieraj i licz komórki zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem13.
    2. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1 x 106/ml w pożywce (RPMI 1640, 10% inaktywowany termicznie FCS, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny i 50 μM 2-merkaptoetanolu) i przenieść je do szklanej probówki FACS.
    3. Włożyć probówkę do cytometru przepływowego i zmierzyć intensywność fluorescencji Dronpa (kanał GFP)14,15.
    4. Nosić okulary ochronne do wszystkich dalszych kroków, aby chronić oczy przed potencjalnie szkodliwymi długościami fal.
    5. Ręcznie umieść światło LED o długości fali 500 nm na zewnątrz rurki i kontynuuj pomiar intensywności fluorescencji Dronpa.
    6. Zwiększaj liczbę i/lub intensywność diod LED, aż intensywność fluorescencji Dronpa zmniejszy się.
    7. Ręcznie umieść światło LED o długości fali 400 nm na zewnątrz tuby i kontynuuj pomiar intensywności fluorescencji Dronpa.
    8. Zwiększaj liczbę i/lub intensywność diod LED, aż intensywność fluorescencji Dronpa wzrośnie.
    9. Do budowy urządzenia należy użyć co najmniej tylu diod LED, ile przewidywano w razie potrzeby po fotoprzełączaniu w krokach 1.1.5 i 1.1.7.
  2. Budowanie urządzenia
    UWAGA: Urządzenie zostało zbudowane przez profesjonalny warsztat obróbki skrawaniem, Arbeitsgruppe Technik z Uniwersytetu we Fryburgu. Większość części jest wykonywana na zamówienie i nie jest dostępna na rynku. Dokładne wymiary każdej części przedstawiono na rysunkach 1 i 2. Aby wyjaśnić montaż tego urządzenia, dostępny jest dodatkowy film 1, a najważniejsze kroki opisano poniżej.
    1. Kawałek młyna A z polichlorku winylu (PVC) z dokładnymi wymiarami pokazanymi na rysunku 1A.
    2. Włóż diody LED do wywierconych otworów w elemencie A i uszczelnij każdy otwór klejem PVC, aby zapobiec wyciekowi wody.
    3. Podłącz diody LED do transformatora wielokanałowego (każda długość fali powinna zajmować osobny kanał) o regulowanej mocy wyjściowej w zakresie 0-29 mA.
    4. Przymocuj zewnętrzną osłonę (B) za pomocą 3 do elementu A, jak pokazano, aby chronić diody LED przed uszkodzeniem fizycznym.
    5. Aby móc podłączyć urządzenie do pompy wodnej, należy wkleić zaciski rurowe (C) w wywiercone otwory elementu A (pokazane na rysunku 1a, przekrój Y: 9 mm i 61,5 mm) za pomocą kleju PVC.
    6. Wytnij rurkę z pleksiglasu o długości 58,5 mm (D1).
    7. Wykonaj elementy D2 i D3 z pleksiglasu, jak pokazano na rysunku 2.
    8. Przyklej kawałek D3 do spodu D1 za pomocą kleju do pleksiglasu.
    9. Przymocuj gumowy O-ring do elementu D2 i przyklej go do górnej części D1 za pomocą kleju do plexi.
      UWAGA: Elementy D1, D2 i D3 razem tworzą część D.
    10. Włóż kawałek D do kawałka A za pomocą 3.
    11. Przetestuj urządzenie pod kątem wycieków wody przed podłączeniem zasilania do transformatora.

2. Pomiar kinetyki narzędzia optogenetycznego

  1. Przygotowywanie komórek
    1. Hodowla limfocytów B Ramosa w pożywce RPMI (RPMI 1640, 10% inaktywowany termicznie FCS, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny i 50 μM 2-merkaptoetanolu) o gęstości 3-10 x 106 komórek/ml w 37 °C i 5% CO2 .
    2. Limfocyty B Ramosa zbiera się przez odwirowanie w temperaturze 350 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    3. Policz komórki za pomocą komory liczącej Neubauera zgodnie z instrukcjami producenta i ponownie zawieś 1-5 x10 6 komórek w pożywce 600 μl.
    4. Przenieś komórki do szklanej probówki FACS, umieść je na lodzie i chroń przed światłem do czasu pomiaru.
  2. Przygotować cytometr przepływowy i urządzenie.
    1. Podłącz urządzenie do pompy podgrzewanej wody i ustaw temperaturę na 37 °C.
    2. W przypadku stosowania szklanych probówek FACS należy wymienić O-ring cytometru przepływowego na gumowy O-ring i dodatkowo nałożyć smar silikonowy.
  3. pomiar
    1. Ostrożnie włóż szklaną rurkę FACS do urządzenia i podłącz ją do cytometru przepływowego (rysunek 3).
    2. Rozpocznij pomiar i zapisz intensywność fluorescencji Dronpa (kanał GFP).
    3. Oświetlić próbkę komórki światłem o długości fali odpowiednio 400 nm lub 500 nm i zarejestrować intensywność fluorescencji Dronpa (kanał GFP).
  4. analiza danych
    1. Analizuj dane eksperymentalne za pomocą odpowiedniego oprogramowania cytometru przepływowego. Wykreśl rozproszenie do przodu przeciwko rozproszeniu bocznemu i bramę żywych komórek. Wykreśl intensywność fluorescencji Dronpa w czasie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystanie z diody LED Thermo Flow z cytometrem przepływowym

Funkcjonalnym rdzeniem urządzenia jest cylindryczna komora, w której diody LED są ułożone w sposób okrągły, skierowane do wewnątrz. Komora ta może być podłączona do źródła wody i pompy, co pozwala na kontrolowanie temperatury diod LED, a także próbki ogniwa. Diody LED są podłączone do transformatora, dzięki czemu natężenie światła dla każdej długości fali może być indyw...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LED Thermo Flow to innowacyjne urządzenie do badania narzędzi optogenetycznych w cytometrze przepływowym.

Do tej pory próbki optogenetyczne były oświetlane jedynie za pomocą laserów mikroskopowych lub latarek11,12. W zależności od kąta i odległości latarki od próbki, spodziewana jest znaczna zmienność w ilości oświetlenia między eksperymentami. Ponadto istnieje ograniczenie liczby latarek, które jedna osoba może obsługiwać w eksperymencie. Ogranicza to repertuar eksperymentalny i od...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy J. Schmidtowi z Uniwersytetu we Fryburgu za skonstruowanie urządzenia. Dziękujemy P. Nielsenowi i D. Medgyesi za ich wsparcie i krytyczną lekturę tego manuskryptu. Badanie to było wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft za pośrednictwem SFB746 oraz przez Inicjatywę Doskonałości Niemieckiej Fundacji Badawczej (GSC-4, Spemann Graduate School).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Szklana rurka FACSThermo Fisher Scientific; Waltham, Stany Zjednoczone14-961-26Rurki ze szkła borokrzemianowego 12x75 mm
Cytometr przepływowyBD Bioscienceg; Heidelberg, Niemcyna specjalne zamówienieFortessa II
: pcDNA3-mNeptune2-NAddgene; Cambridge, Stany Zjednoczone41645
PolyJetSignaGen, Rockville, Stany ZjednoczoneSL100688
LED 505 nmAvago Technologies; Boeblingen, NiemcyHLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 nmAvago Technologies; Boeblingen, NiemcyUV5TZ-400-15
Rurka z pleksiglasu 15 mmMaertin; Fryburg Bryzgowijski, Niemcy76999
plexi 3 mmMaertin; Fryburg Bryzgowijski, Niemcy692230
plexi 2,5 mmMaertin; Fryburg Bryzgowijski, Niemcy692225
plexi 1,5 mmMaertin; Fryburg Bryzgowijski, Niemcy692215
Dachówka PCV 5 mmMaertin; Fryburg Bryzgowijski, Niemcy690020.005
Dachówka PCV 6 mmMaertin; Fryburg Bryzgowijski, Niemcy690020.006
Blok PVC 50 mmMaertin; Fryburg Bryzgowijski, Niemcy690020.050
RPMIInvitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Niemcy61870-010
2-merkaptoetanolEMD; Niemcy805740
FCSPAN Biotech; Aidenbach, NiemcyP30-3302
Penicylina/Strptomycyna (10 000 U/ml)Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Niemcy15140-122
Klej do plexi AcrifixEvonic industries, Essen, Niemcy1R0192
Klej Tangit PVC-UHenkel, Dü sseldorf, Niemcy
Dronpa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
  2. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
  3. Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
  4. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
  5. Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
  6. Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898(2015).
  7. Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
  8. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925(2014).
  9. Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
  10. Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
  11. Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
  12. Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
  13. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
  14. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  15. Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
  16. Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetics Flow CytometryLED Thermo FlowPhotoswitching KineticsDronpa ProteinsFluorescence IntensityLight IntensityWavelength LEDsFlow Cytometric MeasurementsCell Signaling PathwaysRamos B Lymphocytes

Related Articles