Wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale PCR

Podsumowanie

Wysokoprzepustowe testowanie patogenów opartych na DNA i RNA za pomocą nanoskalowego PCR jest opisane za pomocą syndromicznego panelu PCR na psach i koniach.

Streszczenie

Nanolitrowa skala real-time PCR wykorzystuje multipleksowanie przestrzenne, aby umożliwić równoległe przeprowadzanie wielu testów na jednej płytce bez typowych wad łączenia reakcji razem. Zaprojektowaliśmy i oceniliśmy panel oparty na tej zasadzie, aby szybko zidentyfikować obecność powszechnych czynników chorobotwórczych u psów i koni z ostrą chorobą układu oddechowego. Niniejszy manuskrypt opisuje przepływ pracy diagnostycznej PCR w nanoskali do przygotowywania, amplifikacji i analizy docelowych sekwencji patogenów, koncentrując się na procedurach, które różnią się od reakcji w skali mikrolitrów. W przedstawionym panelu oddechowym 18 testów ustawiono w trzech egzemplarzach, mieszcząc do 48 próbek na płytce. Uniwersalny proces ekstrakcji i wstępnej amplifikacji został zoptymalizowany pod kątem wysokoprzepustowego przygotowania próbek w celu uwzględnienia wielu matryc oraz patogenów opartych na DNA i RNA. Przedstawiono reprezentatywne dane dla jednego celu RNA (matryca grypy A) i jednego celu DNA (herpeswirus koni 1). Możliwość szybkiego i dokładnego testowania w kierunku kompleksowej, opartej na syndromach grupy patogenów jest cennym narzędziem poprawiającym wydajność i ergonomię badań diagnostycznych oraz w diagnostyce i leczeniu ostrych chorób układu oddechowego.

Wprowadzenie

Z zapotrzebowaniem na szybkie i kompleksowe wykrywanie wielu czynników w diagnostyce klinicznej dla ludzi i zwierząt, metody diagnostyki molekularnej pojedynczego organizmu do wykrywania patogenów są uciążliwe, chyba że są stosowane dla dużej liczby próbek testowanych pod kątem pojedynczej choroby. W kontekście weterynaryjnym wysokowydajne metody diagnostyczne są szczególnie ważne ze względu na dodatkową potrzebę uwzględnienia patogenów pochodzących z wielu różnych gatunków. Podejścia OneHealth do zarządzania chorobami przenoszonymi przez żywność i nadzorem nad pojawiającymi się patogenami to przykłady potrzeb w zakresie testów, które obejmują szereg bakterii, wirusów (opartych na DNA lub RNA), pasożytów i grzybów. Wyzwaniem związanym z łączeniem ze sobą testów dla wielu analitów (multipleksowanie) w celu poprawy wydajności testów jest możliwa utrata czułości i duże obciążenie związane z optymalizacją i walidacją testów.

Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR) w skali nanolitrów jest alternatywą dla praktyki multipleksowania, która pozwala na jednoczesne przeprowadzanie wielu oddzielnych reakcji na tej samej próbce¹. Platforma OpenArray jest zastosowaniem tej zasady²; łączy w sobie technologię mikromacierzy z PCR w czasie rzeczywistym. W oparciu o koncepcję multipleksowania przestrzennego, każda próbka jest testowana pod kątem dużej liczby obiektów w oddzielnych otworach przelotowych. Platforma ta była początkowo używana z dwuniciową chemią wiążącą DNA na bazie cyjaniny², a teraz jest dostępna do chemii opartej na sondzie przy użyciu ciemnych sond^{hartowniczych 3}. Platforma ta była wykorzystywana przede wszystkim do profilowania genetycznego u ludzi⁴ i zwierząt⁵ . Został niedawno zaadaptowany do wykrywania patogenów DNA i RNA przenoszonych przez krew przez Grigorenko i wsp.⁶ przy użyciu dwuetapowej procedury odwrotnej transkrypcji/wstępnego amplifikacji (PREAMP).

Opisujemy tutaj jednoetapową procedurę opartą na preampie do wykrywania obu typów patogenów w wydzielinach oddechowych oraz wielu innych typów próbek, które mogą być wykonane w całości w ciągu standardowego dnia pracy. Po zakończeniu jednoetapowego przedwzmacniacza próbki są przenoszone na płytkę 384-dołkową, która jest formatem akceptowanym przez zautomatyzowany system obsługi cieczy, który jest dostarczany z tą nanoskalową platformą PCR. System pobiera mieszankę wzorcową i próbkę po powierzchni maksymalnie 4 płytek (192 próbki i kontrole) jednocześnie. Podążając za tym procesem ładowania, opisujemy, w jaki sposób próbki są wzmacniane i analizowane za pomocą makroarkusza kalkulacyjnego, który podsumowuje średnią z 3 powtórzeń technicznych dla każdej kombinacji próba/cel w tabeli, która mieści się na jednej wydrukowanej stronie.

Ustalono jednolitą metodę analizy wyekstrahowanego DNA i/lub RNA z próbek za pomocą tej platformy. Wyodrębniono szeroką gamę próbek, poddano odwrotnej transkrypcji i wstępnej amplifikacji w formacie 96-dołkowym, minimalizując ryzyko błędów. Badane próbki oddechowe obejmowały wymazy z nosa, wymazy z głębokiego gardła, płukanie przeztchawicze, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe i tkankę płucną. Ponieważ niektóre z badanych czynników mogą być również obecne we krwi obwodowej lub kale, włączyliśmy tego typu próbki do procedury. Ten usprawniony przepływ pracy pomaga zaoszczędzić czas i zasoby w porównaniu z przeprowadzaniem eksperymentów na wielu płytkach, umożliwiając wydajne testowanie dzięki panelowemu wykrywaniu genów patogenów i toksyn zamiast indywidualnych testów. Pokazany tutaj panel oddechowy zawierał 18 testów, z których każdy został wydrukowany w trzech otworach przelotowych, mieszczących do 48 próbek na płytce. Wykryte patogeny koni obejmowały adenowirusa koni 1 i 2, wirusa zapalenia tętnic koni, wirusa nieżytu nosa koni A i B, wirusa opryszczki koni (EHV) typu 1 i 4 oraz Streptococcus equi. Do patogenów psów należały: koronawirus układu oddechowego psów (betakoronawirus), wirus nosówki psów, adenowirus psów, wirus parainfluenzy psów, pneumowirus psów, Bordetella bronchiseptica i Mycoplasma cynos. Uwzględniono również uniwersalny test na grypę A i kontrolę wewnętrzną (RNA MS2).

Protokół

Do opracowania tego protokołu nie wykorzystano żadnych ludzi ani zwierząt doświadczalnych. Kontrole uzyskano poprzez oczyszczanie potwierdzonych sekwencyjnie amplikonów i transkrypcję in vitro dla celów RNA. Próbki kliniczne zostały przekazane do rutynowych badań diagnostycznych do Cornell Animal Health Diagnostic Center.

1. Projekt płyty

1. Użyj oprogramowania do projektowania starterów, aby sprawdzić, czy każdy test jest zgodny ze standardowymi warunkami cyklicznymi PCR w czasie rzeczywistym opartymi na sondzie z wyżarzaniem w temperaturze 60 °C za pomocą narzędzia do testowania sondy starter (wybierz ustawienie sondy kwantyfikacyjnej z parametrami domyślnymi).
   UWAGA: Zastosowany reprezentatywny cel RNA został zaadaptowany z uniwersalnego testu ukierunkowanego na matrycę grypy A opublikowanego przez Shu i wsp.⁷. Startery i sonda są następujące: Starter do przodu: GACCRATCCTGTCACCTCTGAC, Starter odwrotny: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, Sonda: Fam-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY. Zastosowany tutaj reprezentatywny test DNA został zaadaptowany z metody wykrywania herpeswirusa koni typu 1 (EHV-1) opublikowanej przez Elia i wsp.⁸. Startery i sonda są następujące: Starter do przodu: GCTCTCAGGTTTTACGACATC, Starter odwrotny: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, Sonda: FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY.
2. Zamów płytki amplifikacyjne do PCR w żądanej konfiguracji.
   UWAGA: W tym badaniu zastosowano format ekspresji genu 18x3 (Tabela 1). Należy dostarczyć producentowi sekwencje dla wszystkich starterów i sond (lub zinwentaryzowanych identyfikatorów testów) dla każdego celu.

2. Ekstrakcja kwasów nukleinowych

1. Ekstrakcja całkowitego kwasu nukleinowego (DNA i RNA) dowolną metodą.
   UWAGA: Zgodnie z instrukcjami producenta zastosowano tutaj zautomatyzowany zestaw do ekstrakcji na bazie kulek magnetycznych (więcej informacji można znaleźć w tabeli materiałów).
2. Przygotuj próbki w następujący sposób:
   1. Wyczyść zewnętrzną część każdego pojemnika na próbkę 10% wybielaczem i dokładnie wysusz. Przetrzyj opuszki palców w rękawiczkach 10% wybielaczem między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
   2. Umieść wymazy z nosa lub głębokiego gardła w dowolnej sterylnej, szczelnie zamkniętej fiolce (takiej jak probówka do pobierania krwi z czerwoną górą) z dodatkiem kilku kropli soli fizjologicznej, aby zapobiec wysuszeniu przed przetworzeniem.
      UWAGA: Waciki bawełniane, plastikowe, drewniane oraz dakronowe i inne syntetyczne są dopuszczalne, ale unikaj wacików z alginianu wapnia.
   3. W przypadku wacików i płukanek tchawicy dodaj zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, tak aby było co najmniej 1-2 ml płynu. Energicznie wymieszaj wacik i DMEM w probówce. Następnie za pomocą pipety przenieś około 1 ml pożywki do nowej probówki.
   4. Mechanicznie poddać lizie tkanki (100-200 mg w 1 ml DMEM) za pomocą urządzenia zaburzającego tkanki zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie odwirować przez 3 minuty przy 825 x g. Przenieść 500 μl supernatantu do nowej probówki.
   5. W przypadku kału połącz 400 mg kału z 800 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami o pH 7,4 (PBS). Wirować zawiesinę przez 1 minutę lub dłużej, aż próbka zostanie zhomogenizowana lub całkowicie zawieszona. Po homogenizacji odwirować zawiesinę przez 10 minut przy 18 000 x g, a następnie przenieść 400 μl do nowej probówki.
   6. W przypadku krwi całej, nieskrzepniętej, należy odwirować próbkę i uzyskać podwielokrotność 250 μl. Dodaj sześć kropli odczynnika litycznego i wir do wymieszania. Inkubować 15 minut w temperaturze 37 °C.
3. Przygotuj do lizy i płukania zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać MS2 lub wybraną kontrolę wewnętrzną do buforu do lizy jako wewnętrzną kontrolę ekstrakcji dodatniej⁹.
4. Dodać 235 μl buforu do lizy i 175 μl próbki (lub PBS do kontroli ujemnej) do każdej probówki z kulkami. Postępuj zgodnie z protokołem producenta.
   UWAGA: Oczyszczony całkowity kwas nukleinowy eluowano tutaj w 90 μl.

3. Odwrotna transkrypcja/Pre-amplifikacja (przedwzmacniacz)

UWAGA: Wszystkie odczynniki i próbki używane w preamp reakcja powinna być zawsze na lodzie. Po przedwzmacniaczu wszystkie odczynniki należy przechowywać w temperaturze pokojowej.

1. Złóż eluowane DNA i/lub RNA, mieszaninę reakcyjną PCR, wodę wolną od nukleaz jako kontrolę ujemną i zbiorcze wzorce do kontroli amplifikacji dodatniej.
   UWAGA: Na płytce wzmacniającej można przeprowadzić do 48 próbek, w tym kontrole (należy uwzględnić co najmniej jedną ujemną kontrolę ekstrakcji dla każdej płytki ekstrakcyjnej, z której mają być pobierane próbki).
2. Wydrukuj przykładową mapę. Poproś drugą osobę, aby sprawdziła, czy mapa i przykładowy układ są zgodne.
3. W probówce o pojemności 1,5 ml dodaj następujące ilości, aby przygotować preamp master mix.
   UWAGA: Użyto tutaj końcowej objętości 14 μl.
   1. Dodać pulę wstępnie zmieszanych starterów z każdego celu, tak aby końcowe stężenie każdego startera wynosiło 900 nM.
      UWAGA: Zastosowany tutaj basen został przygotowany w stężeniu 10x i dodany 1,4 μl na reakcję.
   2. Dodaj losowe startery do końcowego stężenia 600 nM lub 0,1x.
   3. Dodać 2x mieszankę RT-qPCR do połowy końcowej objętości (tutaj 7 μl).
   4. Wymieszaj ze sobą składniki mieszanki głównej, delikatnie wirując i obracając w dół.
4. Wykonaj przedwzmacniacz w standardowej 96-dołkowej płytce, używając tylko lewej strony płytki (kolumny 1-6).
5. Dodaj 8,5 μl miksu głównego przedwzmacniacza i 5,5 μl próbki DNA/RNA do każdego dołka.
6. Po połączeniu wszystkich odczynników (próbek, kontroli dodatnich i kontroli ujemnych z mieszanką Preamp), dokładnie uszczelnij standardową płytkę 96-dołkową przezroczystą uszczelką samoprzylepną. Usuń nadmiar uszczelki za pomocą żyletki, aby zapobiec tworzeniu się szczelin uszczelniających podczas jazdy na rowerze. Odwirować szczelnie zapieczętowaną płytkę przez 20 sekund za pomocą wirówki do płytek PCR. Sprawdź, czy wszystkie odczynniki są połączone na dnie dołków płytkowych.
7. Uruchom test przedwzmacniacza na konwencjonalnym termocyklerze w następujących warunkach: 15 minut w temperaturze 50 °C; 1 minuta w temperaturze 95 °C; 20 cykli po 15 sekund w temperaturze 95 °C, następnie 2 minuty w temperaturze 60 °C; 99,9 °C przez 10 minut; Przytrzymaj w temperaturze 4 °C. Zaprogramuj te warunki przed rozpoczęciem.
8. Włącz konwencjonalny termocykler, wybierz preamp cykl program i uruchom program. Umieść 96-dołkową płytkę w termocyklerze tylko wtedy, gdy dolna część termocyklera (nie pokrywa) osiągnie temperaturę wymaganą do produkcji cDNA (50 °C), monitorując odczyt temperatury na ekranie. Wcześniej utrzymuj płytkę w niskiej temperaturze, aby zminimalizować ryzyko uzyskania wyników fałszywie dodatnich.
9. Po zakończeniu pracy preamp sprawdź, czy płyta pozostała szczelna.
10. Przejdź od razu do kroku 4.1. W celu przechowywania tej płytki przez noc należy przeprowadzić rozcieńczanie w sposób opisany w krokach 4.2-4.5, z wyjątkiem tego, że zamiast luźno przykryć płytkę, należy zapieczętować płytkę przezroczystą uszczelką samoprzylepną i umieścić ją w torbie zamykanej na zamek błyskawiczny, przechowywanej w temperaturze 4 °C.

4. Rozcieńczenie płytki przedwzmacniacza

1. Wyjąć odpowiednią liczbę płytek wzmacniających z zamrażarki (można uruchomić do 4 płytek jednocześnie). Nie otwieraj opakowania. Pozwól talerzowi rozgrzać się przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej. Zapisz numer seryjny i numer partii tabliczki.
   UWAGA: Nieotwarte talerze mogą pozostać w temperaturze pokojowej do 24 godzin, ale w celu uzyskania najlepszych praktyk wyjmij je z zamrażarki nie później niż 30 minut przed potrzebą.
2. Odwiruj gotową płytkę przedwzmacniacza przez 20 sekund za pomocą wirówki do płytek PCR. Włącz amplifikator i komputer, a następnie uruchom powiązany program.
3. Usuń wszystkie niepotrzebne elementy z obszaru konfiguracji PCR. Załóż podwójne rękawice i pokrowce na rękawy.
4. Usuń uszczelkę z preamp płytka i ostrożnie zdejmij i wyrzuć zewnętrzne rękawice. Rozcieńczyć produkty przedwzmacniacza w stosunku 1:5, dodając 56 μl buforu TE do każdej studzienki kolumn 1-6 96-dołkowej płytki przedwzmacniacza i mieszając pipetując w górę iw dół. Idź tylko do pierwszego przystanku pipety, zasysając od dołu i dozując wyżej, ale nie tworząc pęcherzyków. Dodaj bufor TE do wszystkich 6 kolumn niezależnie od nieużywanych studzienek.
5. Ponownie zamknij płytkę przezroczystym klejem lub uszczelką foliową i odwiruj ją przez 20 sekund za pomocą wirówki do płytek PCR. Odłóż tę płytkę na bok (luźno przykrytą) do momentu zakończenia kroku 6.1. Wyrzuć pozostałe rękawice i pokrowce na rękawy.

5. Przygotowanie do transferu 384-dołkowego na płytkę wzmacniającą

1. Ustaw materiały potrzebne do przykrycia i uszczelnienia płytki wzmacniającej: pokrywkę, zatyczkę, strzykawkę z płynem zanurzeniowym, prasę do płytek, butelkę z etanolem i niestrzępiące się chusteczki laboratoryjne. Zdjąć nasadkę strzykawki i przymocować małą plastikową końcówkę do strzykawki (wymaga użycia siły). Wylej niewielką ilość płynu zanurzeniowego na ręcznik papierowy, aby usunąć nagromadzone powietrze (w porządku, jeśli w końcówce pozostaną małe pęcherzyki powietrza). Płyn zanurzeniowy należy zużyć w ciągu 60 minut od wyjęcia strzykawki z zamkniętej próżniowo aluminiowej torebki. Po otwarciu strzykawki nie należy ponownie zakładać nasadki do późniejszego użycia.
2. Sprawdź, czy pojemnik na odpady w pojemniku do ładowania płynów na talerze jest pusty i otwórz pudełko z końcówkami. Napisz datę ważności końcówek na pokrywie pudełka na napiwki po otwarciu nowego pudełka i upewnij się, że końcówki nie wygasły. Włącz urządzenie do obsługi cieczy i komputer, a następnie otwórz oprogramowanie do obsługi cieczy, które wykona autotest.
3. Kliknij "Konfiguracja i załaduj". Kliknij "Przeglądaj", aby wybrać plik csv utworzony z oprogramowania Sample Tracker. Jeśli plik nie jest wyświetlany, przejdź do "Preferencji instrumentu/edycji", a następnie kliknij "Zmień" przy "Folderze plików z płytą próbną". Wybierz folder, w którym zapisany jest plik csv. Następnie kliknij "Konfiguracja i załaduj", a następnie "Przeglądaj" i wybierz plik.
4. Następnie kliknij "Przeglądaj" obok "Pozycja uchwytu płyty 1" i wybierz plik TPF (dostarczony przez producenta), który ma ten sam numer seryjny co tabliczka.

6. Przenoszenie płynów

Uwaga: Nie rozpoczynaj napełniania płytki 384-dołkowej, dopóki wszystkie powyższe kroki nie zostaną wykonane. Parowanie jest problemem w przypadku małych objętości - nie pozwól, aby płytka 384-dołkowa znajdowała się bez przykrycia płynem w środku.

1. Po wykonaniu wszystkich powyższych czynności załóż nowe, dobrze dopasowane podwójne rękawice i ochraniacze na rękawy. Następnie dodaj 2,5 μl głównej mieszanki amplifikacyjnej do płytki 384-dołkowej.
2. Przenieść 2,5 μl rozcieńczonego produktu przedwzmacniacza na płytkę 384-dołkową zgodnie z mapą w tabeli 2 i natychmiast szczelnie przykryć płytkę uszczelką foliową. Wyrzuć rękawice zewnętrzne i pokrowce na rękawy.
3. Odwirować 384-dołkową płytkę przez 20 sekund w wirówce do PCR.
4. Nie zdejmuj uszczelki foliowej, ale umieść płytkę 384-dołkową w pojemniku do cieczy.
5. Otwórz opakowanie zawierające dołączoną płytkę wzmacniającą i ostrożnie umieść ją w pojemniku do obsługi cieczy w pierwszej szczelinie z numerem seryjnym po prawej stronie — trzymaj obudowę za krawędzie, nie dotykając powierzchni płytki. Nieopakowane talerze zużyć w ciągu godziny od otwarcia.
   Uwaga: Zadaniem obudowy jest ochrona płytki przed dotknięciem, ponieważ może to zakłócić niewielkie ilości podkładów i sond wewnątrz otworów przelotowych.
6. Usuń uszczelkę foliową z płytki 384-dołkowej wewnątrz pojemnika do obsługi cieczy, gdy wszystko jest na swoim miejscu. Kliknij Dalej, a następnie zaznacz wszystkie pola po zakończeniu każdego kroku. Kliknij przycisk OK, aby rozpocząć uruchamianie.
7. Zamknij drzwiczki do urządzenia do obsługi cieczy i natychmiast rozpocznij proces napełniania. Pozostań obok osoby zajmującej się obsługą płynów i natychmiast przejdź do następnego kroku po napełnieniu płytki.
8. Podczas pracy urządzenia do obsługi cieczy usuń folię ochronną ze spodu pokrywy etui.
   UWAGA: Klej na spodzie wieczka etui jest pokryty czerwoną taśmą i folią ochronną. Folia musi zostać najpierw usunięta, aby uzyskać dostęp do biurokracji.
   1. Pozostaw górną folię na miejscu do kroku 6.15. Zagruntuj czerwoną taśmę, lekko pociągając, aby uwolnić ją od kleju.
9. Wyjmij załadowaną (wypełnioną) amppłytkę wzmacniającą z urządzenia do obsługi cieczy i delikatnie umieść ją w prasie do płyt z numerem seryjnym po prawej stronie.
10. Umieść pokrywkę na wierzchu talerza z karbowanym końcem po prawej stronie i przyklej na dole (skierowanym w stronę talerza).
11. Pociągnij w dół dźwignię docisku płyty, ostrożnie ją zamykając; lampka będzie migać przez 20 sekund. W tym czasie nie dotykaj prasy do płyt. Gdy lampka zmieni kolor na zielony, ostrożnie podnieś dźwignię i ostrożnie wyjmij zapieczętowaną płytkę, przytrzymując ją za krawędzie.
12. Trzymając szczelną płytkę wzmacniającą pionowo za krawędzie obudowy, natychmiast włóż końcówkę strzykawki do portu ładowania na końcu obudowy, a następnie powoli dozuj płyn zanurzeniowy jednym delikatnym ciągłym ruchem, aby wypełnić przestrzeń między płytką a pokrywką. Zostaw jeden mały pęcherzyk powietrza w rogu po zanurzeniu płytki.
13. Trzymając płytkę pionowo za krawędzie, uszczelnij port ładowania, wkładając wtyczkę do portu i przekręcając wtyczkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara, wywierając wystarczający nacisk, aż uchwyt się oderwie. Chwyć mocno krawędzie obudowy, aby siła złamania uchwytu nie spowodowała upuszczenia obudowy. Jeśli talerz zostanie upuszczony, wyrzuć go.
14. Wyczyść obudowę niestrzępiącą się chusteczką, która została dokładnie spryskana etanolem. Aby wysuszyć etui, przetrzyj je w dół czystą chusteczką. Delikatnie obchodź się z etui; Pamiętaj, aby nie wywierać nacisku na szybę nad studniami.
15. Przynieś zapieczętowaną płytkę do ampmaszyna do lifikacji. W zakładce "Instrument" wybierz "Konsola instrumentów". Wybierz amplifikator, a następnie kliknij przycisk "Otwórz drzwi".
16. Umieść amppłytka wzmacniająca w pierwszym gnieździe adaptera płytki, sprawdzając, czy adapter jest prawidłowo ustawiony z A1 w lewym górnym rogu. Ustaw tabliczkę tak, aby kod kreskowy był skierowany do góry i do przodu urządzenia. Kliknij przycisk "Zamknij drzwi". Zwróć uwagę na użycie tacy adaptera — obowiązuje limit 10 użyć.
17. Na karcie Narzędzia główne u dołu ekranu w menu Uruchom wybierz pozycję OpenArray. Kliknij "Pobierz identyfikatory tablic". Puste pola zostaną automatycznie wypełnione informacjami o tablicy. Aby rozpocząć bieg, kliknij "Rozpocznij bieg".
18. Zamknij oprogramowanie urządzenia do obsługi cieczy i wyłącz je w płynie. Umieść osłonę końcówek na stojaku na końcówki. Wyrzuć końcówki z kosza na śmieci i wyczyść go. Wyczyść i odkaż wszystkie przedmioty, w tym powierzchnię roboczą, pipetę, wiadro na odpady i pojemniki na końcówki.
19. Ponownie uszczelnij płytkę przedwzmacniacza przezroczystą uszczelką samoprzylepną i przechowuj w temperaturze -20 °C.

7. Analiza wyników

1. Po zakończeniu uruchamiania zapisz plik, a następnie kliknij "X" na karcie z nazwą uruchomienia u dołu ekranu, aby zamknąć plik.
2. Kliknij "Otwórz drzwi" u góry ekranu, aby otworzyć drzwi. Wyjmij amppłytka wzmacniająca, sprawdzając, czy nie wyciekł płyn immersyjny. Kliknij "Zamknij drzwi" u góry ekranu, aby zamknąć drzwi.
3. Kliknij "Otwórz" i wybierz plik uruchamiania, aby go otworzyć. Naciśnij zielony przycisk Analizuj w prawym górnym rogu ekranu. Kliknij "Eksportuj" po lewej stronie ekranu, a następnie "Rozpocznij eksport", aby wyeksportować wyniki (jako plik .txt). Zminimalizuj plik po jego otwarciu. Następnie kliknij "Eksportuj obrazy QC".
4. Przeglądaj obrazy kontroli jakości w programie do analizy obrazów zgodnie z następującymi kryteriami:
   1. Oceń jakość załadunku za pomocą PRE-READ_CHANNEL_4.tiff i POST-READ_CHANNEL_4.tiff, sprawdzając, czy nie ma ciemnych plam ani smug.
      UWAGA: Barwnik wykryty przez ten kanał jest dodawany przez producenta do starterów i sond, który jest uwalniany do roztworu po załadowaniu reakcji. Odczyt w tym kanale wskazuje, że reakcje były prawidłowo załadowane i że startery i sonda były zmieszane z barwnikiem.
   2. Sprawdź, czy nie ma wycieków lub wstrząsów na płycie po załadowaniu za pomocą S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp#_spotfind.tiff. Jeśli obraz wygląda na ciemny, zwiększ jasność (naciśnij Ctrl+Shift+C, aby otworzyć elementy sterujące), aż cała płyta będzie widoczna. Sprawdź, czy obraz wygląda jednolicie, bez cieni, pęcherzyków lub przemieszczonych próbek.
   3. Oceń położenie pokrywki i zanieczyszczenia pod pokrywką (jasne punkty) za pomocą STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff i STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff.
5. Opcjonalnie: Otwórz arkusz kalkulacyjny zawierający makro wyników (plik kodu uzupełniającego). W wyeksportowanym pliku danych kliknij prawym przyciskiem myszy zakładkę u dołu ekranu i wybierz "Przenieś lub Kopiuj". W polu "do rezerwacji" wybierz "Makro wyników.xlsm". Kliknij "Przenieś na koniec" i zaznacz pole "Utwórz kopię". Następnie kliknij przycisk OK.
   1. Jeśli opcja Makro wyników nie pojawia się w polu "do rezerwacji", po prostu skopiuj zawartość wyeksportowanego arkusza pliku danych (kliknij lewą górną komórkę, aby podświetlić wszystkie komórki i Ctrl-C) i wklej ją do nowej karty.
6. Usuń starą kartę "Eksportuj", a następnie zmień nazwę nowo dodanej karty na "Eksportuj".
7. Kliknij "Alt-F8" (lub kliknij Widok, a następnie Makra), a następnie wybierz "Makro" i kliknij "Uruchom". Następnie powtórz to dla Makro2, klikając "Alt-F8", a następnie wybierając "Makro2" i klikając "Uruchom".
8. Zmień nazwę pliku makra wyników, podając odpowiednie informacje (datę i numer seryjny), umieść te informacje nad tabelą i zapisz je pod tą samą nazwą w folderze Wyeksportowane wyniki. Na koniec wydrukuj tabelę wyników wygenerowaną przez makro.
9. W oprogramowaniu maszyny do amplifikacji sprawdź krzywe dla każdej próbki i porównaj je z tabelą makr, wybierając opcję Analiza/Wykres amplifikacji po lewej stronie ekranu. Następnie wybierz kartę Próbka i kliknij każdą próbkę, aby potwierdzić, że istnieją 2 lub 3 dodatnie krzywe amplifikacji dla każdego z pozytywnych wyników w tabeli.
10. Wyłącz amplifikator maszyna.

Wyniki

Wyniki przedstawiono na Rysunkach 1 i 2 dla reprezentatywnego testu RNA (macierz grypy) oraz testu DNA (EHV-1), z wykorzystaniem kombinacji kontroli dodatnich i próbek klinicznych przekazanych do rutynowych badań diagnostycznych. Sygnały fluorescencji emitowane podczas tej typowej reakcji przedstawiono na Rysunku 1, który obrazuje surowe wartości fluorescencji w funkcji cyklu. Wszystkie względne wartości progu cyklu (Ct) zostały wygenerowane automatycznie przez oprogramowanie urządzenia do amplifikacji. Fluorescencja tła została wykorzystana jako oddzielna miara do oceny jakości naniesienia próbki, zamiast włączać ją do odczytów fluorescencji przed obliczeniem wartości Ct.

Analityczna granica wykrywalności (LOD) dla każdego celu została obliczona na podstawie ogólnej średniej wartości Ct przy poziomie wykrywalności 95% powiększonej o 2 odchylenia standardowe w puli kontroli dla wszystkich celów. Najwyższym rozcieńczeniem, przy którym co najmniej 95% powtórzeń było pozytywnych dla reprezentatywnych testów, było 50 kopii; wykrycie 5 kopii zakończyło się sukcesem w 50% powtórzeń. W żadnym z testów nie wykryto ilości poniżej jednej kopii. LOD dla testów RNA i DNA obliczono na wartościach Ct wynoszących odpowiednio 21,92 i 20,05. Wartości te uznano za punkty odcięcia dla raportowania wyników jako pozytywne w przeciwieństwie do podejrzanych (potencjalnie niepowtarzalnych).

Inne aspekty wydajności analitycznej celów oceniano za pomocą szeregowych rozcieńczeń połączonych kontroli pozytywnych przeprowadzonych w trzy różne dni (Rysunek 2). Średnia wydajność reprezentatywnych testów RNA i DNA wynosiła odpowiednio 101,1% i 106,6%; całkowita średnia wydajność dla wszystkich celów wyniosła 101,3%. Testy charakteryzowały się również dobrą liniowością (R²>0,98). Zmienność pomiędzy powtórzeniami w obrębie próbek zazwyczaj mieściła się w granicach odchyleń standardowych 0,2 zarówno dla próbek klinicznych, jak i kontroli. Nie zaobserwowano reaktywności krzyżowej pomiędzy żadnym z celów.

Arkusz Final Results w pliku uzupełniającym przedstawia reprezentatywne wyniki ilościowe dla 10 klinicznych próbek diagnostycznych i 4 kontroli. Próbki kliniczne stanowią podzbiór rutynowo badanych rodzajów materiałów, w tym wymazów z nosa/gardła, tkanki płucnej oraz próbek kału. Jedna próbka kału (końska) w tym zestawie wykazuje nieudaną kontrolę wewnętrzną MS2, co wskazuje na obecność inhibitorów w próbce. Sytuację tę zazwyczaj rozwiązuje się poprzez rozcieńczenie eluatów i/lub ponowną ekstrakcję. Podobnie jak w tym przypadku, kontrola negatywna amplifikacji powinna być negatywna dla wszystkich celów, a kontrola negatywna ekstrakcji powinna zawierać jedynie kontrolę wewnętrzną. W zestawie klinicznym próbki wykazały wartości Ct dla betakoronawirusa, Bordetella bronchiseptica, wirusa pomoru psów typu A, wirusa parainfluenzu psów, pneumowirusa psów oraz grypy A.

Rysunek 1. Wykresy amplifikacji. Odczyty fluorescencji naniesiono na wykres w funkcji cykli amplifikacji dla analizy RNA (A) oraz analizy DNA (B). Trójkąty oznaczają wartości Ct. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 2. Krzywe wzorcowe. Krzywe wzorcowe z testów RNA i DNA wykonanych w trzy różne dni zostały przedstawione na wykresach w celu zademonstrowania liniowości i zakresu amplifikacji z wykorzystaniem kontroli dodatnich. Wartości progu cyklu (Ct) naniesiono w funkcji logarytmu dziesiętnego (log10) liczby kopii RNA (A) lub DNA (Bstandard. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1. Schemat płytki do amplifikacji i lokalizacja celów. Płytki stosowane do nanoskalowych testów PCR w czasie rzeczywistym na tej platformie mają rozmiar szkiełek przedmiotowych i są zorganizowane w 48 podmacierzy po 64 otwory przelotowe, co daje łącznie 3072 otwory przelotowe dla poszczególnych reakcji. Tutaj pokazano jedną podmacierz z 18 celami w trzech powtórzeniach. Każda próbka jest nanoszona do jednej podmacierzy przez robot do obsługi cieczy. Płytki są powlekane związkami hydrofilowymi i hydrofobowymi, aby zatrzymać odczynniki w otworach przelotowych dzięki napięciu powierzchniowemu. Chip ze stali nierdzewnej jest „wzorowany fotolitograficznie i trawiony na mokro w celu utworzenia prostokątnej macierzy 3072 mikroobrobionych, 320 µm otwory o objętości 3 nl każdy²Skróty dla celów są następujące: BCOR, psio-oddechowy koronawirus (betakoronawirus); BORD, Bordetella bronchiseptica CAV, adenowirus psia; CPIV, wirus psi paragrypy; CPNV, pneumowirus psi; DISTA/B, wirus psi pomory A i B; EADV1/2, adenowirus koni 1/2; EAV, wirus tętniczaki koni; EHV1/4, herpeswirus koni typu 1/4; ERVA/B, wirus kataru koni A/B; IVM, białko macierzy grypy A; MCYNOS, Mycoplasma cynos; MS2, kontrola wewnętrzna (fag RNA MS2); SEQU, Streptococcus equi.

Tabela 2. Mapa przeniesienia płytek. Przedstawiono mapę przeniesienia materiału między płytkami z kodowaniem kolorystycznym, umożliwiającą wykorzystanie stałej pipety 8-kanałowej do przeniesienia próbek z płytki wstępnej (preamp) o 96 dołkach do płytki o 384 dołkach. Alternatywnie można zastosować pipetę z regulowanym zakresem. Tą samą procedurę przeprowadza się każdorazowo, niezależnie od liczby próbek znajdujących się na płytce.

Plik uzupełniający. Dostarczono arkusz kalkulacyjny z obsługą makr, zawierający dwa makra służące do formatowania wyników w tabeli podsumowującej (zgodnie z opisem w protokole). W pliku (w sekcji Final Results) zamieszczono przykładową tabelę wyników wygenerowaną przez makra. Dwa makra uzupełnią nazwy próbek w pierwszej kolumnie (do 48 próbek) oraz średnią z trzech wartości Ct dla każdego celu w przypadku wyników dodatnich; należy zauważyć, że cele, które nie uległy amplifikacji, pozostają w tej tabeli puste. Tabelę tę można łatwo wydrukować na jednej kartce papieru i wykorzystać jako punkt odniesienia do efektywnej weryfikacji surowych danych. W karcie wyników końcowych (final results tab) przedstawiono reprezentatywne wyniki dla 10 próbek klinicznych i 4 kontroli. Skróty nazw testów wymieniono w legendzie do Tabela 1. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Procedura ta była stosowana do rutynowych testów patogenów układu oddechowego w naszym laboratorium w ciągu sześciu miesięcy (2-3 razy w tygodniu). Odnieśliśmy również sukces, stosując tę samą procedurę do profilowania patogenów jelitowych w próbkach kału i izolatach bakteryjnych na oddzielnie dostosowanej płytce. Po wyprodukowaniu płyt doświadczony personel może wykonać kroki 2-7 w ciągu jednego standardowego dnia roboczego. Najbardziej krytycznymi etapami są prawidłowe uszczelnienie płytki przedwzmacniacza, przeniesienie wstępnie amplifikowanych próbek między płytami (co musi być wykonane szybko, aby zapobiec parowaniu) oraz końcowe pokrycie płytki wzmacniającej. Wykorzystanie arkusza kalkulacyjnego makr jako przewodnika do analizy wyników (sprawdzanie krzywych dla próbek i kontroli) było również krytyczne, ponieważ znacznie zmniejszyło ilość czasu i papierkowej roboty potrzebnej do tego procesu. Dostarczony arkusz kalkulacyjny makr jest przykładem; Musiałby zostać zmodyfikowany lub ponownie utworzony dla płyt o różnych konfiguracjach. Może to łatwo wykonać ktoś, kto ma podstawową wiedzę na temat arkuszy kalkulacyjnych.

Ze względu na bardzo małą ilość próbki załadowanej na płytkę wzmacniającą (33 nl), wymagane jest wstępne amplifikacja. W optymalizacji tego protokołu (nie pokazano) porównaliśmy szereg parametrów przedwzmacniacza, w tym miks główny, dodanie losowych starterów, liczbę cykli, czas wyżarzania i rozcieńczenie przed amplifikacją. Każdy cel miał swoje własne optymalne warunki, a te opisane tutaj reprezentują te, które dały najlepszą ogólną granicę wykrywalności dla naszego panelu. Panel ten obejmuje szeroki zakres patogennych celów i typów próbek, które są spotykane w rutynowych weterynaryjnych testach diagnostycznych, ale modyfikacje procedur wstępnego amplifikacji mogą być konieczne dla różnych paneli. Zoptymalizowane przez producenta warunki amplifikacji są oparte na standardowym protokole PCR w czasie rzeczywistym opartym na sondzie z 10-minutową aktywacją enzymatyczną w temperaturze 95 °C, a następnie denaturacją w temperaturze 95 °C i wyżarzaniem/przedłużaniem w temperaturze 60 °C. Startery i sondy są wstępnie drukowane na płytach również w warunkach zoptymalizowanych przez producenta, dzięki czemu nie wymagają miareczkowania. Połączenie etapów odwrotnej transkrypcji i wstępnej amplifikacji dla wszystkich próbek (niezależnie od rodzaju celu) było konieczne w celu utrzymania wydajności przepływu pracy. Odwrotna transkrypcja wszystkich próbek jest również korzystna dla maksymalizacji czułości. Co więcej, zastosowanie miksu głównego dla przedwzmacniacza, który jest zoptymalizowany pod kątem minimalizacji inhibitorów, pozwala na wszechstronność w łączeniu różnych typów próbek na tej samej płycie.

Test matrycy grypy Centrum Kontroli Chorób (CDC) opisany przez Shu i wsp.⁷ i dostosowany tutaj do reakcji w skali nanolitrów jest uniwersalny test na grypę A, który jest odpowiedni do testowania próbek od ludzi i zwierząt towarzyszących. Został zaprojektowany do uniwersalnego wykrywania genu macierzy wszystkich wirusów grypy A za pomocą reakcji w skali mikrolitrów. Jest on stosowany na całym świecie jako część Panelu CDC ds. Wirusa Grypy Ludzkiej oraz Panelu CDC ds. Wirusa Świńskiej Grypy. Zaadaptowany tutaj test EHV-1⁸ wykrywa ważny patogen układu oddechowego koni, który może powodować poronienia i choroby neurologiczne (sprawdzone przez Pusterla i Hussey¹⁰). Znaczenie dostosowania tych testów do platformy o wysokiej przepustowości z niezależną od gatunku kontrolą wewnętrzną polega na tym, że można je włączyć do podejścia do nadzoru OneHealth. Posiadanie obu tych testów na platformie testowej o wysokiej przepustowości ułatwi gotowość na wypadek sytuacji awaryjnych w placówkach klinicznych, schroniskach i wydarzeniach związanych z występami.

Wyniki opisane powyżej były reprezentatywne dla wszystkich celów na płytce, z wyjątkiem Mycoplasma cynos, który wykazał znacznie większą zmienność w wydajności analitycznej. Było to prawdopodobnie spowodowane nieoptymalną temperaturą topnienia (T_m) starterów, która powinna wynosić 58-60 °C (idealna sonda Tm to 68-70 °C). Ograniczeniem tej platformy jest to, że zaprojektowanie i wyprodukowanie płytek zajmuje więcej czasu niż zamówienie pojedynczych sond, co ogranicza możliwość szybkiej modyfikacji sekwencji. Innym ograniczeniem PCR w czasie rzeczywistym jest brak możliwości wykrycia nowych lub nieoczekiwanych patogenów. Można to do pewnego stopnia przezwyciężyć, projektując testy, które pasują do sekwencji u wielu gatunków, ale bezstronne metodologie oparte na sekwencjonowaniu całego genomu są bardziej odpowiednie do odkrywania nowych czynników. ^{Pytania z dnia 11,12}

Nanoskalowy PCR w czasie rzeczywistym pozwala na nowy paradygmat testowania opartego na syndromie, a nie na gatunkach, co jest przydatne do zmniejszania kosztów odczynników i pracy w wysokoprzepustowej diagnostyce molekularnej. Testy panelowe na dużą skalę przy użyciu tego podejścia mogą ułatwić wysiłki związane z nadzorem OneHealth, takie jak te opisane przez Dunne'a i Gurfielda¹³ oraz Moutaillera i wsp.¹⁴. Wczesne pobranie próbek wymazów, zwykle w ciągu 3 dni od wystąpienia objawów klinicznych, daje najlepszą szansę na zidentyfikowanie obecności patogenów układu oddechowego. Pojawienie się chorób zakaźnych jest często nieprzewidywalne, a testy, które można przeprowadzić na różnych gatunkach bez konieczności modyfikacji odczynników, są idealne do przygotowania się. Przyszłe zastosowania tej technologii będą prawdopodobnie dotyczyły patotypowania, profilowania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe oraz dalszych klinicznych paneli diagnostycznych opartych na syndromach. Nanoskalowy PCR w czasie rzeczywistym jest najbardziej przydatny do szybkich, wysokoprzepustowych badań przesiewowych wielu próbek i typów patogenów i byłby uzupełniony bezstronnymi lub częściowo stronniczymi podejściami opartymi na sekwencjonowaniu do identyfikacji nowych i pojawiających się patogenów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik lityczny Zap-OGlobin II	Beckman Coulter	7546138	Opcjonalny odczynnik do przygotowania próbek krwi.
Zestaw do ekstrakcji (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	AM1840	Można zastąpić inne zestawy ekstrakcyjne odpowiednie dla pożądanych typów próbek. Ten zestaw jest dostarczany z PBS, buforem do lizy i buforem do płukania.
2x Jednoetapowa mieszanka RT-qPCR (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)	Quanta Biosciences	95134-500
Pula starterów specyficzna dla genu	IDT	na zamówienie niestandardowe	Może być generowana przez użytkownika lub kupowana z płytkami wzmacniającymi.
Losowa mieszanka starterów	New England Biolabs	S1330S
Standardowa 96-dołkowa płytka	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	N8010560	Może to być dowolna płytka, która pasuje do używanej konwencjonalnej maszyny do PCR.
Amplification master mix (OpenArray master mix)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4462164
Przezroczysta uszczelka samoprzylepna	Thermo-Fisher	430611
Uszczelka foliowa	Excel Scientific	AF-100
384-dołkowa	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4482221
Płytka wzmacniająca (płytka QuantStudio 12K Flex OpenArray)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4470813	Może być dostosowany do dowolnych testów zgodnych ze standardowymi warunkami TaqMan.
Zestaw akcesoriów	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4469576	Zawiera pokrywki etui, zatyczki i płyn zanurzeniowy.
Końcówki AccuFill	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457246
Amplifikator (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4471090
Liquid handler (OpenArray AccuFill System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457243	Jest on kupowany wraz z amplifikatorem.
Oprogramowanie do projektowania podkładów (Primer Express)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4363991	Szczegółowe specyfikacje podkładu i sondy można znaleźć w instrukcjach producenta.
Program do analizy obrazu (ImageJ)	NIH		Dostępne w http://imagej.nih.gov/ij/
Program arkusza kalkulacyjnego (Excel)	Microsoft		Dostępne pod adresem https://products.office.com/en-us/excel
DMEM	Thermo-Fisher/Gibco	11965-092
Zaburzacz tkankowy (TissueLyser II)	Qiagen	85300
Konwencjonalny termocykler (Veriti)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4375786	Można użyć dowolnego konwencjonalnego termocyklera z podgrzewaną pokrywą.
Wirówka do płytek PCR	VWR	89184-608	To urządzenie ma tylko jedną prędkość (2,500 obr./min); wirnik uruchamia się, gdy pokrywa jest zamknięta i zatrzymuje się po naciśnięciu przycisku.
Bufor TE	Milipore	8890-100ML	10 mM chlorowodorek tris(hydroksymetylo)aminometanu, 1 mM Kwas etylenodiaminotetraoctowy, pH 8,0