Oparta na pływalności metoda określania poziomu tłuszczu u Drosophila

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę pomiaru poziomu tłuszczu w organizmie w trzecim stadium larwalnym (L3) Drosophila melanogaster. Metoda ta wykorzystuje stosunkowo niską gęstość tkanki tłuszczowej do różnicowania larw ze zmienionymi zapasami tłuszczu. Analiza oparta na pływalności jest cennym narzędziem do szybkich, powtarzalnych i ekonomicznych badań przesiewowych.

Streszczenie

Drosophila melanogaster to kluczowy system eksperymentalny w badaniach nad regulacją tkanki tłuszczowej. Obecnie istnieje wiele technik pomiaru poziomu zmagazynowanego tłuszczu u Drosophila, ale większość z nich jest kosztowna i/lub pracochłonna i ma wyraźne ograniczenia. W tym miejscu przedstawiamy metodę szybkiego i taniego oznaczania poziomu tłuszczu w organizmie w larwach L3 Drosophila. Technika ta opiera się na różnicach w gęstości między tkanką tłuszczową a beztłuszczową i pozwala na szybkie wykrycie fenotypów tłuszczu i chudego ciała. Zweryfikowaliśmy dokładność tej metody przez porównanie z procentową zawartością tkanki tłuszczowej oznaczoną za pomocą neutralnej ekstrakcji lipidów i chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GCMS). Ponadto przedstawiamy szczegółowe protokoły pobierania i synchronizacji larw, a także odpowiednie receptury doświadczalne. Przedstawiona poniżej technika przezwycięża główne niedociągnięcia w najczęściej stosowanych metodach oznaczania ilościowego lipidów i zapewnia skuteczny sposób szybkiego i czułego badania przesiewowego larw L3 pod kątem fenotypów regulacji tłuszczu przy jednoczesnym zachowaniu integralności larw. Test ten ma szerokie zastosowanie w badaniu metabolizmu i regulacji tłuszczu za pomocą Drosophila.

Wprowadzenie

Drosophila melanogaster jest używana od ponad stu lat w badaniach genetycznych i innych podstawowych kwestiach biologicznych. W ciągu ostatnich kilku dekad stało się jasne, że Drosophila jest potężnym narzędziem w badaniu wielu chorób człowieka. Ponieważ 70-80% genów związanych z chorobami człowieka ma zidentyfikowany ortolog^{muchy 1-4}, Drosophila zapewnia uproszczony, ale możliwy do przetłumaczenia system do badania złożonych chorób. Na takim badaniu skorzystał w szczególności metabolizm. Nie tylko genetyka metabolizmu jest dobrze zachowana między muchami a ludźmi, ale odpowiednie narządy i typy komórek są również bardzo podobne^2,5. Na przykład ciało tłuszczowe muchy przechowuje zarówno triacyloglicerydy (TAG), jak i glikogen, funkcje analogiczne do tych pełnionych w wątrobie ssaków i białej tkance tłuszczowej⁶. Wykorzystanie Drosophila jako modelu otyłości u ludzi znacznie poprawiło naszą wiedzę na temat metabolizmu lipidów i genetyki otyłości⁷. Stadium rozwoju larwalnego jest szczególnie przydatne do badania segregacji składników odżywczych do przechowywania lub wykorzystania, ponieważ jest przeznaczone do żerowania i magazynowania energii do wykorzystania podczas poczwarki.

Obecnie istnieje wiele różnych metod ilościowych określania poziomu magazynowania tłuszczu u Drosophila. Najczęściej stosowaną metodą jest sprzężony test kolorymetryczny (CCA)^8,9. CCA został opracowany do oznaczania poziomów TAG w ludzkiej surowicy i działa w oparciu o założenie, że glicerol uwolniony ze szkieletu trójglicerydów przejdzie kilka reakcji, ostatecznie powodując reakcję sprzężoną z redoks, w wyniku której powstaje kolorowy produkt. Następnie mierzy się absorbancję określonych długości fal światła w celu określenia początkowej ilości obecnego glicerolu. Jednak glicerol może być również uwolniony z mono- i diacyloglicerydów oprócz TAG i dlatego może nie być dokładną miarą zmagazynowanej tkanki tłuszczowej⁹. Co więcej, pigment oczu zmiażdżonych dorosłych much może zakłócać niektóre odczyty absorbancji i komplikować wyniki^9,10. W związku z tym CCA musi towarzyszyć chromatografia cienkowarstwowa (TLC) i być przez nią zwalidowana, co pozwala na oddzielenie większości rodzin lipidów, które można określić ilościowo za pomocą densytometrii^10,11. Jednak niektóre klasy lipidów, takie jak sterole, nie mogą być analizowane i muszą być oznaczone ilościowo w inny sposób¹². Spektrometria mas (MS) jest dokładnym sposobem ilościowego oznaczania wszystkich klas głównych lipidów komórkowych^12,13. Jednak procedury ekstrakcji lipidów niezbędne do analizy przez SM są zarówno czasochłonne (większość z nich zajmuje prawie cały dzień), jak i kosztowne. W tym artykule przedstawiamy alternatywną metodę szybkiego i taniego oznaczania poziomu tłuszczu w organizmie w larwach L3 Drosophila melanogaster.

Metoda przedstawiona poniżej wykorzystuje różnicę w gęstości między tkanką tłuszczową a tkanką beztłuszczową. Tkanka tłuszczowa ssaków ma gęstość około 0,9 g/ml¹⁴, a mięśnie szkieletowe gęstość 1,06 g/ml¹⁵. Różnica ta oznacza, że zwierzęta z większymi zapasami tłuszczu będą miały mniejszą gęstość niż zwierzęta z niższymi zapasami tłuszczu, co pozwoli im lepiej unosić się w roztworze o stałej gęstości. Ta właściwość pozwala na niezwykle szybkie przesiewanie dużej liczby zwierząt, a jednocześnie jest niedroga i nieinwazyjna. Analiza oparta na pływalności została wykorzystana zarówno do potwierdzenia fenotypów zmiany znanych regulatorów poziomu tłuszczu, jak i do identyfikacji nowych genetycznych i neurologicznych regulatorów otyłości^16,17.

Protokół

1. Zbieraj jaja od much o interesujących genotypach

UWAGA: Idealne krzyżówki składają się ze 150 dziewiczych much i co najmniej 75 samców. Kolekcje stockowe powinny składać się z co najmniej 200 much.

1. Przygotuj talerze z winogronami.
   1. Dodać 37,5 g agaru do 1,5 l wody destylowanej w kolbie o pojemności 4 l.
   2. Mieszaj wodę i agar w autoklawie przez 50 minut w temperaturze 121 ºC (250 ºF).
   3. Podczas autoklawowania mieszaniny wody i agaru dodaj 50 g sacharozy do 500 ml soku winogronowego i mieszaj mieszadłem na rozgrzanej płytce mieszającej, aż sacharoza się rozpuści.
   4. Wyłącz ogień i kontynuuj mieszanie, aby schłodzić mieszaninę soku winogronowego i sacharozy do temperatury poniżej 70 °C. Sprawdzić temperaturę wewnętrzną za pomocą termometru alkoholowego.
   5. Dodać 3 g środka przeciwgrzybiczego Drosophila (np. Tegosept) do ciepłej mieszanki soku winogronowego i sacharozy i mieszać do rozpuszczenia.
   6. Gdy mieszanina wody i agaru zostanie wyjęta z autoklawu, pozwól kolbie ostygnąć w dotyku, od czasu do czasu obracając.
   7. Połącz mieszaninę wody/agaru i mieszaninę soku winogronowego/sacharozy i mieszaj, aż dobrze się wymieszają.
   8. Za pomocą pipety serologicznej dodaj 8 - 10 ml mieszanki winogron do pokrywki małej płytki Petriego (35 x 10 mm). Pozwól, aby mieszanina ukoronowała się wyżej niż wysokość ścianek pokrywy, aby utworzyć wypukły kształt.
   9. Pozostawić talerze winogronowe do ostygnięcia przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać w hermetycznym pojemniku w temperaturze 4 ºC.
2. Przygotuj pastę drożdżową.
   1. Dodać 6 ml buforowego roztworu fosforanowego (PBS) do 4 g żywych aktywnych suszonych drożdży w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i mieszać szpatułką do uzyskania gładkiej konsystencji.
   2. Pastę drożdżową przechowywać w temperaturze 4 ºC.
3. Dodaj małą porcję (około 1/8 łyżeczki) pasty drożdżowej na środek talerza winogronowego. Wygładź wszelkie ostre krawędzie szpatułką.
4. Umieść talerze winogronowe w inkubatorze, aż osiągną temperaturę otoczenia.
5. Przenieś interesujące muchy do komory zbierania jaj i połóż na wierzchu talerz winogronowy z pastą drożdżową skierowaną do wewnątrz. Przyklej talerz winogronowy do komory na jajka, aby uniknąć wypadnięcia talerza. Upewnij się, że zapisałeś ważne informacje o genotypie i dacie na spodzie talerza z winogronami.
6. Odwróć komorę na jajka, aby muchy mogły złożyć jaja na talerzu winogronowym.
7. Umieścić pudełko lub pokrywę nad komorami do zbierania jaj i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 25 °C.
8. Pozwól muchom złożyć jaja przez 4 - 6 godzin.
9. Zakończ zbieranie, wyjmując talerz winogronowy z komory na jaja i przenosząc muchy z powrotem do butelki z jedzeniem. Za pomocą szpatułki zetrzyj nadmiar pasty drożdżowej z talerza winogronowego. Przechowywać talerz winogronowy na większej szalce Petriego w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 25 ºC przez ~ 24 godziny.

2. Przenieś larwy do eksperymentalnego pokarmu

1. Przygotuj eksperymentalne jedzenie.
   UWAGA: Ten przepis na jedzenie jest oparty na przepisie¹⁸ z centrum zapasów Bloomington. Do ważnych zmian należy zwiększenie ilości drożdży w celu optymalizacji wartości odżywczej żywności ocenianej na podstawie czasu etapu wędrówki (między 112 a 120 godzinami po zebraniu jaj w temperaturze 25 ºC). Chociaż stwierdziliśmy, że ta receptura jest idealna dla zdrowia i rozwoju naszych eksperymentalnych larw, każda receptura żywieniowa jest dopuszczalna pod warunkiem kalibracji z kontrolami pozytywnymi i negatywnymi, których przykłady wymieniono w kroku 3.10.
   1. Odmierzyć 1 600 ml wody destylowanej.
   2. Wymieszaj 134 g mąki kukurydzianej, 10,6 g Drosophila Agar Type II i trochę wody (~ 500 ml) w zlewce o pojemności 1 l. Miksuj przez 2 minuty za pomocą zmotoryzowanego miksera ręcznego.
   3. Wymieszaj 70 g żywych aktywnych suchych drożdży, 18,4 g mąki sojowej, 84,8 g ekstraktu słodowego i trochę wody (~ 500 ml) w kolejnej 1 litrowej zlewce. Miksuj przez 2 minuty za pomocą zmotoryzowanego miksera ręcznego.
   4. Zamieszaj każdą zlewkę i przelej do kolby o pojemności 4 l. Użyć pozostałej wody do wypłukania zlewek i dodać do kolby.
   5. Odmierz 140 ml jasnego syropu kukurydzianego i dodaj do kolby, mieszając.
   6. Autoklaw przez 50 minut w temperaturze 121 ºC (250 ºF) w stanie płynnym.
   7. Po sterylizacji w autoklawie wlać żywność do 4-litrowej zlewki i pozostawić do ostygnięcia. Wspomóż proces chłodzenia, mieszając go za pomocą zmotoryzowanego miksera ręcznego.
   8. Gdy kolba ostygnie na tyle, że można jej dotknąć, dodać 8,8 ml kwasu propionowego i 16,8 ml roztworu przeciwgrzybiczego Drosophila/etanolu. Dobrze wymieszaj. (Przygotować roztwór środka przeciwgrzybiczego Drosophila, dodając 380 g środka przeciwgrzybiczego Drosophila do 1 litra etanolu o 200 proof i mieszając na ciepłym talerzu aż do rozpuszczenia, upewniając się, że roztwór nie przekracza 70 °C.)
   9. Wlać pokarm do fiolek, aż pokarm osiągnie głębokość około 1 cala i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 godziny. Zatkać fiolki i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 25 °C. Zużyć w ciągu tygodnia.
2. Zanurz kilkakrotnie szpatułkę w górnej warstwie fiolki z jedzeniem, aby ją naciąć. Pomoże to larwom zakopać się i żerować.
3. 22 - 24 godziny po zakończeniu zbierania jaj użyj małego pędzla, aby zebrać 50 larw pierwszego stadium (L1) o tej samej przybliżonej wielkości. Umieść larwy w eksperymentalnym pokarmie. Wyczyść pędzel chusteczką laboratoryjną i upewnij się, że na pędzlu nie pozostały żadne larwy, zanim przejdziesz do innego genotypu.
4. Umieścić fiolkę z larwami w inkubatorze w temperaturze 25 °C i pozostawić do rozwoju.

3. Określ poziom tłuszczu u larw

1. Przygotuj rozwiązania.
   1. Przygotuj 1 l bulionu 10x PBS.
      1. Dodać 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na₂HPO₄ i 2,4 g KH₂PO₄ do 800 ml wody w zlewce o pojemności 2 l. Mieszaj bez ognia, aż wszystkie sole się połączą. Doprowadzić pH do 7,4. Zwiększ objętość do 1 l wodą.
   2. Przygotuj 2 L 1x PBS. Dodać 200 ml 10 PBS roztworu podstawowego do 1 800 ml wody.
   3. Użyj tego zapasu 1x PBS, aby uzyskać 20% w/v sacharozy.
2. Wyjąć fiolkę z larwami z inkubatora, gdy po bokach fiolki pojawi się 20-40 larw (zwykle piątego dnia po pobraniu jaj). Należy zanotować datę i godzinę testu, a także liczbę wędrujących larw.
3. Przygotować roztwór doświadczalny, dodając 11,5 ml PBS i 9 ml 20% sacharozy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
4. Dodaj 20% sacharozy do fiolki, aż znajdzie się 0,5 - 1 cala od górnej części fiolki.
5. Użyj szpatułki, aby delikatnie wymieszać górną warstwę pokarmu, aby uwolnić larwy, które nadal grzebią się w żywności. Wszystkie larwy wydostaną się na powierzchnię roztworu sacharozy.
6. Za pomocą kleszczy delikatnie przenieś larwy do początkowego stężenia sacharozy z kroku 3.3.
7. Użyj szpatułki, aby delikatnie wymieszać larwy w tym roztworze.
8. Zakryj stożkową rurkę i odwróć kilka razy, aby dokładnie wymieszać roztwór.
9. Rozkręć stożkową rurkę i zakręć, aby utworzyć delikatny wir.
10. Pozwól larwom się uspokoić, unosząc się na wierzch roztworu lub opadając na dno. Odczekaj 2 - 5 minut, aż larwy się usiądą.
    UWAGA: Jeśli nadal istnieją larwy, które nie są na pewno ani pływające, ani tonące, wybierz linię, której chcesz użyć jako punktu odcięcia, aby oznaczyć larwy jako pływak lub ciężarek. Zastosuj to samo kryterium do wszystkich genotypów. Jako granicy używamy kąta na dole stożkowej rury. Larwy z mutacją ADP lub SIR2¹⁷ mogą być stosowane jako kontrola dodatnia, a mutanty LSD2¹⁹ mogą być używane jako kontrola ujemna do kalibracji testu.
11. Zanotować liczbę pływających larw i badane stężenie właściwe.
12. Dodać 1 ml 20% sacharozy do roztworu doświadczalnego, aby zwiększyć jego gęstość.
13. Powtórz kroki od 3.7 do 3.10. Zapisz liczbę pływających larw i to nowe stężenie.
14. Kontynuuj kroki 3.12 i 3.13 do momentu, gdy co najmniej 95% larw zacznie unosić się na wodzie.
15. Użyj kleszczy, aby zebrać wszystkie larwy do naczynia preparacyjnego wypełnionego PBS.
16. Obserwuj larwy pod mikroskopem i zwróć uwagę, czy są jakieś małe larwy, pre-poczwarki, poczwarki lub jakiekolwiek inne różnice między genotypami.
    UWAGA: Idealnie, wszystkie larwy powinny wydawać się jednorodne i na tym samym etapie rozwoju. Zaobserwowaliśmy tylko spójne pomiary tłuszczu w tych warunkach.
17. Zapisać całkowitą liczbę larw.
18. Za pomocą kleszczy przenieś 10 larw do chusteczki laboratoryjnej do wyschnięcia. Oznacz probówkę do mikrowirówki i umieść w niej 10 larw.
19. Błyskawiczne zamrożenie larw w ciekłym azocie. Przechowywać probówkę w temperaturze -20 °C.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia przykład tego, jak test oparty na wyporności może wykrywać zarówno większe, jak i mniejsze zasoby tłuszczu u genetycznie zmodyfikowanych larw. Rysunek 1A pokazuje, że pobudzenie lub wyciszenie określonego podzbioru neuronów (E347) w mózgu larwy indukuje odpowiednio mniejsze i większe zasoby tłuszczu. W obu przypadkach zastosowano tę samą kontrolę z tym samym tłem genetycznym. Rysunek 1B stanowi przykład tego, jak fen...

Dyskusja

Istnieje wiele technik, które zostały opracowane do pomiaru poziomu lipidów ^8-10. Jednak każda z tych metod ma pewne poważne wady, które są rozwiązywane przez test oparty na pływalności opisany powyżej. Po pierwsze, ten test jest niezwykle szybki. Badanie pełnego gradientu stężeń zajmuje nie więcej niż 30 - 60 minut. Jest to ogromny postęp w stosunku do większości obecnie stosowanych technik. Na przykład oznaczanie ilościowe lipidów przez stwardnienie rozsiane zajmuje 7-9 godzin na wyizol...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bacto Agar	VWR	214030
Welch's Original 100% sok
sacharoza	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Etanol			200 proof
Drożdże piekarskie	Fleichmann's
Yellow Mączka kukurydziana	Quaker		Wzbogacony odkiełkowany
Drosophila Agar Typ II	Apex	66-104
Mąka sojowa	ADM Składniki specjalne	062-100
Ekstrakt słodowy	Breiss	5748
Jasny syrop kukurydziany	Kwas propionowy Karo
	VWR	U330-09
Chlorek sodu	Fisher	50147491
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma	P5655-100G
Fosforan sodu bezwodny	Fisher	S3933
Chlorek potasu	Fisher	P330-500
35 x 10 mm płytka Petriego	Fisher	08-757-100A
50 ml Stożkowy	Fisher	50-869-569

winogronowy