Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu

10.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54735

⸱

27 października 2016

 , 
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science, 2Department of Biology, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

Danio pręgowany staje się cennym modelem przetwarzania lipidów w diecie i chorób metabolicznych. Opisano protokoły żywienia larw bogatych w lipidy, obrazowanie na żywo fluorescencyjnych analogów lipidów w diecie oraz ilościowe oznaczanie spożycia pokarmu. Techniki te można zastosować do różnych technik badań przesiewowych, obrazowania i dociekań opartych na hipotezach.

Streszczenie

Danio pręgowany wyłania się jako model przetwarzania lipidów w diecie i chorób metabolicznych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób karmić larwy danio pręgowanego mączką bogatą w lipidy, która składa się z emulsji liposomów żółtka jaja kurzego powstałych w wyniku sonikacji żółtka jaja w pożywce zarodkowej. Podano szczegółowe instrukcje dotyczące badania larw pod kątem spożycia żółtka jaja, tak aby larwy, które nie żerują, nie zafałszowały wyników eksperymentów. Liposomy żółtka jaja kurzego mogą być wzbogacane fluorescencyjnymi analogami lipidów, w tym kwasami tłuszczowymi i cholesterolem, umożliwiając zarówno ogólnoustrojową, jak i subkomórkową wizualizację przetwarzania lipidów w diecie. Opisano kilka metod montowania larw, które sprzyjają krótko- i długoterminowemu obrazowaniu na żywo zarówno z pionowymi, jak i odwróconymi obiektywami przy dużym i małym powiększeniu. Dodatkowo przedstawiono test do ilościowego określania spożycia pokarmu przez larwy poprzez ekstrakcję lipidów larw karmionych fluorescencyjnymi analogami lipidów, plamienie lipidów na płytce chromatografii cienkowarstwowej i ilościowe określanie fluorescencji. Na koniec omówiono krytyczne aspekty procedur, ważne kontrole, opcje modyfikacji protokołów w celu rozwiązania konkretnych pytań eksperymentalnych oraz potencjalne ograniczenia. Techniki te mogą być stosowane nie tylko do ukierunkowanych, opartych na hipotezach badań, ale także do różnych badań przesiewowych i technik obrazowania na żywo w celu badania metabolizmu lipidów w diecie i kontroli spożycia pokarmu.

Wprowadzenie

Mechanizmy, za pomocą których jelito reguluje przetwarzanie lipidów w diecie, wątroba kontroluje złożoną syntezę lipidów i metabolizm lipoprotein, oraz jak te organy współpracują z ośrodkowym układem nerwowym w celu kontrolowania przyjmowania pokarmu, nie są w pełni zrozumiałe. Wyjaśnienie tej biologii w świetle obecnych epidemii otyłości, chorób układu krążenia, cukrzycy i niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby ma znaczenie biomedyczne. Badania na hodowli komórkowej i myszach dostarczyły nam większości wiedzy na temat mechanistycznych związków między lipidami w diecie a chorobami, a danio pręgowany (Danio rerio) wyłania się jako idealny model uzupełniający tę pracę.

Danio pręgowany mają podobne narządy przewodu pokarmowego (GI), metabolizm lipidów i transport lipoprotein jak wyższe kręgowce 1,2, rozwijają się szybko i są genetycznie podatne. Przejrzystość optyczna larw danio pręgowanego ułatwia badania in vivo, co jest szczególnie korzystne w przypadku badania układu pokarmowego, ponieważ jego środowisko zewnątrzkomórkowe (tj. żółć, mikrobiota, sygnalizacja hormonalna) jest praktycznie niemożliwe do modelowania ex vivo. W związku z tym, pojawiają się badania łączące genetyczną wykonalność i skłonność do obrazowania na żywo larw danio pręgowanego z różnymi manipulacjami dietetycznymi (dieta wysokotłuszczowa3,4, -cholesterolowa5 i -węglowodanowa6,7) oraz modelami chorób sercowo-naczyniowych8, cukrzycy9,10, stłuszczenia wątroby11-13 i otyłości14-16, które dostarczają wielu wglądów metabolicznych.

Zasadniczym aspektem przejścia larw danio pręgowanego do badań metabolicznych jest optymalizacja technik opracowanych u innych zwierząt modelowych do danio pręgowanego oraz opracowanie nowych testów, które wykorzystują unikalne mocne strony danio pręgowanego. Protokół ten przedstawia techniki opracowane i zoptymalizowane w celu karmienia larw danio pręgowanego posiłkiem bogatym w lipidy, wizualizacji przetwarzania lipidów w diecie od całego ciała do rozdzielczości subkomórkowej oraz pomiaru spożycia pokarmu. Żółtko jaja kurzego zostało wybrane do skomponowania bogatego w lipidy posiłku, ponieważ zawiera wysoki poziom tłuszczów i cholesterolu (lipidy stanowią ~58% żółtka jaja kurzego, z czego ~5% to cholesterol, 60% to trójglicerydy, a 35% to fosfolipidy). Żółtko jaja kurzego dostarcza więcej tłuszczu niż typowe komercyjne pokarmy mikrogranulowane danio pręgowanego (~ 15% lipidów) i zaletą jest to, że jest to standaryzowana pasza ze znaną zawartością procentową określonych gatunków kwasów tłuszczowych, ponieważ diety danio pręgowanego i reżimy żywieniowe nie zostały ustandaryzowane w laboratoriach17. Co więcej, fluorescencyjne analogi lipidów zawarte w żółtku jaja wizualizują transport i akumulację lipidów w diecie18, obrazują składniki komórkowe, w tym kropelki lipidów, działając zarówno jako niezbędnebarwniki3, jak i poprzez kowalencyjne włączenie do złożonych lipidów, badają metabolizm za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)19 i wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (dane niepublikowane SAF) i zapewniają test ilościowy dla całkowitego spożycia pokarmu20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły te zostały zatwierdzone przez Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care and Use Committee (protokół nr 139).

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Dorosłe osobniki i larwy należy utrzymywać w temperaturze 28 °C w cyklu 14 godzin: 10 godzin światło: ciemność. Karm dorosłe osobniki dwa razy dziennie Artemią bez skorupek (pozbawioną kapsuły, niewylęgającą, od 14 dpf) i dostępnymi w handlu mikrogranulkami.
  2. Protokoły te są zoptymalizowane pod kątem wykorzystania 6-7 larw dpf zebranych podczas naturalnego tarła na tle AB. Protokoły mogą być modyfikowane dla larw w innym wieku i o innym pochodzeniu. Nie podawaj żywności egzogennej przed 6 dpf.
  3. Znieczulić larwy trikainą w pożywce zarodkowej (EM) (4,2 ml 4 mg/ml trikainy na 100 ml EM) w temperaturze pokojowej (RT).

2. Przygotowanie bogatej w lipidy paszy z żółtka jaja

  1. Przygotuj i przechowuj żółtka jaj kurzych. Oddziel żółtko i białko z 12 jaj kurzych. Połączyć żółtka, podaszkować 1 ml do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do 1 roku (12 żółtek da ~80 porcji). Zbierz białka, przechowuj i stosuj jako ubogą w lipidy, bogatą w białko karmę.
  2. Przygotować fluorescencyjny analog(-i) lipidów, który w razie potrzeby zostanie dodany do paszy z żółtka jaja.
    1. Zakupiony, sproszkowany fluorescencyjny analog lipidowy zawiesić w 100% etanolu lub 100% chloroformie w stężeniu 0,1 μg/μl (patrz następna uwaga dotycząca rozpuszczalników), podwielokrotność w nieprzezroczystych szklanych probówkach, uszczelnić parafilmem i przechowywać zgodnie z instrukcjami producenta. Ze względu na szybkie odparowywanie rozpuszczalników organicznych nie należy używać podwielokrotnych objętości mniejszych niż ~400 μl do długotrwałego przechowywania.
      Uwaga: Jeśli analog lipidowy jest zawieszony w etanolu, zostaną użyte duże objętości analogu lipidowego, ponieważ wysycha on szybciej wN2 niż chloroform. Jeśli analog lipidowy jest zawieszony w etanolu, nie musi być suszony i ponownie zawieszany przed dodaniem go do paszy liposomowej w kroku 2.2.4, ale całkowite stężenie etanolu nie powinno przekraczać 0,1% w paszy liposomowej, aby uniknąć potencjalnie mylących skutków fizjologicznych etanolu.
    2. Dla fluorescencyjnych analogów kwasów tłuszczowych: Przygotować całkowitą objętość 20 ml 5% emulsji z żółtka jaja w EM. Z tego należy przygotować 5 ml podwielokrotności o końcowym stężeniu 6,4 μM 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen (BODIPY C16) do obrazowania konfokalnego na żywo i oznaczania spożycia pokarmu lub 1 μg/ml BODIPY C12 do obrazowania stereomikroskopowego. Przenieś żądaną ilość fluorescencyjnego analogu lipidów do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml. Wysuszyć lipid pod strumieniemN2, uważając, aby nie wydmuchać lipidu z probówki.
    3. Natychmiast ponownie zamieszać w 5 μl 100% etanolu, pipetując strumień po bokach probówki, dodać 95 μl EM i dobrze wymieszać.
      Uwaga: Mieszanina powinna wydawać się jednorodna; Jeśli na bokach probówki pozostaje kolorowy lipid lub płyn wydaje się grudkowaty, lipid nie jest w pełni rozpuszczony i wymaga więcej etanolu. Chroń probówkę przed światłem i przechowuj na lodzie.
    4. Dla fluorescencyjnego analogu cholesterolu: przygotować końcowe stężenie 2,4 μg/ml cholesterolu w 5 ml 0,5-5% emulsji z żółtka jaja do badań obrazowych na żywo. Przenieś żądaną ilość cholesterolu do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml. Wysuszyć lipid pod strumieniemN2, uważając, aby nie wydmuchać lipidu z probówki.
    5. Natychmiast ponownie zawiesić 15 μl RT 100% etanolu, pipetując strumień po bokach probówki i wymieszać z 85 μl RT 1% wolnego od kwasów tłuszczowych BSA w oczyszczonymH2O. Chronić probówkę przed światłem i przechowywać na lodzie.
  3. Przygotuj paszę liposomową z żółtka jaja.
    1. Dodać rozmrożoną porcję żółtka jaja do EM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Wiruj rozcieńczoną mieszankę żółtek jaja przez 1-2 minuty; Mieszanina powinna sprawiać wrażenie jednorodnej emulsji.
    2. Przelej mieszaninę przez sitko o drobnych oczkach, aby usunąć konglomeraty białkowe i zebrać w nowej, świeżej stożkowej tubie o pojemności 50 ml.
    3. Pulsacyjnie sonikuj mieszaninę jaj za pomocą zwężającej się mikrokońcówki o średnicy 1/4 cala (5 razy (5 x 1 sekunda wł., 1 sekunda wyłączona), zatrzymując się na 5-10 sekund między każdą serią; intensywność wyjściowa: 6 W) przy RT, aby utworzyć liposomy. Ustawienia mocy sonikatora są zależne od instrumentu i dlatego wymagają optymalizacji dla każdego instrumentu i mikrokońcówki.
      Uwaga: Mieszaninę liposomów należy stale skalać w temperaturze pokojowej, aby zachować jednorodność aż do użycia.
  4. W razie potrzeby dodaj fluorescencyjny analog lipidów do liposomów żółtka jaja. Natychmiast po sonikacji odpipetuj przygotowane lipidy do mieszaniny liposomów i wiruj z dużą prędkością przez 30 sekund, aby włączyć się do liposomów. Chroń mieszaninę przed światłem, owijając rurkę folią i kontynuuj kołysanie przy RT.

3. Paradygmat karmienia

  1. Przygotuj larwy do karmienia.
    1. Przed rozpoczęciem karmienia należy przesiać larwy pod kątem oczywistych wad morfologicznych, które mogą utrudniać karmienie. Przenieść larwy na szalki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm lub płytki 6- lub 12-dołkowe, zredukować EM do minimum i zastąpić 5 ml przygotowanego roztworu liposomowego.
    2. W razie potrzeby przenieść niekarmione larwy kontrolne do 5 ml EM i/lub 5 ml 5% białka jaja w EM i traktować równolegle.
  2. Delikatnie kołysz larwy w inkubowanym kołysku (29-31 °C przy 30 obr./min) przez cały czas trwania paszy, aby zachęcić do przyjmowania pokarmu, jednocześnie kontynuując ochronę przed światłem, jeśli obecne są fluorescencyjne analogi lipidów. Jeśli larwy muszą być wystawione na działanie światła, zminimalizuj narażenie za pomocą przyciemnianej szklanej pokrywy inkubatora.
  3. Pod koniec okresu karmienia przepłukać swobodnie pływające larwy w EM 3 razy.
    Uwaga: Larwy mogą zacząć spożywać liposomy w dowolnym momencie karmienia. Jeżeli bardzo ważne jest, aby larwy rozpoczęły żerowanie w tym samym czasie, po 1 godzinie karmienia należy przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem pobierania pokarmu (patrz ppkt 3.4) i zwrócić tylko larwy, które rozpoczęły żerowanie, do emulsji z żółtka jaja w celu uzupełnienia paszy.
  4. W tym momencie przesiewaj larwy pod kątem przyjmowania pokarmu, ponieważ niewielka liczba może nie jeść (zwykle ~0-5%). Zbadaj jelita larw, które zostały znieczulone lub lekko schłodzone na metalowym bloku na lodzie, aby ustalić, czy się żywiły: larwy, które spożyły liposomy, będą miały ciemne jelito (ryc. 1).
  5. Natychmiast zobrazuj lub przetwórz larwy w celu pobrania pokarmu. Alternatywnie, umieścić larwy w świeżym EM i inkubować w temperaturze 28 °C, aby umożliwić zajście przemiany metabolicznej.

4. Montaż larw do obrazowania na żywo

  1. Przygotuj nośnik montażowy.
    1. Dla 3% metylocelulozy: dodać 0,75 g metylocelulozy do 25 ml prawie wrzącego EM, odwirować, rozdrabniać w temperaturze pokojowej przez 2-3 dni aż do całkowitego rozpuszczenia i przechowywać w temperaturze 4 °C przez lata w temperaturze -20 °C. Powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania w temperaturze 4 °C usuną pęcherzyki powietrza. Przechowuj 3% metylocelulozy na lodzie podczas montowania larw.
    2. Dla 1,2% agarozy o niskiej mocowaniu: dodać 0,3 g niskotopliwej agarozy do 25 ml EM i rozpuścić przez doprowadzenie do wrzenia, podwielokrotność porcjować do probówek o pojemności 2 ml i utrzymywać w temperaturze 26-28 °C na bloku grzewczym. Niewykorzystane podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej lub -20 °C i ponownie gotowane w momencie użycia. Upewnij się, że agaroza jest wystarczająco chłodna, aby można ją było obchodzić przed wystawieniem na działanie larw, w przeciwnym razie mogą być przegrzane.
  2. W przypadku obrazowania na żywo w małym powiększeniu i średniej przepustowości, umieść szklane szkiełko na chusteczce na metalowym bloku na lodzie i poczekaj, aż szkiełko ostygnie. Nanieść dużą ilość 3% metylocelulozy (która była utrzymywana w temperaturze 4 °C na lodzie) na szkiełko, przenieść larwę na 3% metylocelulozy, używając pogrzebacza z żyłki rybackiej (żyłka o średnicy 0,41 mm przyklejona do końca szklanej rurki kapilarnej), stworzyć troth do odprowadzenia nadmiaru EM (tak, aby metyloceluloza nie została rozcieńczona) i ustawić larwy zgodnie z życzeniem.
  3. W przypadku krótkotrwałego (<20 min) obrazowania na żywo w dużym powiększeniu z pionowym obiektywem do emersji olejowej, należy zamontować larwy metodą nakrywki lean-to.
    1. Użyj kleju na bazie cyjanoakrylanu (Superglue), aby przymocować szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 30 mm do jednego końca szkiełka podstawowego. Za pomocą pogrzebacza umieść cienką linię 3% metylocelulozy na szkiełku przylegającym do szkiełka nakrywkowego i przenieś larwy na szkiełko za pomocą pipety Pasteura o szerokim otworze. Usuń nadmiar EM, aby nie rozcieńczył metylocelulozy.
    2. Za pomocą pogrzebacza delikatnie ułóż larwy w metylocelulozie na boku (lewą stroną do góry, aby zobrazować więcej wątroby, prawą stroną do góry, aby zobrazować woreczek żółciowy) z głowami obok szkiełka nakrywkowego.
    3. Umieść klej superglu w rogach drugiego szkiełka nakrywkowego i delikatnie umieść jedną krawędź szkiełka nakrywkowego na zamontowanym szkiełku nakrywkowym, a drugą na szkiełku, mostkując larwy. Należy uważać, aby nie wywierać nadmiernego nacisku podczas tego etapu lub obiektywu podczas obrazowania, aby larwy pozostały nieuszkodzone.
  4. W celu długotrwałego obrazowania w dużym powiększeniu za pomocą pionowego obiektywu zanurzeniowego, larwy należy zamontować w agarozie. Dodać larwę do małej porcji 1,2% niskotopliwej agarozy, a następnie przenieść larwę w małej objętości agarozy na szalkę Petriego.
    1. Szybko ustaw larwy za pomocą pogrzebacza, zanim agaroza zastygnie. Pozostaw agarozę do wyschnięcia na 2-3 minuty i całkowicie przykryj agarozę świeżym EM, aby zapobiec jej wyschnięciu.
  5. W celu długotrwałego obrazowania w dużym powiększeniu za pomocą odwróconego obiektywu, larwy należy umieścić na naczyniu ze szklanym dnem w agarozie.
    1. Ostudzić metalowy blok na lodzie. Umieść naczynie na metalowym bloku oddzielonym chusteczką, aby zapobiec nadmiernemu wychłodzeniu i zamarznięciu larw. Przenieś larwę do naczynia i usuń EM, odprowadzając wilgoć chusteczką.
    2. Umieścić kroplę niskotopliwej agarozy o temperaturze 28 °C (1,2%) na wierzchu larwy i natychmiast ustawić za pomocą pogrzebacza (lewą stroną do dołu, aby najlepiej zobrazować wątrobę, prawą stroną do dołu, aby zobrazować woreczek żółciowy). Wyjmij naczynie z zimnego bloku, pozostaw do wyschnięcia na 2-3 minuty i dodaj wystarczającą ilość świeżego EM, aby przykryć agarozę (~2-5 ml).

5. Test spożycia pokarmu

  1. Na końcu paszy liposomowej z żółtka jaja zawierającej 6,4 μM BODIPY C16 należy zebrać co najmniej 10 umytych larw w plastikowej probówce o pojemności 1,5 lub 2 ml, usunąć EM i zamknąć błyskawicznie. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C, chronione przed światłem przez kilka miesięcy.
    Uwaga: Jeśli to możliwe, zbierz wiele powtórzeń. Ważne jest, aby na tym etapie zebrać niekarmione larwy, aby znormalizować fluorescencję lipidów w tle (najlepiej użyć larw z tego samego lęgu).
  2. Wykonać zmodyfikowaną ekstrakcję lipidów metodą Bligh-Dyera3,21.
    1. Dodać 100 μl buforu homogenizacyjnego (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) do próbki na lodzie (alternatywnie można użyć oczyszczonegoH2O). Homogenizuj na lodzie za pomocą sonografu z mikrokońcówką (łącznie 5 sekund: 1 sekunda włączona 1 sekunda wyłączona). Sprawdź, czy larwy są całkowicie homogenizowane; Jeśli nie, powtórz czynność. Przenieść do jednorazowej szklanej probówki hodowlanej o pojemności 13 ml (można użyć innych szklanych probówek).
      Uwaga: Chloroform jest niebezpieczny; wykonać wszystkie kolejne etapy ekstrakcji lipidów w temperaturze pokojowej w okapie chemicznym.
    2. Na każde 100 μl użytego buforu homogenizacyjnego dodać 375 μl roztworu 1:2 (chloroform:metanol). Wirować 30-60 sekund, inkubować 10 min, dodać 125 μl chloroformu na 100 μl użytego buforu homogenizacyjnego i wirować 30 sek.
    3. Dodać 125 μl 200 mM Tris pH 7,5 na 100 μl użytego buforu homogenizacyjnego, wirować przez 30 sekund i odwirować (2 000 x g, 5 min, RT, chronić przed światłem). Ostrożnie wyjmij próbki z wirówki. Zostaną one podzielone na dwie fazy: górna faza jest wodna, granica resztek larwalnych, a dolna faza organiczna (zawiera lipidy).
    4. Za pomocą pipety z czystego szkła zebrać dolną, organiczną fazę i przenieść ją do czystej szklanej probówki o pojemności 13 ml.
      Uwaga: Należy uważać, aby uniknąć fazy wodnej i resztek larwalnych na granicy faz; Jeśli dojdzie do zanieczyszczenia, powtórz etap wirowania i przypomnij sobie. Odrzuć górną, wodną fazę; Pomocne może być usunięcie i odrzucenie tej fazy przed zebraniem fazy organicznej. Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C przez okres do 1 miesiąca.
    5. Wysuszyć fazę organiczną w próżni (0,12 atm), chroniąc ją przed światłem. Nie należy kontynuować suszenia próbek po odparowaniu cieczy, ponieważ zmniejszy to rozpuszczalność w tłuszczach. Zawiesić lipidy w stosunku 2:1 (chloroform:metanol) i przechowywać na lodzie. Optymalna objętość roztworu chloroformu: metanolu zależy od zastosowanej metody wykrywania; Zacznij od niskiego poziomu i kontynuuj rozcieńczanie w razie potrzeby. Ogólną wskazówką jest użycie 10 μl na 10 larw w puli.
  3. Umieść całe objętości próbki w równych odstępach czasu na kanałowej płytce TLC i zeskanuj płytkę za pomocą skanera laserowego rutynowo używanego do obrazowania biomolekularnego (np. czytnika płytek fluorescencyjnych). W przypadku fluorescencyjnych analogów lipidów znajdujących się w wykazie materiałów, które mają maksima wzbudzenia od 500-650 nm i maksima emisji od 510-665 nm, należy użyć lasera o długości fali 488 nm i przy odbiorze emisji przy 520 nm.
    1. Określ ilościowo całkowitą fluorescencję każdej plamki za pomocą oprogramowania do obrazowania.
      Uwaga: Skorygować naturalnie występującą fluorescencję lipidów tła, odejmując fluorescencję sparowanych, niekarmionych próbek larw.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przy karmieniu na kołysarce w temperaturze 29-31 °C większość zdrowych larw (≥95%) przyjmie pokarm w ciągu 1 h. Po spożyciu emulsji z żółtka jaja jelito larwy ciemnieje. Bardzo ciemne jelita można zaobserwować po 2 h (Rysunek 1). W przypadku larw niekarmionych lub tych, które nie przyjęły pokarmu, jelito pozostaje przeźroczyste. Larwy karmione białkiem jaja wykazują rozszerzone światło jelita, które nie ciemnieje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj techniki pozwalają naukowcom leczyć larwy danio pręgowanego paszą bogatą w lipidy, wizualizować przetwarzanie lipidów w diecie u żywych larw i określać ilościowo spożycie pokarmu przez larwy. Aby zapewnić sukces, należy zwrócić szczególną uwagę na kilka kluczowych kroków. Komercyjne jaja kurze różnią się; Aby zminimalizować potencjalną zmienność, przeprowadzamy wszystkie testy na ekologicznych jajach od kur z chowu bezklatkowego, które nie zostały wzbogacone w kwasy tłuszczowe omega-3. Niższe wskaźniki karm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Meng-Chieh Shen za zdjęcia, Jennifer Anderson za pomocne komentarze do manuskryptu, a także członkom laboratorium Farber za ich wkład w rozwój tych technik. Badanie to zostało sfinansowane przez NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F) i F32DK096786 (J.P.O.). Odpowiedzialność za te treści ponoszą wyłącznie autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH. Dodatkowe wsparcie zostało udzielone przez Fundację Charytatywną G. Harolda i Leili Y. Mathers dla laboratorium S.A.F oraz fundacji Carnegie Institution for Science.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Trikaina (sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu)Sigma-AldrichA5040-25GZnieczulenie dla larw danio pręgowanego
Jaja kurzeN/AN/AJaja ekologiczne, bezklatkowe, niewzbogacone o kwasy tłuszczowe omege-3
Procesor ultradźwiękowy 3000 sonikatorMisonix, Inc.S-3000Do produkcji liposomów z żółtka jaja
Sonabox obudowa akustycznaMisonix, Inc.432BDo produkcji liposomów z żółtka jaja
1/8 "stożkowa mikrokońcówkaMisonix, Inc.419Do produkcji liposomów żółtka jaja
Bursztynowe fiolki (4 ml, szkło)National Scientific13-425Magazynowanie lipidów; zawiera fiolki, kapsle otwarte i przegrody nasadki
Incu-Shaker Mini Benchmark1222U12Wytrząsarka inkubowana do pasz
BODIPY FL C16 Thermo Fisher ScientificD3821Fluorescencyjny analog lipidów; (Kwas 4,4-difluoro-5,7-dimetylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaksen-3-heksadekanowy)
BODIPY FL C12 Thermo Fisher ScientificD3822Fluorescencyjny analog lipidów; (Kwas 4,4-difluoro-5,7-dimetylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indakno-3-dodekanowy)
BODIPY FL C5 Thermo Fisher ScientificD3834Fluorescencyjny analog lipidów; (Kwas 4,4-difluoro-5,7-dimetylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indakno-3-pentanowy)
BODIPY FL C5Thermo Fisher ScientificD2183Fluorescencyjny analog lipidów; (Kwas 4,4-difluoro-5,7-dimetylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indakno-3-propionowy)
Cholesterol TopFluor Avanti Polar Lipids Inc.810255Fluorescencyjny analog lipidów; 23-(difluorek dipyrrometenboru)-24-norcholesterol
Bez kwasów tłuszczowych BSASigma-AldrichA0281-1GDo solubilizacji cholesterolu TopFluor
MetylocelulozaSigma-AldrichM0387Pożywka montażowa do obrazowania żywych larw; 75 x 25 x 1 mm
Agaroza niskotopliwaThermo Fisher ScientificBP165-25Podłoże montażowe dla żywych larw Obrazowania; Szkiełka mikroskopowe 22 x 30
VWR Firma VWR 16004-422Mocowanie larw do obrazowania na żywo
Szkiełka nakrywkowe Szkło osłonowe12-544AMontaż larw do obrazowania na żywo
Super klejLoctiteLOC01-30379Montaż larw do obrazowania na żywo
FluoroDish (naczynie ze szklanym dnem)World Precision Instruments, Inc. FD35-100Montaż larw do obrazowania na żywo; czasza 35 mm, szkło 23 mm, grubość szkła 0,17 mm   
Mikroskop konfokalnyLeica MicrosytemsSP-2, SP-5Mikroskop do obrazowania na żywo w dużym powiększeniu
StereoskopNikonSM21500Mikroskop do obrazowania na żywo w małym powiększeniu
Szklane probówki hodowlane Kimble73500-13100Ekstrakcja lipidów; (13 x 100 mm; 13 ml)
Odkurzacz Savant SpeedVac Plus ThermoQuestSC210A Ekstrakcja lipidów
Kanałowe płytki TLCWhatman ScientificWC4855-821Test przyjmowania pokarmu; LK5D Żel krzemionkowy 150 A, 20 x 20 cm, grubość 250 um; Wycofane z produkcji
kanałowe płytki TLCAnaltech, Inc.66911Test przyjmowania pokarmu; Bezpośredni zamiennik płyt TLC Whatman Scientific
Typhoon 9410 Variable Mode ImagerGE Healthcare9410Czytnik płytek fluorescencyjnych do oznaczania spożycia żywności
OprogramowanieImageQuant GE Healthcare29000605Analiza testu spożycia żywności
5 3/4' Jednorazowe pipety borokrzemianowe Pasteura o szerokim otworze     Kimble63A53WTPrzenoszenie larw

Bibliografia

  1. Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).
  2. Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).
  3. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).
  4. Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).
  5. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
  6. Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).
  7. Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8 (12), 81485(2013).
  8. Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).
  9. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  10. Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
  11. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  12. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
  13. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136 (5), 865-875 (2009).
  14. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21(2010).
  15. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), 36474(2012).
  16. Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).
  17. Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).
  18. Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).
  19. Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).
  20. Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).
  21. Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
  22. Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).
  23. Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).
  24. Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7 (12), 52549(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metabolizm lipidówfluorescencyjne analogi lipidówliposomy z żółtka jajacienkowarstwowa chromatografiailościowe oznaczanie fluorescencjiprzetwarzanie lipidów pokarmowych
Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.