Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

13.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54714

⸱

9 grudnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 2Department of Hematology, VU University Medical Center, 3Department of Medical Oncology, VU University Medical Center, 4Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, 5Division of General and Transplant Surgery, Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana, Universita’ di Pisa, 6Amsterdam Immunology and Rheumatology Center, VU University Medical Center, 7Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 8Cancer Pharmacology Lab, AIRC Start-Up Unit, University of Pisa, 9Institute of Nanoscience and Nanotechnology, CNR-Nano

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół mający na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne rodzicielskich i opornych modeli in vitro za pomocą sekwencjonowania RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących.

Streszczenie

Oporność na leki pozostaje głównym problemem w leczeniu raka, zarówno w przypadku nowotworów hematologicznych, jak i guzów litych. Oporność wewnętrzna lub nabyta może być spowodowana szeregiem mechanizmów, w tym zwiększoną eliminacją leku, zmniejszonym wychwytem leku, inaktywacją leku i zmianami celów leku. Najnowsze dane wykazały, że poza dobrze znanymi modyfikacjami genetycznymi (mutacja, amplifikacja) i epigenetycznymi (hipermetylacja DNA, modyfikacja potranslacyjna histonów), mechanizmy oporności na leki mogą być również regulowane przez aberracje splicingowe. Jest to szybko rozwijająca się dziedzina badań, która zasługuje na przyszłą uwagę w celu zaplanowania bardziej skutecznych podejść terapeutycznych. Protokół opisany w niniejszej pracy ma na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne kilku modeli in vitro za pomocą sekwencji RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących. W szczególności oceniliśmy różnicowy splicing transkryptów DDX5 i PKM. Nieprawidłowy splicing wykryty przez narzędzie obliczeniowe MATS został zweryfikowany w komórkach białaczkowych, wykazując, że różne warianty splicingu DDX5 ulegają ekspresji w komórkach rodzicielskich i opornych. W tych komórkach zaobserwowaliśmy również wyższy stosunek PKM2 / PKM1, który nie został wykryty w odpowiedniku opornym na gemcytabinę Panc-1 w porównaniu z rodzicielskimi komórkami Panc-1, co sugeruje inny mechanizm oporności na leki indukowanej ekspozycją na gemcytabinę.

Wprowadzenie

Pomimo znacznych postępów w leczeniu raka, oporność komórek nowotworowych na chemioterapię, zarówno wrodzona, jak i nabyta po długotrwałym narażeniu na lek, jest główną przyczyną niepowodzenia leczenia w szerokim zakresie białaczek i guzów litych1.

W celu nakreślenia mechanizmów leżących u podstaw oporności na leki, modele linii komórkowych in vitro są opracowywane poprzez stopniową selekcję komórek nowotworowych odpornych na chemioterapeutyki. Procedura ta naśladuje reżimy stosowane w warunkach klinicznych, a tym samym umożliwia dogłębne badanie odpowiednich mechanizmów oporności. Oporne komórki, które przeżyły leczenie, są następnie odróżniane od wrażliwych komórek rodzicielskich za pomocą testów żywotności komórek/cytotoksyczności2. Wykazano, że profile oporności komórek pierwotnych na leki in vitro są istotnie związane z odpowiedzią kliniczną na chemioterapię3.

Wysokoprzepustowe testy cytotoksyczności stanowią wygodną metodę określania wrażliwości leków in vitro. W tym przypadku żywotność komórek ocenia się na przykład za pomocą bromku 3-[4,5-dimetylotiazol-2-ylo]-2,5-difenylotetrazolowego - test MTT4, który opiera się na metabolicznej konwersji niektórych substratów (tj. soli tetrazoliowych) w kolorowe produkty, odzwierciedlając w ten sposób aktywność mitochondrialną komórek. Alternatywnie, zawartość białka komórkowego można określić ilościowo za pomocą testu sulforodaminy B (SRB)5. W tym przypadku liczba żywotnych komórek jest proporcjonalna do gęstości optycznej (OD) mierzonej przy odpowiedniej długości fali w spektrofotometrze, bez potrzeby stosowania rozległych i czasochłonnych procedur zliczania komórek. Zahamowanie wzrostu wywołane przez określony lek chemioterapeutyczny można obliczyć na podstawie OD studzienek, w których komórki potraktowano czynnikiem testowym, i porównać z OD nieleczonych komórek kontrolnych. Krzywą dawka-odpowiedź uzyskuje się przez wykreślenie stężeń leku w funkcji procentowej liczby żywotnych komórek w stosunku do komórek kontrolnych. Wreszcie, wrażliwość na lek można podać jako stężenie, które powoduje zahamowanie wzrostu komórek w 50% w porównaniu z komórkami nieleczonymi (IC50).

Mechanizmy leżące u podstaw oporności na leki obejmują wiele różnych nieprawidłowości, takich jak zmiany wpływające na ekspresję genów determinantów aktywności leku i metabolizmu komórkowego. Te zmiany molekularne, w tym mutacje, aberracje na poziomie transkrypcyjnym i potranskrypcyjnym, a także zaburzona regulacja epigenetyczna często wpływają na geny zaangażowane w metabolizm leków lub apoptozę6.

Alternatywny splicing pre-mRNA i jego zawiła regulacja zyskały ostatnio duże zainteresowanie jako nowy podmiot, który może decydować o lekooporności komórek rakowych7. Do 95% ludzkich genów jest naprzemiennie splecionych w normalnych komórkach za pomocą tego ściśle regulowanego procesu, który wytwarza wiele różnych izoform białek z tego samego genu. Alternatywny splicing jest często rozregulowany w raku, a niektóre nowotwory charakteryzują się zmienionym splicing rosnącej liczby genów zaangażowanych w metabolizm leków (tj. kinazy deoksycytydyny, syntetazy folilopoliglutaminianu lub białek oporności wielolekowej)6,8. Niestety, brakuje kompleksowej analizy profili splicingu komórek lekoopornych. Dlatego konieczne jest opracowanie metod o wysokiej przepustowości dla alternatywnej analizy spawów. Może to pomóc w opracowaniu skuteczniejszych podejść terapeutycznych.

W ciągu ostatniej dekady, szybki rozwój technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS) wzbogacił badania biomedyczne o nowe spojrzenie na molekularne mechanizmy rządzące regulacją ekspresji genomu i ich rolę w różnych procesach biologicznych9. Sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA) jest potężnym podzastosowaniem NGS w dziedzinie transkryptomiki. Umożliwia profilowanie całego genomu (zarówno jakościowo, jak i ilościowo) wzorców ekspresji tysięcy genów jednocześnie i dobrze nadaje się do charakteryzowania nowych kodujących mRNA, a także długich niekodujących RNA, miRNA, siRNA i innych małych klas RNA (np. snRNA i piRNA)10,11.

RNA-Seq ma wiele zalet w porównaniu z poprzednimi technologiami charakteryzacji transkryptomu (np. sekwencjonowanie Sangera i mikromacierze ekspresji). Nie jest oparty na istniejącej adnotacji genomu, ma rozdzielczość na poziomie pojedynczego nukleotydu i ma szerszy zakres dynamiki do szacowania poziomu ekspresji. Krótko mówiąc, podstawowy eksperymentalny przepływ pracy w eksperymentach sekwencyjnych RNA składa się z selekcji i fragmentacji transkryptu poliadenylowanego (mRNA), a następnie konwersji do cDNA, budowy biblioteki i wreszcie masowo równoległego sekwencjonowania głębokiego12,13. Ze względu na gwałtowny spadek kosztów sekwencjonowania w ciągu ostatnich kilku lat, sekwencjonowanie RNA stopniowo zastępuje inne technologie i podejmowane są znaczne wysiłki w celu ulepszenia protokołów przygotowania bibliotek. Na przykład, obecnie możliwe jest zachowanie informacji o nici transkryptów mRNA poprzez znakowanie drugiej nici cDNA trifosforanem deoksyurydyny (dUTP) i, przed amplifikacją PCR, trawienie oznaczonej nici glikosilazą uracylo-DNA (UDG). Proces ten zwiększa dokładność adnotacji genów i szacowania poziomów ekspresji14,15.

Analiza i interpretacja danych sekwencyjnych RNA wymaga skomplikowanych i potężnych pakietów oprogramowania obliczeniowego oraz przetwarzania w ramach procesów bioinformatycznych16,17. W pierwszej kolejności surowe odczyty poddawane są kontroli jakości poprzez usunięcie artefaktów technicznych i biologicznych oraz odrzucenie (przycięcie) sekwencji, które nie spełniają rygorystycznych wymagań jakościowych. Następnie odczyty dla każdej próbki są mapowane do genomu referencyjnego i indeksowane na poziomie genu, eksonu lub transkryptu, w celu określenia obfitości każdej kategorii. W zależności od zastosowania, udoskonalone dane są następnie obliczane za pomocą modeli statystycznych w celu identyfikacji ekspresji specyficznej dla alleli, alternatywnego splicingu, fuzji genów i polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP)12. Wreszcie, analiza różnicowa na wybranym poziomie (tj. ekspresji genów lub alternatywnego splicingu) może być wykorzystana do porównania próbek uzyskanych w różnych warunkach.

Różnicowa analiza splicingu opisuje różnice w użyciu miejsca spawania między dwiema próbkami. Dostępnych jest coraz więcej pakietów oprogramowania przeznaczonych do tego celu, opartych na różnych modelach statystycznych, wydajnościach i interfejsie użytkownika18. Wśród nich MATS (Multivariate Analysis of Transcript Splicing) jawi się jako ogólnodostępne i precyzyjne narzędzie obliczeniowe oparte na bayesowskiej strukturze statystycznej i przeznaczone do wykrywania różnicowych zdarzeń splicingu na podstawie danych sekwencyjnych RNA z pojedynczym lub sparowanym końcem. Począwszy od wyrównanych plików (.bam), MATS może wykrywać wszystkie główne typy alternatywnych zdarzeń splicingu (pomijanie eksonów, alternatywne miejsce splicingu 3', alternatywne miejsce splicingu 5', wzajemnie wykluczające się eksony i retencja intronów - patrz również rysunek 1).

Po pierwsze, oprogramowanie identyfikuje odczyty, które obsługują określone zdarzenie splicingu, na przykład pomijanie eksonów, i klasyfikuje je na dwa typy. "Inkluzja odczytuje" (dla kanonicznego zdarzenia splicingu) mapę w obrębie badanego eksonu i obejmuje połączenia między tym konkretnym eksonem a dwoma eksonami flankującymi w górę i w dół. "Odczyty z pominięciem" (dla alternatywnego zdarzenia splicingu) obejmują połączenie między dwoma eksonami flankującymi. Następnie funkcja MATS zwraca znormalizowany poziom inkluzji zarówno dla zdarzeń kanonicznych, jak i alternatywnych, a następnie porównuje wartości między próbkami lub warunkami. Ostatecznie oblicza wartość P i współczynnik fałszywych odkryć (FDR) przy założeniu, że różnica w stosunku wariantów genu między dwoma warunkami przekracza dany próg zdefiniowany przez użytkownika dla każdego zdarzenia splicingu19,34.

Po różnicowej analizie splicingu w połączeniu z sekwencją RNA, uzasadniona jest obszerna walidacja eksperymentalna w celu zidentyfikowania prawdziwie pozytywnych kandydatów na geny18. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwróconą transkrypcją (qRT-PCR) jest najczęściej stosowaną i optymalną metodą walidacji kandydatów uzyskanych z analizy RNA-Seq20. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie solidnej metodologii badania profili splicingu związanych z lekoopornością w guzach litych i nowotworach hematologicznych. Nasze podejście wykorzystuje profilowanie transkryptomu oparte na sekwencjonowaniu RNA wybranych modeli linii komórkowych nowotworów lekoopornych w połączeniu z uznaną metodą qRT-PCR do walidacji genów kandydujących związanych z opornością na leki.

Modele linii komórkowych ludzkiej białaczki użyte w tym badaniu obejmowały pediatryczną linię komórkową ostrej białaczki limfoblastycznej (T-ALL) z komórek T (CCRF-CEM (CEM-WT), jej dwa subklony odporne na glikokortykosteroidy (GC) CEM-C7H2-R5C3 (CEM-C3) i CEM-C7R5 (CEM-R5)21,22 oraz podlinię CEM/R30dm23 oporną na metotreksat (MTX). Chociaż obecne terapie oparte na GC i MTX przynoszą korzyści kliniczne w około 90% przypadków, pojawienie się oporności na GK nadal stanowi nierozwiązany problem o niejasnym mechanizmie molekularnym. Aby wyizolować subklony odporne na GC, komórki CEM-WT hodowano w 1 μM deksametazonie (Dex) przez 2 do 3 tygodni. Odporna na MTX podlinia CEM/R30dm została opracowana poprzez wielokrotną krótkotrwałą (24 godziny) ekspozycję komórek CEM-WT na 30 μM MTX jako naśladownictwo protokołów klinicznych. Co ciekawe, ta linia komórkowa wykazywała również oporność krzyżową na Dex (niepublikowane wyniki), dla której mechanizm nie jest w pełni poznany.

Model guza litego badany w niniejszym badaniu to gruczolakorak przewodowy trzustki, znany ze swojej niezwykłej oporności na chemioterapię. W tym celu wybraliśmy linię komórkową Panc-1 i jej oporny na gemcytabinę subklon Panc-1R uzyskany w wyniku ciągłej inkubacji z 1 μM leku24. W tym miejscu opisujemy podejście do odkrywania nowych mechanizmów leżących u podstaw oporności na leki in vitro poprzez połączenie trzech protokołów: kolorymetrycznych testów cytotoksyczności w celu oceny wrażliwości leku w komórkach białaczkowych i komórkach rakowych z guzów litych, rurociągu opartego na sekwencjonowaniu RNA w celu identyfikacji nowych wariantów splicingu związanych z wrażliwością/opornością na leki oraz analizy RT-PCR i qRT-PCR w celu walidacji potencjalnych kandydatów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Charakterystyka profili oporności na leki za pomocą testów cytotoksyczności

  1. Hodowla linii komórkowych białaczki
    1. Utrzymuj macierzystą linię komórkową ALL T-CELL CCRF-CEM (CEM-WT), a także jej podlinie oporne na leki, w tym CEM/R30dm, CEM-R5 i CEM-C3, w 25 cm2 w 10 ml pożywki RPMI-1640 zawierającej 2,3 μM kwasu foliowego uzupełnionego 10% płodową surowicą cielęcą i 100 jednostkami/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny.
    2. Hodować komórki w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2
      3. .
    3. Pozwól na wzrost komórek do stężeń między 2 - 3 x 106 komórek/ml.
    4. Dzielić komórki dwa razy w tygodniu w początkowym stężeniu 0,3 x 106 komórek/ml (np. jeśli stężenie komórek wynosi 3 x 106 komórek/ml, przenieść 1 ml zawiesiny komórek do nowej kolby zawierającej 9 ml świeżej pożywki). Wyrzuć kulturę po 20 kolejnych przejściach.
  2. Hodowla linii komórkowej raka trzustki
    UWAGA: Utrzymuj ludzką linię komórkową raka trzustki Panc-1 w 75 cm2 kolbach hodowlanych w 10 ml pożywki DMEM z wysoką glukozą i L-glutaminą uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 jednostkami/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny. Wariant lekooporny, Panc-1R, jest hodowany w tej samej pożywce zawierającej 1 μM gemcytabinę rozpuszczoną w sterylnej wodzie. Więcej szczegółów można znaleźć w 24.
    1. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    2. Dziel komórki co 2-3 dni w stosunku 1:5, gdy komórki osiągną zbieg około 90%.
    3. Aby podzielić komórki, przemyć je dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), dodać 1 ml trypsyny/EDTA na 75 cm2 kolbę hodowlaną i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
    4. Dodać 9 ml pożywki i zebrać oderwane komórki do probówki o pojemności 15 ml. Nasiona 2 ml zawiesiny komórek w nowej kolbie zawierającej 8 ml pożywki. Wyrzuć kulturę po 20 kolejnych przejściach.
  3. Test MTT dla komórek białaczkowych
    1. Przygotować wcześniej roztwór MTT: rozpuścić 500 mg formazanu MTT w 10 ml PBS i mieszać (chronić przed światłem) mieszadłem magnetycznym przez około 1 godzinę. Wysterylizować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm. UWAGA: Roztwór można przechowywać w 10 ml porcji w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu chronić przed bezpośrednim światłem.
    2. Przygotować wcześniej zakwaszony izopropanol: dodać 50 ml 2 M HCl do 2,5 l izopropanolu. UWAGA: Przed użyciem należy przechowywać roztwór przez co najmniej miesiąc w temperaturze pokojowej. Jeśli izopropanol nie zostanie prawidłowo zakwaszony, może tworzyć osady z pożywką i pogorszyć odczyt spektrofotometryczny.
    3. Przygotuj oddzielną 96-dołkową płaską płytkę "Dzień 0" (kontrolną), aby zapewnić dokładniejsze oszacowanie zahamowania wzrostu: poświęć od 3 do 6 dołków na linię komórkową, dodaj 30 μl pożywki wzrostowej i 120 μl zawiesiny komórek (8 000 komórek) na każdą studzienkę i 150 μl pożywki wzrostowej do dołków odpowiadających ślepym próbom (bez komórek). Przejdź od kroku 1.3.9 do kroku 1.3.13 w tej sekcji, aby zmierzyć gęstość optyczną (OD). UWAGA: Więcej szczegółów znajduje się w punkcie 4.
    4. Przygotuj 96-dołkową płytkę doświadczalną z płaskim dnem: poświęć 30 dołków na stężenia leku (10 stężeń, każdy w trzech egzemplarzach), 10 dołków do komórek kontrolnych i 10 dołków do kontrolowania pożywki bez komórek (ślepe próby) i przygotuj zakres rozcieńczania leku deksametazonu (Dex) przy użyciu sulfotlenku dimetylu jako rozpuszczalnika.
      UWAGA: W przypadku ogniw CEM-WT zakres rozcieńczenia Dex wynosi od 2 μM do 0,97 nM. W przypadku ogniw CEM/R30dm, CEM-R5 i CEM-C3 zakres rozcieńczenia Dex wynosi od 640 μM do 0,33 nM.
    5. Dodać 30 μl z każdego rozcieńczenia Dex do odpowiedniego dołka na 96-dołkowej płytce. Upewnij się, że każde stężenie zostało włączone w trzech egzemplarzach.
    6. Dodać 30 μl pożywki wzrostowej do studzienek odpowiadających komórkom kontrolnym i 150 μl pożywki wzrostowej do studzienek odpowiadających ślepym próbom.
    7. Zbieraj wykładniczo rosnące komórki i zawieszaj je ponownie w optymalnym stężeniu wysiewu.
      UWAGA: W celu określenia optymalnych początkowych stężeń komórek, zaleca się ocenę profilu wzrostu każdej linii komórkowej linii komórkowej na 96-dołkowej płytce poprzez wysiewanie komórek w kilku stężeniach i mierzenie ich codziennie przez co najmniej 4 dni. Wybierz stężenie wysiewu, które zapobiegnie przerostowi komórek po 72 godzinach, ponieważ wpłynie to na eksperyment poprzez nasycenie wartości OD. Dla CEM-WT, CEM-C5 i CEM-R5 optymalne stężenie wysiewu wynosi 8 000 komórek/studzienkę, natomiast dla CEM/R30dm jest to 5 000 komórek/studzienkę.
    8. Dodać 120 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki zawierającej roztwór leku lub pożywkę wzrostową (studzienki odpowiadające komórkom kontrolnym). Wypełnić puste zewnętrzne studzienki płytki 150 μl PBS w celu zapewnienia dobrej wilgotności na płytce i inkubować płytki przez 72 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    9. Dodać 15 μl roztworu MTT do każdego dołka i wstrząsać płytką przez 5 minut za pomocą wytrząsarki do maksymalnej prędkości 900 wstrząsów/min.
    10. Umieścić płytki z powrotem w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych i inkubować przez kolejne 4-6 godzin.
    11. Dodać 150 μl zakwaszonego izopropanolu do każdej studzienki i dobrze wymieszać pipetą wielokanałową, aby dokładnie zawiesić wszystkie kryształy formazanu. Zacznij od pustych dołków i upewnij się, że dobrze wypłukałeś końcówki przed przejściem do kolejnego rzędu płytki.
    12. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut.
    13. Za pomocą czytnika mikropłytek określ średnicę zewnętrzną przy długości fali 540 i 720 nm, aby zapewnić dokładny pomiar poprzez skorygowanie o tło zewnętrzne. Następnie zapisz dane w pliku arkusza kalkulacyjnego i przeanalizuj je4.
  4. Test SRB na obecność komórek raka trzustki
    1. Rozpuścić odczynnik SRB w 1% kwasie octowym o końcowym stężeniu 0,4% (w/v).
    2. Rozpuścić kwas trichlorooctowy (TCA) w ultraczystej wodzie o końcowym stężeniu 50% (w/v).
    3. Rozpuścić tris(hydroksymetylo)aminometan w ultraczystej wodzie o końcowym stężeniu 10 mM.
    4. Przygotować oddzielną 96-dołkową płaską płytkę kontrolną "Dzień 0", aby zapewnić dokładniejsze oszacowanie zahamowania wzrostu: wysiewamy 6 dołków z komórkami rosnącymi w fazie wykładniczej w 100 μl pożywki przy odpowiednim stężeniu wysiewu i dodajemy 100 μl pożywki tylko do studzienek odpowiadających ślepym próbom. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu zapewnienia prawidłowego przylegania komórek do płytki. Następnie dodaj 100 μl pożywki do wszystkich studzienek i przejdź do kroków 1.4.8 - 1.4.16 tej sekcji.
    5. Przygotować 96-dołkową płytkę doświadczalną z płaskim dnem: komórki nasienne rosnące w fazie wykładniczej w trzech egzemplarzach na płaskich płytkach z płaskim dnem w 96 dołkach o odpowiedniej gęstości w 100 μl pożywki za pomocą wielokanałowej pipety.
      UWAGA: W celu określenia optymalnych początkowych stężeń komórek, zaleca się ocenę profilu wzrostu każdej linii komórkowej linii komórkowej na 96-dołkowej płytce poprzez wysiewanie komórek w kilku stężeniach i mierzenie ich codziennie przez co najmniej 4 dni. Wybierz stężenie wysiewu, które zapobiegnie przerostowi komórek po 72 godzinach, ponieważ wpłynie to na eksperyment poprzez nasycenie wartości OD. Dla komórek Panc-1 i Panc-1R optymalne stężenie wysiewu wynosi 8000 komórek/studzienkę.
    6. Dodać 100 μl pożywki do samych studzienek i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu zapewnienia prawidłowego przylegania komórek do płytki.
    7. Przygotować zakres rozcieńczania leku gemcytabiny między 1 μM a 10 nM dla Panc-1 i 1 mM oraz 100 nM dla komórek Panc-1R. Dodać 100 μl z każdego rozcieńczenia do odpowiedniego dołka na 96-dołkowej płytce za pomocą pipety wielokanałowej. Upewnij się, że każde stężenie jest w trzech egzemplarzach. Ponadto dodać 100 μl pożywki do studzienek zawierających tylko pożywkę i komórek kontrolnych. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 72 godziny.
    8. Dodać 25 μl zimnego roztworu TCA do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować płytki przez co najmniej 60 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia i utrwalenia białek na dnie studzienek.
    9. Opróżnij płytkę, usuwając podłoże i krótko wysusz na chusteczce.
    10. Umyj 5 razy wodą z kranu, a następnie opróżnij talerz i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
    11. Dodać 50 μl roztworu SRB do studzienki za pomocą powtarzalnej pipety i barwić przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    12. Opróżnij płytkę, usuwając plamę z SRB.
    13. Umyj 4 razy 1% kwasem octowym, a następnie opróżnij talerz i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
    14. Dodać 150 μl roztworu Tris do dołka za pomocą pipety wielokanałowej i mieszać przez 3 minuty na wytrząsarce płytkowej do maksymalnej liczby 900 wstrząsów/min.
    15. Odczytaj gęstość optyczną przy 540 nm (lub 492 nm, jeśli wartości OD są zbyt wysokie).
    16. Przeanalizuj dane.
  5. Analiza danych dla testów MTT i SRB
    1. Oblicz wartości OD komórek w "Dniu 0", korzystając z następującego wzoru:Dzień OD 0 =Komórki kontrolne OD - Średniagłębokość ślepa OD
    2. Obliczyć procent komórek, które przeżyły dla każdego stężenia leku, zgodnie z następującym wzorem: % komórek poddanych działaniu środka = Średnia [Komórki poddane działaniu OD - Średniagłębokość ślepa OD- Dzień 0]/[Komórki kontrolne OD - Średniagłębokość ślepa OD -Dzień OD0]*100
    3. Wykreślić krzywą dawka-odpowiedź (stężenie leku w funkcji zahamowania wzrostu w %).
    4. Obliczyć stężenie leku, który hamuje wzrost komórek o 50% (IC50), stosując krzywą dawka-odpowiedź.

2. Izolacja RNA i przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania RNA

  1. Pobieranie próbek i izolacja RNA
    1. W przypadku komórek CEM: zebrać10-6 komórek bezpośrednio z pożywki hodowlanej.
    2. Dla Panc-1 i Panc-1R: usunąć pożywkę, przemyć komórki dwukrotnie PBS i odłączyć, dodając trypsynę-EDTA i inkubując w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Dodać pożywkę hodowlaną i zebrać 10-6 komórek.
    3. Odwiruj próbki w temperaturze 300 x g przez 3 minuty, usuń supernatant i wyekstrahuj całkowite mRNA za pomocą dostępnych na rynku kolumn wirowych z membraną krzemionkową, postępując zgodnie z protokołem producenta.
    4. Określić stężenie i czystość całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru UV-Vis.
      UWAGA: RNA uważa się za o wysokiej czystości, jeśli współczynnik absorbancji 260 nm / 280 nm jest wyższy niż 1,8. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.
    5. Ocenić całkowitą integralność RNA za pomocą elektroforezy 200 ng próbki na 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny.
      UWAGA: Wykrycie dwóch nienaruszonych prążków odpowiadających ssakom rRNA 28S i 18S o wielkości około 2 kb i 1 kb wskazuje na dobrą całkowitą integralność RNA.
  2. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania
    1. Użyj 2 μg całkowitego mRNA na każdą próbkę. Postępuj zgodnie z protokołem przygotowania biblioteki mRNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Określ jakość i stężenie każdej biblioteki za pomocą systemu bioanalizatora. Połącz biblioteki w jednej próbce do końcowego stężenia 10 nmol/l i zmierz je za pomocą bioanalizatora.
    3. Korzystaj z systemu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości z trybem pojedynczego odczytu 100 bp.
      UWAGA: Długość odczytu > 80 pz jest niezbędna do identyfikacji izoform transkrypcyjnych.

3. Wykrywanie łączenia różnicowego na podstawie odczytów sekwencjonowania

  1. Dostosowanie odczytów do genomu referencyjnego i kontrola jakości
    1. Skompiluj adnotację genu (plik .gtf) z tabeli NCBI refGene za pomocą przeglądarki tabel UCSC (25 963 geny).
    2. Wykonaj wyrównanie z uwzględnieniem adnotacji odczytów sekwencjonowania z genomem referencyjnym (GRCh37) przy użyciu STAR.
    3. Sortuj i indeksuj wynikowe pliki wyrównania za pomocą narzędzi Picard.
    4. Przeprowadź kontrolę jakości po mapowaniu za pomocą RSeQC i samtools.
  2. Wykrywanie różnicowego łączenia między grupami próbek
    1. Zainstaluj język Python i odpowiadające mu wersje NumPy i SciPy. Pobierz i zainstaluj samtools. Pobierz i zainstaluj muszkę i cylinder,
    2. Dodaj katalogi Python, bowtie, tophat i samtools do zmiennej środowiskowej $PATH. Pobierz gotowe indeksy muszki (hg19). Pobierz rMATS w wersji 3.0.9.
      UWAGA: Więcej informacji na temat rMATS znajduje się w punktach 19 i 34.
    3. Wykryj alternatywne zdarzenia splicingu, porównując każdą linię komórkową oporną na Dex z CEM-WT i Panc-1 z Panc-1R w oddzielnych przebiegach MATS zgodnie z rysunkiem 5A.
    4. Aby wykryć zdarzenia splicingu różnicowego z wcześniej wyrównanych odczytów sekwencjonowania (pliki .bam), uruchom MATS przy użyciu poleceń z rysunku 5B dla porównań CEM-WT i CEM-C3, CEM-WT i CEM-R5, CEM-WT i CEM/R30dm oraz Panc1 do Panc-1R.
      UWAGA: MATS utworzy folder wyjściowy z dwoma plikami .txt z wynikami dla każdego typu analizowanego zdarzenia splicingu (SE - pomijanie eksonów, A5SS - alternatywne miejsce łączenia 5', A3SS - alternatywne miejsce łączenia 3', MEX - wzajemnie wykluczające się eksony i RI - retencja intronów): jeden plik zawierający wyniki oparte tylko na liczbie skrzyżowań i drugi plik z wynikami opartymi na liczbie połączeń i odczytach na cel. Ponadto w tym samym folderze generowany jest dodatkowy plik .txt z przeglądem wyników.
    5. W przypadku SE, A5SS, A3SS i RI zaimportuj do arkuszy kalkulacyjnych pliki .txt na podstawie liczby skrzyżowań i odczytów docelowych. W przypadku MEX importuj pliki .txt tylko na podstawie liczby skrzyżowań.
      UWAGA: Plik wyjściowy MATS jest sortowany według rosnących wartości P i zawiera kilka parametrów: identyfikator genu, symbol genu, położenie chromosomu i nici, współrzędne genomowe alternatywnie splicowanych fragmentów, liczby, a także długość form inkluzji i pomijania dla obu analizowanych próbek, długość formy inkluzji i pomijania używanej do normalizacji, wartość p, wskaźnik fałszywych odkryć (FDR), poziom włączenia dla każdej próbki na podstawie znormalizowanych liczb i różnicowego wyniku włączenia (average(IncLevel1) - average(IncLevel2)).
    6. Wybierz statystycznie istotne geny kandydujące o FDR<10% do dalszej walidacji (np. DDX5 i PKM2).
    7. Wizualizacja alternatywnych zdarzeń splicingu za pomocą Integrative Genomics Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), jak pokazano na rysunku 5.

4. Walidacja wyników za pomocą testów RT-PCR i qRT-PCR

  1. Wzór podkładu
    UWAGA: W celu zapewnienia wiarygodnej walidacji wyników uzyskanych przy użyciu potoku bioinformatycznego, transkrypty mRNA wynikające z alternatywnych zdarzeń splicingu są amplifikowane za pomocą RT-PCR i wizualizowane za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym produktów PCR. Zielony barwnik cyjaninowy, taki jak test SYBR green qRT-PCR, służy do ilościowego określania określonych wariantów splicingu w odniesieniu do genu porządkowego. Rysunek 7 przedstawia strategię zastosowaną do wizualizacji zdarzenia pomijania eksonu 12 genu DDX5 oraz do ilościowego określenia wzajemnie wykluczających się eksonów 9 i eksonów 10 genu PKM.
    1. W przypadku testu RT-PCR zaprojektuj pary starterów, które wyżarzają się do konstytutywnych egzonów (ekson 10 i ekson 13) znajdujących się przed i za alternatywnymi miejscami splicingu (Figura 7A).
      UWAGA: Wielkość amplikonu powinna obejmować od 100 do 800 pz, aby zapewnić wyraźne oddzielenie przewidywanych produktów PCR na żelu agarozowym. Temperatura wyżarzania podkładów powinna wynosić od 55 do 65 °C, a zawartość GC nie powinna przekraczać 60%.
    2. Test zieleni cyjaninowej (rysunek 7B).
      1. Sprawdź homologię sekwencji dwóch wzajemnie wykluczających się eksonów i zaprojektuj dwie pary starterów, z których każda specyficznie i wyłącznie wykrywa tylko jeden z dwóch wariantów splicingu.
        UWAGA: W przypadku PKM startery odwrotne wyżarzanie do eksonu 11 są wspólne dla obu wariantów, podczas gdy startery przednie są specyficzne dla wariantu i wyżarzanie do eksonu 9 (PKM1) lub eksonu 10 (PKM2).
      2. W celu wykrycia genu DDX5 o pełnej długości, należy wyżarzyć odwrotny starter w pominiętym eksonie (ekson 12).
        UWAGA: W celu specyficznego wykrywania wariantu DDX5 ΔEx12, starter odwrotny obejmuje granicę ekson11/ekson13. Użyj tego samego startera do przodu, który wyżarza się do konstytuującego się eksonu 10 dla obu reakcji.
        UWAGA: Wielkość amplikonu powinna wynosić od 80 do 200 pz.
  2. Synteza pierwszej nici cDNA
    1. Ustaw odwrotną transkrypcję 1 μg wyizolowanego RNA do cDNA przy użyciu 200 U/μl odwrotnej transkryptazy wirusa mysiej białaczki Moloneya (M-MLV) w buforze reakcyjnym rozcieńczonym w stosunku 1:5 sterylną wodą. Dodaj DTT 1 μM, 0,05 μg losowych heksamerów, mieszaninę deoksynukleotydów (dNTP) 1 mM i 40 U/μl inhibitora rybonukleazy.
    2. Krótko wykonać wir i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    3. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 70 °C przez 5 minut w celu dezaktywacji odwrotnej transkryptazy, przenieść mieszaninę na lód i odwirować za pomocą mikrowirówki. Próbki mogą być używane natychmiast lub przechowywane w temperaturze -20 °C.
  3. Reakcja RT-PCR i żel agarozowy
    1. Ustawić reakcję PCR w probówce PCR na każdą próbkę, mieszając 12,5 μl 2x skoncentrowanego mastermixu PCR, 1,25 μl 10 μM startera do przodu i taką samą ilość dla startera odwrotnego do końcowej objętości 25 μl ze sterylną wodą.
    2. Dodaj 1 μl cDNA do mieszanki i umieść probówki w termocyklerze. Uruchom program w następujący sposób: początkowa denaturacja: 95 °C przez 2 min. Powtórzyć następujące kroki przez 35 cykli: denaturacja w temperaturze 95 °C przez 25 sekund; wyżarzanie w temperaturze 52 °C przez 35 sekund; przedłużanie w temperaturze 72 °C przez 1 min. Ustaw końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C na 5 min.
    3. Przygotować 1% żel agarozowy, rozpuszczając 1 g agarozy w 100 ml 1x bufor TBE. Do roztworu dodać 2,5 μl bromku etydyny. UWAGA: bromek etydyny jest rakotwórczy, należy obchodzić się z nim ostrożnie, używając dygestorium chemicznego.
    4. Załadować próbki i uruchomić żel w 1x buforze TBE przy napięciu 100 V przez około 30 minut w systemie elektroforezy.
    5. Odsłoń żel za pomocą cyfrowej kamery UV i zapisz obraz.
  4. qRT-PCR i analiza danych
    1. Ustaw reakcję PCR z zielonym cyjaninem dla każdej próbki, mieszając 12,5 μl 2x zielonego PCR Mastermix, 2 μl 5 μM startera do przodu i taką samą ilość dla startera odwrotnego do końcowej objętości 15 μl ze sterylną wodą w probówce PCR. Przygotuj mieszankę dla każdego konkretnego wariantu splicingu, który ma zostać wykryty (PKM1, PKM2, DDX5 pełna długość, DDX5 ΔEx12) oraz dla genu porządkowego (GUS).
    2. Załaduj mastermix na białą 96-dołkową płytkę i przygotuj duplikaty dla każdej próbki.
    3. Rozcieńczyć cDNA 10x w wodzie, dodać 5 μl do każdej mieszanki i umieścić płytkę w termocyklerze. Uruchom program w następujący sposób: początkowa denaturacja: 95 °C przez 5 min. Powtórzyć następujące kroki dla 45 cykli: denaturacja w temperaturze 95 °C przez 10 sekund; wyżarzanie w temperaturze 58 °C (dla mieszanin DDX5 i DDX5 ΔEx12) lub 60 °C (dla mieszanin PKM1 i PKM2) przez 20 sek. Ustawić końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C na 20 sek. Ustawić krzywą topnienia, stosując gradient od 65 do 97 °C.
    4. Aby ocenić specyficzność zestawów starterów w stosunku do ich celu, należy sprawdzić krzywe topnienia i upewnić się, że w każdym zestawie starterów powstaje pojedynczy pik.
    5. Oblicz drugie wartości pochodne krzywych wzmocnienia i wyeksportuj wartości progowe cyklu (Ct).
    6. Obliczyć względne poziomy ekspresji (REL) wariantów splicingu mRNA w porównaniu z genem porządkowym (referencyjnym) GUS w każdej próbce przy użyciu metody "delta Ct (ΔCt)". Wzór jest następujący: REL = 2-ΔCt, gdzie ΔCt = Ct docelowy wariant splicingu - gen referencyjny Ct
    7. Aby określić ilościowo względną liczebność wariantów spawów, należy obliczyć współczynnik REL za pomocą wzoru: Stosunek REL współczynnik =wariant spawu REL 1/ wariantspawu REL 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisane w protokole testy cytotoksyczności stanowią niezawodną i solidną metodę oceny oporności komórek nowotworowych na środki chemioterapeutyczne in vitro. Za pomocą testu MTT określono wrażliwość na Dex w czterech liniach komórkowych T-ALL, w tym w wrażliwych na Dex komórkach macierzystych CEM-WT oraz w trzech podliniach opornych na Dex: CEM/R30dm, CEM-R5 i CEM-C3. Ze względu na dużą różnicę w wrażliwości między CEM-WT (2 µM - 0,97 nM) a liniami komórkowymi opornymi na Dex (64...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy nowatorskie podejście, które łączy dobrze znane techniki badań przesiewowych cytotoksyczności i potężne analizy transkryptomiczne oparte na NGS w celu identyfikacji zróżnicowanych zdarzeń splicingu w odniesieniu do oporności na leki. Testy spektrofotometryczne są wygodnymi i niezawodnymi metodami wysokoprzepustowymi do oceny wrażliwości leków w modelach nowotworów in vitro i stanowią pierwszy wybór dla wielu laboratoriów wykonujących badania przesiewowe cytotoksyczności. Rozwiązywanie pro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować prof. J.J. McGuire'owi, prof. R. Koflerowi i dr. K. Quintowi za dostarczenie odpornych linii komórkowych użytych w tej pracy. Badanie zostało sfinansowane z grantów Fundacji Cancer Center Amsterdam (CCA) (dla JC, EG i RS), fundacji KiKa (Children Cancer-free grant for AW), Kancelarii Adwokackiej Petera G. Angelosa Grant z Fundacji Badań Stosowanych Międzybłoniaka (dla VEG i EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), oraz Regione Toscana Bando FAS Salute (do EG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sulforodamina BSigma-Aldrich230162
Kwas trichlorooctowySigma-Aldrich251399
CCRF-CEMATCC, Manassas, Wirginia, Stany ZjednoczoneATCC CCL-119
Panc-1ATCC, Manassas, VA, USAATCC CRL-1469
DMEM wysoki poziom glukozyLonza, Bazylea, Szwajcaria12-604F
RPMI-1640 Gibco, Carlsbad, CA, USA11875093
Surowica płodowa bydła i cielęcaGreiner Bio-One, Frickenhausen, Niemcy758093
penicylina G siarczan streptomycynyGibco, Karlowe Wary, Kalifornia, USA15140122
Tris(hydroksymetylo)-aminometanSigma Aldrich252859
Formazan MTTSigma AldrichM2003
Anthos-Elisa-reader 2001Labtec, Heerhugowaard, Holandia96-dołkowy spektrofotometr płytkowy UV-Vis
Greiner CELLSTAR 96-dołkowe płytkiGreiner/SigmaM0812-100EA
Roztwór trypsyny/EDTA 100 mlLonza, Bazylea, SzwajcariaCC-5012
Kolby do hodowli komórkowych CELLSTAR 25 cm2Greiner Bio-One, Frickenhausen, Niemcy82051-074
Kolby do hodowli komórkowych CELLSTAR 75 cm3Greiner Bio-One, Frickenhausen, Niemcy82050-856
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (NaCl 0,9%)B.Braun Melsungen AG, Niemcy362 3140

Bibliografia

  1. Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
  2. McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40(2014).
  3. Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
  4. van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
  5. Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).
  6. Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
  7. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).
  8. Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).
  9. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).
  10. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
  11. Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
  12. Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).
  13. Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
  14. Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675(2015).
  15. Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).
  16. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
  17. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
  18. Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
  19. Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61(2012).
  20. Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
  21. Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).
  22. Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).
  23. McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).
  24. Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).
  25. Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).
  26. Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).
  27. Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. , (2016).
  28. Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15 (1), (2016).
  29. Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).
  30. Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).
  31. Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).
  32. Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).
  33. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
  34. Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Gen DDX5gen PKMwalidacja qRT-PCRtest MTTtest SRBaberracyjny splicing
Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.