Przygotowanie i charakterystyka in vitro środków kontrastowych na bazie dendrymerów do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego

Podsumowanie

Ten protokół opisuje przygotowanie i charakterystykę dendrymerowego środka kontrastowego do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI), który przenosi makrocykliczne chelaty koordynujące paramagnetyczne jony gadolinu. W serii eksperymentów MRI in vitro środek ten wytwarzał wzmocniony sygnał MRI w porównaniu z dostępnym na rynku analogiem monomerycznym.

Streszczenie

Paramagnetyczne kompleksy gadolinu(III) z acyklicznymi lub makrocyklicznymi chelatami są najczęściej stosowanymi środkami kontrastowymi (CA) do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI). Ich celem jest zwiększenie tempa relaksacji protonów wodnych w tkance, a tym samym zwiększenie kontrastu obrazu MR i swoistości pomiarów MRI. Obecnie klinicznie zatwierdzone środki kontrastowe to cząsteczki o niskiej masie cząsteczkowej, które są szybko usuwane z organizmu. Zastosowanie dendrymerów jako nośników chelatatorów paramagnetycznych może odegrać ważną rolę w przyszłym rozwoju bardziej wydajnych środków kontrastowych do rezonansu magnetycznego. W szczególności wzrost lokalnego stężenia gatunków paramagnetycznych powoduje wyższy kontrast sygnału. Co więcej, ten CA zapewnia dłuższy czas retencji tkanek ze względu na wysoką masę cząsteczkową i rozmiar. W tym miejscu demonstrujemy wygodną procedurę przygotowania makromolekularnych środków kontrastowych MRI na bazie dendrymerów z poli(amidoaminy) (PAMAM) z monomakrocyklicznymi chelatorami typu DOTA (DOTA – 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctan). Jednostka chelatująca została dołączona poprzez wykorzystanie reaktywności grupy izotiocyjanianów (NCS) w stosunku do grup powierzchniowych aminy dendrymeru PAMAM w celu utworzenia mostków tiomocznikowych. Produkty dendrymeryczne oczyszczono i przeanalizowano za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego, spektrometrii mas i analizy pierwiastkowej. Na koniec zarejestrowano obrazy MR o wysokiej rozdzielczości i porównano kontrasty sygnałowe uzyskane z przygotowanych dendrymerów i dostępnych na rynku środków monomerycznych.

Wprowadzenie

Rezonans magnetyczny (MRI) to potężna i niejonizująca technika obrazowania, szeroko stosowana w badaniach biomedycznych i diagnostyce klinicznej, ze względu na jej nieinwazyjny charakter i doskonały wewnętrzny kontrast tkanek miękkich. Najczęściej stosowane metody MRI wykorzystują sygnał uzyskany z protonów wody, zapewniając obrazy o wysokiej rozdzielczości i szczegółowe informacje w tkankach oparte na różnicach w gęstości sygnałów wodnych. Natężenie sygnału i swoistość eksperymentów MRI można dodatkowo poprawić za pomocą środków kontrastowych (CA). Są to gatunki paramagnetyczne lub superparamagnetyczne, które wpływają na podłużne (T₁) i poprzeczne (T₂) czasy relaksacji, odpowiednio^1,2.

Kompleksy gadolinu jonów lantanowców z ligandami kwasu poliaminowo-polikarboksylowego są najczęściej używanymi ligandami T₁ CA. Gadolin(III) skraca czas relaksacji protonów wodnych T₁, zwiększając w ten sposób kontrast sygnału w eksperymentach MRI³. Jednak gadolin jonowy jest toksyczny; jego rozmiar jest zbliżony do rozmiaru wapnia (II) i poważnie wpływa na sygnalizację wspomaganą wapniem w komórkach. Dlatego chelaty acykliczne i makrocykliczne są stosowane do neutralizacji tej toksyczności. Do tej pory opracowano różne ligandy wielozębne, w wyniku których powstały kompleksy gadolinu(III) o wysokiej stabilności termodynamicznej i obojętności kinetycznej¹. Te oparte na 12-członowym cyklu azamakrocyklowym, w szczególności jego tetrakarboksylowej pochodnej DOTA (1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctan) są najbardziej zbadanymi i stosowanymi kompleksami tej klasy CA.

Niemniej jednak, CA typu GdDOTA są systemami o niskiej masie cząsteczkowej, wykazującymi pewne wady, takie jak niska skuteczność kontrastu i szybkie wydalanie przez nerki. Makromolekularne i wielowartościowe CA mogą być dobrym rozwiązaniem tych problemów⁴. Ponieważ biodystrybucja CA zależy głównie od ich wielkości, makrocząsteczkowe CA wykazują znacznie dłuższe czasy zatrzymywania w tkankach. Co równie ważne, wielowartościowość tych czynników skutkuje zwiększonym lokalnym stężeniem monomerycznej sondy MR (np. kompleksu GdDOTA), co znacznie poprawia pozyskiwany sygnał MR i jakość pomiaru.

Dendrymery są jednymi z najbardziej preferowanych rusztowań do przygotowania wielowartościowych CA do MRI^4,5. Te silnie rozgałęzione makrocząsteczki o dobrze zdefiniowanych rozmiarach są podatne na różne reakcje sprzęgania na swojej powierzchni. W niniejszej pracy przedstawiono przygotowanie, oczyszczanie i charakterystykę dendrymerycznego CA do rezonansu magnetycznego składającego się z dendrymeru poli(amidoaminy) (PAMAM) generacji 4 (G4) sprzężonego z chelatami podobnymi do GdDOTA (DCA). Opisujemy syntezę reaktywnej pochodnej DOTA i jej sprzężenie z dendrymerem PAMAM. Po kompleksowaniu z Gd(III) przeprowadzono standardową procedurę charakterystyki fizykochemicznej DCA. Na koniec przeprowadzono eksperymenty MRI, aby wykazać zdolność DCA do tworzenia obrazów MR o silniejszym kontraście niż te uzyskane z CA o niskiej masie cząsteczkowej.

Protokół

1. Przygotowanie DCA

1. Synteza jednostki monomerycznej 4⁶.
   1. Synteza estru tert-butylowego kwasu 4-(4-nitrofenylo)-2-(4,7,10-tris-tert-butoksykarbonylometylo-1,4,7,10-tetraazacyklododecu-1-ylo)masłowego estru (2).
      1. Rozpuścić (4,7-bis-tert-butoksykarbonylometylo-1,4,7,10-tetraaza-cyklodod-1-ylo)-octowy ester tert-butylowy 1 (1,00 g, 1,94 mmol) w N,N-dimetyloformamidzie (DMF, 5 ml), dodać węglan potasu (0,67 g, 4,86 mmol, 2,5 ekwiwalent) i mieszać mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 45 min.
         UWAGA: Makrocykl 1 został przygotowany z cyklonu i bromooctanu tert-butylu zgodnie z wcześniej opublikowaną procedurą⁷.
      2. Dodawać porcjami tert-butylo-2-bromo-4-(4-nitrofenylo)butanian (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 ekwiwalent) porcjami przez 1 godzinę. Kontynuować mieszanie mieszaniny w tych samych warunkach reakcji przez następne 18 godzin.
         Uwaga: Tert-butylo-2-bromo-4-(4-nitrofenylo)butanian otrzymano z kwasu 4-(4-nitrofenylo)-masłowego, chlorku tionylu i bromu zgodnie z wcześniej opublikowaną procedurą 8.
      3. Usunąć DMF za pomocą destylacji próżniowej bańka-bańka w temperaturze 40-60 °C⁹.
      4. Oczyścić pozostałość metodą chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy, 7% metanol/dichlorometan) w celu otrzymania produktu 2 w postaci brązowego amorficznego ciała stałego (1,09 g, 72%)¹⁰.
   2. Synteza estru tert-butylowego kwasu 4-(4-aminofenylo)-2-(4,7,10-tris-tert-butoksykarbonylometylo-1,4,7,10-tetraazacyklododylo-1-ylo)masłowego estru tert-butylowego kwasu (3).
      1. Rozpuścić pochodną nitrobenzenu 2 (1,00 g, 1,28 mmol) w etanolu (10 ml) i 7 N roztwór amoniaku w metanolu (150 μl). Dodać pallad na węglu aktywnym jako katalizator (Pd/C, 150 mg, 15 % wag.) do roztworu.
      2. Wstrząsać niejednorodną mieszaniną przez 16 godzin w atmosferze wodoru (2,5 bara) w aparacie uwodorniacza Parr.
      3. Przygotuj placek z ziemi okrzemkowej, zawieszając go w etanolu i filtrując zawiesinę przez lejek ze spiekanego szkła. Wlać zawiesinę z ppkt 1.1.2.2 na przygotowany placek w celu usunięcia katalizatora Pd/C przez filtrację.
      4. Usunąć rozpuszczalnik przez delikatną destylację na wyparce obrotowej (temperatura łaźni wodnej ~40 °C) w celu otrzymania związku 3 w postaci brązowego amorficznego ciała stałego (0,91 g, 95%).
   3. Synteza estru tert-butylowego kwasu 4-(4-izotiocyjanofenylo)-2-(4,7,10-tris-tert-butoksykarbonylometylo-1,4,7,10-tetraazacyklododylo-1-ylo)masłowego (4).
      1. Dodać tiofosgen (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 ekwiwalent) do mieszaniny 3 (0,91 g, 1,22 mmol) i trietyloaminy (0,685 ml, 4,87 mmol, 4 ekwiwalent) w dichlorometanie (15 ml).
      2. Mieszaninę reakcyjną energicznie mieszać mieszadłem magnetycznym w temperaturze pokojowej przez 16 godzin.
      3. Usunąć rozpuszczalnik przez delikatną destylację na wyparce obrotowej (temperatura łaźni wodnej ~40 °C), a następnie oczyścić surowy produkt metodą chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy, 5% metanol/dichlorometan) w celu otrzymania produktu 4 w postaci jasnobrązowego amorficznego ciała stałego (0,51 g, 53%).
2. Synteza dendrymeru DCA.
   1. Synteza dendrymeru 5.
      1. Weź dendrymer G4-PAMAM (667 mg, 10% roztwór dendrymeru w metanolu, 4,67 μmol), odparuj metanol przez delikatną destylację na wyparce obrotowej (temperatura łaźni wodnej ~40 °C) i rozpuść pozostałość w DMF (4 ml).
      2. Dodać trietyloaminę (0,105 ml, 0,75 mmol, 160 ekwiwalent), mieszać przez 45 minut w temperaturze 60 °C i dodawać izotiocyjanian 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 ekwiwalent w stosunku do grup powierzchniowych aminowych dendrymeru) porcjami przez 1 godzinę.
      3. Mieszaninę reakcyjną mieszać mieszadłem magnetycznym w temperaturze 45 °C przez 48 godzin.
      4. Usunąć rozpuszczalnik za pomocą destylacji próżniowej bańka-bańka w temperaturze 40-60 °C.
      5. Oczyścić pozostałość za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość przy użyciu pożywki filtracyjnej z żelu lipofilowego i metanolu jako eluentu. Aby wypełnić kolumnę, należy spęczniać pożywkę filtracyjną w metanolu przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej (>4 ml metanolu na 1 g proszku) bez wywierania nacisku. Przeprowadzić separację grawitacyjną, zbierając frakcje o pojemności 1 ml.
      6. Zebrane frakcje należy przeanalizować za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Opracuj płytkę TLC w 15% metanolu/dichlorometanie (tylko najbardziej polarne miejsce znajdujące się na linii podstawowej pochodzi z produktu dendrymerowego). Odparować zebrane frakcje przez delikatną destylację na wyparce obrotowej (temperatura łaźni wodnej ~40 °C) do uzyskania produktu 5 (270 mg, 91%).
   2. Synteza dendrymeru 6.
      1. Rozpuścić chroniony chelator dendrymeryczny 5 (270 mg, 4,23 μmol) w kwasie mrówkowym (5 ml) i mieszać mieszaninę w temperaturze 60 °C przez 24 godziny.
      2. Odparować kwas mrówkowy przez destylację na wyparce obrotowej (ciśnienie ~15 mbar, temperatura łaźni wodnej ~40 °C) i wysuszyć produkt na zimno do uzyskania ciśnienia 6 (ciśnienie ~0,2 mbar)⁹.
   3. Synteza dendrymerycznego środka kontrastowego (DCA)
      1. Rozpuścić dendrymeryczny chelator 6 (4,35 μmol) w wodzie i dostosować pH do 7,0 za pomocą 0,1 M wodorotlenku sodu.
      2. Rozpuścić GdCl₃·6H₂O (113 mg, 304 μmol) w wodzie (1 ml) i dodawać kroplami do roztworu chelatora 6 przez okres 4 godzin; utrzymywać pH na poziomie 7,0 w wodnym roztworze wodorotlenku sodu (0,05 M), mierząc pH za pomocą pH-metru.
      3. Mieszaj mieszaninę mieszadłem magnetycznym w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
      4. Dodać kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA, 158 mg, 426 μmol) do roztworu porcjami przez 4 godziny, aby usunąć nadmiar Gd(III), utrzymując pH na poziomie 7,0 za pomocą wodnego roztworu wodorotlenku sodu (0,05 M). Mieszaj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
      5. Przeprowadzić chromatografię wykluczania wielkości w celu usunięcia większości GdEDTA i nadmiaru EDTA. Użyj hydrofilowego żelowego medium filtracyjnego spęczniałego w wodzie, aby wypełnić kolumnę. Zmniejsz mieszaninę do odpowiedniej objętości i załaduj kolumnę. Eluować kolumnę wodą dejonizowaną bez wywierania ciśnienia.
      6. Odwirować próbkę za pomocą filtra odśrodkowego o sile 3 kDa przez 30 minut przy sile odśrodkowej 1 800 x g w celu usunięcia pozostałości GdEDTA i EDTA. Powtórz ten krok (około pięć razy), aż filtrat wykaże brak EDTA i GdEDTA. Przenieść próbkę do kolby, odparować ją, a następnie liofilizować rozpuszczalnik w celu uzyskania produktu o barwie białawej jako końcowego DCA (186 mg, 71%).
         UWAGA: Sprawdź brak EDTA i GdEDTA za pomocą ESI-MS.
      7. Potwierdzić brak Gd(III) jako wolnego jonu za pomocą testu oranżu ksylenolowego. Rozpuścić filtrat (0,5 ml) w roztworze buforowym octanu (pH 5,8). Dodaj kilka kropli roztworu pomarańczy ksylenolowej i śledź zmianę koloru (kolor żółty lub fioletowy wskazuje odpowiednio na brak lub obecność wolnych jonów Gd(III) w roztworze)¹¹.

2. Charakterystyka in vitro produktów dendrymerycznych

1. Oszacowanie liczby makrocyklicznych jednostek DOTA sprzężonych z dendrymerem PAMAM (obciążenie dendrymeru makrocyklami podobnymi do DOTA)
   1. Estymacja za pomocą ¹H NMR (NMR — spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego).
      UWAGA: Ta procedura jest możliwa w przypadku dendrymerów 5 i 6, ale nie w przypadku DCA.
      1. Zapisz widmo ¹H NMR¹².
      2. Zintegruj region aromatyczny i dwa oddzielne regiony alifatyczne (1. sygnały dendrymeru alifatycznego i makrocyklicznych protonów; 2. sygnały grup t-Bu) lub po prostu obszar alifatyczny dla dendrymerów 5 i 6, odpowiednio.
         Uwaga: W regionie alifatycznym nie ma oddzielnego sygnału pochodzącego z grup t-Bu w dendrymerze 6, ponieważ zostały one zhydrolizowane.
      3. Równanie 1 lub równanie 2 służy do oszacowania liczby jednostek makrocyklicznych (n), gdzie R = stosunek całek (alifatyczny/aromatyczny w równaniu 1 lub alifatyczno-dendrymerowy/alifatyczny-t-Bu w równaniu 2), H_dend = liczba protonów w dendrymerach, H_Ar = liczba protonów aromatycznych, H_tBu = liczba protonów w grupach t-Bu, i H_mac = liczba protonów w jednym makrocyklu.
         Uwaga: Równanie 1 lub Równanie 2 może być używane dla dendrymera 5, podczas gdy tylko równanie 1 może być używane dla dendrymera 6. Ponieważ protony wymienne (na aminach, amidach, tiomocznikach lub karboksylanie) są zwykle zastępowane deuterem, nie zostały one uwzględnione w obliczeniach. Tutaj użyto H_dend = 1,128 (dla 5) lub 1,000 (dla 6), H_Ar = 4 i H_mac = 27.
         (1)
         (2)
   2. Oszacowanie na podstawie analizy pierwiastkowej przy użyciu stosunku azotu do siarki.
      1. Wykonaj analizę elementarną na stałej próbce dendrymerowej (DCA w tej pracy).
      2. Równanie 3 służy do oszacowania liczby jednostek makrocyklicznych (n), gdzie R = stosunek wyznaczonych %N i %S, N_dend lub S_dend = liczba atomów azotu lub siarki w dendrymerze, a N_mac lub S_mac = liczba atomów azotu lub siarki w jednej jednostce makrocyklicznej.
         Uwaga: Współczynnik 2,29 otrzymuje się ze stosunku siarki i azotu w masach atomowych. W tej pracy użyto N_dend = 250, S_dend = 2, N_mac = 5 i S_mac = 1.
         (3)
   3. Szacowanie czasu przelotu za pomocą desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą (MALDI-TOF).
      1. Wykonaj analizę MS MALDI-TOF¹³.
      2. Obliczyć liczbę jednostek makrocyklicznych (n) zgodnie z równaniem 4, gdzie M_z = obserwowana masa (m/z), z = ładunek gatunku, M_dend = masa części dendrymerowej, a M_mac = masa jednej jednostki makrocyklicznej.
         UWAGA: W tej pracy użyto M_dend = 14,306 i M_mac = 719.
         (4)
2. Oznaczanie stężenia DCA ([DCA]): Pomiar podatności magnetycznej (BMS)
   1. Rozpuścić DCA (5-10 mg) w wodzie (360 μl) w plastikowej probówce na fiolkę ([DCA] ~5-10 mM).
      UWAGA: [DCA] powinien mieścić się w zakresie 5-10 mM, aby uniknąć ewentualnego nakładania się rezonansów t-BuOH przy stężeniach próbki >15 mM, z rezonansem wody przy δ = 4,7 ppm.
   2. Dodać 60 μl mieszaniny D₂O:t-BuOH (2:1 v/v) do wodnego roztworu DCA i wymieszać otrzymany roztwór (420 μl) za pomocą mieszalnika Vortex.
   3. Przenieść 400 μl próbki do zewnętrznej probówki NMR i umieścić współosiową rurkę z wkładką NMR z mieszaniną t-BuOH:_{H 2}O (10:90 v/v) w probówce z próbką.
   4. Zapisz widmo ¹H NMR i zmierz przesunięcie częstotliwości między sygnałami rezonansowymi pochodzącymi z t-BuOH w wewnętrznych i zewnętrznych probówkach NMR (odniesienie)¹².
   5. Równanie 5 służy do wyznaczania [DCA], gdzie T = temperatura bezwzględna, Δχ = zarejestrowane przesunięcie, μ_eff = efektywny moment magnetyczny dla jonu lantanowca (μ_eff = 7,94 dla Gd(III)¹⁴, a s = stała zależna od kształtu próbki i jej położenia w polu magnetycznym (0, 1/3 i 1/6 w przypadku kuli, cylinder równoległy do pola magnetycznego i cylinder prostopadły do pola magnetycznego, odpowiednio).
      UWAGA: Obliczoną wartość uzyskaną dla [DCA] należy skorygować do pierwotnego stężenia spowodowanego dodaniem roztworu D₂O:t-BuOH (60 μl).
      (5)
3. Pomiary dynamicznego rozpraszania światła (DLS).
   1. Przygotować przefiltrowany roztwór DCA (0,2 μm filtr politetrafluoroetylen/PTFE, 0,75 mM na Gd(III)) w buforze kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) (25 mM, pH 7,4) i przenieść go do kuwety w celu pomiaru DLS.
   2. Umieść kuwetę w aparacie DLS i ustaw następujące parametry: 5 powtórzeń po 15 skanów (1 skan = 12 sekund, współczynnik załamania światła = 1,345, absorpcja = 1%) bez opóźnień między skanami i z wyrównaniem temperatury 30 sekund przed zapisem.
   3. Eksportuj uzyskane dane i uzyskaj histogram rozkładu wielkości, wykreślając populację (%) jako funkcję wielkości (średnicy hydrodynamicznej).
4. Pomiar rozluźnienia wzdłużnego i poprzecznego.
   UWAGA: Podobna procedura została już opisana przy użyciu analizatora czasu relaksacji¹⁵; zabieg ten wykonano przy użyciu spektrometru NMR 300 MHz z oprogramowaniem Topspin.
   1. Przygotować zestaw roztworów DCA w_H2O:_D2O(500 μl, 10%_D2O, w_H2O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 i 5,0 mM, [HEPES] = 25 mM) z próbki podstawowej DCA (patrz sekcja 2.2).
   2. Przenieś 450 μl roztworu do probówki NMR i umieść ją w urządzeniu.
   3. Zoptymalizuj parametry akwizycji (czas trwania impulsu wzbudzenia 90° (p1) i przesunięcie częstotliwości napromieniowania (O₁)), a następnie wykonaj eksperymenty T₁ i T₂, używając odpowiednio sekwencji impulsów odzyskiwania inwersji (IR) i Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG).
   4. Wyznaczanie czasów relaksacji T₁ i T₂.
      1. Wybierz zarejestrowany pomiar, przetwórz widmo 2D w wymiarze F2 i wykonaj interaktywną korekcję fazy.
      2. Wybierz odpowiedni wycinek (pik o maksymalnej intensywności) w oknie relaksacyjnym Analiza/ T₁/T₂, zintegruj go i wyeksportuj region do modułu relaksacji.
      3. Wybierz odpowiednią funkcję dopasowania (invrec lub uxnmrt2 odpowiednio dla eksperymentów IR i CPMG), aby uzyskać czasy relaksacji T₁ lub T₂.
   5. Powtórz kroki 2.4.4.2-2.4.4.4 dla wszystkich pozostałych roztworów [DCA].
   6. Obliczyć współczynniki relaksacji (R₁ i R₂) na podstawie uzyskanych wartości T₁ (R_1,2 = 1/T_1,2).
   7. Wykres R₁ i R₂ (^sek-1) w funkcji stężenia Gd(III) w mM.
   8. Określić relaksywność wzdłużną i poprzeczną, r₁ i r₂ (^{mM-1 sec-1}), od nachylenia dopasowanej linii, jak określono w równaniu 6, gdzie R_{i, obs} = podłużny (i=1) lub poprzeczny (i=2) współczynnik relaksacji diamagnetycznej wody przy braku związków paramagnetycznych, a [Gd] = stężenie Gd(III) użyte w doświadczeniu.
      (6)

3. Rezonans magnetyczny in vitro; Porównanie DCA i GdDOTA

1. Przygotowanie fantomów lampowych
   1. Przygotować wodne roztwory DCA (4 x 350 μl) i GdDOTA (4 x 350 μl) oraz próbki wody (4 x 350 μl) do dwóch zestawów doświadczeń, w których oblicza się stężenie środków kontrastowych: (3.1.1.1) na Gd(III) lub (3.1.1.2) na cząsteczkę.
      1. Przygotować dwie próbki DCA i dwie próbki GdDOTA o stężeniach odpowiednio 0,5 i 1,0 mM na Gd(III). Dodatkowo należy przygotować dwie próbki wody (w postaci probówek kontrolnych).
      2. Przygotować dwie próbki DCA (2,5 i 5,0 mM na Gd(III) lub 0,05 i 0,1 mM na cząsteczkę dendrymeryczną), dwie próbki GdDOTA (0,25, 0,5 mM) i dwie próbki wody (probówki kontrolne).
         UWAGA: Odpowiednie stężenia DCA i GdDOTA należy przygotować poprzez rozcieńczenie odpowiednich próbek podstawowych stężeniami oznaczonymi metodą BMS (patrz sekcja 2.2) buforem HEPES (pH 7.4). W celu uproszczenia obliczeń przyjęto, że n = 50 wynosi dla średniej liczby jednostek makrocyklicznych na cząsteczkę dendrymeru. W związku z tym stosunek DCA:GdDOTA wynosił 1:5, obliczony na podstawie cząsteczki.
   2. Umieścić próbki w plastikowych probówkach na fiolki o pojemności 300 μl, unikając obecności pęcherzyków powietrza w roztworze.
      UWAGA: Rozmiar plastikowych probówek na fiolki zależy od rodzaju i rozmiaru zastosowanej cewki o częstotliwości radiowej (tutaj podano przykład z cewką objętościową).
   3. Włożyć próbki do strzykawki (objętość 60 ml), napełnić ją 1 mM roztworem GdDOTA i umieścić w skanerze.
      UWAGA: Próbki umieszczono w wodnym roztworze GdDOTA, aby uniknąć efektów wrażliwości (zmiany natężenia pola magnetycznego, które występują w pobliżu granic faz między substancjami o różnej podatności magnetycznej).
2. Optymalizacja parametrów i obrazowanie.
   1. Użyj skanu anatomicznego (Lokalizator/Tripilot), aby ustawić strzykawkę z próbkami w izośrodku magnesu.
   2. Naciśnij sygnalizator świetlny (skanowanie regulacyjne), aby wykonać regulację podkładkowania (regulacja jednorodności pola magnetycznego) całej głośności, częstotliwości środkowej (O₁), wzmocnienia odbiornika (RG) i wzmocnienia transmisji (TX0 i TX1).
   3. W przypadku obrazowania T_1-zależnego (T_{1 w}) wybierz metodę szybkiego ujęcia pod niskim kątem (FLASH).
   4. Wybierz plasterek koronalny dla próbek umieszczonych pionowo (strzykawka poziomo) w skanerze za pomocą skanowania Localizer.
   5. Równanie 7 służy do optymalizacji parametrów akwizycji kontrastu do szumu (CNR)¹⁶, gdzie α = kąt odwrócenia, TE = czas echa, TR = czas powtarzania, a T_1,A, T_1,B = T₁ razy próbki A (T_1,A) i próbki B (T_1,B), dla których CNR powinien być zmaksymalizowany (to samo dotyczy T₂ razy: T_2,A oraz T_2,B).
      UWAGA: Czasy relaksacji T ₁ i T₂ należy ustawić na wartości uzyskane z pomiarów relaksacji wzdłużnej i poprzecznej (sekcja 2.4), natomiast TE, TR i α należy uzyskać z obliczeń optymalizacyjnych CNR.
      (7)
   6. Uzyskaj obraz przy użyciu parametrów uzyskanych w poprzednim kroku (3.2.5).
   7. Oblicz stosunek sygnału do szumu (SNR).
      1. Załaduj uzyskany obraz T_1w (skan) do okna Image display & processing (Wyświetlanie i przetwarzanie obrazu) i kliknij Define region of interest (ROI).
      2. Wybierz okrągły zwrot z inwestycji i narysuj go w przykładowej pozycji i tle. Następnie kliknij na wyświetlacz, aby uzyskać średnią amplitudę sygnału (_sygnał S) i odchylenie standardowe tła (_szum S).
      3. Powtórz krok 3.2.7.2 dla DCA, GdDOTA i próbek wody.
      4. Oblicz SNR za pomocą wzoru: SNR = sygnał S / szum S.
   8. Zgodnie z nieco zmodyfikowaną procedurą należy wykonać obrazowanie T_2-zależne (T_2w) metodą szybkiej akwizycji ze wzmocnieniem relaksacji (RARE). Do optymalizacji parametrów akwizycji CNR należy użyć równania 8.
      (8)

Wyniki

Przygotowanie DCA składało się z dwóch etapów: 1) syntezy monomerycznego chelatora typu DOTA (Rysunek 1) oraz 2) sprzężenia chelatora z dendrymerem G4 PAMAM, a następnie przygotowania dendrymerycznego kompleksu Gd(III) (Rysunek 2). W pierwszym etapie przygotowano cykliczny chelator typu DOTA, zawierający cztery kwasy karboksylowe i grupę ortogonalną nadającą się do dalszych modyfikacji syntetycznych. Przygotowanie rozpoczęto od 1<...

Dyskusja

Przygotowanie dendrymerycznego środka kontrastowego MRI wymaga odpowiedniego doboru jednostki monomerycznej (tj. chelatora dla Gd(III)). Zmniejszają toksyczność tego jonu paramagnetycznego i do tej pory służy temu celu szeroka gama chelatorów acyklicznych i makrocyklicznych^1-3. Spośród nich makrocykliczne chelatory typu DOTA charakteryzują się najwyższą stabilnością termodynamiczną i bezwładnością kinetyczną, a zatem są najbardziej preferowanym wyborem do przygotowania obojętnych środków kontrastowych...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cyclen	CheMatech	C002
tert-bromooctan butylu	Alfa Aesar	A14917
N,N,N-dimetyloformamid	Fluka	40248
Węglan potasu	Sigma-Aldrich	209619
Kwas 4-(4-nitrofenylo)butrynowy	Aldrich	335339
Chlorek tionylu	Acros Organics	382662500	Uwaga: Substancja; toksyczna w przypadku wdychania
Brom	Acros Organics	402841000	Uwaga: powoduje poważne oparzenia skóry, śmiertelne w przypadku wdychania
Eter dietylowy	dowolnego źródła
Siarczan sodu	Acros Organics	196640010
Chloroform	VWR Chemicals	22711.29
tert-butylu 2,2,2-trichloroacetimidian	Aldrich	364789	Uwaga: substancja łatwopalna; działa drażniąco na skórę i oczy
Eterian trifluorku boru	Acros Organics	174560250	48% BF3. Uwaga: Substancja łatwopalna; powoduje oparzenia skóry, śmiertelne w przypadku wdychania
Wodorowęglan sodu	Acros Organics	424270010
Octan etylu	z dowolnego źródła		Do chromatografii kolumnowej
n-heksan	dowolne źródło		Do chromatografii kolumnowej
Aparatura do destylacji bańka-bańka (Kugelrohr)	Bü chi		Typ modelu: Piec szklany B-585
Silicagel	Carl Roth GmbH	P090.2
Metanol	dowolne źródło		Do chromatografii kolumnowej
Dichlorometan	dowolne źródło		Do chromatografii kolumnowej
Etanol	VWR Chemicals	20821.296
Amoniak	Acros Organics	428381000	7 N Roztwór w metanolu
Pallad	Aldrich	643181	15% na mokro
Aparatura do uwodornienia PARR	PARR Instrument Company
Celite 503	Aldrich	22151
Lejek ze szkła spiekanego	z dowolnego źródła
Tiofosgen	Aldrich	115150	Uwaga: działa drażniąco na skórę; działa toksycznie w przypadku wdychania
Trietyloamina	Alfa Aesar	A12646
Dichlorometan	Acros Organics	348460010	Ekstra suche
Mieszadło magnetyczne	z dowolnego źródła
PAMAM G4 Dendrimer	Andrews ChemService	AuCS - 297	10% wag. roztwór w MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20	Sigma	LH20100
Płytki do chromatografii cienkowarstwowej	Merck Millipore	1.05554.0001
Kwas mrówkowy	VWR Chemicals	20318.297
Lophylizer	dowolne źródło
Chlorek gadollinium(III) sześciowodny	Aldrich	G7532
Wodorotlenek sodu	Acros Organics	134070010
pH-metr	dowolne źródło
Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuhydrat	Aldrich	E5134
Spektrometr masowy (ESI)	Agilent		Ion Syfon SL 1100
Bufor octanowy	z dowolnego źródła		pH 5,8
Oranżan ksylenolowy	Aldrich	52097	20 μ M w buforze octanowym
Hydrofilowy Sephadex G-15	GE Healthcare	17-0020-01
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 Membrana	Merck Millipore	UFC900324	Ultracel-3 (MWCO 3000)
Wiruj	z dowolnym źródłem
	Bruker		Avance III 300 MHz
Topspin	Bruker		Version 2.1
Przyrząd do analizy spalania	EuroVector SpA		Analizator elementarny EuroEA 3000
Instrument MALDI-ToF MS	Applied Biosystems		Voyager-STR
Tlenek deuteru	Carl Roth GmbH	6672.3
tert-butylowy alkohol	Carl Roth GmbH	AE16.1
Mieszalnik wirowy	z dowolnego źródła
Rurki Norell NMR	Deutero GmbH	507-HP-7
Rurka	koncentryczna NMRDeutero GmbH	koncentryczny b-5-7
DLS instrument	Malvern		Zetasizer Nano ZS
0,20 μ m Filtr PTFE	Carl Roth GmbH	KC94.1
HEPES	Fisher BioReagents	BP310
Fiolki z plastikową probówką	z dowolnego źródła
Dotarem	Guerbet		NDC 67684-2000-1
Skaner MRI	Bruker		BioSpec 70/30 USR magnes (7 T). Uwaga: potencjalne zagrożenia związane z silnymi polami magnetycznymi
Cewka RF	Bruker		Cewka objętościowa o podwójnej częstotliwości (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)Paravision
(oprogramowanie)	Bruker		Wersja 5.1