Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji

Summary

Prezentujemy tutaj metodę rozwoju funkcjonalnych limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu (Ag) (Treg) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do immunoterapii autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim.

Abstract

Choroby autoimmunologiczne powstają z powodu utraty samotolerancji immunologicznej. Limfocyty T regulatorowe (Treg) są ważnymi mediatorami samotolerancji immunologicznej. Tregi reprezentują około 5-10% subpopulacji dojrzałych limfocytów T CD4 ⁺ u myszy i ludzi, przy czym około 1 - 2% tych limfocytów Treg krąży we krwi obwodowej. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą być różnicowane w funkcjonalne limfocyty Treg, które mogą być stosowane w terapiach komórkowych chorób autoimmunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy metodę wytwarzania limfocytów Treg specyficznych dla antygenu (Ag) z iPSC (tj. iPSC-Treg). Metoda opiera się na włączeniu czynnika transkrypcyjnego FoxP3 i receptora limfocytów T specyficznego dla Ag (TCR) do iPSC, a następnie różnicowaniu się na komórkach zrębu OP9 wykazujących ekspresję ligandów Notch delta-podobnych (DL) 1 i DL4. Po różnicowaniu in vitro iPSC-Treg wykazują ekspresję CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3 i TCR specyficznego dla Ag i są w stanie reagować na stymulację Ag. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana w terapii komórkowej autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim. Adoptywne przeniesienie tych specyficznych dla Ag iPSC-Treg do myszy z zapaleniem stawów wywołanym przez Ag (AIA) ma zdolność zmniejszania stanu zapalnego i obrzęku stawów oraz zapobiegania utracie masy kostnej.

Introduction

Autoimmunologiczne zapalenie stawów jest chorobą ogólnoustrojową charakteryzującą się przerostem tkanki maziowej i postępującym niszczeniem chrząstki stawowej, kości i więzadeł¹. Wadliwe wytwarzanie lub funkcja limfocytów Treg w autoimmunologicznym zapaleniu stawów przyczynia się do przewlekłego stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek, ponieważ limfocyty Treg odgrywają kluczową rolę w zapobieganiu rozwojowi autoreaktywnych komórek odpornościowych.

Manipulacja limfocytami Treg jest idealną strategią dla rozwoju terapii tłumiących stan zapalny w sposób zależny od Ag. W przypadku immunoterapii opartej na limfocytach Treg swoistość przenoszonych limfocytów Treg jest ważna w leczeniu trwającej choroby autoimmunologicznej². Aby wykazywać aktywność supresyjną, limfocyty Treg muszą migrować i być zatrzymywane w dotkniętym regionie, co może być kierowane przez specyfikę TCR dla Ag w tej lokalizacji³. Chociaż poliklonalne Treg mogą zawierać niewielką populację zawierającą tę specyficzność Ag z ich TCR, liczba tych Treg specyficznych dla Ag jest zwykle niska. W związku z tym terapie komórkowe z wykorzystaniem poliklonalnych limfocytów Treg przeciwko chorobom autoimmunologicznym wymagają adoptywnych transferów dużej liczby limfocytów Treg^4,5. Ponieważ pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) mają zdolność przekształcania się w dowolny typ komórek, specyficzne dla Ag PSC-Treg mogą okazać się dobrymi kandydatami do immunoterapii opartej na Treg. Wcześniejsze badania wykazały pomyślny rozwój limfocytów T pochodzących z PSC, w tym Tregs^6-8.

Tutaj opisujemy protokół do tworzenia specyficznych dla Ag iPSC-Tregs. Dalej opisujemy terapię komórkową autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim przy użyciu takich limfocytów Treg. Metoda ta opiera się na genetycznie modyfikowanych mysich iPSC za pomocą TCR specyficznych dla Ag i czynnika transkrypcyjnego FoxP3. Zmodyfikowane iPSC następnie różnicują się w specyficzne dla Ag Treg na komórkach zrębu OP9 eksprymujących ligandy Notch DL1, DL4 i cząsteczki MHC-II (^{I-A b}) w obecności cytokin mFlt3L i mIL-7. Te specyficzne dla Ag iPSC-Treg mogą wytwarzać cytokiny supresyjne, takie jak TGF-β i IL-10, gdy są stymulowane przez Ag, a adoptywny transfer takich Treg ma zdolność tłumienia rozwoju AIA w modelu mysim. Opisany protokół może być wykorzystany do opracowania limfocytów Treg specyficznych dla Ag pochodzących z komórek macierzystych do potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Pennsylvania State University College of Medicine (protokół IACUC #45470) i są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Stowarzyszenia Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi.

1. Hodowla komórek macierzystych

1. Inkubować 10 cm naczynie z 10 ml 0,1% żelatyny przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C (inkubator) w celu pokrycia płytki.
2. Usunąć żelatynę z naczynia i umieścić na płytce 3 x 10⁶ napromieniowanych komórek SNL76/7 i inkubować przez jeden dzień w temperaturze 37 °C (inkubator) przy użyciu 10% pożywki DMEM (10% FBS i 1% streptomycyny penicylinowej).
3. Usuń pożywkę z płytki i posaz rozmrożone iPSC na warstwie zasilającej komórki SNL76/7 za pomocą pożywki iPSC (pożywka DMEM zawierająca 15% płodowej surowicy cielęcej, 0,1 mmol/L aminokwasów endogennych, 1 mmol/L L-glutaminy i 0,1 mmol/L β-merkaptoetanolu)⁹. Mysia linia komórkowa iPS-MEF-Ng-20D-17, która została indukowana z mysich fibroblastów embrionalnych przez retro transfekcję wirusa Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-Myc, uzyskano od dr Shinya Yamanaka (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Kyoto, Japonia).
4. W dniu 3 należy zmienić pożywkę na świeżą pożywkę i obserwować kolonie iPSC pod mikroskopem.
   UWAGA: Te kolonie są małymi, błyszczącymi skupiskami lub okrągłymi komórkami z wyraźnym rozgraniczeniem pokazującym ekspresję GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym.

2. Różnicowanie in vitro iPSC-Treg specyficznych dla Ag

1. Wygeneruj konstrukty do wykorzystania w transdukcji retrowirusowej poprzez subklonowanie genów OT-II TCR i FoxP3 do plazmidu MiDR¹⁰ połączonego z samorozszczepiającym peptydem 2A, aby utworzyć konstrukt MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3.
2. Przeprowadzić transdukcję retrowirusową⁹ iPSC przy użyciu komórek Plat E jako linii komórek pakujących.
3. W dniu 0 wysiewaj komórki^b OP9-DL1-DL4-I-A o minimalnej gęstości 10⁴ komórek/cm² przy użyciu pożywki OP-9 (pożywki α-MEM zawierające 20% FCS i 2,2 g/l wodorowęglanu sodu. Talerz 1 x 10⁶ komórek na 10 cm naczynie.
4. W 3 dniu, gdy komórki^b OP9-DL1-DL4-I-A zlewają się w 80-90%, usuń pożywkę i zasiej 0,5 - 1 x 10⁵ komórek^iPSC na komórkach b OP9-DL1-DL4--I-A w pożywce OP-9.
   UWAGA: Ustanawia to kokulturę iPSC na komórkach^B OP9-DL1-DL4-I-A i jest uważane za dzień 0 różnicowania⁹.
5. W dniu 5 należy wyjąć pożywkę z naczynia o średnicy 10 cm przez aspirację, przemyć komórki 10 ml 1x PBS i odessać PBS. Dodać 4 ml 0,25% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Dodać kolejne 8 ml pożywki iPSC do komórek, ponownie je zawiesić i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   1. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki iPSC. Ponownie zawieszone komórki inkubować na świeżym 10 cm naczyniu i ponownie umieścić w inkubatorze przez 30 minut.
      UWAGA: Usuń ogniwa zasilające OP9-DL1-DL4-I-A^b i utrzymuj różnicujące się iPSC unoszące się w podłożu. Utrzymuj limfocyty^B OP9-DL1-DL4-I-A w sposób ciągły, aby osiągnąć 80 - 90% konfluencji dla dalszej kohodowli.
   2. Po 30 minutach zbierz pływające komórki, przefiltruj je przez sitko o wielkości 70 μm i policz komórki za pomocą hemocytometru.
6. Zasiewaj 5 x 10⁵ iPSC do świeżego 80-90% konfluentu komórek^b OP9-DL1-DL4-I-A w pożywce OP9. Uzupełnij pożywkę mFlt-3L w końcowym stężeniu 5 ng/ml.
7. W 8 dniu należy zebrać częściowo zróżnicowane iPSC, myjąc płytkę pożywką z samego naczynia za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Użyj kolejnych 5 ml pożywki OP-9 w naczyniu, aby delikatnie zmyć częściowo przylegające komórki poprzez ostrożne, mocne pipetowanie, aby nie złamać monowarstwy OP9 na dnie naczynia. Powtórzyć płukanie z 10 ml PBS, aby zebrać wszystkie częściowo przylegające komórki różnicujące.
   1. Połączyć oba płuczki, odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, ponownie zawiesić w 10 ml pożywki OP9 zawierającej mFlt-3L (5 ng/ml) i mIL-7 (1 ng/ml) i przefiltrować przez sitko o wielkości 70 μm.
8. Przenieś komórki na 6-dołkową płytkę hodowlaną zawierającą 80 - 90% zlewających się komórek^B OP9-DL1-DL4-I-A, jak w kroku 1.1. Przenieść komórki zebrane z jednego 10-centymetrowego naczynia do jednego dołka na płytce 6-dołkowej.
9. W 10 dniu zmień połowę pożywki z komórek na świeżą pożywkę OP9 uzupełnioną mFlt-3L (5 ng / ml) i mIL-7 (1 ng / ml). Powtarzaj ten krok co dwa dni.
10. Co 4-6 dni, w zależności od wzrostu, należy ponownie wysiać różnicujące się iPSC na płytki ze świeżą warstwą komórek^b OP9-DL1-DL4-I-A, jak opisano w kroku 1.1.

3. Ocena różnicowania i dojrzewania limfocytów Treg in vitro

1. Zmiany morfologiczne różnicujących się iPSC.
   1. Monitoruj codzienną kohodowlę iPSC z komórkami^b OP9-DL1-DL4-I-A, obserwując żywe komórki pod konwencjonalnym mikroskopem jasnego pola (20X). Do 5 dnia obserwuj kolonie o cechach podobnych do mezodermy, takich jak spłaszczone komórki. Do 8 dnia obserwuj małe, okrągłe skupiska komórek, które reprezentują komórki różnicujące się.
   2. Użyj metody wykluczenia błękitu trypanowego, aby policzyć komórki w celu wykrycia liczby i procentu żywych komórek. Oblicz żywotność komórek jako liczbę żywotnych komórek podzieloną przez całkowitą liczbę komórek w czterech siatkach na hemocytometrze. Jeśli komórki pobierają błękit trypanowy, uważaj je za martwe lub niezdolne do życia. Zapisać liczbę żywych komórek pobranych z hodowli.
2. Analiza różnicowania iPSC za pomocą cytometrii przepływowej.
   1. W dniach 5, 7, 11, 15, 19, 21 i 28 wspólnej hodowli usuń komórki z 0,25% trypsyny, jak w kroku 25.
   2. Przed barwieniem powierzchni różnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem należy inkubować 1 x 10⁶ komórek ze 100 μl blokera Fc 2,4G2 rozcieńczonego w PBS (stężenie końcowe 10 μg/ml) w temperaturze 4 °C przez 20 minut, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciała z receptorem Fc na powierzchni komórki.
   3. W dniach 5, 7, 11, 15, 19, 21 i 28 użyj 1 x 10⁶ komórek do cytometrii przepływowej z różnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem w celu wykrycia markerów powierzchniowych komórek, w tym CD3, TCRβ, CD4, CD8, CD25 i CTLA4.
   4. Po bloku Fc przemyć komórki 10 ml PBS i wybarwić różnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przez 20 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej za pomocą 15-kolorowego cytometru przepływowego. Użyj 0,200 μg przeciwciała na 10⁶ komórek rozcieńczonych w 100 μl PBS.
   5. W dniu 28 przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej¹¹ i bramki na komórkach CD4 ⁺ CD8 ⁺ za pomocą barwienia sprzężonego z fluorochromem CD4 i CD8; przeanalizuj pod kątem ekspresji TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4 i FoxP3 (Figura 1). W przypadku barwienia FoxP3 utrwal komórki i przemącz je, a następnie wykonaj barwienie przeciwciałami¹¹.
3. Stymulacja antygenowa in vitro iPSC.
   1. W 28 dniu kohodowli zbierz iPSC-Treg z kultur, zbierając pływające komórki. Trypsynizować pozostałe komórki 0,25% trypsyny (jak w kroku 2.5) i ponownie zawiesić komórki w 8 ml pożywki iPSC. Wirować przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze pokojowej, odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki.
      1. Ponownie zawieszone komórki inkubować w nowym naczyniu o średnicy 10 cm w temperaturze 37 °C przez 30 minut i zebrać unoszące się na nim komórki. Umyj komórki zimnym PBS.
   2. Inkubować 3 x 10⁶ splenocytów ze śledziony myszy C57BL / 6 Rag1-/- z 5 μM peptydem albuminy jaja kurzego w 200 μl pożywki (OVA_323-339) w temperaturze 4 °C przez 30 minut na 96-dołkowej płytce¹¹.
   3. Wymieszaj limfocyty Treg ze splenocytami pulsacyjnymi OVA_323-339 w stosunku 1:4 (użyj 0,75 x 10⁶ Treg). Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ przez 40 godzin. W ciągu ostatnich 4 godzin dodać 4 μl rozcieńczonej pożywki Brefeldin A do kultury (rzeczywiste stężenie 1,000x, rozcieńczone w 1x pożywce hodowlanej).
   4. Zebrać komórki 0,25% trypsyną (jak w kroku 2.5), przemyć 10% roztworem NaN₃ i 0,5 M roztworem EDTA (bufor FACS), zablokować 100 μl rozcieńczonego (końcowe stężenie 10 μg/ml) blokera Fc 2,4G2 i zabarwić markery powierzchniowe, CD4, CD8, TCRVα2 i TCRVβ5, jak w krokach 3.2.3-3.2.4.
   5. Utrwalić komórki 4% roztworem paraformaldehydu w PBS i przepuścić 100 μl 1x buforu permeabilizacji po zabarwieniu powierzchni komórki. ostrożność! Paraformaldehyd jest alergizujący, rakotwórczy i toksyczny.
   6. Barwić komórki TGF-β i IL-10 sprzężonym z fluorochromem przez 20 minut w ciemności. Użyj 0,200 μg przeciwciała/10⁶ komórek rozcieńczonych w 100 μl PBS. Wykryj wewnątrzkomórkową produkcję TGF-β i IL-10 za pomocą 15-kolorowego cytometru przepływowego (ryc. 2).
   7. Przepłukać komórki trzykrotnie zimnym buforem FACS przed analizą cytometryczną przepływową¹¹.
4. Utrzymywanie się in vivo iPSC-Treg swoistych dla Ag.
   1. Po 8 dniach wspólnej hodowli na limfocytach^b OP9-DL1-DL4-I-A przenieś pre-Treg pochodzące z iPSC (Thy1.2), jak w kroku 3.3.1, do myszy kongenicznych Thy 1.1 (4-6 tygodni) poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej bez znieczulenia. Przed wykonaniem iniekcji żyły ogonowej należy rozszerzyć żyłę ogonową za pomocą lampy na podczerwień przez 5 minut. Po rozszerzeniu żyły ogonowej umieść mysz w uwięziele i adoptuj przenieść 3 x 10⁶ komórek zawieszonych w 200 μl PBS poprzez wstrzyknięcie przez żyłę ogonową.
   2. Sześć tygodni po przeniesieniu Treg należy poddać myszy eutanazji przez uduszenie CO₂, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Upewnij się, że myszy nie oddychają. Otwórz jamę otrzewnej, przecinając zewnętrzną skórę otrzewnej za pomocą nożyczek i kleszczy i delikatnie odciągając ją, aby odsłonić wewnętrzną skórę wyściełającą jamę otrzewnej. Odizoluj śledzionę i obwodowe węzły chłonne myszy kongenicznych, którym wstrzyknięto Thy 1.1.
   3. Zbierz komórki ze śledziony i węzłów chłonnych za pomocą mechanicznego łamania, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Inkubować komórki z 5 ml buforu do lizy ACK przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy czerwonych krwinek. Zebrać i przepłukać pozostałe splenocyty lub limfocyty 10 ml zimnego buforu FACS.
   4. Po przemyciu należy potraktować komórki blokerem Fc 2,4G2 w temperaturze 4 °C przez 20 minut, jak w kroku 3.2.2 i wybarwić 100 μl rozcieńczonych przeciwciał anty-Thy 1,2 sprzężonych z fluorochromem.
   5. Przemyć komórki 10 ml buforu FACS i przystąpić do analizy cytometrycznej^{przepływowej 11}.

4. Dojrzewanie in vivo i tłumienie autoimmunologicznego zapalenia stawów

1. Wygeneruj konstrukcje jak w kroku 2.1.
2. Wykonać transdukcję retrowirusową⁹ jak w kroku 2.2.
3. Różnicowanie in vivo i indukcja zapalenia stawów u myszy.
   1. Różnicować iPSC transdukowane przez OT-II TCR / FoxP3 (OT-II-FoxP3 / iPSC), iPSC transdukowane FoxP3 i iPSC transdukowane DsRed na komórkach zrębowych b OP9-DL1-DL4-I-A b w obecności cytokin mFlt-3L i mIL-7 przez 8 dni, jak opisano w krokach 2.1 - 2.6.
   2. Trypizynizować wszystkie trzy rodzaje komórek z płytki o średnicy 10 cm i ponownie zawiesić komórki z każdej płytki o średnicy 10 cm w 10 ml świeżej pożywki. Dodaj komórki do świeżej płytki o średnicy 10 cm i wróć do inkubatora na 30 minut. Po 30 minutach zbierz pływające komórki.
   3. Przepuść komórki przez sitko o wielkości 70 μm, aby usunąć skupiska komórek i policzyć za pomocą hemocytometru. Dostosuj komórki do stężenia 1,5 x 10⁷ komórek/ml w zimnym PBS i ponownie przefiltruj w razie potrzeby. Utrzymuj komórki na lodzie, aż adoptywne przeniesienie komórek do myszy.
   4. Wstrzyknąć 200 μl zawiesiny komórkowej (3 x 10⁶ komórek) trzem różnym grupom 4-6 tygodniowych samic myszy C57BL/6 przez żyłę ogonową, jak opisano w 3.4.1
   5. W 10 dniu po transferze komórek wstrzyknij myszom 100 μg mBSA zemulgowanego w kompletnym adiuwant Freunda u podstawy ogona za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml.
   6. W dniu 17 znieczulij myszy za pomocą parownika izofluranu (zgodnie z wytycznymi IACUC). Stosować 4 - 5% izofluranu do indukcji i 1 - 2% do konserwacji. Wywołać zapalenie stawów przez dostawowe wstrzyknięcie 20 μg mBSA w 10 μl PBS w lewym stawie kolanowym oraz 20 μg mBSA i 100 μg całych OVA w 10 μl PBS w prawym stawie kolanowym. Jedzenie i żel można położyć na podłodze po rozwinięciu się zapalenia stawów. Myszy zostaną poddane eutanazji: ocena kondycji ciała (BCS) 2/5 lub w stanie agonalnym, ciężka kacheksja i/lub uporczywe leżenie (okres 24 godzin) oraz ocena ciężkości 4. W wyniku 4 rumień i silny obrzęk obejmują kostkę, stopę i palce, lub zesztywnienie kończyny.
4. Charakterystyka iPSC transdukowanych przez OT-II TCR/FoxP3.
   1. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego (20X), aby uwidocznić nieutrwalone żywe komórki DsRed⁺ GFP⁺.
   2. Zbadaj integrację i ekspresję genów zarówno za pomocą Western blot, jak i cytometrii przepływowej¹¹.
5. Rozwój i dojrzewanie limfocytów Treg.
   1. W 2, 4 i 6 tygodniu po transferze komórek należy poddać myszy eutanazji. W przypadku eutanazji w każdej klatce należy użyć 1 - 2 l CO₂ w pierwszym etapie. Gdy zwierzę straci przytomność, należy zwiększyć natężenie przepływu CO₂ do 4 - 5 l/min. Poddaj myszy eutanazji przez wdychanie CO₂ . Odizoluj śledzionę i opróżnij węzły chłonne, przecinając zewnętrzną skórę otrzewnej za pomocą nożyczek i kleszczy i delikatnie odciągając ją do tyłu, aby odsłonić wewnętrzną skórę wyściełającą jamę otrzewnej.
   2. Zawiesinę jednokomórkową pobrać ze śledziony i węzłów chłonnych przez mechaniczny rozkład za pomocą sitka do komórek i strzykawki o pojemności 1 ml w pożywce 1% iPSC. Odwirować stożkową probówkę zawierającą pożywkę o masie 400 g przez 5 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu do lizy ACK w celu lizy czerwonych krwinek. Ponowne odwirowanie przy 1 000 obr./min przez 5 min. Ponownie zawiesić osad komórkowy i umyć pozostałe splenocyty lub limfocyty zimnym buforem FACS. Wykonaj kroki 3.4.4 - 3.4.5 i przejdź do analizy cytometrii przepływowej.
6. Barwienie wewnątrzkomórkowe.
   1. W 50 dniu po prowokacji wyizolować śledzionę i opróżnić węzły chłonne myszy (jak w kroku 4.5.1) po eutanazji przez wdychanie CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
   2. Zawiesinę jednokomórkową pobrać ze śledziony i węzłów chłonnych przez mechaniczny rozkład za pomocą sitka do komórek i strzykawki o pojemności 1 ml. Inkubować splenocyty w temperaturze pokojowej przez 5 minut z 5 ml buforu do lizy ACK w celu lizy czerwonych krwinek. Zebrać i umyć pozostałe splenocyty lub limfocyty zimnym buforem FACS. Wykonaj kroki 3.2.3 - 3.2.4, ale zabarwić za pomocą znaczników powierzchni CD4, CD8, CD25 i TCRVβ5.
   3. Przystąp do utrwalania komórek do barwienia wewnątrzkomórkowego, jak opisano w 3.3.5 - 3.3.7 i analizuj produkcję cytokin wewnątrzkomórkowych (TGF-β i IL-10) Tregów pochodzących z iPSC i bramki na żywych komórkach CD4 ⁺ CD25 ⁺.
7. Naciekanie limfocytów Treg specyficznych dla Ag w kolanach i tłumienie zapalenia stawów.
   1. Postępując zgodnie z krokami (4.3 - 4.3.6) w dniach 7 - 14 po indukcji zapalenia stawów, należy poddać myszy eutanazji przez wdychanie CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy (zgodnie z wytycznymi IACUC). Usuń włosy z kolan za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia i wytnij kolana za pomocą zabiegu chirurgicznego.
   2. Usuń skórę z nóg, wykonując nacięcie w tylnej nodze nożyczkami o końcu i przeciąć skórę w poprzek uda i w dół do kostki. Delikatnie peeling skóry na nodze i stopie, aby odsłonić mięsień. Ostrożnie usuń mięsień z nogi, nie uszkadzając stawu kolanowego.
      1. Przetnij tylną nogę tuż nad stawem miednicy/biodrowym i odetnij kość piszczelową ostrymi nożyczkami preparacyjnymi.
   3. Umocuj kolana w 4% formalinie przez 48 godzin. Odwapnij kolana za pomocą 2,5 M kwasu mrówkowego; spłucz trzykrotnie ksylenem przez 3 minuty, spłucz dwa razy w 100% etanolu, spłucz dwa razy w 95% etanolu, spłucz dwa razy w wodzie dejonizowanej przez 2 minuty i odwapnij w 1 mM EDTA. Traktować w temperaturze poniżej wrzenia (90 °C) przez 20 minut.
   4. Schłodzić utrwaloną chusteczkę przez 30 min. Płukać ją 1x PBS przez 4 minuty i zanurzyć w parafinie. Odwodnić tkanki przez serię kąpieli etanolowych, aby wyprzeć wodę, a następnie naciekać je woskiem. Następnie zanurz naciekane tkanki w blokach woskowych. Wykonaj zarówno pionowe, jak i poziome cięcie w celu barwienia. Przygotować skrawki o wielkości 4 μm za pomocą przesuwnego mikrotomu.
   5. Wykonać barwienie immunofluorescencyjne na skrawkach po standardowych procedurach deparafinowania i rehydratacji przy użyciu ksylenu i etanolu¹².
   6. Zablokować endogenną aktywność peroksydazy, zanurzając szkiełko w wystarczającej ilości 3% roztworu nadtlenku wodoru na 3 minuty po pobraniu Ag. Szkiełka blokowe do niespecyficznego wiązania w 3% BSA w PBS w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze przez 60 min.
   7. Wybarwić skrawki 200 μl przeciwciała TCRVβ5 sprzężonego z fluorochromem rozcieńczonego w stosunku 1:100 w roztworze blokującym. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w komorze 75 - 100% wilgotnej i myć 5 razy w 1x PBS przez 5 minut.
   8. Przeciwbarwić szkiełka do barwienia jądrowego odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu zawierającym DAPI. Dodać około 300 μl rozcieńczonego roztworu barwiącego DAPI (300 nM w 1x PBS) do szkiełka nakrywkowego, upewniając się, że całe szkiełko nakrywkowe jest pokryte. Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu analizy pod mikroskopem fluorescencyjnym (ryc. 3).
8. Test supresji zapalenia stawów
   1. Zmierz obrzęk obu kolan myszy przed indukcją zapalenia stawów za pomocą suwmiarki zegarowej, aby ustalić linię bazową.
   2. Postępuj zgodnie z krokami (4.3 - 4.3.6) dla indukcji zapalenia stawów i transferu Treg. Zmierz kolana myszy za pomocą suwmiarki zegarowej po transferze Treg.
   3. Oblicz procentowy wzrost średnicy kolana: Procentowy wzrost = (Średnica kolana w dniu 1 - Średnica kolana w dniu 0) / Średnica kolana w dniu 0.
9. Pomiar zniszczenia stawów i naciekania komórek zapalnych w kolanach za pomocą histologii (ryc. 4).
   1. W 7 dniu po indukcji zapalenia stawów należy poddać myszy eutanazji zgodnie z wcześniejszym opisem i wyciąć kolana za pomocą zabiegu chirurgicznego. Patrz kroki 4.7.1 - 4.7.2.
   2. Utrwal kolana w 4% formalinie, odwapnij w EDTA i zanurz w parafinie. Patrz krok 4.7.3
   3. Usuń oba kolana, utrwal w 10% formalinie i zwapniej w Formical-4. Zanurzyć tkanki w parafinie, przeciąć na 4 μm i wybarwić hematoksyliną i eozyną (H i E) lub barwieniem Safraniną O (jak w kroku 4.7.7) i obserwować pod mikroskopem.
   4. Użyj barwienia H & E do oceny erozji kości za pomocą półilościowego systemu punktacji (0: brak nadżerek; 4: przedłużone nadżerki i zniszczenie kości). Użyj barwienia Safraniną O, aby ocenić utratę proteoglikanów i ocenić za pomocą półilościowego systemu punktacji (0: brak utraty proteoglikanów; 3: całkowita utrata barwienia dla proteoglikanów).
      1. Użyj półilościowego systemu punktacji, aby ocenić naciek komórek zapalnych na szkiełkach barwionych H i E (0: brak naciekania komórek; 4: obfita infiltracja komórek). Oceń wyniki, badając oba kolana w ślepy sposób.

5. Pomiar ubytku kości w kolanach za pomocą systemu mikrotomografii komputerowej (micro-CT) o wysokiej rozdzielczości

1. W 10 dniu po indukcji zapalenia stawów znieczulij myszy 2% izofluranem i przygotuj się do obrazowania.
2. Ułóż myszy z kolanami skierowanymi do góry w komorze.
3. Użyj systemu mikro-CT o wysokiej rozdzielczości, aby uzyskać obrazowanie in vivo architektury kości wokół kolan myszy.
4. Wykonaj skany mikro-CT o długości 2,2 mm, w tym stawy kolanowe myszy o następujących parametrach: rozmiar woksela 10,5 μm przy 55 kv, czas integracji 145 μA 200 ms, 211 obrazów.
5. Importuj obrazy z mikrotomografii komputerowej i przechwytuj obrazy płaszczyzny czołowej po dalszym przetwarzaniu obrazu (renderowanie objętościowe i transformacja) (ryc. 5).

Results

Jak pokazano tutaj, w dniu 28, specyficzne dla Ag Tregi znacznie wyrażały CD3 i specyficzny dla Ag TCR, dwa markery limfocytów T. Populacja CD3 ⁺ TCRVβ5 ⁺ wykazywała ekspresję CD4. Większość komórek CD3 ⁺ TCRVβ5 ⁺ CD4 ⁺ wyraża również CD25, CD127 i CTLA-4, które zwykle ulegają ekspresji na podwyższonych poziomach w naturalnie występujących T_regach (nTregs) oraz w komórkach T eksprymujących ektopowo FoxP3. Ekspresja FoxP3 w ...

Discussion

W tym protokole krytycznym etapem jest różnicowanie in vitro iPSC transdukowanych genem TCR/FoxP3. Metody in vitro Sygnalizacja Notch indukuje rozwój w kierunku linii limfocytów T. Aby zróżnicować iPSC w limfocyty Treg CD4 ⁺ FoxP3 ⁺ , użyliśmy limfocytów^b OP9-DL1 / DL4 / I-A, które wykazują wysoką ekspresję cząsteczek MHC II (I-A^b). Większość iPSC różnicuje się w komórki CD4⁺ . Jednak po powierzchniowej ekspresji TCR wiele zróżnicowanych komórek pre...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myszy C57BL/6j	Jackson Laboratory	664
B6.129S7 Rag1tm1Mom/J	Jackson Laboratory	2216
Przeciwciało anty-CD3 (2C11)	BD Pharmingen	553058
Przeciwciało anty-CD28 (37.51)	Przeciwciało Pharmingen	553295
Anti-CD4 (GK1.5)	Biolegend	100417
Anty-CD8 ( 53– 6.7) przeciwciało	Biolegend	100714
przeciwciało anty-CD25 (3C7)	Biolegend	101912
Anti-TCR-β (H57597) przeciwciało	Biolegend	109220
Anti-IL10	Biolegend	505010
Anti-TGFβ	Biolegend	141402
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Brefeldin A	Sigma	B7651
Polybrene	Sigma	107689
Genejammer	Zintegrowana nauka	204130
ACK Bufor do lizy	Lonza	10-548E
mFlt-3L	peprotech	250-31L
mIL-7	peprotech	217-17
Żelatyna	Sigma	G9391
Paraformaldehyd	Sigma	P6148-500G	Uwaga: Alergenne, rakotwórcze, toksyczne
Bufor permeabilizacji	Biolegend
mBSA	Sigma	A7906
Albumina Ova	Avantor	0440-01
CFA	Difco	2017014
Ogranicznik Tailveiner	Braintree scientific	RTV 150-STD