Mysi model kolonizacji pochwy paciorkowcami grupy B

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest imitacja kolonizacji pochwy przez Streptococcus grupy B (GBS) w modelu mysim. Metoda ta może być stosowana do badania odpowiedzi immunologicznych gospodarza i czynników bakteryjnych przyczyniających się do utrzymywania się GBS w pochwie, a także do testowania strategii terapeutycznych.

Streszczenie

Streptococcus agalactiae (Streptococcus grupy B, GBS), jest Gram-dodatnim, bezobjawowym kolonizatorem ludzkiego przewodu pokarmowego i dróg pochwy u 10 - 30% dorosłych. U osób z obniżoną odpornością, w tym noworodków, kobiet w ciąży i osób starszych, GBS może przekształcić się w inwazyjny patogen powodujący sepsę, zapalenie stawów, zapalenie płuc i zapalenie opon mózgowych. Ponieważ GBS jest wiodącym patogenem bakteryjnym noworodków, obecna profilaktyka obejmuje badania przesiewowe w kierunku kolonizacji pochwy GBS w późnej ciąży, a następnie antybiotykoterapię okołoporodową matek z dodatnim wynikiem GBS. Duże obciążenie pochwy GBS jest czynnikiem ryzyka zarówno chorób noworodków, jak i kolonizacji. Niestety, niewiele wiadomo na temat gospodarza i czynników bakteryjnych, które promują lub umożliwiają kolonizację pochwy przez GBS. Protokół ten opisuje technikę ustalania trwałej kolonizacji pochwy GBS przy użyciu pojedynczego wstępnego leczenia β-estradiolem i codziennego pobierania próbek w celu określenia obciążenia bakteryjnego. Dalej wyszczególnia metody podawania dodatkowych terapii lub odczynników będących przedmiotem zainteresowania oraz pobierania płynu z płukania pochwy i tkanek dróg rodnych. Ten mysi model pozwoli lepiej zrozumieć interakcję GBS-gospodarz w środowisku pochwy, co doprowadzi do potencjalnych celów terapeutycznych w celu kontrolowania kolonizacji pochwy matki w czasie ciąży i zapobiegania przenoszeniu wirusa na wrażliwego noworodka. Interesujące będzie również pogłębienie naszej wiedzy na temat ogólnych interakcji bakteria-gospodarz w żeńskich drogach pochwowych.

Wprowadzenie

Streptococcus agalactiae, Streptococcus grupy B (GBS), to zamknięta w kapsułkach, Gram-dodatnia bakteria, która jest często izolowana z jelit i dróg moczowo-płciowych zdrowych dorosłych. W latach siedemdziesiątych XX wieku GBS stał się głównym czynnikiem zakaźnej śmiertelności noworodków, z ponad 7000 przypadków chorób noworodków^rocznie1. Choroba GBS o wczesnym początku (EOD) występuje w pierwszych godzinach lub dniach życia, pojawia się jako zapalenie płuc lub niewydolność oddechowa i często przekształca się w sepsę, podczas gdy choroba o późnym początku (LOD) następuje po kilku miesiącach i objawia się bakteriemią, która często rozwija się w zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych^{typu 2}. Od 2002 roku Centers for Disease Control and Prevention zaleca matkom z dodatnim wynikiem GBS powszechne badania przesiewowe w kierunku kolonizacji pochwy GBS w późnej ciąży i śródporodowej profilaktyce antybiotykowej (IAP)^1. Pomimo zmniejszenia liczby przypadków choroby o wczesnym początku do około 1000 rocznie w Stanach Zjednoczonych z powodu IAP, GBS pozostaje główną przyczyną sepsy noworodków o wczesnym początku, a występowanie o późnym początku pozostaje^{nienaruszone1}. Niezależnie od tego, czy w macicy, podczas porodu, czy nawet w późnych przypadkach, narażenie noworodków na GBS wymaga przeżycia, przejścia przez wiele środowisk i barier gospodarza, unikania odporności, a w przypadku zapalenia opon mózgowych przekroczenia wysoce regulowanej bariery krew-mózg². Przed tymi zjadliwymi interakcjami w obrębie noworodka następuje początkowa kolonizacja dróg pochwowych matki. Wskaźniki kolonizacji pochwy przez matkę GBS wahają się od 8 do 18% w krajach rozwiniętych i rozwijających się, z szacowanym średnim wskaźnikiem 12,7%^3,4. Kolonizacja dróg pochwowych przez GBS w czasie ciąży może mieć charakter stały, przerywany lub przemijający u poszczególnych kobiet⁵. Co ciekawe, wiek matki > 36 lat wiąże się z uporczywą kolonizacją⁶. Zidentyfikowano liczne biologiczne i społeczno-ekonomiczne czynniki ryzyka kolonizacji pochwy przez GBS. Czynniki biologiczne obejmują kolonizację przewodu pokarmowego GBS i brak Lactobacillus w jelitach. Jednak pochodzenie etniczne, otyłość, higiena i aktywność seksualna są również związane z nosicielstwem pochwy GBS⁷.

Chociaż GBS jest znany z powodowania infekcji u noworodków, powoduje również różne infekcje u matki, zarówno okołoporodowe, jak i poporodowe. Nosicielstwo GBS jest zwiększone u kobiet z zapaleniem pochwy⁸, a w niektórych przypadkach może być nawet jednostką chorobową⁹. Dodatkowo wznoszenie się GBS w układzie rozrodczym w czasie ciąży może skutkować infekcją wewnątrzowodniową lub zapaleniem błony płodowej¹⁰. Ponadto nawet w 3,5% ciąż GBS rozprzestrzenia się do pęcherza moczowego, powodując infekcję dróg moczowych lub bezobjawową bakteriurię¹¹. Bakteriuria GBS w czasie ciąży wiąże się ze zwiększonym ryzykiem gorączki śródporodowej, zapalenia błon płodowych, przedwczesnego porodu i przedwczesnego pęknięcia błon płodowych¹². Podsumowując, obecność GBS w drogach pochwowych jest związana z infekcjami wielu tkanek gospodarza, a zdolność do wyeliminowania GBS z tej niszy jest niezbędna zarówno dla zdrowia matki, jak i noworodka.

Do niedawna, większość prac badających interakcje GBS z drogą szyjno-pochwową ograniczała się do modeli komórkowych in vitro ^13-15. Te eksperymenty in vitro ujawniły czynniki bakteryjne, które są ważne dla przylegania, w tym białka powierzchniowe, takie jak pilusy i powtórzenia bogate w serynę^17,18, a także dwuskładnikowe systemy regulacyjne^15,19 i globalną odpowiedź transkrypcyjną nabłonka pochwy na GBS¹⁹. Jednak, aby w pełni wyjaśnić interakcje gospodarz-mikroorganizm w drogach oddechowych, niezbędny jest solidny model zwierzęcy. Wczesne prace wykazały, że GBS można odzyskać z dróg pochwowych zaszczepionych myszy^20,21 i szczurów²² zarówno w ciąży, jak i poza nią. W 2005 roku krótkoterminową kolonizację pochwy GBS modelowano na myszach w celu zbadania skuteczności enzymu litycznego fagowego w leczeniu pochwy GBS^{przez okres} 24 godzin. Kilka lat później opracowano długoterminowy model mysiej kolonizacji pochwy GBS w celu zbadania czynników gospodarza i bakterii decydujących o trwałości GBS. Model ten zidentyfikował liczne czynniki GBS przyczyniające się do kolonizacji, w tym przydatki powierzchniowe^17,18 i dwuskładnikowe systemy GBS^19,24. Model ten przyczynił się do identyfikacji mechanizmów odpowiedzi gospodarza^19,25 i został wykorzystany do przetestowania kilku strategii terapeutycznych, w tym peptydów immunomodulujących²⁶ i probiotyków²⁷. Protokół ten zawiera niezbędne wskazówki do inokulacji GBS w drogach pochwowych myszy, a następnie śledzenia kolonizacji i pobierania próbek do dalszych analiz.

Protokół

Wszystkie prace na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Biuro Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi na Uniwersytecie Stanowym w San Diego i przeprowadzone zgodnie z przyjętymi standardami weterynaryjnymi. Do opracowania tej metody wykorzystano samice myszy w wieku 8 - 16 tygodni.

1. Przygotowanie i dootrzewnowe wstrzyknięcie β-estradiolu

1. Odmierzyć β-estradiol (0,5 mg/mysz) na papierze wagowym, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE). UWAGA: β-estradiol może być wchłaniany przez skórę i powierzchnię błony śluzowej.
2. Przenieś β-estradiol do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wiruj, aż wszystkie grudki zostaną usunięte, a β-estradiol stanie się drobnym proszkiem. Pobrać olej sezamowy (100 μl/mysz) do strzykawki o pojemności 10 ml. Strzykawka filtruje olej sezamowy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej β-estradiol za pomocą filtra 0,45 μm. Wirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml, aż β-estradiol stanie się jednorodną zawiesiną w oleju sezamowym.
3. Pobrać zawiesinę β-estradiolu do nowej strzykawki o pojemności 10 ml. Z 18 G, 1-calowym. igła, podwielokrotność 100 μl zawiesiny do 1 ml strzykawek tuberkulinowych. Przygotować jedną strzykawkę dla każdej myszy. Umieść nowy, sterylny 26 G, 1/2 cala. igły na każdej strzykawce tuberkuliny.
4. Podawać 0,5 mg β-estradiolu zawieszonego w 100 μl oleju sezamowego (5 mg/ml) każdej myszy na 24 godziny przed inokulacją bakteryjną. Wstrzyknąć każdą mysz w jamę otrzewnową, w dolnych kwadrantach brzucha, po prawej lub lewej stronie linii środkowej, jak opisano wcześniej²⁸,
   UWAGA: Nie jest konieczne czyszczenie ani przycinanie miejsca wstrzyknięcia.

2. Inokulacja dopochwowa za pomocą GBS

1. Na jeden dzień przed inokulacją należy wyhodować 5 ml płynnej kultury przez noc interesującego szczepu GBS, takiego jak A909 (serotyp Ia), w bulionie Todda Hewitta (THB) w temperaturze 37 °C.
2. Subkultura przez noc GBS w objętości 1:10 do świeżego THB i inkubacja w temperaturze 37 °C. Wyhodować bakterie do połowy fazy logarytmicznej (OD₆₀₀ = 0,4-0,5). UWAGA: Zwykle zajmuje to od 2 do 3 godzin, w zależności od szczepu GBS.
3. Przenieść subkulturę do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i osadzać bakterie w granulkach o masie 3 000 × g przez 5 minut. Odessać supernatant. Zawiesić osad bakteryjny w 200 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
4. Używając zawieszonego osadu, doprowadzić 3 - 5 ml PBS (1 ml na 10 myszy) dokładnie do OD₆₀₀ = 0,4 w nowej 5-mililitrowej probówce hodowlanej. Będzie to stężenie ~ 1 × 10⁸ jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml. Przenieść do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i ponownie granulować bakterie w ilości 3 000 × g przez 5 minut. Odessać supernatant.
5. Ponownie zawiesić osad w PBS na poziomie 1/10 pierwotnej objętości. Na przykład, jeśli 3 ml OD₆₀₀ = 0,4 zostało granulowane, to ponownie zawiesić je w 300 μl PBS. UWAGA: Jest to końcowa zawiesina bakteryjna (~ 1 ×^{10 9} CFU/ml) stosowana do inokulacji zwierząt.
6. Zachować 50 μl tej zawiesiny do seryjnego rozcieńczania i powlekania na agarze THB w celu określenia dokładnego inokulum.
7. Zaszczepić każdą mysz 10 μl końcowej zawiesiny bakteryjnej, tak aby każdej myszy podano 1 ×^{10 7} jtk.
   1. Aby zaszczepić, należy ręcznie unieruchomić mysz, zabezpieczając luźną skórę na karku między kciukiem a palcem wskazującym przewodnika, a następnie unieruchamiając ogon, jak opisano wcześniej²⁸.
   2. Pobrać 10 μl GBS przygotowanego w kroku 2.6 do końcówki pipety o objętości 200 μl z żelem. Włóż końcówkę na 5 do 10 mm do światła pochwy i dozuj 10 μl inokulum.
      UWAGA: Końcówki do ładowania żelem są preferowane w stosunku do standardowych końcówek o pojemności 200 μl, aby zminimalizować ryzyko urazu lub urazu narządów, szczególnie u młodszych lub mniejszych myszy.
   3. Bezpośrednio po zaszczepieniu zwolnij kark i unieś tylny koniec myszy, unosząc mysz za ogon i chodząc przednimi łapami po twardej powierzchni przez ~ 1 min.
   4. Sprawdź wzrokowo otwór pochwy pod kątem cofania się inokulum. W przypadku zaobserwowania przepływu wstecznego, można użyć świeżej końcówki pipety do manipulowania lub powiększania otworu pochwy, ułatwiając wchłanianie przepływu wstecznego do światła. Dodatkowo przepływ zwrotny może być odessany za pomocą pipety i ponownie zaszczepiony.
      UWAGA: W przypadku podawania środków miejscowych, organizmów probiotycznych lub białek będących przedmiotem zainteresowania, do dróg pochwowych można podać objętość do 20 μl w buforze fizjologicznym.

3. Wymaz z pochwy w celu ilościowego określenia obciążenia GBS

1. Przygotuj jedną probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml na mysz, dodając 100 μl PBS. Tuż przed pobraniem wymazu należy go wstępnie zwilżyć w PBS.
2. Unieruchomić mysz zgodnie z opisem w kroku 2.7.1 i włożyć wacik na 10 mm do światła pochwy. Delikatnie obróć wacik 4 razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara i 4 razy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, lekko naciskając na ścianę pochwy.
3. Przenieś wacik do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml ze 100 μl PBS. Przed posiewem należy wirować probówkę mikrowirówki przez ~15 sekund, aby uwolnić bakterie z wacika. Każdą próbkę należy seryjnie rozcieńczyć w PBS i rozcieńczyć 20 μl roztworów w stosunku 1:10 do 1:10 000 na płytkach agarowych z podłożem różnicowym, przygotowanych zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Kolonie GBS będą miały kolor jasnoróżowy lub fioletowy. Inna endogenna flora zostanie zahamowana lub pojawi się jako niebieskie, białe lub szare kolonie.

4. Zbieranie płynu do płukania pochwy

1. Unieruchom, jak opisano w kroku 2.7.1. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl z żelem odpipetuj 20 μl PBS do światła pochwy. Delikatnie odpipetować całą objętość w górę i w dół 4 razy w obrębie światła, a następnie pobrać całą objętość do tej samej końcówki pipety. UWAGA: Jeśli płyn do płukania jest gęsty od śluzu, do zebrania końcowego płynu płukanego można użyć standardowej końcówki pipety o pojemności 200 μl.
2. W przypadku oszczędzania płynu z płukania do analizy cytokin lub oznaczania ilościowego CFU, należy go przelać do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,7 ml. W przypadku określania stadium rui należy nanieść co najmniej 5 μl płynu do płukania na szkiełko podstawowe i obserwować komórki w 100-krotnym powiększeniu pod mikroskopem świetlnym. UWAGA: Przykłady etapów rujowych znajdują się na rysunku 1.

5. Sekcja tkanek i homogenizacja

1. Dla każdej myszy przygotuj trzy probówki z nakrętką o pojemności 2 ml (po jednej na każdą tkankę: pochwę, szyjkę macicy i macicę). Napełnij każdą probówkę dużą ilością (0,4 - 0,5 g) 1,0 mm kulek cyrkonu, aby pokryć stożkowate dno tuby.
2. Przygotowane probówki należy sterylizować w autoklawie przed pobraniem tkanki przez 30 minut w temperaturze 121 °C, zwłaszcza w przypadku ilościowego określania obciążenia bakteryjnego. Do każdej probówki dodać 500 μl sterylnego PBS. Zważyć każdą probówkę po autoklawowaniu i zapisać do wykorzystania w przyszłości w celu obliczenia masy odzyskanej tkanki.
3. Poświęć mysz przy użyciu zatwierdzonych metod instytucjonalnych, takich jak uduszenie CO₂ i zwichnięcie szyjki macicy. Spryskaj brzuszną część brzucha 70% EtOH. Sterylnymi nożyczkami otwórz jamę brzuszno-miedniczną, unieś skórę pleców i mięśnie brzucha oraz przemieszcz jelita tak, aby drogi rodne były odsłonięte.
4. Wysterylizuj nożyczki 70% EtOH, w razie potrzeby wytrzyj do czysta i przetnij oba rogi macicy w połowie długości między trzonem macicy a jajnikami. Za pomocą nożyczek i kleszczy oddziel tłuszcz trzewny, błony i pęcherz moczowy z dala od dróg rodnych, poruszając się doogonowo.
5. Wysterylizuj nożyczki zgodnie z opisem w kroku 5.4. Przetnij pochwę poprzecznie jak najbliżej sromu, aby oddzielić drogi rodne od ciała. Podnieś i usuń nienaruszony układ rozrodczy i umieść go na sterylnej szalce Petriego.
6. Za pomocą nowej żyletki oddziel macicę od szyjki macicy jednym poprzecznym cięciem. Wysterylizuj żyletkę 70% EtOH, a następnie oddziel szyjkę macicy od pochwy jednym poprzecznym cięciem. UWAGA: Do szyjki macicy nadal będzie przyczepiona minimalna ilość tkanki macicy. Do szyjki macicy nadal będzie przyczepiona minimalna ilość tkanki pochwy.
7. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś każdą z tkanek do odpowiednich 2-mililitrowych probówek zawierających PBS i kulki homogenizujące. Oczyść kleszcze 70% EtOH pomiędzy czynnościami z każdą tkanką.
8. Zważ każdą probówkę z zakrętką o pojemności 2 ml i odejmij pierwotną wagę probówki, aby określić masę tkanki. Masa tkanek zazwyczaj waha się między 20 - 100 mg. Szczelnie zamknij rurki z nakrętką i homogenizuj tkanki przez 1 minutę z maksymalną prędkością w homogenizatorze tkankowym.
9. Aby określić ilościowo obciążenie bakteryjne, należy seryjnie rozcieńczyć 25 μl homogenatu tkankowego i rozcieńczenia płytki w stosunku 1:10 do 1:10 000 na płytkach agarowych z podłożem różnicowym. Inkubować płytki zgodnie z opisem w kroku 3.3. W celu przechowywania próbek do oznaczania ilościowego cytokin należy zamrozić homogenaty tkanek w temperaturze -20 °C.

Wyniki

Podczas opracowywania tego modelu, poczyniono wiele obserwacji dotyczących czynników wpływających na czas trwania kolonizacji pochwy GBS. Aby określić, w jaki sposób stadium rui podczas inokulacji wpływa na trwałość bakterii GBS, myszy poddano inscenizacji w dniu inokulacji za pomocą płynu z płukania pochwy. Rycina 1 ilustruje cztery etapy cyklu rujowego myszy, określone za pomocą płynu do płukania pochwy na mokro, dobrze znanej metody²⁹. Myszy podzielono na gr...

Dyskusja

Aby pogłębić wiedzę na temat interakcji GBS zarówno z gospodarzem, jak i innymi drobnoustrojami w kontekście gospodarza, potrzebny jest model zwierzęcy. W pracy opisano techniczne aspekty ustalenia kolonizacji pochwy GBS u myszy. Protokół ten osiąga > 90% kolonizacji myszy bez użycia środków znieczulających do zaszczepiania bakterii lub pobierania próbek wymazów, środków immunosupresyjnych umożliwiających kolonizację, wstępnego mycia pochwy lub dodatków zagęszczających inokulum. Co więcej, model ten wykazuje solidną odtw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Olej sezamowy	Sigma Aldrich	S3547-250ML
β-Estradiol	Sigma Aldrich	E8875-1G	UWAGA: Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. &beta-estradiol może być wchłaniany przez skórę i powierzchnię błony śluzowej.
200 μ l Końcówki do pipet z żelem	USA Scientific	1252-0610
Waciki moczowo-płciowe, sterylne, z alginianu wapnia	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, igły 1,5 cala	BD	305199
26 G, igły 0,5 cala	BD	305111
Strzykawki 10 ml	BD	309604
Strzykawki 1 ml	BD	309659
0,45 μ m Filtry strzykawkowe PVDF	Whatman	6900-2504
Buforowany fosforanem roztwór soli Dulbecco 1x	Corning	21-031-CV