Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i charakterystyka in vitro środków kontrastowych na bazie dendrymerów do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54776

⸱

4 grudnia 2016

 ,  ,  , 
1MR Neuroimaging Agents, Max Planck Institute for Biological Cybernetics

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje przygotowanie i charakterystykę dendrymerowego środka kontrastowego do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI), który przenosi makrocykliczne chelaty koordynujące paramagnetyczne jony gadolinu. W serii eksperymentów MRI in vitro środek ten wytwarzał wzmocniony sygnał MRI w porównaniu z dostępnym na rynku analogiem monomerycznym.

Streszczenie

Paramagnetyczne kompleksy gadolinu(III) z acyklicznymi lub makrocyklicznymi chelatami są najczęściej stosowanymi środkami kontrastowymi (CA) do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI). Ich celem jest zwiększenie tempa relaksacji protonów wodnych w tkance, a tym samym zwiększenie kontrastu obrazu MR i swoistości pomiarów MRI. Obecnie klinicznie zatwierdzone środki kontrastowe to cząsteczki o niskiej masie cząsteczkowej, które są szybko usuwane z organizmu. Zastosowanie dendrymerów jako nośników chelatatorów paramagnetycznych może odegrać ważną rolę w przyszłym rozwoju bardziej wydajnych środków kontrastowych do rezonansu magnetycznego. W szczególności wzrost lokalnego stężenia gatunków paramagnetycznych powoduje wyższy kontrast sygnału. Co więcej, ten CA zapewnia dłuższy czas retencji tkanek ze względu na wysoką masę cząsteczkową i rozmiar. W tym miejscu demonstrujemy wygodną procedurę przygotowania makromolekularnych środków kontrastowych MRI na bazie dendrymerów z poli(amidoaminy) (PAMAM) z monomakrocyklicznymi chelatorami typu DOTA (DOTA – 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctan). Jednostka chelatująca została dołączona poprzez wykorzystanie reaktywności grupy izotiocyjanianów (NCS) w stosunku do grup powierzchniowych aminy dendrymeru PAMAM w celu utworzenia mostków tiomocznikowych. Produkty dendrymeryczne oczyszczono i przeanalizowano za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego, spektrometrii mas i analizy pierwiastkowej. Na koniec zarejestrowano obrazy MR o wysokiej rozdzielczości i porównano kontrasty sygnałowe uzyskane z przygotowanych dendrymerów i dostępnych na rynku środków monomerycznych.

Wprowadzenie

Rezonans magnetyczny (MRI) to potężna i niejonizująca technika obrazowania, szeroko stosowana w badaniach biomedycznych i diagnostyce klinicznej, ze względu na jej nieinwazyjny charakter i doskonały wewnętrzny kontrast tkanek miękkich. Najczęściej stosowane metody MRI wykorzystują sygnał uzyskany z protonów wody, zapewniając obrazy o wysokiej rozdzielczości i szczegółowe informacje w tkankach oparte na różnicach w gęstości sygnałów wodnych. Natężenie sygnału i swoistość eksperymentów MRI można dodatkowo poprawić za pomocą środków kontrastowych (CA). Są to gatunki paramagnetyczne lub superparamagnetyczne, które wpływają na podłużne (T1) i poprzeczne (T2) czasy relaksacji, odpowiednio1,2.

Kompleksy gadolinu jonów lantanowców z ligandami kwasu poliaminowo-polikarboksylowego są najczęściej używanymi ligandami T1 CA. Gadolin(III) skraca czas relaksacji protonów wodnych T1, zwiększając w ten sposób kontrast sygnału w eksperymentach MRI3. Jednak gadolin jonowy jest toksyczny; jego rozmiar jest zbliżony do rozmiaru wapnia (II) i poważnie wpływa na sygnalizację wspomaganą wapniem w komórkach. Dlatego chelaty acykliczne i makrocykliczne są stosowane do neutralizacji tej toksyczności. Do tej pory opracowano różne ligandy wielozębne, w wyniku których powstały kompleksy gadolinu(III) o wysokiej stabilności termodynamicznej i obojętności kinetycznej1. Te oparte na 12-członowym cyklu azamakrocyklowym, w szczególności jego tetrakarboksylowej pochodnej DOTA (1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctan) są najbardziej zbadanymi i stosowanymi kompleksami tej klasy CA.

Niemniej jednak, CA typu GdDOTA są systemami o niskiej masie cząsteczkowej, wykazującymi pewne wady, takie jak niska skuteczność kontrastu i szybkie wydalanie przez nerki. Makromolekularne i wielowartościowe CA mogą być dobrym rozwiązaniem tych problemów4. Ponieważ biodystrybucja CA zależy głównie od ich wielkości, makrocząsteczkowe CA wykazują znacznie dłuższe czasy zatrzymywania w tkankach. Co równie ważne, wielowartościowość tych czynników skutkuje zwiększonym lokalnym stężeniem monomerycznej sondy MR (np. kompleksu GdDOTA), co znacznie poprawia pozyskiwany sygnał MR i jakość pomiaru.

Dendrymery są jednymi z najbardziej preferowanych rusztowań do przygotowania wielowartościowych CA do MRI4,5. Te silnie rozgałęzione makrocząsteczki o dobrze zdefiniowanych rozmiarach są podatne na różne reakcje sprzęgania na swojej powierzchni. W niniejszej pracy przedstawiono przygotowanie, oczyszczanie i charakterystykę dendrymerycznego CA do rezonansu magnetycznego składającego się z dendrymeru poli(amidoaminy) (PAMAM) generacji 4 (G4) sprzężonego z chelatami podobnymi do GdDOTA (DCA). Opisujemy syntezę reaktywnej pochodnej DOTA i jej sprzężenie z dendrymerem PAMAM. Po kompleksowaniu z Gd(III) przeprowadzono standardową procedurę charakterystyki fizykochemicznej DCA. Na koniec przeprowadzono eksperymenty MRI, aby wykazać zdolność DCA do tworzenia obrazów MR o silniejszym kontraście niż te uzyskane z CA o niskiej masie cząsteczkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie DCA

  1. Synteza jednostki monomerycznej 46.
    1. Synteza 4-(4-nitrófenylo)-2-(4,7,10-tris-tertkwas (1-({2-butoxykarbonylometylo-1,4,7,10-tetraazacyklododek-1-ylo})butyrowy) tert-ester butylowy (2).
      1. Rozpuścić (4,7-bis-tertkwas (-butoxykarbonylometylo-1,4,7,10-tetraaza-cyklododek-1-ylo)-octowy tertester butylowy 1 (1,00 g, 1,94 mmol) w N,Ndo dimetyloformamidu (DMF, 5 ml), dodać węglan potasu (0,67 g, 4,86 mmol, 2,5 ekwiwalentu) i mieszać mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 45 min.
        UWAGA: Makrocykl 1 przygotowano z cyklenu i tert-bromoacetan n-butylu zgodnie z wcześniej opisaną procedurą7.
      2. Dodaj tert--butylo-2-bromo-4-(4-nitrofenylo)butanonian (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 ekwiwalentu) dodawać porcjami przez 1 h. Mieszać mieszaninę w tych samych warunkach reakcji przez kolejne 18 h.
        Uwaga: Tertn-butyl-2-bromo-4-(4-nitrophenyl)butanoate został otrzymany z kwasu 4-(4-nitrofenylo)maślanowego, chlorku tionylu i bromu zgodnie z wcześniej opublikowaną procedurą8.
      3. Usunąć DMF za pomocą próżniowej destylacji z kolby do kolby w temperaturze 40-60 °C9.
      4. Oczyścić pozostałość za pomocą chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy, 7% metanol/dichlorometan), aby uzyskać produkt 2 w postaci brązowego amorficznego ciała stałego (1,09 g, 72%)10.
    2. Synteza 4-(4-aminofenylu)-2-(4,7,10-tris-tertkwas (1-(tert-butoksykarbonylo-metylu-1,4,7,10-tetraazacyklododek-1-yl)butyrykowy tertester butylowy (3).
      1. Rozpuścić pochodną nitrobenzenu 2 (1,00 g, 1,28 mmol) w etanolu (10 ml) i 7 N roztworze amoniaku w metanolu (150 µl). Do roztworu dodać pallad na węglu aktywnym jako katalizator (Pd/C, 150 mg, 15% wag.).
      2. Wstrząsać niejednorodną mieszaninę przez 16 h w atmosferze wodoru (2,5 bara) w aparaturze do uwodorniania Parr.
      3. Przygotuj placek z ziemi okrzemkowej, zawieszając ją w etanolu, a następnie filtrując zawiesinę przez spieczony lejek szklany. Przelej zawiesinę z punktu 1.1.2.2 przez przygotowany placek, aby usunąć katalizator Pd/C poprzez filtrację.
      4. Usuń rozpuszczalnik poprzez delikatną destylację na ewaporatorze obrotowym (temperatura kąpieli wodnej ~40 °C) w celu otrzymania związku 3 w postaci brązowej amorficznej substancji stałej (0,91 g, 95%).
    3. Synteza 4-(4-izotiocyjanofenylu)-2-(4,7,10-tris-tert-kwas (2-butoxykarbonylometylu-1,4,7,10-tetraazacyklododek-1-ylu)masłowy tert-butylester butylu (4).
      1. Do mieszaniny związku 3 (0,91 g, 1,22 mmol) i trietyloaminy (0,685 ml, 4,87 mmol, 4 ekwiwalenty) w dichlorometanie (15 ml) dodać tiofosgen (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 ekwiwalentu).
      2. Mieszaninę reakcyjną energicznie mieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze pokojowej przez 16 h.
      3. Usuń rozpuszczalnik poprzez delikatną destylację na ewaporatorze obrotowym (temperatura kąpieli wodnej ~40 °C), a następnie oczyścić surowy produkt za pomocą chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy, 5% metanol/dichlorometan), aby otrzymać produkt 4 w postaci jasnobrązowego amorficznego ciała stałego (0,51 g, 53%).
  2. Synteza dendrymeru DCA.
    1. Synteza dendrymeru 5.
      1. Należy odważyć dendrymer G4-PAMAM (667 mg, 10% roztwór dendrymeru w metanolu, 4.67 µmol), odparować metanol poprzez łagodną destylację na ewaporatorze obrotowym (temperatura kąpieli wodnej ~40 °C), a następnie rozpuścić pozostałość w DMF (4 ml).
      2. Dodać trietyloaminę (0,105 ml, 0,75 mmol, 160 ekwiwalentów) i mieszać przez 45 min w temperaturze 60 °Ci dodać izotiocyjanian 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 ekwiwalentu w stosunku do powierzchniowych grup aminowych dendrymeru) porcjami w ciągu 1 h.
      3. Mieszać mieszaninę reakcyjną za pomocą mieszadła magnetycznego przy 45 °C przez 48 h.
      4. Usuń rozpuszczalnik za pomocą destylacji próżniowej z kolby do kolby w temperaturze 40-60 °C.
      5. Oczyścić osad za pomocą chromatografii żelowej (wykluczania rozmiarowego), stosując lipofilne medium do filtracji żelowej i metanol jako eluent. W celu zapakowania kolumny, napęcznieć medium filtracyjne w metanolu przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej (>4 ml metanolu na 1 g proszku) bez przykładania ciśnienia. Przeprowadzić rozdział grawitacyjny, zbierając frakcje o objętości 1 ml.
      6. Przeanalizować zebrane frakcje za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Wywołać płytkę TLC w 15% metanolu w dichlorometanie (tylko najbardziej polarna plama znajdująca się na linii startowej pochodzi z produktu dendrymerycznego). Odparować zebrane frakcje poprzez delikatną destylację na ewaparatorze obrotowym (temperatura kąpieli wodnej ~40 °C) w celu otrzymania produktu 5 (270 mg, 91%).
    2. Synteza dendrymeru 6.
      1. Rozpuścić chroniony chelator dendrymerowy 5 (270 mg, 4.23 µmol) w kwasie mrówkowym (5 ml) i mieszaj mieszaninę przy 60 °C przez 24 h.
      2. Odparować kwas mrówkowy poprzez destylację na rotavaporze (ciśnienie ~15 mbar, temperatura kąpieli wodnej ~40 °C) i poddać produkt liofilizacji w celu otrzymania 6 (ciśnienie ~0,2 mbar)9.
    3. Synteza dendrymerycznego środka kontrastowego (DCA)
      1. Rozpuścić chelator dendrymerowy 6 (4.35 µmol) w wodzie i dostosować pH do wartości 7,0 za pomocą 0,1 M wodorotlenku sodu.
      2. Rozpuścić GdCl33·6h2O (113 mg, 304 µmol) w wodzie (1 ml) i dodawać kroplami do roztworu chelatora 6 przez okres 4 h; utrzymywać pH na poziomie 7,0 przy użyciu wodnego roztworu wodorotlenku sodu (0,05 M), mierząc pH za pomocą pH-metru.
      3. Mieszaninę mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze pokojowej przez 24 h.
      4. Dodaj kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA, 158 mg, 426 µmol) do roztworu porcjami w ciągu 4 h w celu usunięcia nadmiaru Gd(III), utrzymując pH na poziomie 7,0 za pomocą wodnego roztworu wodorotlenku sodu (0,05 M). Mieszaninę mieszać w temperaturze pokojowej przez 24 h.
      5. Przeprowadzić chromatografię wykluczania rozmiarów w celu usunięcia większości GdEDTA oraz nadmiaru EDTA. Do wypełnienia kolumny należy użyć hydrofilowego medium do filtracji żelowej napęczniałego w wodzie. Odparować mieszaninę do odpowiedniej objętości i nałożyć na kolumnę. Eluować kolumnę wodą dejonizowaną bez przyłożenia ciśnienia.
      6. Odwiruj próbkę, używając jednostki filtra odwirującego o progu odcięcia 3 kDa, przez 30 min przy sile odśrodkowej 1 800 x g, aby usunąć pozostałości GdEDTA i EDTA. Powtarzaj ten krok (około pięć razy), aż w filtracie nie zostanie wykryte EDTA i GdEDTA. Przenieś próbkę do kolby, odparuj ją, a następnie liofilizuj rozpuszczalnik, aby otrzymać produkt o złamanej białej barwie jako końcowy DCA (186 mg, 71%).
        UWAGA: Sprawdzić brak EDTA i GdEDTA za pomocą ESI-MS.
      7. Potwierdź brak Gd(III) w formie wolnych jonów za pomocą testu z pomarańczowym ksylenolem. Rozpuść filtrat (0,5 ml) w roztworze buforu octanowego (pH 5,8). Dodaj kilka kropli roztworu pomarańczowego ksylenolu i obserwuj zmianę barwy (kolor żółty lub fioletowy wskazuje odpowiednio na brak lub obecność wolnych jonów Gd(III) w roztworze).11.

2. Charakterystyka produktów dendrymerycznych in vitro

  1. Szacowanie liczby makrocyklicznych jednostek DOTA przyłączonych do dendrymeru PAMAM (stopień załadowania dendrymeru makrocyklami typu DOTA)
    1. Szacowanie za pomocą 1H NMR (NMR — spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego).
      UWAGA: Procedura ta jest możliwa do przeprowadzenia dla dendrymerów 5 i 6, ale nie dla DCA.
      1. Należy zarejestrować widmo 1H NMR12.
      2. Należy zintegrować obszar aromatyczny oraz dwa oddzielne obszary alifatyczne (1. sygnały alifatycznego dendrymeru i protonów makrocyklicznych; 2. sygnały grup t-Bu) lub tylko obszar alifatyczny odpowiednio dla dendrymerów 5 i 6.
        Uwaga: W przypadku dendrymeru 6 w obszarze alifatycznym nie występuje oddzielny sygnał pochodzący z grup t-Bu, ponieważ zostały one poddane hydrolizie.
      3. Do oszacowania liczby jednostek makrocyklicznych (n) należy użyć równania 1 lub równania 2, gdzie R = stosunek całek (alifatycznej do aromatycznej w równ. 1 lub alifatycznej-dendrymeru do alifatycznej-t-Bu w równ. 2), Hdend = liczba protonów w dendrymerze, HAr = liczba protonów aromatycznych, HtBu = liczba protonów w grupach t-Bu, a Hmac = liczba protonów w jednym makrocyklu.
        Uwaga: Dla dendrymeru 5 można zastosować równanie 1 lub 2, natomiast dla dendrymeru 6 tylko równanie 1. Ponieważ protony wymienne (przy aminach, amidach, tiomocznikach lub karboksylowych grupach kwasowych) są zazwyczaj zastępowane deuterem, nie uwzględniono ich w obliczeniach. Przyjęto wartości: Hdend = 1,128 (dla 5) lub 1,000 (dla 6), HAr = 4 oraz Hmac = 27.
        figure-protocol-1 (1)
        figure-protocol-2 (2)
    2. Szacowanie na podstawie analizy elementarnej z wykorzystaniem stosunku azotu do siarki.
      1. Należy przeprowadzić analizę elementarną stałej próbki dendrymeru (w niniejszej pracy DCA).
      2. Do oszacowania liczby jednostek makrocyklicznych (n) należy użyć równania 3, gdzie R = stosunek wyznaczonego %N i %S, Ndend lub Sdend = liczba atomów azotu lub siarki w dendrymerze, a Nmac lub Smac = liczba atomów azotu lub siarki w jednej jednostce makrocyklicznej.
        Uwaga: Współczynnik 2,29 wynika ze stosunku mas atomowych siarki i azotu. W niniejszej pracy przyjęto Ndend = 250, Sdend = 2, Nmac = 5 oraz Smac = 1.
        figure-protocol-3 (3)
    3. Szacowanie metodą desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej macierzą z analizą czasu przelotu (MALDI-TOF).
      1. Należy przeprowadzić analizę MALDI-TOF MS13.
      2. Liczbę jednostek makrocyklicznych (n) oblicza się zgodnie z równaniem 4, gdzie Mz = obserwowana masa (m/z), z = ładunek cząsteczki, Mdend = masa części dendrymerowej, a Mmac = masa jednej jednostki makrocyklicznej.
        UWAGA: W niniejszej pracy przyjęto Mdend = 14,306 oraz Mmac = 719.
        figure-protocol-4 (4)
  2. Wyznaczanie stężenia DCA ([DCA]): Pomiar podatności magnetycznej objętościowej (BMS)
    1. DCA (5-10 mg) należy rozpuścić w wodzie (360 µl) w plastikowej probówce ([DCA] ~5-10 mM).
      UWAGA: Stężenie [DCA] powinno mieścić się w zakresie 5-10 mM, aby uniknąć możliwego nakładania się rezonansów t-BuOH przy stężeniach próbek >15 mM na rezonans wody przy δ = 4,7 ppm.
    2. Do wodnego roztworu DCA należy dodać 60 µl mieszaniny D2O:t-BuOH (2:1 v/v) i wymieszać otrzymany roztwór (420 µl) za pomocą miksera Vortex.
    3. 400 µl próbki należy przenieść do zewnętrznej probówki NMR i umieścić w niej współosiową wkładkę NMR z mieszaniną t-BuOH:H2O (10:90 v/v).
    4. Należy zarejestrować widmo 1H NMR i zmierzyć przesunięcie częstotliwości między sygnałami rezonansowymi pochodzącymi od t-BuOH w wewnętrznej i zewnętrznej probówce NMR (referencyjnie)12.
    5. Do wyznaczenia [DCA] należy użyć równania 5, gdzie T = temperatura bezwzględna, Δχ = zarejestrowane przesunięcie, µeff = efektywny moment magnetyczny jonu lantanowca (µeff = 7,94 dla Gd(III)14), a s = stała zależna od kształtu próbki i jej położenia w polu magnetycznym (odpowiednio 0, 1/3 i 1/6 w przypadku sfery, cylindra równoległego oraz cylindra prostopadłego do pola magnetycznego).
      UWAGA: Obliczoną wartość [DCA] należy skorygować do stężenia pierwotnego ze względu na dodatek roztworu D2O:t-BuOH (60 µl).
      figure-protocol-5 (5)
  3. Pomiary dynamicznego rozpraszania światła (DLS).
    1. Należy przygotować przefiltrowany roztwór DCA (filtr z politetrafluoroetylenu/PTFE 0,2 µm, 0,75 mM na Gd(III)) w buforze z kwasem 4-(2-hydroksyetyl)piperazynoetanosulfonowym (HEPES) (25 mM, pH 7,4) i przelać go do kuwety do pomiaru DLS.
    2. Kuwetę należy umieścić w aparacie DLS i ustawić następujące parametry: 5 powtórzeń po 15 skanów (1 skan = 12 s, współczynnik załamania = 1,345, absorpcja = 1%) bez opóźnień między skanami oraz z wyrównaniem temperatury przez 30 s przed rejestracją.
    3. Należy wyeksportować uzyskane dane i wyznaczyć histogram rozkładu wielkości, wykreślając populację (%) jako funkcję wielkości (średnicy hydrodynamicznej).
  4. Pomiar relaksacyjności podłużnej i poprzecznej.
    UWAGA: Podobna procedura została już opisana z użyciem analizatora czasu relaksacji15; niniejsza procedura została przeprowadzona przy użyciu spektrometru NMR 300 MHz z oprogramowaniem Topspin.
    1. Z roztworu stokowego DCA (patrz sekcja 2.2) należy przygotować zestaw roztworów DCA w H2O:D2O (500 µl, 10% D2O w H2O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 i 5,0 mM, [HEPES] = 25 mM).
    2. 450 µl roztworu należy przenieść do probówki NMR i umieścić w urządzeniu.
    3. Należy zoptymalizować parametry akwizycji (czas trwania impulsu wzbudzenia 90° (p1) oraz przesunięcie częstotliwości naświetlania (O1)), a następnie przeprowadzić eksperymenty T1 i T2 przy użyciu odpowiednio sekwencji impulsów odwracania i powrotu (IR) oraz sekwencji Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG).
    4. Wyznaczenie czasów relaksacji T1 i T2.
      1. Należy wybrać zarejestrowany pomiar, przetworzyć widmo 2D w wymiarze F2 i przeprowadzić interaktywną korekcję fazy.
      2. W oknie Analysis/ T1/T2 relaxation należy wybrać odpowiedni przekrój (piki o maksymalnej intensywności), zintegrować go i wyeksportować ten obszar do modułu relaksacji.
      3. Należy wybrać odpowiednią funkcję dopasowania (invrec dla eksperymentów IR lub uxnmrt2 dla CPMG), aby uzyskać czasy relaksacji T1 lub T2 .
    5. Kroki 2.4.4.2-2.4.4.4 należy powtórzyć dla wszystkich pozostałych roztworów [DCA].
    6. Szybkości relaksacji (R1 i R2) oblicza się z uzyskanych wartości T1 (R1,2=1/T1,2).
    7. Należy wykreślić R1 i R2 (s-1) jako funkcję stężenia Gd(III) w mM.
    8. Relaksacyjność podłużną i poprzeczną, r1 i r2 (mM-1 s-1), wyznacza się z nachylenia dopasowanej linii zgodnie z równaniem 6, gdzie Ri,obs = podłużna (i=1) lub poprzeczna (i=2) diamagnetyczna szybkość relaksacji wody w obecności gatunków paramagnetycznych, a [Gd] = stężenie Gd(III) użyte w eksperymencie.
      figure-protocol-6 (6)

3. In vitro MRI; Porównanie DCA i GdDOTA

  1. Przygotowanie fantomów rurkowych
    1. Przygotuj wodne roztwory DCA (4 x 350 µl) oraz GdDOTA (4 x 350 µl) oraz próbki wody (4 x 350 µl) dla dwóch zestawów eksperymentów, w których stężenie środków kontrastowych jest obliczane: (3.1.1.1) na Gd(III) lub (3.1.1.2) na cząsteczkę.
      1. Przygotuj dwie próbki DCA oraz dwie próbki GdDOTA próbki z odpowiednimi stężeniami 0,5 i 1,0 mM w przeliczeniu na Gd(III). Dodatkowo należy przygotować dwie próbki wody (jako próbki kontrolne).
      2. Przygotować dwie próbki DCA (2,5 i 5,0 mM na Gd(III) lub 0,05 i 0,1 mM na cząsteczkę dendrymeru), dwie próbki GdDOTA (0,25, 0,5 mM) oraz dwie próbki wody (probówki kontrolne).
        UWAGA: Odpowiednie stężenia DCA i GdDOTA należy przygotować poprzez rozcieńczenie odpowiednich próbek zapasowych o stężeniach wyznaczonych metodą BMS (patrz sekcja 2.2) buforem HEPES (pH 7,4). W celu uproszczenia obliczeń przyjęto, że średnia liczba jednostek makrocyklicznych na cząsteczkę dendrymeru wynosi n = 50. Zatem stosunek DCA:GdDOTA wyniósł 1:5, obliczony w przeliczeniu na jedną cząsteczkę.
    2. Umieść próbki w 300 µl probówki plastikowe, unikając obecności pęcherzyków powietrza w roztworze.
      UWAGA: Rozmiar plastikowych probówek zależy od rodzaju i wielkości zastosowanej cewki radiową (w tym przypadku przedstawiono przykład z cewką objętościową).
    3. Wprowadzić próbki do strzykawki (objętość 60 ml), a następnie napełnić ją 1 mM GdDOTA roztwór, a następnie umieść go w skanerze.
      UWAGA: Próbki umieszczono w roztworze wodnym GdDOTA, aby uniknąć efektów podatności (zmian natężenia pola magnetycznego występujących w pobliżu granic między substancjami o różnej podatności magnetycznej).
  2. Optymalizacja parametrów i obrazowanie.
    1. Użyj skanu anatomicznego (Localizer/Tripilot), aby umieścić strzykawkę z próbkami w izocentrum magnesu.
    2. Naciśnij ikonę sygnalizacji świetlnej (skanowanie regulacyjne), aby przeprowadzić korektę shimowania (regulację jednorodności pola magnetycznego) całej objętości, częstotliwości centralnej (O1), wzmocnienie odbiornika (RG) oraz wzmocnienie nadawcze (TX0 i TX1).
    3. Dla T1-ważone (T1w) obrazowania, wybierz metodę szybkiego obrazowania pod niskim kątem (FLASH).
    4. Wybierz przekrój wieńcowy dla próbek umieszczonych pionowo (strzykawka poziomo) w skanerze, korzystając z obrazu lokalizacyjnego (Localizer scan).
    5. Należy użyć równania 7 do optymalizacji parametrów akwizycji stosunku kontrastu do szumu (CNR)16, gdzie α = kąt odchylenia, TE czas echa, TR = czas repetycji, a T1,A, T1,B te T1 czasy dla próbki A (T1,A) i próbki B (T1,B) dla której stosunek sygnału do szumu (CNR) powinien zostać zmaksymalizowany (to samo dotyczy T2 czasy: T2,A i T2,B).
      UWAGA: T1 i T2 czasy relaksacji należy ustawić na wartości uzyskane z pomiarów relaksywności podłużnej i poprzecznej (rozdział 2.4), podczas gdy TE, TRi α należy uzyskać z obliczeń optymalizacji CNR.
      figure-protocol-7 (7)
    6. Należy wykonać obrazowanie, korzystając z parametrów uzyskanych w poprzednim kroku (3.2.5).
    7. Oblicz stosunek sygnału do szumu (SNR).
      1. Załaduj uzyskane T1w obraz (skan) do Wyświetlanie obrazu & okno procesowei kliknij w Zdefiniowanie obszaru zainteresowania (ROI) – obszar zainteresowania.
      2. Wybierz kolisty obszar zainteresowania (ROI) i narysuj go w miejscu próbki oraz w tle. Następnie kliknij wyświetlacz aby uzyskać średnią amplitudę sygnału (Ssygnał) oraz odchylenie standardowe tła (Sszum).
      3. Powtórz krok 3.2.7.2 dla próbek DCA, GdDOTA oraz wody.
      4. Oblicz stosunek sygnału do szumu (SNR), korzystając ze wzoru: SNR = Ssygnał / Sszum.
    8. Postępując zgodnie z nieco zmodyfikowaną procedurą, należy przeprowadzić T2-ważony (T2wobrazowanie z wykorzystaniem metody szybkiej akwizycji z wzmocnieniem relaksacyjnym (RARE). W celu optymalizacji parametrów akwizycji pod kątem CNR należy zastosować równanie 8.
      figure-protocol-8 (8)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przygotowanie DCA składało się z dwóch etapów: 1) syntezy monomerycznego chelatora typu DOTA (Rycina 1) oraz 2) sprzężenia chelatora z dendrymerem G4 PAMAM i kolejnej przygotowania dendrymerycznego kompleksu Gd(III) (Rycina 2). W pierwszym etapie przygotowano oparty na cyklenie chelator typu DOTA zawierający cztery kwasy karboksylowe oraz grupę ortogonalną nadającą się do dalszych modyfikacji chemicznych. Proces przygotowania rozpoczynał ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przygotowanie dendrymerycznego środka kontrastowego MRI wymaga odpowiedniego doboru jednostki monomerycznej (tj. chelatora dla Gd(III)). Zmniejszają toksyczność tego jonu paramagnetycznego i do tej pory służy temu celu szeroka gama chelatorów acyklicznych i makrocyklicznych1-3. Spośród nich makrocykliczne chelatory typu DOTA charakteryzują się najwyższą stabilnością termodynamiczną i bezwładnością kinetyczną, a zatem są najbardziej preferowanym wyborem do przygotowania obojętnych środków kontrastowych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe Towarzystwa Maxa Plancka, tureckiego Ministerstwa Edukacji Narodowej (stypendium doktoranckie dla S. G.) oraz Niemieckiej Służby Wymiany Akademickiej (DAAD, stypendium doktoranckie dla T. S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CyclenCheMatechC002
tert-bromooctan butylu Alfa AesarA14917
N,N,N-dimetyloformamidFluka40248
Węglan potasuSigma-Aldrich209619
Kwas 4-(4-nitrofenylo)butrynowyAldrich335339
Chlorek tionylu Acros Organics382662500Uwaga: Substancja; toksyczna w przypadku wdychania
BromAcros Organics402841000Uwaga: powoduje poważne oparzenia skóry, śmiertelne w przypadku wdychania 
Eter dietylowydowolnego źródła
Siarczan soduAcros Organics196640010
Chloroform VWR Chemicals22711.29
tert-butylu 2,2,2-trichloroacetimidianAldrich364789Uwaga: substancja łatwopalna; działa drażniąco na skórę i oczy
Eterian trifluorku boruAcros Organics17456025048% BF3. Uwaga: Substancja łatwopalna; powoduje oparzenia skóry, śmiertelne w przypadku wdychania
Wodorowęglan soduAcros Organics424270010
Octan etyluz dowolnego źródłaDo chromatografii kolumnowej
n-heksandowolne źródłoDo chromatografii kolumnowej
Aparatura do destylacji bańka-bańka (Kugelrohr)Bü chiTyp modelu: Piec szklany B-585
SilicagelCarl Roth GmbHP090.2
Metanoldowolne źródłoDo chromatografii kolumnowej
Dichlorometan dowolne źródłoDo chromatografii kolumnowej
EtanolVWR Chemicals20821.296
AmoniakAcros Organics4283810007 N Roztwór w metanolu
PalladAldrich64318115% na mokro
Aparatura do uwodornienia PARRPARR Instrument Company
Celite 503Aldrich22151
Lejek ze szkła spiekanegoz dowolnego źródła
TiofosgenAldrich115150Uwaga: działa drażniąco na skórę; działa toksycznie w przypadku wdychania
TrietyloaminaAlfa AesarA12646
Dichlorometan Acros Organics348460010Ekstra suche 
Mieszadło magnetycznez dowolnego źródła
PAMAM G4 DendrimerAndrews ChemServiceAuCS - 29710% wag. roztwór w MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20SigmaLH20100
Płytki do chromatografii cienkowarstwowejMerck Millipore1.05554.0001
Kwas mrówkowyVWR Chemicals20318.297
Lophylizer dowolne źródło
Chlorek gadollinium(III) sześciowodnyAldrichG7532
Wodorotlenek soduAcros Organics134070010
pH-metrdowolne źródło
Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuhydratAldrichE5134
Spektrometr masowy (ESI)AgilentIon Syfon SL 1100 
Bufor octanowyz dowolnego źródłapH 5,8
Oranżan ksylenolowyAldrich5209720 μ M w buforze octanowym
Hydrofilowy Sephadex G-15GE Healthcare17-0020-01
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 MembranaMerck MilliporeUFC900324Ultracel-3 (MWCO 3000)
Wirujz dowolnym źródłem
 BrukerAvance III 300 MHz
TopspinBrukerVersion 2.1
Przyrząd do analizy spalaniaEuroVector SpAAnalizator elementarny EuroEA 3000 
Instrument MALDI-ToF MSApplied BiosystemsVoyager-STR
Tlenek deuteruCarl Roth GmbH6672.3
tert-butylowy alkoholCarl Roth GmbHAE16.1
Mieszalnik wirowyz dowolnego źródła
Rurki Norell NMRDeutero GmbH507-HP-7
Rurkakoncentryczna NMRDeutero GmbHkoncentryczny b-5-7
DLS instrumentMalvernZetasizer Nano ZS
0,20 μ m Filtr PTFE Carl Roth GmbHKC94.1
HEPESFisher BioReagentsBP310
Fiolki z plastikową probówkąz dowolnego źródła
DotaremGuerbetNDC 67684-2000-1
Skaner MRIBrukerBioSpec 70/30 USR magnes (7 T). Uwaga: potencjalne zagrożenia związane z silnymi polami magnetycznymi
Cewka RFBrukerCewka objętościowa o podwójnej częstotliwości (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)Paravision
(oprogramowanie)BrukerWersja 5.1
spektrometr NMR

Bibliografia

  1. Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, É The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. , Wiley. (2013).
  2. Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast Media Mol. Imaging. 4 (1), 1-23 (2009).
  3. Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99 (9), 2293-2352 (1999).
  4. Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics. Chem. Rev. 110 (5), 2921-2959 (2010).
  5. Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. Dendrimers and magnetic resonance imaging. New J. Chem. 31 (7), 1152-1160 (2007).
  6. Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent. ChemPlusChem. 80 (3), 612-622 (2015).
  7. Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites. Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).
  8. Vibhute, S. M., et al. Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin. Org. Biomol. Chem. 11 (8), 1294-1305 (2013).
  9. Vogel, A. I., Furniss, B. S. Vogel's textbook of practical organic chemistry. 5th ed. , Longman. (1989).
  10. Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. , Wiley-VCH. (2013).
  11. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
  12. Keeler, J. Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed. , Wiley. (2010).
  13. Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications. , Wiley-VCH. (2007).
  14. Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).
  15. Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (53), e2844(2011).
  16. Hagberg, G. E., Scheffler, K. Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths. Contrast Media Mol. Imaging. 8 (6), 456-465 (2013).
  17. Boswell, C. A., et al. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharmaceut. 5 (4), 527-539 (2008).
  18. Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. Primer on Gadolinium Chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
  19. Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents. Tetrahedron Lett. 56 (6), 759-765 (2015).
  20. Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics. Bioconjugate Chem. 20 (11), 2142-2153 (2009).
  21. Ali, M. M., et al. Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent. Chem. Eur. J. 14 (24), 7250-7258 (2008).
  22. Jackson, C. L., et al. Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions. Macromolecules. 31 (18), 6259-6265 (1998).
  23. Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. Dendrimer toxicity: Let's meet the challenge. Int. J. Pharm. 394 (1-2), 122-142 (2010).
  24. Rudovsky, J., et al. PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange. Bioconjugate Chem. 17 (4), 975-987 (2006).
  25. Xu, H., et al. Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry. J. Med. Chem. 50 (14), 3185-3193 (2007).
  26. Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques. Bioconjugate Chem. 21 (6), 1014-1017 (2010).
  27. Livramento, J. B., et al. First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).
  28. Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent. J. Am. Chem. Soc. 130 (15), 5335-5340 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przygotowanie środka kontrastowego do MRIsynteza dendrymeru PAMAMsprzęganie chelatora typu DOTAchelatowanie gadolinuchromatografia wykluczania cząsteczkowegoanaliza NMR protonowegopomiar relaksywnościobrazowanie T1-zależneobrazowanie T2-zależne
Przygotowanie i charakterystyka in vitro środków kontrastowych na bazie dendrymerów do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.