Hybrid-Cut: ulepszona metoda cięcia opornych próbek tkanek roślinnych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje prostą metodę cięcia tkanek metodą Hybrid-Cut, która jest przydatna dla opornych tkanek roślinnych. Dobrej jakości skrawki tkanek umożliwiają badania anatomiczne i inne badania biologiczne, w tym hybrydyzację in situ (ISH).

Streszczenie

Utrzymanie integralności sekcji roślin jest niezbędne do badania szczegółowych struktur anatomicznych na poziomie komórkowym, tkankowym, a nawet narządowym. Jednak niektóre komórki roślinne mają sztywne ściany komórkowe, twarde włókna i kryształy (szczawian wapnia, krzemionka itp.) oraz wysoką zawartość wody, które często zaburzają integralność tkanek podczas sekcji tkanek roślinnych.

To badanie ustanawia prostą metodę cięcia tkanek metodą Hybrid-Cut. Protokół ten modyfikuje technikę cięcia na bazie parafiny i poprawia integralność skrawków tkanek z różnych roślin. Tkanki roślinne zanurzono w parafinie przed sekcją w kriosacie w temperaturze -16 °C. Cięcie w niskiej temperaturze utwardziło bloki parafiny, zmniejszyło rozdzieranie i drapanie oraz znacznie poprawiło integralność tkanek. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do bogatych w szczawian wapnia tkanek storczyków Phalaenopsis, a także tkanek opornych, takich jak narządy rozrodcze i liście ryżu, kukurydzy i pszenicy. Ponadto wysoka jakość skrawków tkanek z Hybrid-Cut może być wykorzystana w połączeniu z hybrydyzacją in situ (ISH) w celu uzyskania przestrzennych wzorców ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania. Podsumowując, protokół ten jest szczególnie przydatny w przypadku opornych tkanek roślinnych o wysokiej zawartości kryształów lub krzemionki. Dobrej jakości skrawki tkanek umożliwiają badania morfologiczne i inne badania biologiczne.

Wprowadzenie

Metoda cięcia na bazie parafiny jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach anatomicznych. Zachowanie nienaruszonej anatomii tkanek jest ważne dla badań morfologicznych i biologicznych. Technika cięcia zatopionego w parafinie jest korzystna, ponieważ zatapianie w parafinie zachowuje morfologię komórek i tkanek. Ponadto bloki parafiny można wygodnie przechowywać przez długi czas. Jednak cięcie zatopione w parafinie nie jest odpowiednie dla tkanek roślinnych zawierających kryształy wewnątrzkomórkowe. Kryształy w komórkach często rozrywają wstęgi parafinowe i uszkadzają integralność tkanek podczas cięcia.

W przeciwieństwie do sekcji parafiny, kriosekcja jest stosunkowo szybka i skrawki można uzyskać bez fiksacji, seryjnego odwadniania lub zatapiania infiltracji medium ¹. Kriosekcje są kompatybilne z wieloma aplikacjami, takimi jak immunohistochemia, hybrydyzacja in-situ i histochemia enzymów. Inną zaletą kriosekcji jest to, że metoda ta nie przechodzi przez potencjalne procesy denaturacji, takie jak wysoka temperatura i zabiegi chemiczne, dzięki czemu cząsteczki komórkowe są dobrze zachowane w skrawkach tkanek ². Kriosekcja jest ogólnie preferowana w stosunku do sekcji opartej na parafinie w badaniach na tkankach zwierzęcych. Jednak kriosekcja nie jest pierwszym wyborem w roślinach, ponieważ ujemna temperatura czasami powoduje tworzenie się kryształków lodu, które wpływają na jakość integralności sekcji. Chociaż doniesiono, że osmoregulacja, taka jak roztwory sacharozy, glikol polietylenowy (PEG) lub glicerol ³, zmniejsza tworzenie się lodu krystalicznego w warunkach zamarzania, poprawa jest mniej niż optymalna.

Aby dostosować się do różnych środowisk, różne rośliny często mają odmienną strukturę tkanki, a komórki roślinne ewoluowały, tworząc sztywne ściany komórkowe, wytrzymałe włókna i kryształy ^4,5. Na przykład nierozpuszczalne kryształy szczawianu wapnia i ciała krzemionkowe są dość powszechne w roślinach ⁶. Doniesiono, że ciała/kryształy krzemianowe pomagają w utrzymaniu architektury roślin, erekcji oraz zapobiegają chorobom lub szkodnikom u roślin zbożowych ^7-9.

Rynek storczyków doniczkowych i storczyków na kwiaty cięte kwitnie i jest to rozwijający się przemysł. Phalaenopsis aphrodite (orchidea) jest jedną z najważniejszych eksportowych roślin ozdobnych na Tajwanie. Podjęto znaczne wysiłki w celu zrozumienia morfologicznych i fizjologicznych zmian procesów kwitnienia storczyków Phalaenopsis. Kwiatowe kłosy storczyków Phalaenopsis są inicjowane z pąków pachowych u podstawy liścia. Po okresie chłodnej temperatury otoczenia (około półtora miesiąca) pąki pachowe powiększają się, przerywają spoczynek i wystają z podstawy liścia, przekształcając się w młode kłosy kwiatowe. Aby zrozumieć fizjologiczne, komórkowe i molekularne procesy inicjacji kolców, konieczne jest opracowanie solidnej techniki anatomicznej do wizualizacji tkanek lub markerów w odpowiednim czasie. Jednak obecność wszechobecnych kryształów w tkankach storczyków, szczególnie w pąkach pachowych, utrudnia prace anatomiczne.

Tutaj staraliśmy się poprawić integralność sekcji opornych tkanek roślinnych, które do tej pory były uważane za technicznie trudne. Tutaj pokazujemy ulepszony protokół o nazwie Hybrid-Cut. Jest to metoda cięcia na bazie parafiny, która jest wykonywana za pomocą kriostatu. Osadzanie parafiny rozwiązuje problem wysokiej zawartości wody w tkance roślinnej. Cięcie w niskiej temperaturze utwardza blok parafinowy, zmniejsza problem rozrywania kryształów i znacznie poprawia integralność tkanki. Protokół ten znacznie poprawia integralność tkanek w przypadku opornych próbek roślin.

Protokół

1. Utrwalanie i osadzanie

1. Przygotowanie odczynnika
   1. 10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
      1. Dodać 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na₂HPO₄ i 2,4 g KH₂PO₄ w 800 ml podwójnej wody destylowanej (ddH₂O) i dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl. Dodać ddH₂O do całkowitej objętości 1 l, następnie dodać 1 000 μl pirowęglanu dietylu (DEPC) i energicznie wstrząsnąć. PBS należy przechowywać przez noc w temperaturze pokojowej i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut następnego dnia.
   2. 1x PBS (Biblioteka PBS)
      1. Rozcieńczyć materiał podstawowy 10x PBS w stosunku 1:10 w ddH₂O, aby uzyskać końcowe stężenie 0,01 M Na₂HPO₄, 0,002 M KH₂PO₄, 0,003 M KCl i 0,13 M NaCl.
   3. Utrwalacz paraformaldehydu (PFA)
      Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny. Przygotuj go pod wyciągiem. Nosić rękawice.
      1. Aby przygotować 250 ml utrwalacza PFA, podgrzać 100 ml 1x PBS do temperatury 70 - 80 °C i dodać 1,750 μl NaOH. Następnie dodaj 10 g paraformaldehydu i dokładnie wymieszaj, aż do rozpuszczenia. Umieścić roztwór na lodzie, a następnie po schłodzeniu dostosować pH do 7,2 za pomocą_H2SO4 (260 - 270 μl na 100 ml).
      2. Dostosuj objętość do 250 ml za pomocą 1x PBS, dodaj 625 μl aldehydu glutarowego do końcowego stężenia 0,25%. Dodać 250 μl Triton X-100 i 250 μl Tween 20, aby ułatwić infiltrację utrwalacza.
         UWAGA: Utrwalacz PFA może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez jeden miesiąc bez utraty zdolności utrwalania.
   4. Przygotuj różne stężenia etanolu (30%, 50%, 70%, 85% i 95%) z wodą uzdatnioną DEPC.
2. Pobieranie próbek roślin
   1. Pąki pachowe
      1. Używaj dojrzałych roślin storczyków Phalaenopsis w fazie czterolistnej. Ostrożnie usuń liście, rozrywając liść za nerwem za pomocą rąk.
      2. Użyj ostrego skalpela, aby ostrożnie usunąć pąki pachowe z podstawy trzeciego lub czwartego liścia na łodydze monopodialnej.
   2. Próbka nasion
      1. Zbierz dojrzałe strąki nasion orchidei po 4 miesiącach od zapylenia. Strąki nasion przeciąć wzdłużnie skalpelem. Delikatnie potrząśnij otwierającą się saszetką nasienną i uwolnij suche nasiona na bibule filtracyjnej.
   3. Protokorm (Protocorm)
      1. Dojrzałe nasiona orchidei wysiewać na 1/2x płytce agarowej Murashige i Skoog i hodować w pomieszczeniu do hodowli tkankowej w 12-godzinnym okresie świetlnym i stałej temperaturze 25 °C. Próbkę zielonego protokormu należy pobrać po 7 tygodniach od wysiania.
   4. Ciała podobne do protokormu (PLB)
      1. Hodować PLB storczyków na regenerujących się płytkach agarowych T2, jak opisano wcześniej ¹⁰ i umieścić w tych samych warunkach wzrostu, co w kroku 1.2.3.1. Zbierz 10 PLB na wysokości 5 - 8 mm.
   5. Próbka liści
      1. Pobrać tkankę liści z dojrzałej rośliny storczyka Phalaenopsis zgodnie z opisem w kroku 1.2.1.1.
      2. Za pomocą ostrego skalpela odetnij mały kawałek tkanki liścia (7 mm długości x 5 mm szerokości) z drugiego nowo rozwiniętego liścia.
   6. Próbka korzeniowa
      1. Używając tej samej rośliny opisanej w kroku 1.2.1.1, wypreparuj 1 cm długości tkanki wierzchołka korzenia za pomocą ostrego skalpela.
   7. Młody kolec
      1. Za pomocą ostrego skalpela odetnij młodą tkankę kolca z końcówki łodygi kwiatowej o długości 10 cm.
   8. Pączek kwiatowy
      1. Z łodygi kwiatu orchidei należy wyciąć mały pączek kwiatowy o średnicy 5 mm. Wytnij część tkanki pąka kwiatowego wzdłuż (o grubości 3 mm).
   9. Tkanki liści i kłosków roślin zbożowych
      1. Wytnij tkankę blaszki liściowej o długości 1 cm z pierwszych nowo rozwiniętych liści ryżu, pszenicy i kukurydzy.
      2. Zbierz 10 kłosków z roślin (ryżu, pszenicy i kukurydzy) na dzień przed śmiercią.
3. Utrwalenie
   1. Próbki roślin należy natychmiast utrwalić, przenosząc je do szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej 15 ml lodowatego utrwalacza PFA.
   2. Zastosuj próżnię (~ 720 mm Hg) do sadzenia próbek w chłodnym pomieszczeniu o temperaturze 4 °C. Utrzymuj próżnię przez 15 - 20 minut (z próbek powinny zostać uwolnione małe pęcherzyki). Powtarzaj ten krok, aż większość tkanek opadnie po uwolnieniu próżni. Trzymaj odkurzacz przez noc i powoli uwalniaj odkurzacz następnego dnia.
4. Odwodnienie
   UWAGA: Użyj tej samej fiolki od utrwalenia przez etapy infiltracji. Wlać lub użyć pipety, aby odsączyć roztwór z poprzedniego kroku i zastąpić 15 ml nowego roztworu w fiolce. W zależności od tekstury tkanek należy traktować twardsze tkanki, takie jak pąk pachowy orchidei, nasiona, protokorma i PLB oraz kłosek ryżu, pszenicy i kukurydzy przez dłuższy czas; Traktuj bardziej miękkie tkanki, takie jak pąki kwiatowe orchidei, młode kłosy, liście i korzeń oraz liście ryżu, pszenicy i kukurydzy przez krótszy czas.
   1. Po utrwaleniu zanurzyć próbkę w 15 ml 1x PBS na 10 minut na lodzie.
      1. Próbki odwodnić w serii 15 ml etanolu w temperaturze pokojowej w następujący sposób: 30% etanolu przez 30 minut, 50% etanolu przez 30 minut, 70% etanolu przez 1 godzinę, 85% etanolu przez 54 minuty dla tkanek twardych i 30 minut dla tkanek miękkich, 95% etanolu przez 54 minuty dla tkanek twardych i 30 minut dla tkanek miękkich oraz 100% etanolu dwa razy przez 54 minuty dla tkanek twardych i 30 minut dla tkanek miękkich.
         UWAGA: Próbki roślin można przechowywać w 70% etanolu w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
5. Naciek parafinowy
   1. Próbki infiltrować 15 ml mieszaniny etanolu i substytutu ksylenu przez 54 minuty każda dla tkanek twardszych i 30 minut dla tkanek miękkich, w temperaturze pokojowej w następujący sposób: substytut etanol/ksylen (2:1, v/v), podstawienie etanolu/ksylenu (1:1, v/v), podstawienie etanolu/ksylenu (1:2, v/v) i dwukrotne podstawienie czystego ksylenu. Uwaga: Ksylen jest toksyczny. Wykonaj ten krok w dygestorium.
   2. Naciekać próbkę w fiolce za pomocą 15 ml substytutu ksylenu i mieszaniny parafiny w piecu w temperaturze 60 °C, przez noc w przypadku tkanek twardszych i przez 60 minut w przypadku tkanek miękkich w następujący sposób: substytut ksylenu/parafina (2:1, v/v), substytut ksylenu/parafina (1:1, v/v) i substytut ksylenu/parafina (1:2, v/v).
   3. Próbkę naciekać 15 ml czystej parafiny dwa razy dziennie i inkubować w temperaturze 60 °C w piecu.
   4. Powtórz krok 1.5.3 następnego dnia.
6. Osadzanie tkanek
   1. Włącz moc centrum zatapiania tkanek 1 godzinę wcześniej, aby stopić wosk w zbiorniku parafiny przed zatopieniem tkanek w bloku parafiny.
   2. Rozgrzej metalowe foremki (rozmiar podstawy 3,3 cm długości x 2 cm szerokości) na tacy grzewczej w temperaturze 62 °C i wlej około 13 ml stopionego wosku do podstawy formy.
   3. Przenieść jedną próbkę tkanki z sekcji 1.5.4 do formy za pomocą rozgrzanych kleszczyków i ustawić ją w żądanej pozycji.
   4. Ostrożnie przenieś formę na chłodną płytkę i pozostaw do zastygnięcia wosku.

2. Sekcja tkanek

1. Metoda cięcia parafiny
   1. Wykonaj bazę woskową, umieszczając kasetę do zatapiania na wierzchu formy (ten sam rozmiar w sekcji 1.6.2), wypełnij stopionym woskiem i wyjmij formę po zestaleniu się wosku.
      UWAGA: Kaseta do zatapiania utworzy woskową podstawę do zakotwiczenia bloku parafiny próbki.
   2. Przytnij blok parafiny do odpowiedniego kształtu i rozmiaru, a następnie umieść kilka kawałków wosku na płaskiej szpatułce. Podgrzej kawałki wosku za pomocą palnika alkoholowego, aż wosk się rozpuści, a następnie umieść stopiony wosk na woskowej podstawie w sekcji 2.1.1, aby przykleić blok. Zacisnąć go w mikrotomie.
   3. Umieść nowe ostrze na mikrotomie i wyreguluj kąt do 5 stopni, aby ułatwić cięcie w mikrotomie.
   4. Próbkę warstwy parafinowej pokroić w cienkie plasterki (10 μm), jak opisano wcześniej ¹¹.
2. Metoda przekroju Hybrid-Cut
   1. Przyciąć blok parafiny próbki od kroku 1.6.4 do kolumny z trapezową powierzchnią u góry do odpowiedniego rozmiaru za pomocą żyletki.
   2. Dodaj trochę środka o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na środek stolika kriostatu. Przymocuj blok parafinowy do etapu kriostatu, a następnie szybko ustaw blok tkanki w żądanej pozycji.
   3. Przenieść blok/stolik parafinowy do komory kriostatu. Pozostawić OCT do zestalenia się na pasku do szybkiego zamrażania w temperaturze -42 °C przez 10 minut. Nie przesuwaj bloku podczas krzepnięcia OCT (Rysunek 2C).
   4. Poczekaj, aż adapter do kriostatu i temperatura komory ostygną odpowiednio do -20 °C i -16 °C przed podłączeniem bloku/stolika parafinowego do adaptera kriostatu. Przekroje tkanek do grubości 10 μm.
   5. Pobieraj skrawki tkanek za pomocą kleszczy. Zanurzyć sekcje w 800 μl wody uzdatnionej DEPC w szkiełku pokrytym poli-L-lizyną i przenieść szkiełka na płytę grzejną w temperaturze 42 °C.
   6. Pozwól, aby sekcje spłaszczyły się na wodzie uzdatnionej przez DEPC w temperaturze 42 °C. Użyj bibuły filtracyjnej, aby spuścić wodę z krawędzi.
   7. Zamontuj chusteczkę na szkiełku, umieszczając szkiełko na nocy na płycie grzejnej o temperaturze 42 °C.

3. Barwienie tkanek

1. Deparafinizacja
   1. Zbierz szkiełka z płyty grzejnej i umieść je na stojaku do barwienia. Dodaj 150 ml ksylenu do słoika do barwienia w dygestoriach i zanurz stojak w ksylenach na 5 minut.
2. Rehydracja
   1. Przygotuj roztwory etanolu o różnych stężeniach (100%, 95%, 70%, 50% i 30%) w wodzie uzdatnionej DEPC i napełnij odpowiednio 150 ml roztworu do różnych słoików do barwienia.
   2. Próbki należy ponownie uwodnić poprzez serię zmniejszających się stężenia etanolu, co każdy etap przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Przenieś szkiełka z stojaka do barwienia z jednego słoika do innego słoika zawierającego etanol o różnych stężeniach: 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu, 50% etanolu i 30% etanolu.
   3. Po ponownym nawodnieniu zanurzyć próbki w ddH₂O na 3 minuty.
3. Barwienie hematoksyną
   1. Próbki tkanek należy barwić, zanurzając szkiełka tkankowe w roztworze hematoksyliny na 1,5 minuty.
   2. Płukać krótko w ddH₂O zawierających 1 - 2 krople 12 N kwasu solnego (HCl) przez kilka sekund, a następnie krótko myć w ddH₂O.
4. odwodnienie
   1. Odwadniać próbki poprzez serię rosnących stężeń etanolu przez 3 minuty w temperaturze pokojowej: 30% etanolu, 50% etanolu, 70% etanolu, 95% etanolu i 100% etanolu. Oczyść próbki ksylenem w dygestoriach przez 5 minut.
5. Montażu
   1. Upuść odpowiednio 600 μl medium montażowego na bazie ksylenu na szkiełko. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na próbce. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza, aby uzyskać obrazy dobrej jakości.
   2. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez noc. Następnego dnia należy obserwować próbkę pod mikroskopem.
      Uwaga: Obrazy zostały wykonane w powiększeniu od 25x do 400x, w zależności od wielkości okazów.

4. Hybrydyzacja in situ

1. Synteza sondy
   1. Klon Phalaenopsis aphrodite Sekwencja kodująca specyficzny dla genu aktyny przy użyciu starterów 5'-GGCAGAGTATGATGATGATGGTCC-3' i 5'- AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3' (w celu uzyskania amplikonu PCR 242 pz) i CyclinB1; 1 sekwencja kodująca specyficzna dla genu przy użyciu starterów 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3' i 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3' (w celu uzyskania amplikonu PCR 327 bp), jak opisano ¹².
   2. Zliguj określone sekwencje kodowania w wektory (np. pGEMT) zgodnie z protokołem producenta.
   3. Generuj sondy wykrywające i antysensowne znakowane digoksygeniną (DIG) za pomocą zestawu do znakowania RNA SP6/T7 DIG zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Hybrydyzacja in situ
   1. Wytnij 2. i 3. wycinki tkanki pąka pachowego (o grubości 10 μm) wygenerowane metodą Hybrid-Cut i zamontuj plastry na powlekanym szkiełku.
   2. Odparafinować skrawki tkanek w ksylenie (patrz ppkt 3.1.1), ponownie uwodnić w zmniejszających się stężeniach etanolu (patrz ppkt 3.2.2) i trawić za pomocą 2 mg/ml proteinazy K w temperaturze 37 °C przez 30 min.
   3. Przeprowadzić hybrydyzację in situ zgodnie z protokołem opisanym wcześniej ^11,13 z pewnymi modyfikacjami, tj. z temperaturą hybrydyzacji dla aktyny wynoszącą 59 °C i 60 °C dla cykliny B1;1. Hybrydyzuj szkiełko z sondą RNA znakowaną 40 ng DIG.
   4. Użyj roztworu nitroniebieskiego tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (NBT/BCIP) w celu wykrycia sygnałów hybrydyzacji, jak opisano ¹¹.

Wyniki

Hybrydowe cięcie poprawia integralność sekcji tkanek

Zrozumienie anatomii reprodukcyjnej struktury kwiatowej jest ważne dla zbadania mechanizmu inicjacji kwitnienia u storczyków. Jednak nagromadzenie wewnątrzkomórkowych kryształów szczawianu wapnia w storczykach Phalaenopsis sprawia, że takie badania są trudnym zadaniem. Aby obejść problemy związane z rozrywaniem się kryształów podczas procesu cięcia (ilustracja 1), opracowaliśmy system, który nazwaliśmy Hybrid-Cut. Protokół ten łączy w sobie tradycyjne techniki zatapiania parafiny i kriosekcji. Po raz pierwszy przetestowaliśmy Hybrid-Cut w pachowych pąkach orchidei Phalaenopsis, ponieważ są one znane ze sztywności tkanek i wysokiej zawartości kryształów. Tkankę pączka pachowego utrwalono w 4% PFA (patrz Protokół, krok 1.3). Po seryjnym odwodnieniu etanolu i infiltracji wosku parafinowego, pączek pachowy został osadzony w bloku parafinowym. Blok został przycięty do odpowiedniego rozmiaru przed przekrojem (Rysunek 2A). Niewielką ilość OCT nałożono następnie na środek etapu kriostatu (ryc. 2B). Blok parafinowy został następnie przyklejony do sceny za pomocą OCT. Etap inkubowano w kriostacie przez 10 minut, aby umożliwić całkowite zestalenie OCT przed sekcją (ryc. 2C), a następnie kriosekcję przeprowadzono w komorze o temperaturze -16 °C (ryc. 2D).

Dla porównania, blok parafiny zawierający pachowy pączek orchidei Phalaenopsis był poddawany regularnemu cięciu mikrotomem. Jak pokazano na rysunku 1A, po przecięciu mikrotomem zaobserwowano silne rozerwanie wstęg parafinowych. Integralność tkanki i struktura komórkowa również zostały naruszone (ryc. 1B). Z drugiej strony Hybrid-Cut wytworzył nienaruszone skrawki tkanek (ryc. 3A) z zachowaną integralnością strukturalną (ryc. 3B).

Zastosowanie hybrydowego cięcia na różnych tkankach P. aphrodite

Aby dodatkowo przetestować funkcjonalność Hybrid-Cut, przetestowaliśmy różne tkanki storczyków Phalaenopsis. Często trudno jest uzyskać skrawki nasion o dobrej integralności tkankowej ze względu na stwardniałą okrywę nasienną. Korzystając z tego protokołu, szczegółowe struktury nasion zostały zachowane po podziale (ryc. 4A). Jak pokazano na rysunku 4A, ciała białkowe, powszechne produkty magazynowania ¹⁴, można było wyraźnie zidentyfikować. Projekt Hybrid-Cut również zadziałał pomyślnie i pokazał szczegółowe struktury merystemu wierzchołkowego pędu jednomiesięcznego protokormu (struktura kiełkująca z nasiona) (ryc. 4B) i ciał podobnych do protokormu (PLB, ryc. 4C). Kryształy wewnątrzkomórkowe obserwowano w przekrojach PLB. Storczyki Phalaenopsis mają grube i soczyste liście i przeprowadzają fotosyntezę typu metabolizmu kwasu gruboszowego (CAM) ¹⁵. W poprzecznym przekroju blaszki liściowej widoczne były duże komórki mezofilu i wiązki naczyniowe zawierające ksylem i łyko (ryc. 4D). W ciągu dnia zaobserwowano kilka otworów szparkowych na powierzchni liścia aosiowego (ryc. 4D). W rzeczywistości rośliny CAM ewoluowały, aby maksymalizować przyrost węgla, ale jednocześnie minimalizować utratę wody, otwierając swoje szparki w nocy w suchych warunkach ^15,16. Merystem wierzchołkowy korzenia P. aphrodite pokazano na rycinie 4E. Komórki wierzchołka korzenia wydawały się zawierać znaczną liczbę kryształów, które były bardzo dobrze zachowane po przecięciu (ryc. 4E). Podłużne przekroje młodych kłosów kwiatowych dostarczyły informacji o architekturze młodych pierwotnych kwiatów (ryc. 4F). Co więcej, działki, płatki, labellum i pyłki można było wyraźnie zidentyfikować na podstawie podłużnego przekroju młodych pąków kwiatowych, które zakończyły różnicowanie w tym 5-milimetrowym pąku kwiatowym (ryc. 4G). Zauważ, że kryształy zostały nagromadzone w działkach młodych pąków kwiatowych. Krótko mówiąc, protokół ten działa konsekwentnie w celu utrzymania integralności tkanek i tworzy nienaruszoną morfologię, umożliwiając anatomiczne i możliwe badania komórkowe.

Hybrydowy krój zachowuje integralność tkanek w uprawach zbóż

Przetestowaliśmy również Hybrid-Cut na uprawach zbóż, takich jak ryż, pszenica i kukurydza, które zawierają wysoką zawartość krzemionki ^17,18. Jak pokazano na rysunku 5, integralność tkanek poprzecznych odcinków liści ryżu, pszenicy i kukurydzy uległa znacznej poprawie dzięki metodzie Hybrid-Cut. Ksylem, łyko, komórki mezofilu, aparaty szparkowe i komórki pęcherzowate, które kontrolują zwijanie się blaszki liściowej w celu uniknięcia utraty wody, zostały wyraźnie zidentyfikowane na podstawie odcinków liści ryżu. Anatomia Kranza, komórki mezofilu i wiązki naczyniowe liścia kukurydzy ^19,20 zostały wyraźnie zidentyfikowane. Intrygujące było odkrycie dużego zagęszczenia szparkowców zarówno po stronie przyosiowej, jak i abaksjalnej liści kukurydzy (ryc. 5). Stosunek aparatów szparkowych adaksjalnych i abaksjalnych wynoszący 0,7 w kukurydzy został opisany wcześniej ²¹. Ponadto protokół ten zadziałał również z powodzeniem, zapewniając szczegółową morfologię komórek kłosków ryżu, pszenicy i kukurydzy (ryc. 6). Wiadomo, że kłoski zawierają dużo krzemionki ⁹. Zwykle powoduje to trudności w przeprowadzaniu sekcji tkanek.

Hybrydyzacja in situ

Podejścia genomiczne i transkryptomiczne są powszechnie używane do opisywania funkcji genów. Zapewnienie przestrzennego rozmieszczenia transkryptów genów będących przedmiotem zainteresowania w kontekście rozwojowym lub środowiskowym jest ważne, aby uzyskać nowy wgląd w możliwe funkcje genów. Hybrydyzacja in-situ (ISH) została opracowana w celu lokalizacji wzorców ekspresji genów na poziomie tkanki ^11,22-25. Ponadto ISH może zapewnić komórkową, a w niektórych przypadkach subkomórkową rozdzielczość dystrybucji mRNA w organizmach wielokomórkowych ²⁶. Podczas ISH integralność RNA i tkanek jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych informacji przestrzennych o wybranym transkryptie. Przetestowaliśmy ISH przy użyciu protokołu Hybrid-Cut. Gen aktyny (PATC157348) sklonowano przy użyciu starterów 5'-GGCAGAGTATGATGATGATGGTCC-3' i 5'- AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3', aby uzyskać amplikon PCR 242 bp. Sekwencja kodująca specyficzny dla genu cykliny B1:1 (PATC146999) przy użyciu starterów 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3' i 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3' w celu uzyskania amplikonu PCR 327 pz. Po ISH monitorowano ekspresję genów aktyny i cykliny B1:1 w młodych i dojrzałych pąkach pachowych (ryc. 7). Oba geny ulegały ekspresji w komórkach merystematycznych 2^{. i 3}. pąków^pachowych, przy czym silniejsze sygnały wykryto w 3.^pąkach pachowych. Wyniki te wykazały, że Hybrid-Cut zachowuje dobrą anatomię i zapewnia przestrzenny wzorzec ekspresji genów.

Rycina 1: Tradycyjny przekrój parafinowy powoduje poważne rozerwanie tkanki. Blok parafinowy zawierający pachowy pączek storczyka Phalaenopsis poddano regularnemu cięciu mikrotomowemu. Silne rozerwanie wstęg parafinowych zaobserwowano po tradycyjnym przecięciu mikrotomem (A). Integralność tkanek i struktura komórkowa również zostały naruszone (B). Strzałki pokazują silne rozdarcie wycinka tkanki. Grot strzały pokazuje ciała kryształowe. Podziałka 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Metoda cięcia hybrydowego. Tkanka pączka pachowego została utrwalona w PFA, a tkanki zostały odwodnione, naciekane woskiem parafinowym i zatopione w bloku parafinowym. Blok parafiny został przycięty do odpowiedniego rozmiaru (A). Związek o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) został nałożony na środek stopnia kriostatu (B). Blok parafiny został przyłączony do OCT na stoliku kriostatu. W niskiej temperaturze blok parafinowy przyklejono do etapu kriostatu za pomocą OCT (C). Plastry tkanek podzielono na sekcje w komorze kriostatu w temperaturze -16 °C (D). Paski skali reprezentują 0,5 cm (A) i 1 cm (BD). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Cięcie hybrydowe poprawia integralność przekroju. Blok parafinowy zawierający pachowy pączek storczyka Phalaenopsis poddano cięciu hybrydowemu (A), a metodą cięcia hybrydowego uzyskano skrawki o doskonałej integralności tkankowej (B). Grot strzały pokazuje endogenne ciała krystaliczne osadzone w tkance pączka pachowego. Podziałka 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Zastosowanie ciętego hybrydy do różnych odcinków tkanek storczyka Phalaenopsis. Metodą Hybrid-Cut dzielono różne tkanki storczyków, takie jak przekrój podłużny nasion storczyków w fazie dojrzałości (A), przekrój podłużny protokormu (B), przekrój podłużny ciał protokormu (PLB) (C), przekrój poprzeczny blaszki liściowej (D), przekrój podłużny korzenia (E), przekrój podłużny młodego kwiatostanu (F)i przekrój podłużny młodych pąków kwiatowych (G). Wycinki tkanek barwiono hematoksyliną. SC, okrywa nasienna; PB, ciało białkowe; M, merystem; MP, matka PLB; DP, córka PLB; Ad, adaksjalna powierzchnia liścia; Ab, powierzchnia liścia abaksjalnego; Św., aparaty szparkowe; MC, komórka mezofilu; VB, pęczek naczyniowy; RC, czapka korzeniowa; fb, pączek kwiatowy; Se, działka; Pe, płatek; La, labellum; Po, pollinia; Ro, rostellum; Ca, kalus. Groty strzał ukazują kryształy. Podziałki reprezentują 20 μm (A-E) i 200 μm (F-G). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Cięcie hybrydowe zachowuje integralność tkanek liści w kilku uprawach zbóż. Porównanie tkanki liścia przy użyciu tradycyjnej metody parafinowej (lewy panel) i techniki Hybrid-Cut opracowanej w tym badaniu (prawy panel). Zdjęcia pokazują poprzeczne przekroje liści ryżu, pszenicy i kukurydzy. MC, komórka mezofilu; Ph, łyko; Św., aparaty szparkowe; BC, komórka pęcherzowata. Strzałki pokazują rozdarcie wycinka tkanki. Groty strzał pokazują ciała krzemionkowe. Niebieskie przerywane kółka wskazują anatomię Kranza w kukurydzy C4. Podziałka 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Cięcie hybrydowe zachowuje integralność tkanki kłosków w kilku uprawach zbóż. Porównanie integralności tkankowej skrawków kłosków pomiędzy tradycyjnymi metodami parafinowymi i Hybrid-Cut. Strzałki pokazują rozdarcie wycinka tkanki. Groty strzałek wskazują ciała krzemionkowe. Podziałka 20 μm (ryż) i 200 μm (pszenica i kukurydza). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Hybrydyzacja in situ aktyny i cykliny B1; 1 Wzorce ekspresji w pąku pachowym orchidei Phalaenopsis. Plastry tkankowe 2. pąka^pachowego i 3. zawiązka^pachowego przygotowano metodą Hybrid-Cut. Łącznie 40 ng aktyny i cykliny B1; Do hybrydyzacji użyto 1 sondy znakowanej dig-label. Sonda wyczuwalna została użyta jako kontrola negatywna. Strzałki wskazują merystem rozrodczy pąka pachowego. Podziałka 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Komórki roślinne mają sztywne ściany komórkowe, twarde włókna, kryształy i wysoką zawartość wody, które powodują problemy z rozdzieraniem tkanek podczas cięcia tkanek roślinnych. Mimo że cięcie na bazie parafiny jest często stosowane w przypadku tkanek roślinnych, endogenne kryształy często ranią tkankę roślinną podczas cięcia (ryc. 1). Ze względu na z natury wysoką zawartość wody w komórkach roślinnych, sekcje oparte na kriostacie często powodują pękanie komórek i pękanie tkanek.

W niniejszym badaniu opracowano połączony protokół zatapiania parafiny i kriosekcji o nazwie Hybrid-Cut i uzyskano dobrej jakości skrawki tkanek. Protokół ten rozwiązuje problem związany z wysoką zawartością wody poprzez wprowadzenie zatapiania parafiny i zmniejsza efekt rozdzierania poprzez utwardzanie wosku parafinowego w niskiej temperaturze podczas cięcia (ryc. 3). Dlatego ten zmodyfikowany protokół jest korzystny w porównaniu z sekcją na bazie parafiny lub kriosekcją w celu zachowania integralności tkanek roślinnych.

Manuskrypt ten pokazuje, że metoda Hybrid-Cut zachowuje integralność tkanek w wielu tkankach storczyków Phalaenopsis , takich jak pąki pachowe, nasiona i PLB itp., które zawierają wysoki poziom kryształów (ryc. 3-4). Co więcej, protokół ten jest podatny na uprawy zbóż, takie jak narządy rozrodcze i liście ryżu, kukurydzy i pszenicy, które zawierają wysoką zawartość krzemionki (ryc. 5-6). Przypuszczalnie protokół ten może być stosowany do roślin drzewiastych zawierających dużo błonnika.

Ogólnie rzecz biorąc, dokładne utrwalenie tkanki jest bardzo ważne w przypadku Hybrid-Cut. Odkryliśmy, że utrwalacz kwasu formaldehydowo-alkoholowo-kwaśnego (FAA) jest lepszy niż PFA, aby zachować integralność tkanek niektórych opornych tkanek, takich jak osiowo pąki, korzenie itp. Jednak PFA działa lepiej niż FAA w zachowaniu integralności RNA. Dlatego zaleca się utrwalenie próbki PFA do hybrydyzacji in situ (ISH). Opisany tutaj protokół jest przeznaczony do eksperymentu RNA ISH. Dlatego wszystkie odczynniki zostały przygotowane tak, aby uniknąć degradacji RNA poprzez eliminację zanieczyszczenia RNazą przez obróbkę DEPC. Jeśli sekcja Hybrid-Cut jest przeznaczona do badań anatomicznych, dopuszczalna jest zwykła woda z odwróconej osmozy (RO) i jej pochodny bufor lub odczynniki.

Zmniejszenie rozmiaru i grubości próbki do mniej niż 3 mm jest pomocne w infiltracji. Co więcej, w przypadku tkanek o twardej teksturze konieczne jest wydłużenie czasu zanurzenia w celu odwodnienia i infiltracji. Ograniczenie tego protokołu może wynikać z problemów spowodowanych nieodpowiednim utrwaleniem, odwodnieniem i infiltracją próbki. Dlatego dostosowanie czasu przetwarzania dla każdego etapu ma kluczowe znaczenie dla wyprodukowania dobrej jakości bloku parafinowego. Zwykle twardsza tkanka wymaga dłuższego czasu przetwarzania niż tkanka miękka.

Ponadto wykazaliśmy, że Hybrid-Cut działał z powodzeniem w połączeniu z ISH, aby zapewnić przestrzenną dystrybucję wybranych transkryptów (Rysunek 7). Podsumowując, protokół ten jest przydatny do badania anatomii roślin i zapewnia specyficzną tkankowo mapę RNA wybranych genów. Ponadto może być stosowany w innych badaniach molekularnych, takich jak końcowy test znakowania końca nicka deoksynukleotydylotransferazy dUTP (TUNEL), fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i techniki barwienia immunologicznego. Podsumowując, ten ulepszony protokół sekcji tkanek jest zarówno użyteczny, jak i pomocny dla badaczy zajmujących się społecznościami roślinnymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Centrum osadzania model EC780-1	CSA
Microtome model RM2255	Leica
Cryostat model CM 1950	Leica
Axio Scope A1	Zeiss
Murashige & Pożywka Skoog zawierająca witaminy	Duchefa Biochemia	M0222.0050
Odkażacz powierzchniowy bez RNaz	Apex	10-228
Pirowęglan dietylu (DEPC)	Bio Basic Inc.
Chlorek sodu (NaCl)	MDBio, Inc.	101-7647-14-5
Chlorek potasu, kryształ (KCl)	J.T. Baker	7447-40-7
Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	7558-79-4
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	7778-77-0
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma-Aldrich	16005
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Showa	19430160
Kwas siarkowy (H2SO4)	Sigma-Aldrich	7664-93-9
Roztwór aldehydu glutarowego	Sigma-Aldrich	111-30-8
Monolaurynian polioksyetylenu 20 sorbitolu (Tween 20)	J.T. Baker	9005-64-5
Etoksylowany oktylofenol (Triton X100)	J.T. Baker	9002-93-1
Szklane fiolki scyntylacyjne	Newastar	DG60805-00020
Eksykator próżniowy	Violet Bioscience Inc.	TS-402030
Pompa łopatkowa RZ2.5	Vacuubrand	36149406
Etanol	J.T. Baker	64-17-5
Sub-X	Leica Surgipath	3803670	Substytut ksylenu
Paraplast Plus	Leica Surgipath	39602004	Parafina do zatapiania w tkankach
SUPERFROST mikroszkiełko szkiełkowe	Matsunami	S7441
FSC 22 Clear	Leica Surgipath	3801480	Mieszanka do optymalnej temperatury cięcia (OCT)
Ksyleny, oczyszczone	Leica Surgipath	3803665
Hematoxylin	Merck	HX305311
Kwas solny (HCl)	Sigma-Aldrich	7647-01-0
Micromount	Leica Surgipath	3801731	Medium montażowe
pGEM T-easy wektor Promega		A1360
Proteinaza K	Roche
Zestaw do znakowania RNA SP6/T7 DIG Roche		11175025910
roztwór podstawowy NBT/BCIP	Roche	11681451001