Tutaj prezentujemy metodę pomiaru poziomu tłuszczu w organizmie w trzecim stadium larwalnym (L3) Drosophila melanogaster. Metoda ta wykorzystuje stosunkowo niską gęstość tkanki tłuszczowej do różnicowania larw ze zmienionymi zapasami tłuszczu. Analiza oparta na pływalności jest cennym narzędziem do szybkich, powtarzalnych i ekonomicznych badań przesiewowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Oparta na pływalności metoda określania poziomu tłuszczu u Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Drosophila melanogaster to kluczowy system eksperymentalny w badaniach nad regulacją tkanki tłuszczowej. Obecnie istnieje wiele technik pomiaru poziomu zmagazynowanego tłuszczu u Drosophila, ale większość z nich jest kosztowna i/lub pracochłonna i ma wyraźne ograniczenia. W tym miejscu przedstawiamy metodę szybkiego i taniego oznaczania poziomu tłuszczu w organizmie w larwach L3 Drosophila. Technika ta opiera się na różnicach w gęstości między tkanką tłuszczową a beztłuszczową i pozwala na szybkie wykrycie fenotypów tłuszczu i chudego ciała. Zweryfikowaliśmy dokładność tej metody przez porównanie z procentową zawartością tkanki tłuszczowej oznaczoną za pomocą neutralnej ekstrakcji lipidów i chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GCMS). Ponadto przedstawiamy szczegółowe protokoły pobierania i synchronizacji larw, a także odpowiednie receptury doświadczalne. Przedstawiona poniżej technika przezwycięża główne niedociągnięcia w najczęściej stosowanych metodach oznaczania ilościowego lipidów i zapewnia skuteczny sposób szybkiego i czułego badania przesiewowego larw L3 pod kątem fenotypów regulacji tłuszczu przy jednoczesnym zachowaniu integralności larw. Test ten ma szerokie zastosowanie w badaniu metabolizmu i regulacji tłuszczu za pomocą Drosophila.
Wprowadzenie
Drosophila melanogaster jest używana od ponad stu lat w badaniach genetycznych i innych podstawowych kwestiach biologicznych. W ciągu ostatnich kilku dekad stało się jasne, że Drosophila jest potężnym narzędziem w badaniu wielu chorób człowieka. Ponieważ 70-80% genów związanych z chorobami człowieka ma zidentyfikowany ortologmuchy 1-4, Drosophila zapewnia uproszczony, ale możliwy do przetłumaczenia system do badania złożonych chorób. Na takim badaniu skorzystał w szczególności metabolizm. Nie tylko genetyka metabolizmu jest dobrze zachowana między muchami a ludźmi, ale odpowiednie narządy i typy komórek są ró....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Zbieraj jaja od much o interesujących genotypach
UWAGA: Idealne krzyżówki składają się ze 150 dziewiczych much i co najmniej 75 samców. Kolekcje stockowe powinny składać się z co najmniej 200 much.
- Przygotuj talerze z winogronami.
- Dodać 37,5 g agaru do 1,5 l wody destylowanej w kolbie o pojemności 4 l.
- Mieszaj wodę i agar w autoklawie przez 50 minut w temperaturze 121 ºC (250 ºF).
- Podczas autoklawowania mieszaniny wody i agaru dodaj 50 g sacharozy do 500 ml soku winogronowego i mieszaj mieszadłem na rozgrzanej płytce mieszającej, aż sacharoza się rozpuści.
- Wyłącz ogień i kontynuuj mieszanie, aby schłod....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia przykład tego, jak test oparty na wyporności może wykrywać zarówno wyższe, jak i niższe zapasy tłuszczu w genetycznie zmodyfikowanych larwach. Rysunek 1A pokazuje, że pobudzenie lub wyciszenie określonej podgrupy neuronów (E347) w mózgu larwy indukuje odpowiednio niższe i wyższe zapasy tłuszczu. W obu przypadkach zastosowano tę samą kontrolę tła genetycznego. Rysunek 1B stanowi przykład tego, jak fenotyp uzyskany za .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Istnieje wiele technik, które zostały opracowane do pomiaru poziomu lipidów 8-10. Jednak każda z tych metod ma pewne poważne wady, które są rozwiązywane przez test oparty na pływalności opisany powyżej. Po pierwsze, ten test jest niezwykle szybki. Badanie pełnego gradientu stężeń zajmuje nie więcej niż 30 - 60 minut. Jest to ogromny postęp w stosunku do większości obecnie stosowanych technik. Na przykład oznaczanie ilościowe lipidów przez stwardnienie rozsiane zajmuje 7-9 godzin na wyizol.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
K.E.H. był wspierany przez Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. Praca ta była wspierana przez NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 i AHA Award 12BGIA11930014 dla T.R.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bacto Agar | VWR | 214030 | |
| Welch's Original 100% sok | |||
| sacharoza | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Etanol | 200 proof | ||
| Drożdże piekarskie | Fleichmann's | ||
| Yellow Mączka kukurydziana | Quaker | Wzbogacony odkiełkowany | |
| Drosophila Agar Typ II | Apex | 66-104 | |
| Mąka sojowa | ADM Składniki specjalne | 062-100 | |
| Ekstrakt słodowy | Breiss | 5748 | |
| Jasny syrop kukurydziany | Kwas propionowy Karo | ||
| VWR | U330-09 | ||
| Chlorek sodu | Fisher | 50147491 | |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Sigma | P5655-100G | |
| Fosforan sodu bezwodny | Fisher | S3933 | |
| Chlorek potasu | Fisher | P330-500 | |
| 35 x 10 mm płytka Petriego | Fisher | 08-757-100A | |
| 50 ml Stożkowy | Fisher | 50-869-569 |
Bibliografia
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila development and disease Usin....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
