Artykuł metodologiczny

Hybrid-Cut: ulepszona metoda cięcia opornych próbek tkanek roślinnych

22K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54754

⸱

23 listopada 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Academia Sinica Biotechnology Center in Southern Taiwan; Agricultural Biotechnology Research Center, Academia Sinica

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje prostą metodę cięcia tkanek metodą Hybrid-Cut, która jest przydatna dla opornych tkanek roślinnych. Dobrej jakości skrawki tkanek umożliwiają badania anatomiczne i inne badania biologiczne, w tym hybrydyzację in situ (ISH).

Streszczenie

Utrzymanie integralności sekcji roślin jest niezbędne do badania szczegółowych struktur anatomicznych na poziomie komórkowym, tkankowym, a nawet narządowym. Jednak niektóre komórki roślinne mają sztywne ściany komórkowe, twarde włókna i kryształy (szczawian wapnia, krzemionka itp.) oraz wysoką zawartość wody, które często zaburzają integralność tkanek podczas sekcji tkanek roślinnych.

To badanie ustanawia prostą metodę cięcia tkanek metodą Hybrid-Cut. Protokół ten modyfikuje technikę cięcia na bazie parafiny i poprawia integralność skrawków tkanek z różnych roślin. Tkanki roślinne zanurzono w parafinie przed sekcją w kriosacie w temperaturze -16 °C. Cięcie w niskiej temperaturze utwardziło bloki parafiny, zmniejszyło rozdzieranie i drapanie oraz znacznie poprawiło integralność tkanek. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do bogatych w szczawian wapnia tkanek storczyków Phalaenopsis, a także tkanek opornych, takich jak narządy rozrodcze i liście ryżu, kukurydzy i pszenicy. Ponadto wysoka jakość skrawków tkanek z Hybrid-Cut może być wykorzystana w połączeniu z hybrydyzacją in situ (ISH) w celu uzyskania przestrzennych wzorców ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania. Podsumowując, protokół ten jest szczególnie przydatny w przypadku opornych tkanek roślinnych o wysokiej zawartości kryształów lub krzemionki. Dobrej jakości skrawki tkanek umożliwiają badania morfologiczne i inne badania biologiczne.

Wprowadzenie

Metoda cięcia na bazie parafiny jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach anatomicznych. Zachowanie nienaruszonej anatomii tkanek jest ważne dla badań morfologicznych i biologicznych. Technika cięcia zatopionego w parafinie jest korzystna, ponieważ zatapianie w parafinie zachowuje morfologię komórek i tkanek. Ponadto bloki parafiny można wygodnie przechowywać przez długi czas. Jednak cięcie zatopione w parafinie nie jest odpowiednie dla tkanek roślinnych zawierających kryształy wewnątrzkomórkowe. Kryształy w komórkach często rozrywają wstęgi parafinowe i uszkadzają integralność tkanek podczas cięcia.

W przeciwieństwie do sekcji parafiny, kriosekcja jest stosunkowo szybka i skrawki można uzyskać bez fiksacji, seryjnego odwadniania lub zatapiania infiltracji medium 1. Kriosekcje są kompatybilne z wieloma aplikacjami, takimi jak immunohistochemia, hybrydyzacja in-situ i histochemia enzymów. Inną zaletą kriosekcji jest to, że metoda ta nie przechodzi przez potencjalne procesy denaturacji, takie jak wysoka temperatura i zabiegi chemiczne, dzięki czemu cząsteczki komórkowe są dobrze zachowane w skrawkach tkanek 2. Kriosekcja jest ogólnie preferowana w stosunku do sekcji opartej na parafinie w badaniach na tkankach zwierzęcych. Jednak kriosekcja nie jest pierwszym wyborem w roślinach, ponieważ ujemna temperatura czasami powoduje tworzenie się kryształków lodu, które wpływają na jakość integralności sekcji. Chociaż doniesiono, że osmoregulacja, taka jak roztwory sacharozy, glikol polietylenowy (PEG) lub glicerol 3, zmniejsza tworzenie się lodu krystalicznego w warunkach zamarzania, poprawa jest mniej niż optymalna.

Aby dostosować się do różnych środowisk, różne rośliny często mają odmienną strukturę tkanki, a komórki roślinne ewoluowały, tworząc sztywne ściany komórkowe, wytrzymałe włókna i kryształy 4,5. Na przykład nierozpuszczalne kryształy szczawianu wapnia i ciała krzemionkowe są dość powszechne w roślinach 6. Doniesiono, że ciała/kryształy krzemianowe pomagają w utrzymaniu architektury roślin, erekcji oraz zapobiegają chorobom lub szkodnikom u roślin zbożowych 7-9.

Rynek storczyków doniczkowych i storczyków na kwiaty cięte kwitnie i jest to rozwijający się przemysł. Phalaenopsis aphrodite (orchidea) jest jedną z najważniejszych eksportowych roślin ozdobnych na Tajwanie. Podjęto znaczne wysiłki w celu zrozumienia morfologicznych i fizjologicznych zmian procesów kwitnienia storczyków Phalaenopsis. Kwiatowe kłosy storczyków Phalaenopsis są inicjowane z pąków pachowych u podstawy liścia. Po okresie chłodnej temperatury otoczenia (około półtora miesiąca) pąki pachowe powiększają się, przerywają spoczynek i wystają z podstawy liścia, przekształcając się w młode kłosy kwiatowe. Aby zrozumieć fizjologiczne, komórkowe i molekularne procesy inicjacji kolców, konieczne jest opracowanie solidnej techniki anatomicznej do wizualizacji tkanek lub markerów w odpowiednim czasie. Jednak obecność wszechobecnych kryształów w tkankach storczyków, szczególnie w pąkach pachowych, utrudnia prace anatomiczne.

Tutaj staraliśmy się poprawić integralność sekcji opornych tkanek roślinnych, które do tej pory były uważane za technicznie trudne. Tutaj pokazujemy ulepszony protokół o nazwie Hybrid-Cut. Jest to metoda cięcia na bazie parafiny, która jest wykonywana za pomocą kriostatu. Osadzanie parafiny rozwiązuje problem wysokiej zawartości wody w tkance roślinnej. Cięcie w niskiej temperaturze utwardza blok parafinowy, zmniejsza problem rozrywania kryształów i znacznie poprawia integralność tkanki. Protokół ten znacznie poprawia integralność tkanek w przypadku opornych próbek roślin.

Protokół

1. Utrwalanie i osadzanie

  1. Przygotowanie odczynnika
    1. 10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
      1. Dodać 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4 i 2,4 g KH2PO4 w 800 ml podwójnej wody destylowanej (ddH2O) i dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl. Dodać ddH2O do całkowitej objętości 1 l, następnie dodać 1 000 μl pirowęglanu dietylu (DEPC) i energicznie wstrząsnąć. PBS należy przechowywać przez noc w temperaturze pokojowej i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut następnego dnia.
    2. 1x PBS (Biblioteka PBS)
      1. Rozcieńczyć materiał podstawowy 10x PBS w stosunku 1:10 w ddH2O, aby uzyskać końcowe stężenie 0,01 M Na2HPO4, 0,002 M KH2PO4, 0,003 M KCl i 0,13 M NaCl.
    3. Utrwalacz paraformaldehydu (PFA)
      Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny. Przygotuj go pod wyciągiem. Nosić rękawice.
      1. Aby przygotować 250 ml utrwalacza PFA, podgrzać 100 ml 1x PBS do temperatury 70 - 80 °C i dodać 1,750 μl NaOH. Następnie dodaj 10 g paraformaldehydu i dokładnie wymieszaj, aż do rozpuszczenia. Umieścić roztwór na lodzie, a następnie po schłodzeniu dostosować pH do 7,2 za pomocąH2SO4 (260 - 270 μl na 100 ml).
      2. Dostosuj objętość do 250 ml za pomocą 1x PBS, dodaj 625 μl aldehydu glutarowego do końcowego stężenia 0,25%. Dodać 250 μl Triton X-100 i 250 μl Tween 20, aby ułatwić infiltrację utrwalacza.
        UWAGA: Utrwalacz PFA może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez jeden miesiąc bez utraty zdolności utrwalania.
    4. Przygotuj różne stężenia etanolu (30%, 50%, 70%, 85% i 95%) z wodą uzdatnioną DEPC.
  2. Pobieranie próbek roślin
    1. Pąki pachowe
      1. Używaj dojrzałych roślin storczyków Phalaenopsis w fazie czterolistnej. Ostrożnie usuń liście, rozrywając liść za nerwem za pomocą rąk.
      2. Użyj ostrego skalpela, aby ostrożnie usunąć pąki pachowe z podstawy trzeciego lub czwartego liścia na łodydze monopodialnej.
    2. Próbka nasion
      1. Zbierz dojrzałe strąki nasion orchidei po 4 miesiącach od zapylenia. Strąki nasion przeciąć wzdłużnie skalpelem. Delikatnie potrząśnij otwierającą się saszetką nasienną i uwolnij suche nasiona na bibule filtracyjnej.
    3. Protokorm (Protocorm)
      1. Dojrzałe nasiona orchidei wysiewać na 1/2x płytce agarowej Murashige i Skoog i hodować w pomieszczeniu do hodowli tkankowej w 12-godzinnym okresie świetlnym i stałej temperaturze 25 °C. Próbkę zielonego protokormu należy pobrać po 7 tygodniach od wysiania.
    4. Ciała podobne do protokormu (PLB)
      1. Hodować PLB storczyków na regenerujących się płytkach agarowych T2, jak opisano wcześniej 10 i umieścić w tych samych warunkach wzrostu, co w kroku 1.2.3.1. Zbierz 10 PLB na wysokości 5 - 8 mm.
    5. Próbka liści
      1. Pobrać tkankę liści z dojrzałej rośliny storczyka Phalaenopsis zgodnie z opisem w kroku 1.2.1.1.
      2. Za pomocą ostrego skalpela odetnij mały kawałek tkanki liścia (7 mm długości x 5 mm szerokości) z drugiego nowo rozwiniętego liścia.
    6. Próbka korzeniowa
      1. Używając tej samej rośliny opisanej w kroku 1.2.1.1, wypreparuj 1 cm długości tkanki wierzchołka korzenia za pomocą ostrego skalpela.
    7. Młody kolec
      1. Za pomocą ostrego skalpela odetnij młodą tkankę kolca z końcówki łodygi kwiatowej o długości 10 cm.
    8. Pączek kwiatowy
      1. Z łodygi kwiatu orchidei należy wyciąć mały pączek kwiatowy o średnicy 5 mm. Wytnij część tkanki pąka kwiatowego wzdłuż (o grubości 3 mm).
    9. Tkanki liści i kłosków roślin zbożowych
      1. Wytnij tkankę blaszki liściowej o długości 1 cm z pierwszych nowo rozwiniętych liści ryżu, pszenicy i kukurydzy.
      2. Zbierz 10 kłosków z roślin (ryżu, pszenicy i kukurydzy) na dzień przed śmiercią.
  3. Utrwalenie
    1. Próbki roślin należy natychmiast utrwalić, przenosząc je do szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej 15 ml lodowatego utrwalacza PFA.
    2. Zastosuj próżnię (~ 720 mm Hg) do sadzenia próbek w chłodnym pomieszczeniu o temperaturze 4 °C. Utrzymuj próżnię przez 15 - 20 minut (z próbek powinny zostać uwolnione małe pęcherzyki). Powtarzaj ten krok, aż większość tkanek opadnie po uwolnieniu próżni. Trzymaj odkurzacz przez noc i powoli uwalniaj odkurzacz następnego dnia.
  4. Odwodnienie
    UWAGA: Użyj tej samej fiolki od utrwalenia przez etapy infiltracji. Wlać lub użyć pipety, aby odsączyć roztwór z poprzedniego kroku i zastąpić 15 ml nowego roztworu w fiolce. W zależności od tekstury tkanek należy traktować twardsze tkanki, takie jak pąk pachowy orchidei, nasiona, protokorma i PLB oraz kłosek ryżu, pszenicy i kukurydzy przez dłuższy czas; Traktuj bardziej miękkie tkanki, takie jak pąki kwiatowe orchidei, młode kłosy, liście i korzeń oraz liście ryżu, pszenicy i kukurydzy przez krótszy czas.
    1. Po utrwaleniu zanurzyć próbkę w 15 ml 1x PBS na 10 minut na lodzie.
      1. Próbki odwodnić w serii 15 ml etanolu w temperaturze pokojowej w następujący sposób: 30% etanolu przez 30 minut, 50% etanolu przez 30 minut, 70% etanolu przez 1 godzinę, 85% etanolu przez 54 minuty dla tkanek twardych i 30 minut dla tkanek miękkich, 95% etanolu przez 54 minuty dla tkanek twardych i 30 minut dla tkanek miękkich oraz 100% etanolu dwa razy przez 54 minuty dla tkanek twardych i 30 minut dla tkanek miękkich.
        UWAGA: Próbki roślin można przechowywać w 70% etanolu w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  5. Naciek parafinowy
    1. Próbki infiltrować 15 ml mieszaniny etanolu i substytutu ksylenu przez 54 minuty każda dla tkanek twardszych i 30 minut dla tkanek miękkich, w temperaturze pokojowej w następujący sposób: substytut etanol/ksylen (2:1, v/v), podstawienie etanolu/ksylenu (1:1, v/v), podstawienie etanolu/ksylenu (1:2, v/v) i dwukrotne podstawienie czystego ksylenu. Uwaga: Ksylen jest toksyczny. Wykonaj ten krok w dygestorium.
    2. Naciekać próbkę w fiolce za pomocą 15 ml substytutu ksylenu i mieszaniny parafiny w piecu w temperaturze 60 °C, przez noc w przypadku tkanek twardszych i przez 60 minut w przypadku tkanek miękkich w następujący sposób: substytut ksylenu/parafina (2:1, v/v), substytut ksylenu/parafina (1:1, v/v) i substytut ksylenu/parafina (1:2, v/v).
    3. Próbkę naciekać 15 ml czystej parafiny dwa razy dziennie i inkubować w temperaturze 60 °C w piecu.
    4. Powtórz krok 1.5.3 następnego dnia.
  6. Osadzanie tkanek
    1. Włącz moc centrum zatapiania tkanek 1 godzinę wcześniej, aby stopić wosk w zbiorniku parafiny przed zatopieniem tkanek w bloku parafiny.
    2. Rozgrzej metalowe foremki (rozmiar podstawy 3,3 cm długości x 2 cm szerokości) na tacy grzewczej w temperaturze 62 °C i wlej około 13 ml stopionego wosku do podstawy formy.
    3. Przenieść jedną próbkę tkanki z sekcji 1.5.4 do formy za pomocą rozgrzanych kleszczyków i ustawić ją w żądanej pozycji.
    4. Ostrożnie przenieś formę na chłodną płytkę i pozostaw do zastygnięcia wosku.

2. Sekcja tkanek

  1. Metoda cięcia parafiny
    1. Wykonaj bazę woskową, umieszczając kasetę do zatapiania na wierzchu formy (ten sam rozmiar w sekcji 1.6.2), wypełnij stopionym woskiem i wyjmij formę po zestaleniu się wosku.
      UWAGA: Kaseta do zatapiania utworzy woskową podstawę do zakotwiczenia bloku parafiny próbki.
    2. Przytnij blok parafiny do odpowiedniego kształtu i rozmiaru, a następnie umieść kilka kawałków wosku na płaskiej szpatułce. Podgrzej kawałki wosku za pomocą palnika alkoholowego, aż wosk się rozpuści, a następnie umieść stopiony wosk na woskowej podstawie w sekcji 2.1.1, aby przykleić blok. Zacisnąć go w mikrotomie.
    3. Umieść nowe ostrze na mikrotomie i wyreguluj kąt do 5 stopni, aby ułatwić cięcie w mikrotomie.
    4. Próbkę warstwy parafinowej pokroić w cienkie plasterki (10 μm), jak opisano wcześniej 11.
  2. Metoda przekroju Hybrid-Cut
    1. Przyciąć blok parafiny próbki od kroku 1.6.4 do kolumny z trapezową powierzchnią u góry do odpowiedniego rozmiaru za pomocą żyletki.
    2. Dodaj trochę środka o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na środek stolika kriostatu. Przymocuj blok parafinowy do etapu kriostatu, a następnie szybko ustaw blok tkanki w żądanej pozycji.
    3. Przenieść blok/stolik parafinowy do komory kriostatu. Pozostawić OCT do zestalenia się na pasku do szybkiego zamrażania w temperaturze -42 °C przez 10 minut. Nie przesuwaj bloku podczas krzepnięcia OCT (Rysunek 2C).
    4. Poczekaj, aż adapter do kriostatu i temperatura komory ostygną odpowiednio do -20 °C i -16 °C przed podłączeniem bloku/stolika parafinowego do adaptera kriostatu. Przekroje tkanek do grubości 10 μm.
    5. Pobieraj skrawki tkanek za pomocą kleszczy. Zanurzyć sekcje w 800 μl wody uzdatnionej DEPC w szkiełku pokrytym poli-L-lizyną i przenieść szkiełka na płytę grzejną w temperaturze 42 °C.
    6. Pozwól, aby sekcje spłaszczyły się na wodzie uzdatnionej przez DEPC w temperaturze 42 °C. Użyj bibuły filtracyjnej, aby spuścić wodę z krawędzi.
    7. Zamontuj chusteczkę na szkiełku, umieszczając szkiełko na nocy na płycie grzejnej o temperaturze 42 °C.

3. Barwienie tkanek

  1. Deparafinizacja
    1. Zbierz szkiełka z płyty grzejnej i umieść je na stojaku do barwienia. Dodaj 150 ml ksylenu do słoika do barwienia w dygestoriach i zanurz stojak w ksylenach na 5 minut.
  2. Rehydracja
    1. Przygotuj roztwory etanolu o różnych stężeniach (100%, 95%, 70%, 50% i 30%) w wodzie uzdatnionej DEPC i napełnij odpowiednio 150 ml roztworu do różnych słoików do barwienia.
    2. Próbki należy ponownie uwodnić poprzez serię zmniejszających się stężenia etanolu, co każdy etap przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Przenieś szkiełka z stojaka do barwienia z jednego słoika do innego słoika zawierającego etanol o różnych stężeniach: 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu, 50% etanolu i 30% etanolu.
    3. Po ponownym nawodnieniu zanurzyć próbki w ddH2O na 3 minuty.
  3. Barwienie hematoksyną
    1. Próbki tkanek należy barwić, zanurzając szkiełka tkankowe w roztworze hematoksyliny na 1,5 minuty.
    2. Płukać krótko w ddH2O zawierających 1 - 2 krople 12 N kwasu solnego (HCl) przez kilka sekund, a następnie krótko myć w ddH2O.
  4. odwodnienie
    1. Odwadniać próbki poprzez serię rosnących stężeń etanolu przez 3 minuty w temperaturze pokojowej: 30% etanolu, 50% etanolu, 70% etanolu, 95% etanolu i 100% etanolu. Oczyść próbki ksylenem w dygestoriach przez 5 minut.
  5. Montażu
    1. Upuść odpowiednio 600 μl medium montażowego na bazie ksylenu na szkiełko. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na próbce. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza, aby uzyskać obrazy dobrej jakości.
    2. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez noc. Następnego dnia należy obserwować próbkę pod mikroskopem.
      Uwaga: Obrazy zostały wykonane w powiększeniu od 25x do 400x, w zależności od wielkości okazów.

4. Hybrydyzacja in situ

  1. Synteza sondy
    1. Klon Phalaenopsis aphrodite Sekwencja kodująca specyficzny dla genu aktyny przy użyciu starterów 5'-GGCAGAGTATGATGATGATGGTCC-3' i 5'- AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3' (w celu uzyskania amplikonu PCR 242 pz) i CyclinB1; 1 sekwencja kodująca specyficzna dla genu przy użyciu starterów 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3' i 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3' (w celu uzyskania amplikonu PCR 327 bp), jak opisano 12.
    2. Zliguj określone sekwencje kodowania w wektory (np. pGEMT) zgodnie z protokołem producenta.
    3. Generuj sondy wykrywające i antysensowne znakowane digoksygeniną (DIG) za pomocą zestawu do znakowania RNA SP6/T7 DIG zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Hybrydyzacja in situ
    1. Wytnij 2. i 3. wycinki tkanki pąka pachowego (o grubości 10 μm) wygenerowane metodą Hybrid-Cut i zamontuj plastry na powlekanym szkiełku.
    2. Odparafinować skrawki tkanek w ksylenie (patrz ppkt 3.1.1), ponownie uwodnić w zmniejszających się stężeniach etanolu (patrz ppkt 3.2.2) i trawić za pomocą 2 mg/ml proteinazy K w temperaturze 37 °C przez 30 min.
    3. Przeprowadzić hybrydyzację in situ zgodnie z protokołem opisanym wcześniej 11,13 z pewnymi modyfikacjami, tj. z temperaturą hybrydyzacji dla aktyny wynoszącą 59 °C i 60 °C dla cykliny B1;1. Hybrydyzuj szkiełko z sondą RNA znakowaną 40 ng DIG.
    4. Użyj roztworu nitroniebieskiego tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (NBT/BCIP) w celu wykrycia sygnałów hybrydyzacji, jak opisano 11.

Wyniki

Metoda Hybrid-Cut poprawia integralność skrawków tkanek

Zrozumienie anatomii reprodukcyjnej struktury kwiatowej jest istotne dla badania mechanizmów leżących u podstaw inicjacji kwiatów u storczyków. Jednakże akumulacja wewnątrzkomórkowych kryształów szczawianu wapnia u storczyków z rodzaju Phalaenopsis sprawia, że takie badania są trudnym zadaniem. Aby uniknąć problemów związanych z rozdarciami powodowanymi przez kryształy podczas procesu krojenia (Rycina 1), opracowaliśmy system, który nazwaliśmy Hybrid-Cut. Protokół ten łączy tradycyjne zatapianie w parafinie z technikami kriosekcjonowania. W pierwszej kolejności przetestowaliśmy metodę Hybrid-Cut w pąkach pachwinowych storczyka Phalaenopsis, ponieważ charakteryzują się one dużą sztywnością tkanek i wysoką zawartością kryształów. Tkankę pąka pachwinowego utrwalono w 4% PFA (patrz Protokół, krok 1.3). Po seryjnym odwodnieniu etanolem i infiltracji woskiem parafinowym, pąk pachwinowy zatopiono w bloku parafiny. Przed krojeniem blok przycięto do odpowiedniego rozmiaru (Rycina 2A). Następnie niewielką ilość OCT naniesiono na środek stolika kriostatu (Rycina 2B). Blok parafiny przymocowano do stolika za pomocą OCT. Stolik inkubowano w kriostacie przez 10 min, aby umożliwić całkowite zastygnięcie OCT przed krojeniem (Rycina 2C), a następnie wykonano kriosekcjonowanie w komorze o temperaturze -16 °C (Rycina 2D).

Dla porównania, blok parafiny zawierający pąk pachwinowy storczyka Phalaenopsis poddano standardowemu cięciu mikrotomem. Jak pokazano na Rysunku 1A, po cięciu mikrotomem zaobserwowano silne rozdarcia wstęg parafiny. Naruszona została również integralność tkanki i struktura komórkowa (Rysunek 1B). Z kolei metoda Hybrid-Cut pozwoliła na uzyskanie nienaruszonych przekrojów tkanki (Rysunek 3A) z zachowaną integralnością strukturalną (Rysunek 3B).

Zastosowanie metody Hybrid-Cut w odniesieniu do różnych tkanek P. aphrodite

Aby dalej przetestować podatność na metodę Hybrid-Cut, zbadaliśmy różne tkanki storczyków z rodzaju Phalaenopsis. Często trudno jest uzyskać przekroje nasion o dobrej integralności tkankowej ze względu na utwardzone łupiny nasion. Stosując ten protokół, szczegółowe struktury nasion zostały zachowane po sekcjonowaniu (Rysunek 4A). Jak pokazano na Rysunku 4A, można było wyraźnie zidentyfikować ciała białkowe, powszechne produkty magazynowe 14. Metoda Hybrid-Cut zadziałała również pomyślnie i ukazała szczegółowe struktury merystemu wierzchołkowego pędu miesięcznego protokormu (struktury wykiełkowanej z nasiona) (Rysunek 4B) oraz ciał protokormopodobnych (PLB, Rysunek 4C). W przekrojach PLB zaobserwowano kryształy wewnątrzkomórkowe. Storczyki Phalaenopsis mają grube i mięsiste liście i przeprowadzają fotosyntezę typu CAM (metabolizm kwasów cranksulaceowych) 15. Przekrój poprzeczny blaszki liściowej wykazał duże komórki mezofila oraz wiązki przewodzące zawierające ksylem i floem (Rysunek 4D). W ciągu dnia na abaksjalnej powierzchni liścia zaobserwowano niewiele otworów szparkowych (Rysunek 4D). W rzeczywistości rośliny CAM ewoluowały, aby maksymalizować przyswajanie węgla, a jednocześnie minimalizować utratę wody poprzez otwieranie szparek w nocy w warunkach suchych 15,16. Merystem wierzchołkowy korzenia P. aphrodite przedstawiono na Rysunku 4E. Komórki wierzchołka korzenia zdawały się zawierać znaczną liczbę kryształów, które zostały bardzo dobrze zachowane po sekcjonowaniu (Rysunek 4E). Przekroje podłużne młodych kwiatostanów dostarczyły informacji o architekturze młodych primordiów kwiatowych (Rysunek 4F). Ponadto, w przekroju podłużnym młodych pąków kwiatowych, które zakończyły różnicowanie w tym 5 mm pąku, można było wyraźnie zidentyfikować sepale, płatki, labellum i pollinia (Rysunek 4G). Należy zauważyć, że w sepalach młodych pąków kwiatowych nagromadziły się kryształy. Podsumowując, protokół ten działa spójnie w zakresie zachowania integralności tkankowej i pozwala uzyskać nienaruszoną morfologię, umożliwiając badania anatomiczne i potencjalnie cytologiczne.

Metoda Hybrid-Cut zachowuje integralność tkanek w uprawach zbóż

Przetestowaliśmy również metodę Hybrid-Cut na roślinach zbożowych, takich jak ryż, pszenica i kukurydza, które charakteryzują się wysoką zawartością krzemionki 17,18. Jak pokazano na Rysunku 5, integralność tkanek w przekrojach poprzecznych liści ryżu, pszenicy i kukurydzy uległa znacznej poprawie dzięki zastosowaniu metody Hybrid-Cut. W przekrojach liści ryżu wyraźnie zidentyfikowano ksylem, floem, komórki mezofila, szparki oraz komórki buliformne odpowiedzialne za zwijanie się blaszki liściowej w celu uniknięcia utraty wody. Wyraźnie zidentyfikowano również anatomię Kranza, komórki mezofila oraz wiązki przewodniczące liścia kukurydzy 19,20. Co interesujące, stwierdzono wysoką gęstość szparek zarówno po stronie adaksjalnej, jak i abaksjalnej liści kukurydzy (Rysunek 5). Stosunek szparek adaksjalnych do abaksjalnych wynoszący 0,7 u kukurydzy był raportowany wcześniej 21. Ponadto protokół ten z sukcesem pozwolił na uzyskanie szczegółowej morfologii komórkowej kłosków ryżu, pszenicy i kukurydzy (Rysunek 6). Kłoski są znane z wysokiej zawartości krzemionki 9, co zazwyczaj utrudnia wykonywanie przekrojów tkanek.

In Situ Hybrydyzacja

Podejścia genomiczne i transkryptomiczne są powszechnie stosowane do adnotacji funkcji genów. Wykazanie przestrzennego rozkładu transkryptów interesujących genów w kontekstach rozwojowych lub środowiskowych jest istotne dla uzyskania nowej wiedzy na temat możliwych funkcji tych genów. In situ hybrydyzacja in situ (ISH) została opracowana w celu lokalizacji wzorców ekspresji genów na poziomie tkankowym 11,22-25Dodatkowo metoda ISH może zapewnić rozdzielczość komórkową, a w niektórych przypadkach podkomórkową, w obrazowaniu rozmieszczenia mRNA w organizmach wielokomórkowych. 26Podczas ISH kluczowe jest zachowanie integralności RNA i tkanki w celu uzyskania wiarygodnych informacji przestrzennych na temat wybranego transkryptu. Przetestowaliśmy ISH z wykorzystaniem protokołu Hybrid-Cut. Aktyna Gen (PATC157348) został sklonowany przy użyciu starterów 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3' oraz 5'- AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3', aby uzyskać amplikony PCR o długości 242 bp. Cyklina B1:1 (PATC146999) specyficzna dla genu sekwencja kodująca z wykorzystaniem starterów 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3' oraz 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3', aby uzyskać 327 bp amplikonu PCR. Po ISH, Aktyna i Kiclina B1:1 ekspresja genów monitorowano w młodych i dojrzałych pąkach pachwinowych (Rycina 7). Oba geny były ekspresowane w komórkach merystematycznych z 2nd i 3B&R pąki pachyneuralne, przy czym silniejsze sygnały wykryto w 3rd pąki pachymentalne. Wyniki te wykazały, że metoda Hybrid-Cut pozwala na zachowanie prawidłowej anatomii i umożliwia uzyskanie przestrzennego wzorca ekspresji genów.

Proces mikrotomii; instrument do cięcia tkanek i porównanie struktury tkanki histologicznej.
Rysunek 1: Tradycyjne cięcie w parafinie powoduje silne rozdarcia tkanki. Blok parafinowy zawierający pączek pachy storczyka Phalaenopsis poddano rutynowemu cięciu mikrotomem. Po tradycyjnym cięciu mikrotomem zaobserwowano silne rozdarcia wstęg parafinowych (A). Naruszona została również integralność tkanki i struktura komórkowa (B). Strzałki wskazują silne rozdarcia przekroju tkanki. Grot strzałki wskazuje ciała krystaliczne. Pasek skali 100 µm. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Przygotowanie i analiza próbki kompozytu polimerowego; obejmuje nakładanie kleju, montaż i konfigurację optyczną.
Rysunek 2: Hybrydowa metoda sekcjonowania. Tkankę pąka pachy został utrwalono w PFA, a następnie odwodniono, zinfiltrowano woskiem parafinowym i zatopiono w bloku parafiny. Blok parafiny przycięto do odpowiedniego rozmiaru (A). Do środka stolika kriostatu nałożono związek OCT (Optimal Cutting Temperature) (B). Blok parafiny przymocowano do OCT na stoliku kriostatu. W niskiej temperaturze blok parafiny przylgnął do stolika kriostatu za pomocą OCT (C). Plasterki tkanki wycinano w komorze kriostatu w temperaturze -16 °C (D). Paski skali oznaczają 0,5 cm (A) oraz 1 cm (B-D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Przecięcie mikrotomem (A) i schemat tkanki roślinnej (B); przygotowanie próbki, analiza mikroskopowa.
Rysunek 3: Metoda Hybrid-Cut poprawia integralność przekrojów. Blok parafinowy zawierający pąk pachylowy storczyka Phalaenopsis został poddany cięciu metodą Hybrid-Cut (A), a metoda Hybrid-Cut pozwoliła uzyskać przekroje o doskonałej integralności tkanki (B). Grot strzałki wskazuje endogenne kryształy wbudowane w tkankę pąka pachylowego. Pasek skali 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przekroje tkanek roślinnych w mikroskopii, schemat przekroju poprzecznego z wyróżnionymi wiązkami przewodzącymi i mezofilem.
Rycina 4: Zastosowanie metody Hybrid-Cut w różnych przekrojach tkanek storczyka Phalaenopsis . Różne tkanki storczyka zostały przekrojone metodą Hybrid-Cut, m.in. przekrój podłużny nasiona storczyka w stadium dojrzałym (A), przekrój podłużny protokormu (B), przekrój podłużny ciałek podobnych do protokormów (PLB) (C), przekrój poprzeczny blaszki liściowej (D), przekrój podłużny korzenia (E), przekrój podłużny młodego kwiatostanu (F) oraz przekrój podłużny młodych pąków kwiatowych (G). Przekroje tkanek zabarwiono hematoksyliną. SC, łupina nasienna; PB, ciało białkowe; M, merystem; MP, macierzyste PLB; DP, potomne PLB; Ad, adaksjalna powierzchnia liścia; Ab, abaksjalna powierzchnia liścia; St, aparaty szparkowe; MC, komórka mezofila; VB, wiązka przewodząca; RC, kofia korzenia; fb, pąk kwiatowy; Se, sepal; Pe, płatek; La, labellum; Po, pollinia; Ro, rostellum; Ca, kalus. Groty strzałek wskazują kryształy. Paski skali oznaczają 20 µm (A-E) i 200 µm (F-G). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy przekrojów poprzecznych wykazujące komórki miękiszu w ryżu, pszenicy i kukurydzy przy zastosowaniu metody parafiny oraz metody Hybrid-Cut.
Rycina 5: Metoda Hybrid-Cut zachowuje integralność tkanki liścia w kilku uprawach zbóż. Porównanie tkanki liściowej z wykorzystaniem tradycyjnej metody parafiny (panel lewy) oraz techniki Hybrid-Cut opracowanej w niniejszym badaniu (panel prawy). Obrazy przedstawiają przekroje poprzeczne liści ryżu, pszenicy i kukurydzy. MC, komórka mezofilu; Ph, floem; St, aparaty szparkowe; BC, komórka buliformna. Strzałki wskazują rozdarcia warstw tkanki. Grotami strzałek zaznaczono ciała krzemionkowe. Niebieskie przerywane okręgi wskazują anatomię Kranza w C4 kukurydzy. Paski skali 20 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie histologiczne tkanek ryżu, pszenicy i kukurydzy w przekrojach parafinowych i hybrydowych; analiza mikroskopowa.
Rysunek 6: Metoda Hybrid-Cut zachowuje integralność tkanki kłosków w kilku uprawach zbożowych. Porównanie integralności tkanki przekrojów kłosków pomiędzy tradycyjną metodą parafinową a metodą Hybrid-Cut. Strzałki wskazują rozdarcia plasterka tkanki. Groty strzałek wskazują ciała krzemionkowe. Paski skali 20 µm (ryż) oraz 200 µm (pszenica i kukurydza). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przekroje tkanek pąka pachynego wykazujące ekspresję genów aktyny i cykliny B1;1, analiza mikroskopowa.
Rysunek 7: In situ Hybrydyzacja Aktyna i CyclinB1;1 Wzorce ekspresji w pąku pachyralnym Phalaenopsis storczyk Przekroje tkankowe 2nd pąki pachwinowe i 3B&R pąki pachylowe przygotowano metodą Hybrid-Cut. Łącznie 40 ng Aktyna i CyclinB1;1 do hybrydyzacji wykorzystano sondy znakowane digoryksyną (dig). Sonda sensywna posłużyła jako kontrola negatywna. Strzałki wskazują merystem rozrodczy pąka pachwinowego. Paski skali 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

Dyskusja

Komórki roślinne mają sztywne ściany komórkowe, twarde włókna, kryształy i wysoką zawartość wody, które powodują problemy z rozdzieraniem tkanek podczas cięcia tkanek roślinnych. Mimo że cięcie na bazie parafiny jest często stosowane w przypadku tkanek roślinnych, endogenne kryształy często ranią tkankę roślinną podczas cięcia (ryc. 1). Ze względu na z natury wysoką zawartość wody w komórkach roślinnych, sekcje oparte na kriostacie często powodują pękanie komórek i pękanie tkanek.

W niniejszym badaniu opracowano połączony protokół zatapiania parafiny i kriosekcji o nazwie Hybrid-Cut i uzyskano dobrej jakości skrawki tkanek. Protokół ten rozwiązuje problem związany z wysoką zawartością wody poprzez wprowadzenie zatapiania parafiny i zmniejsza efekt rozdzierania poprzez utwardzanie wosku parafinowego w niskiej temperaturze podczas cięcia (ryc. 3). Dlatego ten zmodyfikowany protokół jest korzystny w porównaniu z sekcją na bazie parafiny lub kriosekcją w celu zachowania integralności tkanek roślinnych.

Manuskrypt ten pokazuje, że metoda Hybrid-Cut zachowuje integralność tkanek w wielu tkankach storczyków Phalaenopsis , takich jak pąki pachowe, nasiona i PLB itp., które zawierają wysoki poziom kryształów (ryc. 3-4). Co więcej, protokół ten jest podatny na uprawy zbóż, takie jak narządy rozrodcze i liście ryżu, kukurydzy i pszenicy, które zawierają wysoką zawartość krzemionki (ryc. 5-6). Przypuszczalnie protokół ten może być stosowany do roślin drzewiastych zawierających dużo błonnika.

Ogólnie rzecz biorąc, dokładne utrwalenie tkanki jest bardzo ważne w przypadku Hybrid-Cut. Odkryliśmy, że utrwalacz kwasu formaldehydowo-alkoholowo-kwaśnego (FAA) jest lepszy niż PFA, aby zachować integralność tkanek niektórych opornych tkanek, takich jak osiowo pąki, korzenie itp. Jednak PFA działa lepiej niż FAA w zachowaniu integralności RNA. Dlatego zaleca się utrwalenie próbki PFA do hybrydyzacji in situ (ISH). Opisany tutaj protokół jest przeznaczony do eksperymentu RNA ISH. Dlatego wszystkie odczynniki zostały przygotowane tak, aby uniknąć degradacji RNA poprzez eliminację zanieczyszczenia RNazą przez obróbkę DEPC. Jeśli sekcja Hybrid-Cut jest przeznaczona do badań anatomicznych, dopuszczalna jest zwykła woda z odwróconej osmozy (RO) i jej pochodny bufor lub odczynniki.

Zmniejszenie rozmiaru i grubości próbki do mniej niż 3 mm jest pomocne w infiltracji. Co więcej, w przypadku tkanek o twardej teksturze konieczne jest wydłużenie czasu zanurzenia w celu odwodnienia i infiltracji. Ograniczenie tego protokołu może wynikać z problemów spowodowanych nieodpowiednim utrwaleniem, odwodnieniem i infiltracją próbki. Dlatego dostosowanie czasu przetwarzania dla każdego etapu ma kluczowe znaczenie dla wyprodukowania dobrej jakości bloku parafinowego. Zwykle twardsza tkanka wymaga dłuższego czasu przetwarzania niż tkanka miękka.

Ponadto wykazaliśmy, że Hybrid-Cut działał z powodzeniem w połączeniu z ISH, aby zapewnić przestrzenną dystrybucję wybranych transkryptów (Rysunek 7). Podsumowując, protokół ten jest przydatny do badania anatomii roślin i zapewnia specyficzną tkankowo mapę RNA wybranych genów. Ponadto może być stosowany w innych badaniach molekularnych, takich jak końcowy test znakowania końca nicka deoksynukleotydylotransferazy dUTP (TUNEL), fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i techniki barwienia immunologicznego. Podsumowując, ten ulepszony protokół sekcji tkanek jest zarówno użyteczny, jak i pomocny dla badaczy zajmujących się społecznościami roślinnymi.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie techniczne od Pani Hong Xian Hsing, Pana Min Jeng Li i Pana Erica C. P. Wu. Wyrażamy nasze uznanie dla Mirandy Loney za redakcję w języku angielskim.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Centrum osadzania model EC780-1CSA
Microtome model RM2255Leica
Cryostat model CM 1950Leica
Axio Scope A1 Zeiss
Murashige & Pożywka Skoog zawierająca witaminyDuchefa BiochemiaM0222.0050
Odkażacz powierzchniowy bez RNazApex10-228
Pirowęglan dietylu (DEPC)Bio Basic Inc. 
Chlorek sodu (NaCl)MDBio, Inc.101-7647-14-5
Chlorek potasu, kryształ (KCl)J.T. Baker7447-40-7
Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Sigma-Aldrich7558-79-4
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma-Aldrich7778-77-0
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich16005
Wodorotlenek sodu (NaOH)Showa19430160
Kwas siarkowy (H2SO4)Sigma-Aldrich7664-93-9
Roztwór aldehydu glutarowegoSigma-Aldrich111-30-8
Monolaurynian polioksyetylenu 20 sorbitolu (Tween 20)J.T. Baker9005-64-5
Etoksylowany oktylofenol (Triton X100)J.T. Baker9002-93-1
Szklane fiolki scyntylacyjneNewastarDG60805-00020
Eksykator próżniowyViolet Bioscience Inc.TS-402030
Pompa łopatkowa RZ2.5Vacuubrand36149406
EtanolJ.T. Baker64-17-5
Sub-X Leica Surgipath3803670Substytut ksylenu
Paraplast Plus Leica Surgipath39602004Parafina do zatapiania w tkankach
SUPERFROST mikroszkiełko szkiełkoweMatsunamiS7441
FSC 22 Clear Leica Surgipath3801480Mieszanka do optymalnej temperatury cięcia (OCT) 
Ksyleny, oczyszczoneLeica Surgipath3803665
HematoxylinMerckHX305311
Kwas solny (HCl)Sigma-Aldrich7647-01-0
MicromountLeica Surgipath3801731Medium montażowe
pGEM T-easy wektor PromegaA1360
Proteinaza KRoche
Zestaw do znakowania RNA SP6/T7 DIG Roche11175025910
roztwór podstawowy NBT/BCIPRoche11681451001
Mikroskop D8011543115879001

Bibliografia

  1. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harb Protoc. 3, 1-2 (2008).
  2. Knox, R. B. Freeze-sectioning of plant tissues. Stain Technol. 45, 265-272 (1970).
  3. Ruan, J. L., et al. An improved cryosection method for polyethylene glycol hydrogels used in tissue engineering. Tissue Eng.: Part C Methods. 19, 794-801 (2013).
  4. Prychid, C. J., Rudall, P. J. Calcium oxalate crystals in monocotyledons: A review of their structure and systematics. Ann Bot. 84, 725-739 (1999).
  5. Prychid, C. J., Rudall, P. J., Gregory, M. Systematics and biology of silica bodies in monocotyledons. Bot. Rev. 69 (4), 377-440 (2004).
  6. Arnott, H. J., Pautard, F. G. E., Steinfink, H. Structure of calcium oxalate monohydrate. Nature. 208, 1197-1198 (1965).
  7. Mitani, N., Yamaji, N., Ma, J. F. Identification of maize silicon influx transporters. Plant Cell Physiol. 50, 5-12 (2009).
  8. Hayasaka, T., Fujii, H., Ishiguro, K. The role of silicon in preventing appressorial penetration by the rice blast fungus. Phytopathology. 98, 1038-1044 (2008).
  9. Ma, J. F., Yamaji, N. Silicon uptake and accumulation in higher plants. Trends Plant Sci. 11, 392-397 (2006).
  10. Chen, W., Tang, C., YL, K. Ploidy doubling by in vitro culture of excised protocorms or protocorm-like bodies in Phalaenopsis species. Plant Cell Tiss Org. 98, 229-239 (2009).
  11. Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants. J. Vis. Exp. (57), e3328(2011).
  12. Park, D. J. E. PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. 687, (2011).
  13. Lin, H. Y., et al. Genome-wide annotation, expression profiling, and protein interaction studies of the core cell-cycle genes in Phalaenopsis aphrodite. Plant Mol Biol. 84, 203-226 (2014).
  14. Lee, Y. -I., Yeung, E. C., Lee, N., Chung, M. -C. Embryology of Phalaenopsis amabilis var. formosa: embryo development. Bot Stud. 49, 139-146 (2008).
  15. Endo, M., Ikusima, I. Diurnal rhythm and characteristics of photosynthesis and respiration in the leaf and root of a Phalaenopsis plant. Plant Cell Physiol. 30, 43-47 (1989).
  16. Guo, W. J., Lee, N. Effect of leaf and plant age, and day/night temperature on net CO2 uptake in Phalaenopsis amabilis var. formosa. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 131, 320-326 (2006).
  17. Lewin, J., Reimann, B. Silicon and plant growth. Ann. Rev. of Plant Physiol. 20, 289-304 (1969).
  18. Kaufman, P. B., et al. Silica in shoots of higher plants. Silicon and siliceous structures in biological systems. Simpson, T. L., Valcani, B. E. , Springer-Verlag. 409-449 (1981).
  19. Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution. J Exp Bot. 65, 3357-3369 (2014).
  20. Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3979-3984 (2013).
  21. Driscoll, S. P., Prins, A., Olmos, E., Kunert, K. J., Foyer, C. H. Specification of adaxial and abaxial stomata, epidermal structure and photosynthesis to CO2 enrichment in maize leaves. J Exp Bot. 57, 381-390 (2006).
  22. Karlgren, A., Carlsson, J., Gyllenstrand, N., Lagercrantz, U., Sundström, J. F. Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species. J. Vis. Exp. (26), (2009).
  23. Hejatko, J., et al. In situ hybridization technique for mRNA detection in whole mount Arabidopsis samples. Nat Protoc. 1, 1939-1946 (2006).
  24. Javelle, M., Timmermans, M. C. In situ localization of small RNAs in plants by using LNA probes. Nat Protoc. 7, 533-541 (2012).
  25. Drea, S., et al. In situ analysis of gene expression in plants. Methods Mol Biol. 513, 229-242 (2009).
  26. Drea, S., et al. A streamlined method for systematic, high resolution in situ analysis of mRNA distribution in plants. Plant Methods. 1, 8(2005).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Metoda Hybrid-Cutkrojenie w parafiniekrojenie w kriotomieintegralność tkankihybrydyzacja in situzatapianie tkankiodwodnienie tkankiinfiltracja tkankimontowanie tkanki
Hybrid-Cut: ulepszona metoda cięcia opornych próbek tkanek roślinnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.