Danio pręgowany staje się cennym modelem przetwarzania lipidów w diecie i chorób metabolicznych. Opisano protokoły żywienia larw bogatych w lipidy, obrazowanie na żywo fluorescencyjnych analogów lipidów w diecie oraz ilościowe oznaczanie spożycia pokarmu. Techniki te można zastosować do różnych technik badań przesiewowych, obrazowania i dociekań opartych na hipotezach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Danio pręgowany wyłania się jako model przetwarzania lipidów w diecie i chorób metabolicznych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób karmić larwy danio pręgowanego mączką bogatą w lipidy, która składa się z emulsji liposomów żółtka jaja kurzego powstałych w wyniku sonikacji żółtka jaja w pożywce zarodkowej. Podano szczegółowe instrukcje dotyczące badania larw pod kątem spożycia żółtka jaja, tak aby larwy, które nie żerują, nie zafałszowały wyników eksperymentów. Liposomy żółtka jaja kurzego mogą być wzbogacane fluorescencyjnymi analogami lipidów, w tym kwasami tłuszczowymi i cholesterolem, umożliwiając zarówno ogólnoustrojową, jak i subkomórkową wizualizację przetwarzania lipidów w diecie. Opisano kilka metod montowania larw, które sprzyjają krótko- i długoterminowemu obrazowaniu na żywo zarówno z pionowymi, jak i odwróconymi obiektywami przy dużym i małym powiększeniu. Dodatkowo przedstawiono test do ilościowego określania spożycia pokarmu przez larwy poprzez ekstrakcję lipidów larw karmionych fluorescencyjnymi analogami lipidów, plamienie lipidów na płytce chromatografii cienkowarstwowej i ilościowe określanie fluorescencji. Na koniec omówiono krytyczne aspekty procedur, ważne kontrole, opcje modyfikacji protokołów w celu rozwiązania konkretnych pytań eksperymentalnych oraz potencjalne ograniczenia. Techniki te mogą być stosowane nie tylko do ukierunkowanych, opartych na hipotezach badań, ale także do różnych badań przesiewowych i technik obrazowania na żywo w celu badania metabolizmu lipidów w diecie i kontroli spożycia pokarmu.
Wprowadzenie
Mechanizmy, za pomocą których jelito reguluje przetwarzanie lipidów w diecie, wątroba kontroluje złożoną syntezę lipidów i metabolizm lipoprotein, oraz jak te organy współpracują z ośrodkowym układem nerwowym w celu kontrolowania przyjmowania pokarmu, nie są w pełni zrozumiałe. Wyjaśnienie tej biologii w świetle obecnych epidemii otyłości, chorób układu krążenia, cukrzycy i niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby ma znaczenie biomedyczne. Badania na hodowli komórkowej i myszach dostarczyły nam większości wiedzy na temat mechanistycznych związków między lipidami w diecie a chorobami, a danio pręgowany (Danio rerio) wyłania się jako idealny model uzupełn....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokoły te zostały zatwierdzone przez Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care and Use Committee (protokół nr 139).
1. Przygotowanie zwierząt
- Dorosłe osobniki i larwy należy utrzymywać w temperaturze 28 °C w cyklu 14 godzin: 10 godzin światło: ciemność. Karm dorosłe osobniki dwa razy dziennie Artemią bez skorupek (pozbawioną kapsuły, niewylęgającą, od 14 dpf) i dostępnymi w handlu mikrogranulkami.
- Protokoły te są zoptymalizowane pod kątem wykorzystania 6-7 larw dpf zebranych podczas naturalnego tarła na tle AB. Protokoły mogą być modyfikowane dla larw w innym wieku i o innym pochodzeniu. Nie podawaj żywności eg....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przy karmieniu na kołysarce w temperaturze 29-31 °C większość zdrowych larw (≥95%) przyjmie pokarm w ciągu 1 h. Po spożyciu emulsji z żółtka jaja jelito larwy ciemnieje. Bardzo ciemne jelita można zaobserwować po 2 h (Rysunek 1). W przypadku larw niekarmionych lub tych, które nie przyjęły pokarmu, jelito pozostaje przeźroczyste. Larwy karmione białkiem jaja wykazują rozszerzone światło jelita, które nie ciemnieje.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisane tutaj techniki pozwalają naukowcom leczyć larwy danio pręgowanego paszą bogatą w lipidy, wizualizować przetwarzanie lipidów w diecie u żywych larw i określać ilościowo spożycie pokarmu przez larwy. Aby zapewnić sukces, należy zwrócić szczególną uwagę na kilka kluczowych kroków. Komercyjne jaja kurze różnią się; Aby zminimalizować potencjalną zmienność, przeprowadzamy wszystkie testy na ekologicznych jajach od kur z chowu bezklatkowego, które nie zostały wzbogacone w kwasy tłuszczowe omega-3. Niższe wskaźniki karm.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Meng-Chieh Shen za zdjęcia, Jennifer Anderson za pomocne komentarze do manuskryptu, a także członkom laboratorium Farber za ich wkład w rozwój tych technik. Badanie to zostało sfinansowane przez NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F) i F32DK096786 (J.P.O.). Odpowiedzialność za te treści ponoszą wyłącznie autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH. Dodatkowe wsparcie zostało udzielone przez Fundację Charytatywną G. Harolda i Leili Y. Mathers dla laboratorium S.A.F oraz fundacji Carnegie Institution for Science.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Trikaina (sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Znieczulenie dla larw danio pręgowanego |
| Jaja kurze | N/A | N/A | Jaja ekologiczne, bezklatkowe, niewzbogacone o kwasy tłuszczowe omege-3 |
| Procesor ultradźwiękowy 3000 sonikator | Misonix, Inc. | S-3000 | Do produkcji liposomów z żółtka jaja |
| Sonabox obudowa akustyczna | Misonix, Inc. | 432B | Do produkcji liposomów z żółtka jaja |
| 1/8 "stożkowa mikrokońcówka | Misonix, Inc. | 419 | Do produkcji liposomów żółtka jaja |
| Bursztynowe fiolki (4 ml, szkło) | National Scientific | 13-425 | Magazynowanie lipidów; zawiera fiolki, kapsle otwarte i przegrody nasadki |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Wytrząsarka inkubowana do pasz |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescencyjny analog lipidów; (Kwas 4,4-difluoro-5,7-dimetylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaksen-3-heksadekanowy) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescencyjny analog lipidów; (Kwas 4,4-difluoro-5,7-dimetylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indakno-3-dodekanowy) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescencyjny analog lipidów; (Kwas 4,4-difluoro-5,7-dimetylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indakno-3-pentanowy) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescencyjny analog lipidów; (Kwas 4,4-difluoro-5,7-dimetylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indakno-3-propionowy) |
| Cholesterol TopFluor | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescencyjny analog lipidów; 23-(difluorek dipyrrometenboru)-24-norcholesterol |
| Bez kwasów tłuszczowych BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | Do solubilizacji cholesterolu TopFluor |
| Metyloceluloza | Sigma-Aldrich | M0387 | Pożywka montażowa do obrazowania żywych larw; 75 x 25 x 1 mm |
| Agaroza niskotopliwa | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Podłoże montażowe dla żywych larw Obrazowania; Szkiełka mikroskopowe 22 x 30 |
| VWR | Firma VWR | 16004-422 | Mocowanie larw do obrazowania na żywo |
| Szkiełka nakrywkowe | Szkło osłonowe | 12-544A | Montaż larw do obrazowania na żywo |
| Super klej | Loctite | LOC01-30379 | Montaż larw do obrazowania na żywo |
| FluoroDish (naczynie ze szklanym dnem) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Montaż larw do obrazowania na żywo; czasza 35 mm, szkło 23 mm, grubość szkła 0,17 mm |
| Mikroskop konfokalny | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Mikroskop do obrazowania na żywo w dużym powiększeniu |
| Stereoskop | Nikon | SM21500 | Mikroskop do obrazowania na żywo w małym powiększeniu |
| Szklane probówki hodowlane | Kimble | 73500-13100 | Ekstrakcja lipidów; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Odkurzacz Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A Ekstrakcja lipidów | |
| Kanałowe płytki TLC | Whatman Scientific | WC4855-821 | Test przyjmowania pokarmu; LK5D Żel krzemionkowy 150 A, 20 x 20 cm, grubość 250 um; Wycofane z produkcji |
| kanałowe płytki TLC | Analtech, Inc. | 66911 | Test przyjmowania pokarmu; Bezpośredni zamiennik płyt TLC Whatman Scientific |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Czytnik płytek fluorescencyjnych do oznaczania spożycia żywności |
| Oprogramowanie | ImageQuant GE Healthcare | 29000605 | Analiza testu spożycia żywności |
| 5 3/4' Jednorazowe pipety borokrzemianowe Pasteura o szerokim otworze | Kimble | 63A53WT | Przenoszenie larw |
Bibliografia
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
