Test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej

Przez ostatnie dziesięciolecia, ogólna interpretacja funkcji neurogleju ewoluowała od przypisywania jedynie pomocniczej do aktywnej roli regulacyjnej dotyczącej funkcji neuronalnej¹. Ze względu na ich znaczący wpływ na homeostazę mózgu w zdrowiu i chorobie², astrocyty są szczególnie interesujące dla społeczności naukowej. W ciągu ostatnich kilku lat wiele badań koncentrowało się na interakcjach neuron-glej in vivo i in vitro³. Jednak większość systemów hodowli nie pozwala na oddzielną analizę obu typów komórek i ich odpowiednich sekretomów.

Kilka podejść wykorzystuje bezpośrednią kokultywację neuronów i gleju w celu osiągnięcia długotrwałego przetrwania i fizjologicznie istotnego rozwoju sieci neuronalnej^4-6. Obecny protokół osiąga te same cele, przy jednoczesnym utrzymaniu obu typów komórek fizycznie oddzielonych⁷. W porównaniu z kondycjonowaną pożywką^8,9, nasz system pozwala na badanie dwukierunkowej komunikacji między neuronami a astrocytami. Ekspresja wydzielanych cząsteczek sygnałowych może być monitorowana, gdy komórki dojrzewają we wspólnym pożywce. Ta możliwość jest szczególnie istotna, ponieważ astrocyty uwalniają rozpuszczalne czynniki, takie jak cytokiny, czynniki wzrostu i cząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej^10,11, regulując w ten sposób wzrost i funkcję neuronów^7,12. W ten sposób wykazano, że dodanie trombospondyny do komórek zwojowych siatkówki in vitro indukuje tworzenie synaps¹³. Jednak inne, jeszcze nieznane czynniki są niezbędne, aby synapsy działały¹³. Co więcej, cząsteczki uwalniane przez astrocyty muszą zostać zidentyfikowane, aby zrozumieć podstawy interakcji neuron-glej.

Hodowla pierwotnych neuronów i astrocytów myszy i szczura została opisana wcześniej^14-16. Przedstawiamy tutaj eleganckie i wszechstronne narzędzie do łączenia obu typów komórek w ramach pośredniego podejścia do kokultury. Ponieważ te dwie kultury są fizycznie oddzielone, a jednocześnie korzystają z tego samego podłoża, wpływ neuronów, astrocytów i rozpuszczalnych cząsteczek może być analizowany oddzielnie, tworząc w ten sposób potężne narzędzie do badań interakcji neuron-glej.

Eksperymenty na myszach były zgodne z niemieckim prawem i wytycznymi niemieckiego Towarzystwa Neurologicznego dotyczącymi hodowli zwierząt. Komisje ds. opieki nad zwierzętami i ich utylizacji Uniwersytetu Ruhry w Bochum udzieliły odpowiednich zezwoleń.

1. Przygotowanie i hodowla astrocytów korowych

Uwaga: Wykonaj te kroki protokołu co najmniej 7 dni przed przejściem do następnych kroków, ponieważ kultury astrocytów powinny przekształcić się w zlewające się monowarstwy zanim neurony zostaną przygotowane. Astrocyty pierwotne pochodzą z mieszanych kultur glejowych uzyskanych od młodych myszy około dnia pourodzeniowego (P) 0-3. Na każdą kolbę T75 należy użyć trzech mózgów (6 kory) do zainstalowania zębów.

1. Przygotuj pożywkę astrocytów, uzupełniając zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) firmy Dulbecco 10% v/v surowicy końskiej i 0,1% v/v gentamycyny w sterylnych warunkach. Przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
2. Pokryć 3 kolby T75 10 μg/ml poli-D-lizyny (PDL; w wodzie przeznaczonej do hodowli komórkowych) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C w obecności 6% v/v CO₂ . Po pokryciu należy dwukrotnie przemyć kolby solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia niezwiązanych kationów i dodać 9 ml pożywki astrocytowej.
3. Aby przygotować mózgi, dodaj 10 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do 1x 10 cm szalki Petriego i 1 ml HBSS do 1x 15 ml probówki (niezależnie od liczby mózgów, które zostaną użyte). Trzymaj nożyczki chirurgiczne, 2 cienkie kleszcze i lornetkę w zasięgu ręki podczas zabiegu.
4. Szybko odetnij 3 szczenięta nożyczkami chirurgicznymi i zbierz głowy do pustego 10-centymetrowego naczynia.
   1. Wykonaj przygotowanie kory mózgowej pod lornetką. Za pomocą dwóch cienkich kleszczy usuń skórę grzbietową z czaszki w linii środkowej, zaczynając od szyi w górę w kierunku poziomu oczu. Następnie mózg z naczyniami krwionośnymi jest widoczny pod czaszką.
   2. Przymocuj głowę na końcu rostralnym za pomocą kleszczy i naciąć linię środkową czaszki, zaczynając od tylnego końca. Następnie odetnij prawą i lewą połowę czaszki, aby odsłonić mózg.
   3. Zamknij końcówkę kleszczy i umieść ją brzusznie pod mózgiem. Wyjmij mózg z czaszki i przenieś go na wypełnioną HBSS 10-centymetrową szalkę Petriego. Postępuj w ten sam sposób z pozostałą próbką, aż wszystkie mózgi zostaną zebrane w naczyniu.
5. Po zebraniu mózgów zacznij od oddzielenia kory mózgowia, ściskając tyłomózgowie za pomocą kleszczy, takich jak nożyczki. Wykonaj nacięcie w linii środkowej między dwiema półkulami za pomocą jednej pary kleszczy. Ostrożnie przymocuj mózg kleszczami i odetnij śródmózgowie i opuszki węchowe za pomocą drugiego kleszcza, aby uzyskać połówki kory mózgowej.
6. Przymocuj jedną połowę kory mózgowej za pomocą jednej pary kleszczy i oderwij opony mózgowe od półkul, odrywając je od bocznej krawędzi, a następnie wyciągając je z powierzchni kory za pomocą drugich kleszczy.
7. Odwróć połowę kory mózgowej z powierzchnią skierowaną w dół w kierunku naczynia; ostrożnie wypreparuj i usuń hipokamp w kształcie półksiężyca za pomocą jednej pary kleszczy. Przenieś pojedyncze kory do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą jednego zamkniętego kleszcza do przenoszenia pojedynczej kory.
8. Po zebraniu całej kory należy przejść do sterylnego okapu z przepływem laminarnym i rozpocząć przygotowania do dysocjacji tkanki korowej.
9. Dodaj 1 ml DMEM do probówki reakcyjnej o pojemności 2 ml i dodaj 0,1% w/v papainy (30 jednostek). Inkubować zawiesinę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C aż do uzyskania oczyszczonego roztworu (około 3 min). Dodać 0,24 mg/ml L-cysteiny i 20 μg/ml DNAzy i delikatnie wstrząsnąć.
   UWAGA: Do trawienia potrzeba około 1 ml roztworu enzymatycznego.
10. Przefiltrować (wielkość porów 0,22 μm), aby uzyskać 1 ml sterylnego roztworu przed dodaniem go do tkanki korowej. Inkubować probówki przez 30 minut - 1 godzinę w temperaturze 37 °C (tj. w łaźni wodnej_).
    UWAGA: Kroki 1.11 - 1.14 są krytyczne i powinny zostać wykonane w ciągu 15 minut.
11. Aby zakończyć reakcję trawienia, dodaj 1 ml pożywki astrocytów i ostrożnie rozdrobnij strawioną tkankę za pomocą pipety o pojemności 1 ml. W celu roztarcia delikatnie przesunąć tłok pipety, zasysając w ten sposób i wytłaczając zawiesinę tkanki korowej.
12. Po dysocjacji tkanki do zawiesiny jednokomórkowej dodać 5 ml pożywki astrocytowej i wirować przez 5 minut przy 216 x g.
13. Ostrożnie odessać supernatant z powstałego osadu i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki astrocytowej.
14. Dodać zawiesiny komórkowe do kolb T75 uzupełnionych 9 ml pożywki astrocytów (patrz 1.2).
15. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze w obecności 6% v/v CO₂ . Po 4 dniach należy przeprowadzić pierwszą pełną wymianę podłoża (10 ml). Następnie zmieniaj pożywkę co 2 - 3 dni.
16. Po 7 dniach sprawdź, czy komórki utworzyły zlewającą się monowarstwę. Jeśli nie, poczekaj kolejne 2 - 3 dni, aż zostanie osiągnięte całkowite zlanie się kultury.
    UWAGA: Astrocyty mają duże, spłaszczone ciała komórkowe, lokalizują się na dnie kolby i nie rozwijają zauważalnych procesów komórkowych. Różnią się one od małych jasnych komórek progenitorowych z kontrastem fazowym i mikrogleju znajdującego się na wierzchu monowarstwy¹⁷.
17. W celu pozbycia się komórek progenitorowych i uzyskania czystej kultury astrocytów, należy umieścić kolby T75 na wytrząsarce orbitalnej i wstrząsnąć kulturami O/N z prędkością 250 obr./min. Upewnić się, że temperatura jest ustawiona na 37 °C i że filtr kolby jest uszczelniony folią laboratoryjną w celu zapobieżenia parowaniu CO_{2 .}
18. Następnego dnia odessać pożywkę i dodać 10 ml świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 20 μM cytozyno-1-β-D-arabinofuranozydu (AraC) w celu wyeliminowania resztek dzielących się komórek.
    UWAGA: inkubacja z AraC przez 2 - 3 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 6% CO₂ da w wyniku czystą hodowlę astrocytów.
19. Monitoruj czystość kultur astrocytów poprzez oględziny pod mikroskopem świetlnym. Jeśli resztkowe jasne komórki progenitorowe z kontrastem fazowym i mikroglej nadal znajdują się na wierzchu monowarstwy^{astrocytarnej 17} (patrz krok 1.16), powtórz kroki 1.18 i 1.19.
    UWAGA: Zlewające się i czyste monowarstwy astrocytów można utrzymywać do 14 dni w inkubatorze (37 °C, 6% v/v CO₂) przed przejściem do następnego kroku. Zmieniaj połowę podłoża co 3 dni. Nie zbieraj, nie zamrażaj i nie rozmrażaj astrocytów, ponieważ komórki te stracą swoje właściwości neuronalne w wyniku procedury przechowywania.

2. Przygotowanie astrocytów do kokultury pośredniej

Uwaga: 48 - 72 godziny przed przygotowaniem neuronów, przenieś astrocyty do wkładek do hodowli komórkowych. Ogólnie rzecz biorąc, pojedyncza kolba T75 dostarcza wystarczającą liczbę komórek, aby podtrzymać kultury neuronalne uzyskane za pomocą jednego preparatu.

1. Umieść tyle wkładek, ile potrzeba, w płytkach 24-dołkowych. Pokryj każdą wkładkę 10 μg/ml PDL (rozpuszczonym w wodzie do hodowli komórkowych) przez około 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO₂ . Po inkubacji należy dwukrotnie przemyć wkładki PBS. W międzyczasie przystąp do przygotowania astrocytów.
   UWAGA: Wkładki wypełnione PBS można przechowywać do momentu, gdy zawiesina komórek astrocytów będzie gotowa do użycia.
2. Odessać pożywkę astrocytów (za pomocą AraC) i przemyć kulturę jednorazowo 10 ml PBS, aby upewnić się, że wszelkie pozostałości surowicy zostały usunięte.
3. Dodać 3 ml 0,05% trypsyny-EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego) do kolb i inkubować komórki do trypsynizacji w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO₂ przez około 10 minut.
4. Kontroluj odrywanie komórek poprzez oględziny za pomocą mikroskopu i ułatwiaj odłączanie komórek, stukając bokiem kolb o pulpit.
   UWAGA: Kroki 2.5 - 2.8 są krytyczne i powinny zostać zakończone w ciągu 15 - 20 minut.
5. Po trypsynizacji delikatnie ponownie zawiesić komórki w pożywce astrocytowej o pojemności 7 ml i przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez 5 minut przy 216 x g.
6. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki dla astrocytów.
7. Policz komórki za pomocą komory liczącej.
8. Wypełnij dno studzienek 24-dołkowej płytki 500 μl pożywki astrocytowej i przenieś 25 000 komórek z 500 μl pożywki astrocytowej do każdej pojedynczej wkładki. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO₂,
   UWAGA: Po 42 - 72 godzinach kultury osiągną około 100% zbieżności. Na tym etapie czystość kultury można zweryfikować za pomocą immunocytochemii¹¹. Zlewające się kultury można utrzymywać do 7 dni, aż do przejścia do następnego kroku. Zmieniaj połowę podłoża co 3 dni.

3. Przygotowanie pierwotnych neuronów hipokampa

Uwaga: Pierwotne neurony hipokampa myszy powinny pochodzić z zarodków E15.5 - E16 ciężarnych myszy.

1. Przygotować pożywkę neuronową (MEM z 10 mM pirogronianu sodu, 0,1% w/v albuminy jaja kurzego, 2% v/v suplementu B27 i 0,1% v/v gentamycyny (sterylnie przefiltrowana)) i pożywkę przygotowawczą (HBSS z 0,6% w/v glukozy i 10mM HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazyno-etanosulfonowy)). Wstępnie ogrzać i wstępnie zrównoważyć pożywkę neuronową w kolbach filtracyjnych w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO₂ .
2. Umieścić szklane szkiełka nakrywkowe (o średnicy 12 mm) w dołkach na płytkach 24-dołkowych (użyć specjalnych szkiełek nakrywkowych, które są nacięte do stosowania z wkładkami do hodowli komórkowych).
   1. Pokryć przez co najmniej 1 godzinę 15 μg/ml poli-DL-ornityny w wodzie (klasy hodowli komórkowej) w temperaturze 37 °C. Użyć co najmniej 500 μl na studzienkę, aby upewnić się, że szkiełka nakrywkowe są całkowicie pokryte. Umyj studzienki dwukrotnie PBS. Pozostaw PBS w studzienkach do czasu posiewu komórek. Upewnij się, że studzienki nie wyschną.
3. Aby wypreparować hipokampy, przygotuj 3 naczynia o średnicy 10 cm wypełnione pożywką i 1 x probówkę o pojemności 2 ml z 1 ml pożywki do przygotowywania pokarmu. Przygotuj nożyczki i 2 cienkie kleszcze.
4. Poświęć ciężarną mysz przez zwichnięcie szyjki macicy, wysterylizuj brzuch, myjąc go 70% v/v etanolem i otwórz brzuch ostrymi nożyczkami. Ostrożnie wyciąć paciorkę nożyczkami i przenieść narząd do naczynia o wymiarach 1x 10 cm wypełnionego podłożem do przygotowywania.
5. Następnie usuń zarodki z macicy. Ostrożnie naciąć macicę i usunąć owodnię bez uszkadzania zarodków za pomocą 2 kleszczy. Następnie odetnij głowę każdemu zarodkowi nożyczkami i przenieś główki do drugiego 10-centymetrowego naczynia wyposażonego w pożywkę do przygotowania.
6. Przystąpić do przygotowania głów (podobnie jak w przypadku preparatu opisanego w 1.4 - 1.7).
   1. Unieruchomić głowę kleszczami i naciąć czaszkę i skórę w okolicy szyi w pobliżu tyłomózgowia, prostopadle do neuraksji. Użyj drugiej pary kleszczy, aby podnieść zarówno czaszkę, jak i zakrywającą skórę, a następnie zegnij miękką nasadkę czaszki w kierunku rostralnego końca głowy, odsłaniając w ten sposób mózg.
   2. Za pomocą 2 kleszczy odłącz mózg od jamy czaszki. Aby to zrobić, zamknij 1 parę kleszczy i oddziel mózg od czaszki, zaczynając od opuszki węchowej i przesuwając się w kierunku tyłomózgowia. Zbierz mózgi do innego 10-centymetrowego naczynia wypełnionego podłożem do przygotowywania.
7. Wypreparuj hipokampy z ugrupowań kory mózgowej, jak opisano powyżej, aby przygotować astrocyty (krok 1.6). Usuń hipokampy z każdej półkuli i zbierz je do probówki o pojemności 2 ml wypełnionej pożywką.
8. Po zakończeniu sekcji należy przenieść probówkę do sterylnej ławy laminarnej i wytrawić tkankę hipokampa za pomocą 1 ml roztworu trawiącego zawierającego papainę. Przygotuj roztwór wytrawiający zgodnie z opisem w krokach 1.9 - 1.10, ale zamiast tego użyj MEM DMEM.
   UWAGA: Kroki 3.9 - 3.12 są krytyczne i powinny zostać wykonane w ciągu 10 - 15 minut.
9. Po zakończeniu trawienia ostrożnie pobrać roztwór wytrawiający, delikatnie odsysając pipetą.
10. Przemyj hipokampy 3 razy pożywką neuronową, dodając kolejno, a następnie ostrożnie odsysając 1 ml świeżej pożywki hodowlanej na cykl mycia. Nie należy odwirowywać zawiesiny komórek.
11. Po ostatnim etapie płukania ostrożnie rozetrzeć tkankę w 1 ml pożywki neuronowej.
12. Policz komórki za pomocą komory liczącej i umieść 35 000 komórek w pożywce neuronowej o pojemności 500 μl na pojedynczy dołek na płytce 24-dołkowej (płytka wspomniana w 3.2).
    UWAGA: Opcjonalnie podwielokrotność komórki może być barwiona przeciwstawnie błękitem trypanowym w celu oceny żywotności preparatu komórkowego. Kontroluj gęstość posiewu poprzez oględziny za pomocą mikroskopu (zwykle 90 - 110 komórek na pole widzenia standardowego obiektywu 10X).
13. Umieścić neurony w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO₂ przez 1 godzinę.
14. Po inkubacji wyjąć przygotowane wkładki (wysiane zlewającymi się monowarstwami astrocytów) z inkubatora (patrz krok 2.8). Wymień pożywkę, odsysając pożywkę astrocytów i zastępując ją 500 μl świeżej pożywki neuronowej.
    UWAGA: Wkładki powinny zawierać zlewające się monowarstwy astrocytów po 2 - 3 DIV (Days In Vitro).
15. Ostrożnie umieść wstawki z astrocytami w studzienkach zawierających kultury neuronów (krok 3.13) za pomocą sterylnych kleszczy.
16. Powstałą pośrednią kokulturę neuronów i astrocytów umieścić z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO₂,
    UWAGA: W tych warunkach neurony mogą być hodowane przez okres do 4 tygodni w całkowicie zdefiniowanym pożywce. Nie jest konieczna żadna zmiana medium. W przypadku kultur długotrwałych zaleca się napełnianie pustych studzienek sterylną wodą w celu zmniejszenia parowania z płytki 24-dołkowej.
17. Wykonaj analizy komórkowe in vitro po pożądanych okresach hodowli (np. dla immunocytochemii, PCR, Western blot, zapisów elektrofizjologicznych (patch clamp lub matryca wieloelektrodowa)^)7,15,18.
    UWAGA: System hodowli nadaje się również do ostrego i przewlekłego leczenia farmakologicznego kultur¹¹.

Analiza kultur neuronalnych za pomocą pośredniego systemu kokultury jest różnorodna i może być przeprowadzana na różnych etapach dojrzewania kultury. Ze względu na to, że komórki mogą być utrzymywane do 4 tygodni, możliwe są długoterminowe badania kultur.

Schemat w lewym środkowym panelu Rysunku 1 pokazuje konfigurację wspólnej uprawy. Za pomocą tego systemu można wykonywać obrazowanie żywych komórek obu typów komórek, czego przykładem są obrazy z kontrastem fazowym monowarstwy astrocytów (lewy górny panel) i sieci neuronalnej (lewy dolny panel). Po utrwaleniu możliwa jest ocena immunocytochemiczna, jak pokazano w prawym górnym i prawym dolnym panelu.

Neurony zaczynają tworzyć połączenia synaptyczne począwszy od około 7 DIV w naszym modelu (dane nie pokazane). Przez 14 DIV w sieciach neuronalnych powstaje wiele synaps, co można zidentyfikować za pomocą połączonego immunocytochemicznego wykrywania markerów pre i postsynaptycznych (ryc. 1, prawy dolny panel). Co ważne, za pomocą tego podejścia można zobrazować i określić ilościowo nie tylko ilość markerów synaptycznych puncta, ale także strukturalnie ukończone synapsy, które najprawdopodobniej przyczynią się do łączności sieciowej.

Kultury astrocytów nie tylko zapewniają troficzne wsparcie neuronom11, ale także syntetyzują kilka wydzielanych czynników19,20 zaangażowanych w plastyczność neuronalną. Ekspresja jednego z tych czynników, a mianowicie metaloproteinazy macierzy 2 (MMP2), pokazano w prawym górnym panelu rysunku 1. Co ciekawe, 2 różne izoformy MMP2 wykryto w pożywce kokultury przy użyciu Western Blot (ryc. 1, środkowy prawy panel). Potencjalnie astrocyty wydzielają MMP2 do wspólnego podłoża, wpływając w ten sposób na plastyczność neuronów. Zidentyfikowano również wiele izoform tenascyny-C, znanego regulatora wzrostu aksonów, migracji i różnicowania komórek21.

Zebrane razem, wyniki te pokazują dwa przykłady i tym samym dostarczają dowodu na zasadność różnorodności badań astrocytów, neuronów i ich wzajemnej komunikacji, które mogą być realizowane przy użyciu metody pośredniego współuprawy opisanej tutaj.

Ryc. 1: Pośredni system kokultury astrocytów i neuronów pozwala na oddzielną analizę astrocytów, neuronów i wydzielanych mediatorów molekularnych. Górny panel, po lewej: astrocyty tworzą monowarstwy na błonie wkładki do hodowli komórkowej, kontrast fazowy; Podziałka: 250 mikronów. Górny panel, po prawej: astrocyty są wybarwione immunologicznie pod kątem kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) (mysi klon GA5) i metaloproteazy macierzy 2 (MMP2) (poliklonalny królik); Podziałka: 250 mikronów. Środkowy panel, po lewej: schemat ilustruje pośrednią konfigurację kokultury. Chociaż dwie kultury są fizycznie oddzielone, dzielą to samo medium. Środkowy panel, po prawej: dwa wydzielane molekularne mediatory interakcji neuron-glej ujawniają się w pożywce do wspólnej hodowli przy użyciu Western Blot. Udokumentowano wiele izoform tenacyny C (TNC), regulatora wzrostu neurytów, i MMP2, modyfikatora macierzy zewnątrzkomórkowej. Dolny panel, po lewej: pierwotne neurony rozwijają wysoce połączone sieci do 14dnia hodowli, kontrast fazowy; Podziałka: 250 mikronów. Dolny panel, po prawej: począwszy od 14 d in vitro, między neuronami ustanawia się wiele połączeń synaptycznych, co wykrywa się za pomocą znakowania immunocytochemicznego; Podziałka: 50 mikronów. Kolokalizacja markera presynaptycznego fagotu (poliklonalnego królika) z postsynaptycznym białkiem rusztowania PSD95 (mysi klon 6G6-1C9) dokumentuje strukturalnie zakończone tworzenie synaps. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.