Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany protokół skutecznego znakowania radioaktywnego nanocząstek złota przy użyciu azydkowej grupy protetycznej znakowanej 125I

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54759

⸱

10 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano szczegółową procedurę syntezy azydku znakowanego 125I oraz znakowania radioaktywnego nanocząstek złota o wielkości 13 nm sprzężonych z grupą dibenzocyklooktynu (DBCO) przy użyciu reakcji kliknięcia bez miedzi.

Streszczenie

Tutaj demonstrujemy szczegółowy protokół radiosyntezy grupy protetycznej azydku znakowanej 125I i jego zastosowanie do efektywnego znakowania radioaktywnego nanocząstek złota funkcjonalizowanych przez grupę DBCO za pomocą reakcji kliknięcia bez miedzi. Radiojodowanie cynowanego prekursora (2) przeprowadzono przy użyciu [125I]NaI i chloraminy T jako utleniacza w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po oczyszczeniu produktu surowego metodą HPLC uzyskano oczyszczony azydek znakowany 125I (1) o wysokiej wydajności radiochemicznej (75 ± 10%, n = 8) i doskonałej czystości radiochemicznej (>99%). Do syntezy znakowanych radioaktywnie nanocząstek złota o wielkości 13 nm, nanocząstki złota funkcjonalizowane DBCO (3) przygotowano przy użyciu tiolowanego polimeru glikolu polietylenowego. Bezmiedziowa reakcja kliknięcia między 1 a 3 dała 125znakowanych I nanocząstek złota (4) o ponad 95% wydajności radiochemicznej, określonej za pomocą radiochromatografii cienkowarstwowej (radio-TLC). Wyniki te wyraźnie wskazują, że obecna metoda znakowania radioaktywnego wykorzystująca wspomaganą przez szczep reakcję kliknięcia bez miedzi będzie przydatna do wydajnego i wygodnego znakowania radioaktywnego nanomateriałów zawierających grupę DBCO.

Wprowadzenie

Promowana przez szczep reakcja kliknięcia bez miedzi między azydkami a cyklooktynami została szeroko zastosowana do efektywnego bioortogonalnego znakowania szerokiej gamy biomolekuł, nanomateriałów i żywych obiektów1-7. Ze względu na doskonałą specyficzność miejscową i szybkość reakcji tej reakcji koniugacji, został on również wykorzystany do syntezy znaczników znakowanych radioaktywnie. Kilka 18grup protetycznych azydku znakowanego F lub DBCO zostało przygotowanych do znakowania in vitro różnych nowotworów ukierunkowanych na peptydy i przeciwciała, a także do wstępnie ukierunkowanego obrazowania in vivo guzów8-13. Oprócz tych przykładów, tę samą reakcję koniugacji zastosowano do znakowania nanomateriałów metalowo-radioizotopowych do badań obrazowania pozytonowej tomografii emisyjnej (PET)14-16.

Przez kilka dziesięcioleci, radioaktywne jody były wykorzystywane do badań biomedycznych i prób klinicznych poprzez obrazowanie PET (124I), obrazowanie metodą tomografii komputerowej emisji pojedynczych fotonów (SPECT) (123I, 125I) i leczenie raka tarczycy (131I)17-21. Dlatego skuteczna metoda znakowania jodu promieniotwórczego ma fundamentalne znaczenie dla różnych badań, w tym badań obrazowania molekularnego, analizy rozmieszczenia narządów biomolekuł, identyfikacji biomarkerów i opracowywania leków. Strategia reakcji na kliknięcie bez miedzi może być stosowana do znakowania radioaktywnego jodu. Jednak ta aplikacja nie została zbadana tak dokładnie, jak 18biomolekuł znakowanych F22-23. Tutaj przedstawimy krok po kroku protokół syntezy azydku znakowanego 125I do znakowania radioaktywnego cząsteczek pochodzących z grupy DBCO. Procedury przedstawione w niniejszym raporcie będą obejmowały radiojodowanie cynowego prekursora, etapy oczyszczania za pomocą HPLC oraz ekstrakcję do fazy stałej. Demonstrujemy również skuteczne znakowanie radioaktywne nanocząstek złota modyfikowanych przez grupę DBCO o wielkości 13 nm przy użyciu azydku znakowanego 125I. Szczegółowy protokół zawarty w tym raporcie pomoże chemikom syntetycznym zrozumieć nową metodologię znakowania radioizotopowego do syntezy produktów znakowanych radioizotopem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ostrzeżenie: Utleniona forma radioaktywnego jodu jest dość lotna i należy się z nią obchodzić za pomocą odpowiednich osłon ołowianych i ołowianych fiolek. Wszystkie etapy radiochemiczne powinny być przeprowadzane w dobrze wentylowanym okapie przefiltrowanym węglem drzewnym, a procedury eksperymentalne muszą być monitorowane za pomocą urządzeń wykrywających radioaktywność.

1. Przygotowanie substancji chemicznych i wkładu z odwróconą fazą do syntezy azydku znakowanego 125I

  1. Przygotowanie odczynników w roztworze
    1. Rozpuścić 1 mg prekursora azydku (2) w 150 μl absolutnego alkoholu etylowego (rysunek 1).
      UWAGA: Szczegółowa procedura syntezy prekursora azydku (2) została opisana w poprzedniej pracy22.
    2. Rozpuścić 1 mg chloraminy T w 20 μl 1x buforu fosforanowego soli fizjologicznej (pH = 7,4).
    3. Rozpuścić 2 mg pirosiarczynu sodu w 20 μlH2O.
  2. Przygotowanie wkładu
    1. Umyć wkład tC18 10 ml absolutnego alkoholu etylowego, a następnie 10 mlH2O. Nie suszyć matrycy wkładu powietrzem.

2. Radiosynteza 125znakowanej I grupy protetycznej azydku

  1. Reakcja jodowania promieniotwórczego prekursora
    1. Dodać roztwór prekursora azydku (1 mg w 150 μl absolutnego alkoholu etylowego) i kwas octowy (10 μl) do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać 150 MBq [125I]NaI w 0,1 M NaOH (50 μl) do mieszaniny reakcyjnej.
    3. Dodać roztwór chloraminy T (1 mg na 20 μl 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej) i zamknąć probówkę mikrowirówki zawierającą mieszaninę reakcyjną.
    4. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aż do zakończenia reakcji jodowania promieniotwórczego.
    5. Dodać roztwór pirosiarczynu sodu (2 mg w 20 μlH2O) do mieszaniny reakcyjnej w celu wygaszenia reakcji jodowania promieniotwórczego.
    6. Pobrać 0,2 μl surowego produktu, a następnie rozcieńczyć go 100 μl roztworu (H2O/CH3CN, 1:1) do analizy HPLC.
      UWAGA: Do wszystkich eksperymentów HPLC należy używać 0,1% kwasu mrówkowego zawierającegoH2O(rozpuszczalnik A) i 0,1% kwasu mrówkowego zawierającego acetonitryl (rozpuszczalnik B) jako eluentów.
    7. Analizować rozcieńczony produkt surowy przy użyciu analitycznej radio-HPLC z odwróconymi fazami (kolumna C18 z odwróconymi fazami; natężenie przepływu: 1 ml/min; gradient eluentu: 20% rozpuszczalnik B przez 0-2 min, 20-80% rozpuszczalnik B przez 2-22 min, 80-100% rozpuszczalnik B przez 22-23 min i 100% rozpuszczalnik B przez 23-28 min; czas retencji: 16,4 min) (Rysunek 2).
  2. Oczyszczanie produktu surowego preparatywnym HPLC
    UWAGA: Zapewnij wystarczającą osłonę ołowiu wokół części HPLC, takich jak wtryskiwacz, kolumna, detektor, fiolki zbiorcze i pojemnik, w którym zbierane są ścieki.
    1. Pobrać całą mieszaninę reakcyjną do fiolki HPLC. Przepłukać probówkę reakcyjną acetonitrylem (0,5 ml) i dodać płukanie do tej samej fiolki do wstrzykiwań. Zebrany roztwór rozcieńczyćH2O(1 ml).
    2. Wstrzyknąć surowy produkt do preparatywnego radio-HPLC (kolumna C18 z odwróconymi fazami; natężenie przepływu: 10 ml/min; gradient eluentu: 20% rozpuszczalnika B przez 0-2 min, 20-80% rozpuszczalnika B przez 2-22 min, 80-100% rozpuszczalnika B przez 22-23 min i 100% rozpuszczalnika B przez 23-28 min).
    3. Zebrać pik promieniotwórczy reprezentujący azydek znakowany 125I (1) (tR w tych warunkach HPLC wynosi 17,8-18,8 min) w szklanej probówce (rysunek 2).
    4. Zmierzyć wydajność radiochemiczną frakcji za pomocą kalibratora dawki promieniotwórczości zgodnie z protokołem producenta.
    5. Wstrzyknąć oczyszczony produkt do analitycznej radio-HPLC, stosując te same warunki HPLC do oznaczania czystości radiochemicznej produktu.
  3. Ekstrakcja produktu do fazy stałej
    1. Rozcieńczyć frakcję zawierającą pożądany produkt (1) w 40 ml czystegoH2O.
    2. Dodać rozcieńczony roztwór do wstępnie przygotowanego wkładu tC18.
    3. Umyć wkład dodatkowym 15 ml H2O.
    4. Eluować produkt (1) uwięziony we wkładzie za pomocą 2 ml acetonu do szklanej fiolki o pojemności 10 ml, która jest chroniona ołowianą osłoną. Zmierzyć radioaktywność eluowanego produktu za pomocą kalibratora dawki promieniotwórczości zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Dimetylosulfotlenek (DMSO) lub etanol absolutny mogą być również używane do elucji produktu z wkładu. Około 5-10% radioaktywności zwykle przykleja się do wkładu, a pozostały produkt znakowany radioaktywnie nie może być całkowicie wymyty przez użycie nadmiernych ilości rozpuszczalnika organicznego.
    5. Odparować aceton za pomocą strumienia azotu lub argonu.
    6. Rozpuścić pozostałość za pomocą DMSO (100-200 μl) do następnego etapu znakowania radioizotopowego.

3. Synteza nanocząstek złota sprzężonych z grupą DBCO

  1. Modyfikacja powierzchni nanocząstek złota o wielkości 13 nm za pomocą glikolu polietylenowego zawierającego grupę DBCO
    1. Przygotować nanocząstki złota stabilizowane cytrynianem sodu (3) (średnia wielkość = 13 nm) zgodnie z poprzednim sprawozdaniem24.
    2. Dodać wodny roztwór Tween 20 (1 mM, 1,5 ml) do stabilizowanych cytrynianem nanocząstek złota (10 nM, 15 ml). Wstrząsaj roztworem przez 20 minut na wytrząsarce orbitalnej.
    3. Dodać wodny roztwór tiolu glikolu polietylenowego zawierającego grupę DBCO (średnia masa cząsteczkowa = 5 000, 100 μM, 1,5 ml). Wstrząsaj roztworem przez 2 godziny na wytrząsarce orbitalnej.
  2. Oczyszczanie nanocząstek złota modyfikowanych grupą DBCO
    1. Oczyść zmodyfikowane nanocząstki złota zmodyfikowane przez grupę DBCO (4) przez kolejne wirowanie (11 400 x g, 15 min x 3).
    2. Zdekantować supernatant i dodać czystą wodę w celu ponownego zawieszenia granulek nanocząstek złota.

4. Znakowanie radioaktywne nanocząstek złota modyfikowanych przez grupę DBCO za pomocą reakcji kliknięcia bez miedzi

  1. Synteza nanocząstek złota znakowanych 125I przy użyciu azydku znakowanego 125I (1)
    1. Przygotować stężony roztwór nanocząstek złota zmodyfikowanych przez grupę DBCO, stosując wirowanie (11 400 x g, 15 min) i dostosować stężenie nanocząstek złota do 2 μM.
    2. Dodać 4,1 MBq 125znakowanego I azydku (1) w DMSO (5 μl) do zawiesiny nanocząstek złota (4) (2 μM, 50 μl).
    3. Powstałą mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 40 °C przez 60 minut.
    4. Pobrać podwielokrotność (0,2 μl) z produktu surowego i nałożyć ją na płytkę do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) pokrytej krzemionką.
    5. Wywołać płytkę TLC, używając octanu etylu jako fazy ruchomej.
    6. Umieścić płytkę TLC na skanerze radio-TLC i uruchomić skaner w celu monitorowania reakcji znakowania radioaktywnego (rysunek 3) zgodnie z protokołem producenta.
  2. Oczyszczanie produktu surowego
    1. Oczyścić mieszaninę reakcyjną zawierającą 125nanocząstek złota znakowanych izotopem I (4) przez odwirowanie (11 400 x g, 15 min).
    2. Zdekantować supernatant i dodać czystą wodę w celu ponownego zawieszenia granulek nanocząstek złota.
    3. Pobrać podwielokrotność (0,2 μl) z oczyszczonego produktu i nałożyć ją na płytkę TLC pokrytą krzemionką.
    4. Wywołaj płytkę TLC, używając octanu etylu jako fazy ruchomej.
    5. Umieścić płytkę TLC na skanerze radio-TLC i uruchomić skaner w celu określenia wydajności radiochemicznej i czystości radiochemicznej 125nanocząstek złota znakowanych I (4) (rysunek 3) zgodnie z protokołem producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reakcję radiojodowania prekursora stannylowanego (2) przeprowadzono z użyciem 150 MBq [125I]NaI, kwasu octowego oraz chloraminy T w temperaturze pokojowej przez 15 min, otrzymując produkt znakowany promieniotwórczo (1). Po oczyszczaniu surowej mieszaniny metodą preparatywnej HPLC, pożądany produkt uzyskano z wydajnością radiochemiczną 75 ± 10% (n = 8). Analityczna HPLC wykazała, że czystość radiochemiczna produktu znakowanego 125I pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ogólnie rzecz biorąc, obserwowana wydajność radiochemiczna oczyszczonego azydku znakowanego 125I (1) wynosiła 75 ± 10% (n = 8). Znakowanie radiochemiczne zostało przeprowadzone przy 50-150 MBq radioaktywności, a wyniki radiochemiczne są dość spójne. Jeśli [125I]NaI (t1/2 = 59,4 d), które uległo rozpadowi promieniotwórczemu przez ponad miesiąc, zostało użyte w reakcji jodowania promieniotwórczego, zaobserwowano, że wydajność radiochemiczna 1 była ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z National Research Foundation of Korea, finansowane przez rząd Republiki Korei, (granty nr 2012M2B2B1055245 i 2012M2A2A6011335) oraz przez RI-Biomics Center of Korea Atomic Energy Research Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chloramina T trójwodzianSigma402869
[125I]NaI w ilości NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Pirosiarczyn sodu SigmaS9000
Kwas mrówkowySigma251364
Sep-Pak tC18 plus wkładWodyWAT036800
Dimetylosulfotlenek SigmaD2650
AcetonSigma650501
EtanolSigma459844
Trójwodny chlorek(III)Sigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5,000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC żel krzemionkowy 60 F254Merck
Analytical HPLCAgilent1290 InfinityNumer modelu
Preparatywa HPLCAgilent1260 InfinityNumer modelu
Analityczna kolumna C18 z odwróconymi fazamiAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Preparatywa C18 kolumna z odwróconymi fazamiAgilentPrepHT XDB-C18
Radiowy skaner TLCBioscanAR-2000Numer modelu
Kalibrator dawki radioizotopowejCapintec, IncCRC -25R kalibrator dawkiNumer modelu

Bibliografia

  1. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
  2. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
  3. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
  4. Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
  5. Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
  6. Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
  7. Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
  8. Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
  9. Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
  10. Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
  11. Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
  12. Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
  13. Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
  14. Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
  15. Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
  16. Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
  17. Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
  18. Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
  19. Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
  20. Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
  21. Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
  22. Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
  23. Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
  24. Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Radioznakowanie nanocz steczek z otareakcja click bezmiedziowagrupa protezy azydowej jodu 125protok radiojodowaniaoczyszczanie metod HPLCanaliza radio TLCnanocz steczki funkcjonalizowane DBCOcykloaddycja azydowo alkinowa promowana napr eniempomiar wydajno ci radiochemicznejekstrakcja do fazy sta ej

Powiązane artykuły