Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Summary

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem mutacji termostabilizujących, oczyścić ludzki transporter serotoniny, wygenerować przeciwciała o wysokim powinowactwie i skrystalizować kompleks transporter-przeciwciało serotoniny związany z lekiem przeciwdepresyjnym S-citalopram. Protokół ten można dostosować do badania innych trudnych transporterów błonowych, receptorów i kanałów.

Abstract

Transporter serotoniny to transporter sprzężony z sodem i chlorkiem, który "pompuje" zewnątrzkomórkową serotoninę do komórek. S-citalopram jest lekiem stosowanym w leczeniu depresji i lęku poprzez wiązanie się z transporterem serotoniny o wysokim powinowactwie, blokującym wychwyt zwrotny serotoniny. Tutaj przedstawiamy skuteczną procedurę i zestaw narzędzi do stabilizacji, ekspresji, oczyszczania i krystalizacji kompleksów transporter-przeciwciało serotoniny związanych z S-citalopramem i innymi lekami przeciwdepresyjnymi. Mutacje, które stabilizują transporter serotoniny, zidentyfikowano za pomocą testu wiązania S-citalopramu. Transporter serotoniny ulegający ekspresji ^{w komórkach} GnTI transduk HEK293S owanych przez bakulowirusa został odtworzony w proteoliposomach i wykorzystany do wytworzenia przeciwciał o wysokim powinowactwie. Opracowaliśmy strategię odkrywania przeciwciał, które są przydatne w badaniach strukturalnych. Ustalono również proste podejście do ekspresji fragmentów przeciwciał w komórkach Sf9. Oczyszczone za pomocą tej procedury kompleksy transporter-przeciwciało zachowują się dobrze i łatwo krystalizują, wytwarzając kompleksy z S-citalopramem, które załamują promieniowanie rentgenowskie do rozdzielczości 3-4 A. Opracowane w ten sposób strategie można wykorzystać do określenia struktury innych trudnych białek błonowych.

Introduction

Transporter serotoniny (SERT) jest integralnym białkiem błonowym, które ułatwia transport serotoniny przez błony komórkowe¹. SERT należy do rodziny symporterów neuroprzekaźników sodu (NSS), która obejmuje również transportery dopaminy i noradrenaliny². SERT jest celem molekularnym powszechnie przepisywanych leków przeciwdepresyjnych i przeciwlękowych, które działają w celu konkurencyjnego hamowania transportu serotoniny³. SERT wykorzystuje energetycznie korzystny kotransport sodu do usuwania neuroprzekaźnika ze szczeliny synaptycznej. Obszerna charakterystyka układu serotoninergicznego wykazała, że zmiany w metabolizmie serotoniny wydają się wpływać na praktycznie wszystkie procesy neurologiczne, w tym nastrój, sen, ból, funkcje poznawcze i zachowania^agresywne. Funkcja SERT może być modyfikowana poprzez stosowanie leków przeciwdepresyjnych i selektywnych inhibitorów wychwytu zwrotnego serotoniny (SSRI), takich jak S-citalopram, a także przez psychostymulanty i narkotyki uzależniające, takie jak amfetamina i 3,4-metylenodioksy-N-metyloamfetamina lub "ecstasy"^1,2.

SSRI są niezwykle ważne w leczeniu zaburzeń nastroju, jednak dokładne strukturalne podstawy ich działania nie są dobrze poznane. WT SERT jest niestabilny w micelach detergentowych, co utrudnia postęp w kierunku trójwymiarowej (3D) struktury SERT^5,6. Ostatnio opracowaliśmy warianty Sert , które są solidnie stabilne w szerokiej gamie detergentów i zachowują aktywność wiążącą SSRI⁶. Te termostabilne warianty SERT zostały wybrane za pomocą scyntylacyjnego testu termostabilności opartego na bliskości. Tutaj opisujemy procedurę wytwarzania przeciwciał o wysokim powinowactwie, które mogą wiązać SERT, oraz oczyszczania i krystalizacji termostabilnego SERT w kompleksie z przeciwciałem i S-citalopramem.

Ten protokół zakłada, że geny SERT i 8B6 zostały pomyślnie sklonowane odpowiednio do wektorów ekspresyjnych BacMam⁷ i owadów. Aby wytworzyć przeciwciała, reszty kodujące cDNA 73-616 WT SERT sklonowano do wektora BacMam za pomocą C-końcowego znacznika Strep II (SERT_IC). Do badania termostabilności użyto pozostałości SERT 73-616 z C-końcowym GFP, Strep II i znacznikami 10-His (SERT_TC). Poszczególne mutacje punktowe zostały wygenerowane w tle SERT_TC. Do protokołu krystalizacji białko fuzyjne SERT-GFP zastosowano ze znacznikami Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys(GlyGlyGlySer)₂GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] i 10-His, przenoszącymi termostabilne mutanty, Y110A, I291A i T439S oraz mutacje cystein powierzchniowych C554A, C580A i C622A (SERT_CC). Sekwencje rozszczepienia trombiny (LVPRGS) zostały również wprowadzone do SERT_CC po Q76 i T618, aby umożliwić usunięcie N- i C-końców. Plazmid kodujący 8B6 Fab został zaprojektowany do ekspresji zarówno ciężkich, jak i lekkich łańcuchów przeciwciała z sekwencjami wydzielania GP67 pod kontrolą dwóch oddzielnych promotorów poliedryny. C-koniec ciężkiego łańcucha przeciwciała 8B6 został oznaczony znacznikiem 8-His, a miejsce rozszczepienia trombiny zostało wprowadzone między ciężki łańcuch a znacznik.

Protocol

1. Transfekcja przylegających HEK293S ogniw GnTI do ekranu termostabilności

1. Przygotować 96-dołkowe płytki pokryte poli-D-lizyną (PDL). Wszystkie prace należy wykonywać w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.
   1. Przefiltrować roztwór 25 μg/ml (PDL) o masie cząsteczkowej 70 000-150 000 Da, używając sterylnego filtra 0,2 μm. Dodać 50 μl PDL do każdego dołka na 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej (TC), upewniając się, że dno jest równomiernie pokryte, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   2. Odessać roztwór PDL i przemyć 200 μl sterylnej wody.
   3. Pozostawić płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez 2 godziny przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C. Płytki powlekane PDL można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
2. Trypsynizacja przylegających komórek HEK293S.
   1. Rosną HEK293S do 80% konfluencji w 10-centymetrowym naczyniu utrzymywanym w temperaturze 37 °C z 8% CO₂ . Pojedyncza 10-centymetrowa miska powinna mieć około 10 milionów HEK293S komórek. Nie używaj komórek po 30 przejściach!
   2. Odessać pożywkę i przemyć 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodać 1 ml roztworu trypsyny-EDTA (0,25% trypsyny, 0,02% EDTA) do komórek i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.
   3. Dodać 10 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i ponownie zawiesić komórki, wielokrotnie pipetując w górę iw dół za pomocą pipety serologicznej.
   4. Odpipetować 10 μl komórek i wymieszać z 10 μl roztworu błękitu trypanowego (0,4%). Określ gęstość komórek za pomocą hemocytometru i mikroskopu świetlnego. Nie licz komórek, które są zabarwione na niebiesko, ponieważ są martwe. Upewnij się, że żywotność komórek przekracza 90%.
3. Dokładnie zawiesić trypsynizowane HEK293S komórki GnTI w DMEM uzupełnionym 10% FBS do gęstości 0,5 x 10⁶ komórek/ml w jednorazowym zbiorniku na pipety. Na każdą płytkę potrzeba około 5 milionów HEK293S komórek. Za pomocą tego protokołu można transfekować łącznie 24 konstrukty na każdej płytce.
4. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 μl komórek do każdego dołka płytki pokrytej PDL. Po napełnieniu każdej płytki należy ponownie zawiesić komórki w zbiorniku pipety, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 8% CO₂ . Po 24 godzinach komórki powinny osiągnąć około 80% zbieżności.
5. 1 godzinę przed transfekcją wymienić pożywkę. Przygotować kompleksy odczynników do transfekcji DNA do transfekcji.
   1. Dla każdego konstruktu w tle SERT_TC, który ma być poddany badaniom przesiewowym, wymieszaj 450 ng DNA z 45 μl DMEM bez surowicy i wymieszaj. Dodać 1,6 μl odczynnika do transfekcji do 45 μl DMEM bez surowicy i wymieszać.
   2. Natychmiast dodać rozcieńczony roztwór odczynnika do transfekcji do roztworu DNA i wymieszać. Nie mieszaj roztworów w odwrotnej kolejności. Odczekaj 10 - 15 minut i dodaj 20 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji/DNA do 4 dołków.
6. Po transfekcji wszystkich studzienek wymieszać płytkę, delikatnie kołysząc ją w przód i w tył, a następnie powrócić do inkubatora o temperaturze 37 °C.
7. Po 16 - 24 godzinach zastąp pożywkę DMEM zawierającą surowicę i 10 mM maślanu sodu.
8. Około 48 godzin po transfekcji usunąć pożywkę i natychmiast przystąpić do badania termostabilnego lub zamrozić komórki w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Komórki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.

2. Scyntylacyjny ekran termostabilny oparty na zbliżeniu z S-citalopramem

1. Inkubować komórki z 200 nM S-citalopramem w 25 μl TBS (sól fizjologiczna buforowana trisem — 20 mM tris, pH 8, 100 mM NaCl) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Rozpuścić komórki, dodając 25 μl 8 mM n-dodecylo-β-D-maltopyranozydu (C12M), 1 mM hemmibursztynianu cholesterolu (CHS), koktajlu inhibitorów proteazy (2 mM fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF), 0,1 mg/ml aprotyniny, 4 g/ml pepstatyny A i 4 μg/ml leupeptyny) w TBS i inkubując przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Dodaj 50 μl TBS z 20 nM [³H]citalopramem (81,7 Ci/mmol), 0,1% albuminą surowicy bydlęcej i 2 mg/ml kulek zbliżeniowego powinowactwa do scyntylacji (SPA) do trzech studzienek dla każdego konstruktu. Do ostatniego dołka dodać ten sam roztwór, ale uzupełnić 100 μM sertraliną, aby określić niespecyficzne wiązanie. Upewnij się, że kulki SPA o powinowactwie His-tag są dokładnie wymieszane podczas dodawania do płytki 96-dołkowej.
4. Zmierz wiązanie [³H]citalopram za pomocą 96-dołkowego licznika scyntylacyjnego w RT z 1-minutowym czasem liczenia na dołek. Kontynuuj liczenie płytek, aż całkowita liczba ustabilizuje się (mniej więcej po 36 godzinach).
5. Podgrzewać płytki przez 15 minut w bloku grzewczym z podgrzewaną pokrywką w temperaturze 33 °C. Zmierzyć [³H]citalopram wiążący ponownie po podgrzaniu, jak opisano w 2.4.
6. Powtórz krok 2.4 - 2.5 i zmień etap ogrzewania na 36 °C, 39 °C, 45 °C, 48 °C i 51 °C. Dostosuj temperaturę ogrzewania w zależności od pozornej temperatury topnienia (Tm) białka docelowego i termostabilności najbardziej stabilnej konstrukcji. Kontynuuj podgrzewanie płyt, aż wszystkie konstrukcje będą miały niską liczbę właściwą.
7. Analizuj dane, aby określić wartości Tm.
   1. Określ średnią całkowitą liczbę na minutę (CPM) każdego konstruktu dla studzienek, które nie zawierają sertraliny, uśredniając 3 dołki replikacji. Określ niespecyficzny CPM, uśredniając CPM każdej studzienki zawierającej sertralinę na jednej płytce.
   2. Obliczanie określonego CPM przez odjęcie nieokreślonego CPM od całkowitego CPM.
   3. Oblicz Tm przez nieliniowe dopasowanie do funkcji sigmoidalnej Boltzmanna. Konstrukcje z niskim CPM właściwym na poziomie RT (<10% WT) zazwyczaj nie mają dokładnych wartości Tm. Mutacje z najbardziej termostabilnych konstruktów mogą być łączone ze sobą i badane pod kątem addytywnego wzrostu termostabilności.

3. Ekspresja ludzkiego transportera serotoniny w komórkach HEK293S GnTI

1. Przekształć chemicznie kompetentne komórki DH10Bac za pomocą 1 ng plazmidu.
   1. Dodaj plazmid do 50 μl komórek DH10Bac i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
   2. Szok termiczny Komórki DH10Bac w temperaturze 42 °C przez 30 sek. Dodać 200 μl pożywki SOC i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny z wytrząsaniem.
   3. Umieść wszystkie bakterie na płytce Luria Bulion (LB) zawierającej 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny, 10 μg/ml tetracykliny, 100 μg/ml 5-bromo-3-indolylu β-D-D-galaktopyranozydu i 40 μg/ml izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG).
2. Izolować kolonie lacZ (białe kolonie) uprawiane w temperaturze 37 °C przez 2 dni na płytkach agarowych LB.
3. Hodować kilka kolonii O/N w temperaturze 37 °C w 5 ml LB zawierającego antybiotyki i wyizolować DNA bakterii.
   1. Odwirować bakterie w ilości 1 000 x g w wirówce przez 5 minut. Wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić bakterie za pomocą 200 μl buforu do reprodukcji miniprep.
   2. Poddaj bakterie lizie, delikatnie 10 razy dodając 200 μl buforu do lizy miniprep i probówkę odwracającą. Dodać 200 μl buforu neutralizującego.
   3. Usunąć nierozpuszczalną frakcję, wirując w temperaturze 14 000 x g przez 10 minut w wirówce. Dodać 1 ml izopropanolu do supernatantu i schłodzić w temperaturze -20 °C przez 20 minut w celu wytrącenia DNA.
   4. Wirować w temperaturze 14 000 x g przez 15 minut w wirówce i wyrzucić supernatant.
   5. Przemyć osad DNA 70% EtOH i ponownie wirować w temperaturze 14 000 x g przez 15 minut. Odrzucić supernatant. Suszyć DNA na powietrzu, aż cały EtOH wyparuje i ponownie zawiesić w 50 μl wody.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, DNA Bacmid należy natychmiast transfekować do komórek Sf9, ale może być również przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
4. Transfekcję bakimidowego DNA do^{1x10 6} komórek przylegającego Sf9 hodowanych w wilgotnej komorze w temperaturze 27 °C w naczyniu 6-dołkowym. Wszystkie manipulacje związane z hodowlą komórkową należy wykonywać w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.
   1. Usuń pożywkę z komórek i dodaj 2 ml świeżej pożywki Sf9. Dodać 5 μg bakmidowego DNA do 100 μl pożywki Sf9 (roztwór A).
   2. Dodać 8 μl odczynnika do transfekcji kationowo-lipidowej Sf9 do 100 μl pożywki Sf9 (roztwór B). Inkubować probówkę zawierającą roztwór B przez 5 minut.
   3. Zmieszać probówkę zawierającą roztwór A z roztworem B i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie dodać cały roztwór do komórek Sf9.
   4. Po 96 godzinach zebrać supernatant (wirus P1), przechodząc przez filtr 0,2 μm. Wirus P1 może być przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C w ciemności i w razie potrzeby ponownie wykorzystany do wytworzenia wirusa P2.
5. Dodaj 100 μl wirusa P1 do 1 l komórek Sf9 o gęstości 1 x 10⁶ komórek/ml w pożywce Sf9. Infekować komórki przez 96 godzin, rosnąc w temperaturze 27 °C na wytrząsarce z prędkością 100 obr./min.
6. Odwirować komórki w wirówce o stężeniu 4 000 x g przez 15 minut i przefiltrować supernatant zawierający cząsteczki wirusa przez filtr 0,2 μm. Wyrzuć osad komórkowy. Określ gęstość wirusa za pomocą testu płytki wirusowej lub licznika wirusów. Gęstość wirusa powinna wynosić >1 x 10⁸ cząstek wirusa na mililitr. Wirus P2 może być przechowywany w temperaturze 4 °C w ciemności i używany przez kilka miesięcy.
7. Zakażone 10 l komórek HEK293S GnTI7 rosnących w zawiesinie w temperaturze 37 °C z 8% CO₂ i wilgotnością 85% na wytrząsarce przy 130 obr./min w 293 pożywkach ekspresyjnych uzupełnionych 2% FBS przy wielokrotności infekcji (MOI) 2 i gęstości 3 x 10⁶ komórek/ml, zwykle 30 - 50 ml wirusa P2 na 800 ml komórek w kolbie z przegrodą o pojemności 2 l.
   UWAGA: Nie zaleca się stosowania więcej niż 80 ml wirusa P2^, ponieważ HEK293S komórek GnTI- będzie rosła powoli i może stać się nieżywotna z powodu zmiany pH. Pożywka Sf9 jest bardziej kwaśna niż pożywka ekspresyjna 293.
8. 12 - 16 godzin po zakażeniu, dodać maślan sodu do stężenia 10 mM z 1 M zapasu. 48 - 60 godzin po zakażeniu, zebrać komórki przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 15 min. Usunąć supernatant.
9. Zawiesić komórki w 150 ml TBS, 2 μM S-citalopramu lub innych inhibitorów SERT i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do oczyszczenia.

4. Oczyszczanie powinowactwa transportera serotoniny do immunizacji i krystalizacji

1. Rozmrozić komórki z 10 l kultury w ciepłej wodzie (około 30 °C) i ponownie zawiesić, szybko przepuszczając przez pipetę o pojemności 10 ml do uzyskania jednorodności.
2. Przygotuj roztwór detergentu do solubilizacji (150 ml): 80 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl zawierający 40 mM C12M, 5 mM CHS i koktajl inhibitorów proteazy.
3. Dodaj wszystkie komórki do zlewki z mieszadłem i dodaj cały roztwór detergentu do komórek, mieszając. Rozpuszczać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę z mieszaniem.
4. Wirować lizat przy 8 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić osad i zdekantowany supernatant do czystych probówek ultrawirówek. Wirować z prędkością 100 000 x g przez 1 godzinę w ultrawirówce. Wyrzuć osad i przefiltruj supernatant przez filtr 0,2 μm.
5. Przepuścić lizat przez 10 ml żywicy powinowactwa do Strep upakowanej w kolumnę za pomocą pompy perystaltycznej zrównoważonej w buforze do przemywania : 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, 5% glicerolu, 25 μM lipidów (1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina, 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfoetanoloamina i 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoglicerol w stosunku molowym 1:1:1) i 1 μM S-citalopram lub SSRI w TBS.
6. Podłączyć kolumnę powinowactwa do paciorkowca do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) i przemywać kolumnę z prędkością 2 ml / min z 66 ml (6,6 objętości kolumny) buforu do przemywania się. Elute oczyszczone białko w tym samym buforze uzupełnionym 5 mM destiobiotyną w tempie 0,5 ml/min przy użyciu 33 ml (objętość 3,3 kolumny) buforu. Zbierz frakcje o pojemności 1 ml; frakcje szczytowe wyniosą ~10 ml. Oczyszczone białko może być przechowywane w temperaturze 4 °C przez 2 - 3 dni, jeśli jest to pożądane.
   UWAGA: Całkowita wydajność wyniesie 3 - 4 mg SERT_CC i 1 mg SERT_IC. Absorpcja 2 j.a. przy 280 nm jest równa 1 mg/ml SERT.

5. Rekonstytucja transportera do liposomów w celu immunizacji

1. Przygotuj liposomy zawierające asolektynę: cholesterol, lipid A, lipid polarny mózgu (stosunek molowy 60:17:3:20). Rozpuścić lipidy w 1 ml chloroformu i dodać 40 mg całkowitego stężenia lipidów do szklanej kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml we wskazanym stosunku molowym.
   1. Odparowywać chloroform przez co najmniej 1 godzinę w próżni przy obracającej się kolbie okrągłodennej w ciepłej wodzie o temperaturze około 30 °C.
   2. Uwodnić lipidy, dodając 10 ml TBS. Inkubować w buforze przez 10 minut.
   3. Zamrozić lipid, umieszczając kolbę w cieczy_N2.
   4. odwilż. Zanurzyć kuliste dno kolby w zlewce wypełnionej ciepłą wodą o temperaturze około 30 °C. Sonikować w kąpieli sonikatora na 5 minut.
   5. Wirować i powtarzać kroki 5.1.3 - 5.1.4 10 razy lub do momentu, gdy lipid zostanie całkowicie zawieszony od dna i utworzy mętną zawiesinę.
   6. Wytłacz całą mieszaninę lipidów dwukrotnie przez filtry 200 nm. Lipid pojawi się jako mleczna zawiesina przed wytłaczaniem; potem będzie półprzezroczysty. Nie dodawaj całej mieszaniny lipidów do ekstrudera od razu, ponieważ może się ona zatkać, powodując utratę próbki.
   7. Wiruj lipidy w temperaturze 100 000 x g przez 20 minut i ponownie zawieś w 0,5 - 1 ml TBS w stężeniu 40 mg/mL.
2. Zagęścić oczyszczony_{SERT IC} do 250 - 500 μL za pomocą koncentratora białek wirówki MWCO o mocy 100 kDa do 2 - 4 mg / ml i nasycić liposomy 5 mM C12M. Dodać oczyszczony SERT do mieszaniny detergent:lipid w 1 ml końcowej objętości
.
3. Usuń C12M przez 3 kolejne dodatki hydrofobowej żywicy absorpcyjnej o stężeniu 80 mg/mL. Przez pierwsze 2 dodatki inkubować z żywicą na przemian przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Usunąć żywicę, przepuszczając przez watę szklaną. Wykonaj końcową inkubację z żywicą przez noc.
4. Zagęścić proteoliposomy przez odwirowanie przy 100 000 x g przez 20 minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 - 500 μl TBS.
5. Dodać 10 μM końcowego stężenia S-citalopramu do odtworzonego białka po ostatecznym usunięciu żywicy.
6. Rozpuścić 2,5 μl proteoliposomów w buforze ładującym SDS-PAGE (62,5 mM Tris, pH 6,8, 10% glicerol, 2% SDS, 0,01% błękitu bromofenolowego, 100 mM DTT) i uruchomić na żelu SDS-PAGE przy 200 V przez 1 godzinę, aby upewnić się, że SERT został pomyślnie odtworzony. Proteoliposomy mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach do długotrwałego przechowywania i rozmrażane na lodzie przed każdym szczepieniem.

6. Badania przesiewowe na obecność przeciwciał rozpoznających epitopy 3D

1. Badanie przesiewowe linii komórkowych hybrydoma za pomocą western blot. Przeciwciała, które rozpoznają SERT po western blot, prawdopodobnie wiążą liniowe epitopy i prawdopodobnie nie będą przydatne w badaniach strukturalnych.
   1. Wymieszaj 1 μg oczyszczonego SERT_IC lub SERT_CC i uruchom na 4 - 15% żelu SDS-PAGE przy 200 V przez 1 godzinę.
   2. Przenieść do membrany nitrocelulozowej o natężeniu 200 mA przez 30 minut przy użyciu buforu Towbin (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 20% (v/v) metanolu, 0,1% SDS). Membranę można suszyć i przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej.
   3. Ponownie zwilżyć membranę 10% metanolem i przepłukać PBS (10 mM fosforan, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
   4. Blok z 5% mlekiem w proszku w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Przemyć PBS i inkubować z 1 μg/ml przeciwciała w PBS z 0,1% mlekiem.
   6. Umyj obficie PBS zawierającym 0,1% Tween-20.
   7. Inkubować z kozim przeciwciałem anty-mysim sprzężonym z barwnikiem IR rozcieńczonym 1:10 000 w PBS z 0,1% Tween 20 i 0,1% mlekiem.
   8. Dokładnie umyj i zeskanuj za pomocą systemu obrazowania.
2. Zmieszaj supernatant hybrydoma zawierający zachodnie przeciwciała ujemne z białkiem 100 nM SERT_CC przy użyciu stosunku molowego 1:2 (SERT:mAb) w 200 μl TBS z 1 mM C12M, 0,2 mM CHS i 1 μM S-citalopram. Wirować przy 100 000 x g przez 20 min. Analizować supernatant zawierający kompleksy SERT-mAb i analizować za pomocą chromatografii wykluczającej z detekcją fluorescencji (FSEC)⁸. Wyrzuć granulkę.
   1. Uruchomić 100 μl supernatantu na kolumnie wykluczającej wielkość z prędkością 0,5 ml/min przy użyciu systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) wyposażonego w detektor fluorescencyjny (wzbudzenie: 480 nm, emisja: 510 nm) przy użyciu działającego buforu zawierającego TBS, 0,4 mM glikolu neopentylowo-maltozowego laurylu i 1 μM S-citalopramu. Przeciwciała, które tworzą kompleksy, spowodują, że białko fuzyjne GFP zostanie wymywane wcześniej niż wolny transporter z kolumny wykluczającej rozmiar.
   2. Rozcieńczyć kompleksy do 10, 1, 0,1 nM w 200 μL TBS z 1 mM C12M, 0,2 mM CHS i 1 μM S-citalopram i ponownie uruchomić FSEC. Przeciwciała, które nadal mogą przesuwać pik transportera przy niskich stężeniach nanomolowych, są spoiwami o wysokim powinowactwie i dobrymi kandydatami do badań strukturalnych.
3. Powtórz test wiązania przez FSEC w obecności 1 mM serotoniny. Przeciwciała, które specyficznie rozpoznają konformację związaną z SSRI, nie będą wiązać się w obecności substratu. Przeciwciała, które rozpoznają epitop 3D, który nie zmienia się w wyniku konformacji, zwiążą się niezależnie od obecnego liganda.
4. Wymieszaj parami różne kombinacje przeciwciał i test wiązania przez FSEC. Przeciwciała, które rozpoznają różne epitopy, spowodują wcześniejszą elucję SERT po połączeniu w porównaniu z wiązaniem pojedynczego przeciwciała.
5. Do wstępnych badań strukturalnych wybierz przeciwciała o najwyższym powinowactwie, które rozpoznają epitopy 3D.

7. Ekspresja fragmentu przeciwciała w komórkach Sf9

1. Sklonuj zmienne i stałe domeny Fab metodą PCR do systemu ekspresji owadów w celu ekspresji w komórkach Sf9 przy użyciu standardowych protokołów.
2. Transfekcja 1 x 10⁶ komórek Sf9 z 5 μg DNA Bacmid kodującego lekkie i ciężkie łańcuchy 8-His oznaczonego 8B6 Fab sekwencją wydzielania GP67 (zgodnie z sekcją 3.4).
3. Zebrać wirusa P1 96 godzin po transfekcji i dodać 500 μl wirusa P1 do 1 l komórek Sf9 o gęstości 1 x 10⁶ komórek/ml w kolbie o pojemności 2 litrów, aby uzyskać wirusa P2. Infekować komórki przez 96 godzin w temperaturze 27 °C.
4. Zebrać wirusa P2 (zgodnie z sekcją 3.6).
5. Zakażone 6 l komórek Sf9 o gęstości 2 - 3 x 10⁶ komórek/ml MOI 2 z wirusem P2, zwykle 40 - 50 ml na kolbę z 1 litrem komórek Sf9 w każdej kolbie o pojemności 2 litrów.
6. Zbierz komórki około 96 godzin po zakażeniu. Dodać do komórek 50 ml buforu fosforanowego o pH 8 i końcowym stężeniu 50 mM i wirować w temperaturze 4000 x g przez 20 minut. Wyrzuć osad ogniwa i przefiltruj supernatant przez styczną celę przepływową filtra 0,2 μm. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 dni, jeśli jest to pożądane.

8. Oczyszczanie fragmentów przeciwciał z supernatantu Sf9

1. Stężyć supernatant Sf9 za pomocą celi o odcięciu masy cząsteczkowej (MWCO) o masie cząsteczkowej 30 kDa do około 400 - 800 ml.
2. Dodać imidazol o pH 8 przy końcowym stężeniu 10 mM i 10 ml żywicy o powinowactwie do His-tag. Mieszać w zlewce przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
3. Zebrać żywicę o powinowactwie His-tag przez odwirowanie w stężeniu 2 000 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant.
4. Zapakuj żywicę powinowactwa His-tag do kolumny i podłącz do FPLC.
5. Przemyć żywicę powinowactwa His-tag z prędkością 2 ml/min 66 ml (objętość 6,6 kolumny) o 50 mM fosforanie pH 8, 150 mM NaCl, 25 mM imidazolu.
6. Elute 8B6 Fab w 33 ml 50 mM fosforanu pH 8, 150 mM NaCl, 250 mM imidazolu. Zbierz frakcje o pojemności 1 ml.
7. Rozcieńczony Fab oczyszczony z powinowactwa z 10-krotną objętością lodowatego octanu 20 mM o pH 5.
8. Zwiąż Fab z kolumną kationowymienną o pojemności 1 ml za pomocą pompy perystaltycznej o prędkości 1 ml/min.
9. Oddziel Fab za pomocą 30 ml gradientu liniowego NaCl (0 - 500 mM) w octanie 20 mM o pH 5,5 za pomocą FPLC. Fab będzie eluować jako pojedynczy pik przy ~300 mM NaCl.
10. Przeprowadzić analizę na 12,5% żelu SDS-PAGE przy użyciu buforu próbki zawierającego 100 mM DTT. Ciężkie i lekkie łańcuchy 8B6 Fab będą pracować odpowiednio z prędkością 27 i 25 kDa na redukcyjnym żelu SDS-PAGE.
11. Frakcje zbiorcze zawierające Fab i koncentrat do co najmniej 10 - 15 mg/ml za pomocą koncentratora białka MWCO o stężeniu 30 kDa w wirówce kubełkowej wahadłowej o sile 3 000 x g.
12. Dostosuj do pH 8, dodając 1 M Tris pH 8 do końcowego stężenia 50 mM i przechowuj oczyszczony Fab przez długi czas w temperaturze 4 °C. Całkowita wydajność wyniesie 25 - 30 mg. Absorbancja 1,4 j.a. przy 280 nm jest równa 1 mg/ml 8B6 Fab.

9. Tworzenie kompleksów transporter-przeciwciało i rozdzielanie przez chromatografię wykluczającą wielkość

1. W celu krystalizacji należy oczyścić SERT_CC za pomocą chromatografii powinowactwa do paciorkowców w C12M, jak opisano wcześniej (sekcja 4).
2. Trawić trombiną w celu usunięcia znaczników (1:100 w/w) i EndoH (1:10 w/w) O/N przy RT. Skoncentrować do 250 - 300 μL za pomocą koncentratora białka wirówki MWCO o stężeniu 100 kDa do stężenia białka 10 mg/ml.
3. Zmieszać skoncentrowany SERT z Fab w stosunku molowym 1:1,2 w objętości mniejszej niż 500 μL. Odwirować przy 100 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min. Zebrać supernatant zawierający kompleks SERT-Fab. Wyrzuć granulkę.
4. Rozdzielać metodą chromatografii wykluczania według wielkości (SEC) przy użyciu FPLC na kolumnie wykluczającej wielkość zrównoważoną w TBS uzupełnionej 40 mM n-oktylo-β-D-maltozydem (C8M), 0,5 mM CHS, 5% glicerolu, 25 μM lipidu (tak samo jak w kroku 4.5) i 1 μM S-citalopram w stężeniu 0,5 ml/min.
5. Zebrać frakcje 0,5 ml i przeanalizować na 4 - 15% żelach SDS-PAGE, a także za pomocą fluorescencji tryptofanu metodą SEC. SERT oznaczony GFP będzie działał przy około 80 kDa na żelu SDS-PAGE. Po usunięciu końcówek i cukrów sprzężonych z N będzie działać jako białko o masie 45 kDa.
6. Określić, które frakcje należy połączyć, łącząc tylko te frakcje, które są monodyspersyjne, jak oceniono na podstawie analizy frakcji za pomocą fluorescencji tryptofanu SEC (wzbudzenie: 280, emisja: 335 nm).
7. Oczyszczony kompleks SERT-8B6 należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.

10. Krystalizacja kompleksów transporter-przeciwciało przez wiszącą kroplę

1. Przed krystalizacją należy zagęścić frakcje pikowe z separacji SEC kompleksu SERT-8B6 do 2 mg/ml za pomocą koncentratora białek wirówki MWCO o mocy 100 kDa. Absorbancja 2 j.a. przy 280 nm jest równa 1 mg/ml.
2. Dodaj dodatkowy Fab w stosunku 1:0,05 complex:free Fab. Dodaj 10 μM wolnego S-citalopramu.
3. Wirować przy 100 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Zebrać supernatant zawierający kompleks SERT-Fab. Wyrzuć granulkę.
4. Ustawić wiszący 24-dołkowy ekran w temperaturze 4 °C zgodnie z tabelą 1. Hoduj kryształy o jakości dyfrakcyjnej na roztworach zbiornikowych zawierających 100 mM Tris-NaOH, pH 8,5, 25 - 125 mM KCl, 32,5 - 34% PEG 400 i 0,5% kwasu 6-aminoheksanowego.
   UWAGA: Jako bufor należy stosować Tris dostosowany z NaOH do pH 8,5. Nie stosować bazy Tris wyregulowanej HCl. Sito można przygotować w probówkach o pojemności 2 ml i używać do końca. Zadbaj o dokładne pipetowanie PEG 400 za pomocą pipety wyporowej, ponieważ jest ona wyjątkowo lepka!
   1. Odpipetować 500 μl roztworu z każdego zbiornika na niskoprofilowej płytce 24-dołkowej z uszczelniaczem nałożonym na każdą studzienkę. Odpipetować 1,5, 1,75 i 2 μl kompleksu SERT-8B6 na 18 mm szkiełko nakrywkowe ze szkła silikonowanego. Odpipetować 1 μl roztworu rezerwuarowego na próbkę białka.
      UWAGA: Płyta została zakupiona z uszczelniaczem już nałożonym na krawędź studni.
   2. Przyłóż szkiełko zakrywające do 24-dołka z kroplami skierowanymi w stronę roztworu zbiornika i natychmiast uszczelnij, dociskając szkiełko przykrywkowe do szczeliwa wstępnie nałożonego do każdej studzienki.
   3. Kontynuuj, aż wszystkie 24 dołki zostaną ustawione.
   4. Gotową płytę pozostawić w dobrze izolowanym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C. Nie przeszkadzaj talerzom przez co najmniej 3 dni
      UWAGA: Monokryształy pojawią się w ciągu około 3 dni i urosną do 100-175 μm po 14 dniach.
5. Zbieraj kryształy w kriopętlach i bezpośrednio schładzaj w cieczy_N2 przed zebraniem danych dyfrakcji rentgenowskiej.
6. W razie potrzeby znajdź dodatkowe warunki krystalizacji poprzez szerokie przesiewanie z wiszącymi kroplami. Użyj trzech kropli o proporcjach białko do strącania 2:1, 1,5:1, 1:1. Jeśli robot jest dostępny, umieść 100-150 nL kropli na 70 μl roztworu rezerwuarowego na 96-dołkowej płytce. Większe kryształy 3D można hodować w 24 dołkach.
7. Wynik na podstawie wyglądu kropli: 0, przezroczysty; 1, pył; 2, osad ziarnisty; 3, separacja faz; 4, mikrokrystaliczny; 5, igły; 6, płytki; 7, kryształy 3D.
8. Ustaw krystalizację metodą zawieszania kropli w 24 dołkach, jak opisano powyżej, wokół nowo zidentyfikowanych warunków.

Results

Biblioteka jednopunktowych mutantów_{w tle TC} SERT została stworzona w celu przesiewania mutacji termostabilizujących. Poszczególne mutanty zostały wygenerowane przy użyciu standardowej mutagenezy. Protokół przesiewowy wykorzystuje przejściowo transfekowane komórki HEK293S i scyntylacyjne badanie termostabilności oparte na bliskości w celu szybkiej identyfikacji przydatnych mutacji do krystalizacji, jak opisano na rysunku 1A. Wykreślenie wartości Tm w stosunku do związanego [³H] citalopramu w RT ujawnia konstrukty o wysokiej termostabilności i poziomach ekspresji odpowiednich do oczyszczania białek (Figura 1B). Trzy mutanty (Y110A, I291A i T439S) połączono w celu wygenerowania wysoce stabilnego konstruktu (ryc. 1C). Termostabilność jest również skorelowana ze zwiększoną stabilnością w detergentach o krótkich łańcuchach, niezbędnych do krystalizacji kompleksu SERT-Fab.

Duża ekspresja ludzkiego SERT za ^{pomocą transdukowanych} przez bakulowirusa HEK293S komórkach GnTI- może potrzebować mniej niż 2 tygodnie i może wytwarzać miligramowe ilości, jak pokazano na rysunku 2A. Zastosowanie białka SERT_CC znakowanego GFP pozwala na wygodne śledzenie SERT podczas ekspresji i oczyszczania przez fluorescencję (Figura 2B). Nasza strategia oczyszczania obejmowała: 1) solubilizację SERT związanego z S-citalopramem z komórek HEK293S GnTI^- w C12M w obecności CHS jako stabilizującego lipidu; 2) wiązanie SERT z macierzą powinowactwa do paciorkowca; 3) usuwanie białek zanieczyszczających poprzez intensywne mycie; oraz 4) elucja funkcjonalnego SERT z buforem zawierającym destiobiotynę (ryc. 2C). Wymyte białko jest w dużej mierze wolne od innych wykrywalnych białek przez barwienie na niebiesko Coomassie i monodyspersję, zgodnie z oceną FSEC (Figura 2D, E).

Podobną strategię zastosowano w celu oczyszczenia SERT za pomocą znacznika Strep II, który był używany do rekonstytucji i immunizacji (Rysunek 3A, B). Włączenie SERT do proteoliposomów zwiększa okres półtrwania i stabilność SERT w surowicy oraz zwiększa prawdopodobieństwo wyizolowania przeciwciał o wysokim powinowactwie. Ponadto włączenie lipidu A, składnika ściany komórkowej bakterii, służy jako silny adiuwant⁹. Liposomy wielopłytkowe przygotowano przez dodanie buforu do wysuszonej mieszaniny lipidów w szklanych probówkach i ponownie zawieszono w buforze. Ekstruzja liposomów przez filtry o wielkości porów 200 nm wytwarza monodyspersyjne, jednowarstwowe zawiesiny liposomalne. Liposomy są następnie nasycane detergentem, a następnie dodawane jest oczyszczony SERT do detergentu. Na koniec detergent jest usuwany przez dodanie hydrofobowej żywicy absorpcyjnej do mieszaniny lipidów i detergentów. Do odtworzonej próbki należy dodać dodatkowy ligand w celu wybrania przeciwciał, które rozpoznają konformację związaną z lekiem przeciwdepresyjnym. Obecność SERT w proteoliposomach należy potwierdzić przez solubilizację małej próbki za pomocą barwnika ładującego SDS-PAGE lub C12M i uruchomienie na SDS-PAGE i FSEC (Figura 3C, D).

Linie komórkowe hybrydoma wykazujące ekspresję przeciwciał SERT mogą być badane pod kątem spoiw o wysokim powinowactwie, które rozpoznają epitopy 3D. Właściwości te mają kluczowe znaczenie dla ostatecznego powodzenia krystalizacji, ponieważ przeciwciało musi pozostać mocno związane z ustrukturyzowanym regionem, aby promować upakowanie kryształów w jednorodne, dobrze uporządkowane domeny. W pierwszym etapie identyfikowane są przeciwciała, które rozpoznają obszary nieustrukturyzowane. SERT jest denaturowany i osuszany na membranie nitrocelulozowej; przeciwciała, które wiążą zdenaturowany SERT, będą zachodnio-dodatnie i prawdopodobnie rozpoznają liniowe epitopy. Na rysunku 4A pokazujemy 2 przykłady przeciwciał, które są zachodnio-dodatnie i prawdopodobnie nie są przydatne do promowania krystalogenezy. Na rysunku 4B pozostałe przeciwciała zachodnio-ujemne są inkubowane ze 100 nM SERT-GFP i rozdzielane przez FSEC. Przeciwciała, które wiążą SERT, przesuną pik GFP-dodatni do wcześniejszej pozycji. Kompleksy SERT-przeciwciało można dalej rozcieńczać w detergencie w celu określenia, czy mogą wiązać się z powinowactwem nanomolowym, a następnie analizować za pomocą FSEC. Dodanie serotoniny powoduje zmiany konformacyjne w transporterze, a zatem przeciwciała mogą być ponownie badane w celu ustalenia, czy mogą specyficznie rozpoznać konformację związaną z SSRI. Na rysunku 4C pokazano, że przeciwciała wiążą SERT w obecności serotoniny, co pokazuje, że epitop (epitopy) nie zmieniają się ze stanu SSRI do stanu związanego z substratem. Wreszcie, na rysunku 4D kombinacje przeciwciał są testowane pod kątem ich zdolności do wiązania różnych epitopów, co skutkuje dalszym przesunięciem w lewo. W tym przypadku przeciwciała 15B8 lub 8A11 rozpoznają epitop, który różni się od 8B6.

Przeciwciało 8B6 zostało wybrane do dalszej analizy strukturalnej na podstawie wstępnego badania kryształów za pomocą Fab traktowanego papainą. Geny 8B6 Fab zostały sklonowane do wektora ekspresji komórek owadów. Fab może ulegać ekspresji i wydzielać się z komórek Sf9 rosnących w zawiesinie. 8B6 Fab można oczyścić z supernatantu komórek Sf9 za pomocą powinowactwa do znacznika Hisa (Figura 5A, B) i chromatografii kationowymiennej (Figura 5C, D), w wyniku czego powstaje białko, które wydaje się wolne od zanieczyszczeń na żelach SDS-PAGE. Na rysunku 5E pokazano, że rekombinowany 8B6 Fab wiąże SERT i jest używany w kolejnych eksperymentach biochemicznych i biofizycznych.

Oczyszczony powinowactwem SERT_CC jest trawiony za pomocą trombiny i EndoH i mieszany z 8B6 Fab, tworząc kompleks w obecności S-citalopramu. Kompleks transporter-przeciwciało jest następnie rozdzielany przez SEC w C8M (Figura 6A), a frakcje pikowe zawierają zarówno SERT, jak i Fab, jak pokazano na SDS-PAGE (Figura 6B). Zastosowanie C8M ma kluczowe znaczenie dla tworzenia kryształów, prawdopodobnie dlatego, że detergent o krótkim łańcuchu umożliwia lepsze upakowanie między cząsteczkami w sieci krystalicznej. FSEC służy do określenia, które frakcje należy zebrać w celu krystalizacji (rysunek 6C); frakcje, które nie są monodyspersyjne i/lub zawierają duże ilości wolnego SERT lub Fab, nie powinny być łączone.

Kryształy przeciwciała SERT w kształcie pryzmatu mogą być hodowane w obecności S-citalopramu za pomocą tego protokołu, zawieszając dyfuzję par kroplowych (Rysunek 7A). Powstałe kryształy załamują promieniowanie rentgenowskie do rozdzielczości 3,15 A¹⁰ (ryc. 7B).

Rysunek 1: Test termostabilności oparty na bliskości scyntylacji. A. Przegląd protokołu badania przesiewowego termostabilności w obecności [³H]citalopramu. B. Maksymalny związany [³H]citalopram w funkcji pozornej temperatury topnienia (Tm). Linie kropkowane reprezentują wartości transportera WT. Oznaczone są 3 najbardziej termostabilne mutanty. Szary obszar reprezentuje mutanty, które mają mniej niż 10% wiązania [³H]citalopram w stosunku do WT, a zatem niedokładne wartości Tm z powodu niskiego stosunku sygnału do szumu. C. Krzywe termostabilności dla WT SERT_TC i 3 pierwszych mutantów. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (S.D.). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przegląd ekspresji białek heterologicznych u ssaków. A. Schematyczny przegląd generowania i ekspresji SERT wirusa BacMam ^{w HEK293S} komórkach GnTI. B. HEK293S GnTI ^- komórki eksprymujące SERT_CC (fluorescencja GFP). C. Profil elucji SERT_CC na żywicy powinowactwa do paciorkowca. Zielony ślad reprezentuje stężenie destiobiotyny, 0 - 100% (0 - 5 mM). D. Analiza powinowactwa oczyszczonego SERT_CC na 4 - 15% żelu SDS-PAGE. E. FSEC oczyszczonego powinowactwa SERT_CC wykryty przez fluorescencję GFP (wzbudzenie: 480 nm; Emisja: 510 nm). Pik elucji przy 15 ml to SERT (#), a 18 ml to wolny GFP (*). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne oczyszczanie powinowactwa i rekonstytucja_{układu scalonego} SERET. A. Schematyczny przegląd wytwarzania przeciwciał. B. Profil elucji obserwowany przy 280 nm oczyszczania powinowactwa SERT_IC na żywicy powinowactwa do paciorkowca. Zielony ślad reprezentuje stężenie destiobiotyny, 0 - 100% (0 - 5 mM). C. Analiza powinowactwa oczyszczonego i odtworzonego SERT na 4 - 15% żelu SDS-PAGE. D. FSEC rozpuszczonego SERT po rozpuszczeniu. Fluorescencję reszt tryptofanu wykorzystano do wykrycia SERT (wzbudzenie: 280 nm; Emisja: 335 nm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Analiza reprezentatywnych przeciwciał SERT. A. Badania przesiewowe przeciwciał metodą western blot. Około 1 μg SERT_CC z GFP lub bez GFP nałożono na 4 - 15% żel SDS-PAGE i osuszono na membranie nitrocelulozowej. Wiązanie wykryto przy użyciu koziego przeciwciała anty-mysiego sprzężonego z barwnikiem IR. 2G4 i 10F2 są zachodnio-pozytywne. B. Wiązanie przeciwciał z SERT znakowanym 100 nM GFP i wykrywanie przez FSEC wykryte za pomocą fluorescencji GFP. C. Wiązanie wybranych Fab z 100 nM SERT znakowanym GFP w obecności 1 mM serotoniny. D. Wiązanie 8A11 lub 15B8 Fab z SERT-8B6 Fab. Niewielkie piki eluujące przy 18 ml są wolne od GFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywne oczyszczanie 8B6 Fab z ogniw Sf9. A. Profil elucji obserwowany przy 280 nm oczyszczania 8B6 Fab za pomocą chromatografii powinowactwa znacznika Hisa. Zielony ślad reprezentuje stężenie imidazolu, 0 - 50% (0 - 250 mM). B. Nieredukujący i redukujący żel SDS-PAGE po oczyszczeniu powinowactwa His-tag. Białko, które przebiega w pobliżu 50 kDa, jest niezredukowanym Fab (#), a mniejsze gatunki w wieku 25 kDa to zredukowane Fab (*). C. Profil elucji obserwowany przy 280 nm oczyszczania 8B6 Fab przez wymianę kationową, wykazujący pojedynczy symetryczny pik, który eluuje się pod liniowym gradientem chlorku sodu. Zielony ślad reprezentuje stężenie NaCl, 0 - 100% (0 - 500 mM). D. Analiza 8B6 Fab na 12,5% żelu SDS-PAGE po oczyszczeniu przez kationowymienność. E. Wiązanie 8B6 Fab z SERT znakowanym GFP 10 nM, wykryte za pomocą fluorescencji GFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Reprezentatywna chromatografia z filtracją żelową kompleksu SERT-8B6 w obecności S-citalopramu. A. Profil elucji filtracji żelowej oczyszczonego kompleksu SERT-8B6. Głównym pikiem eluującym przy 11,5 ml jest kompleks SERT-8B6. Peak przy 15 - 17 ml zawiera GFP i Fab. B. Analiza oczyszczonego kompleksu SERT-8B6 na 4 - 15% żelu SDS-PAGE. Pozycje SERT oraz ciężkie i lekkie łańcuchy Fab są pokazane za pomocą myślnika. C. FSEC frakcji rozdzielonych według wielkości. Kompleksy SERT-8B6 wykryto za pomocą fluorescencji tryptofanu. Frakcja 17 zawiera większą ilość SERC, która nie była skomplikowana z Fab. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 7: Krystalizacja kompleksu SERT-8B6 związanego z S-citalopramem. A. Mikroskopia świetlna kryształów w kształcie równoległościanu kompleksu SERT-8B6 po 2 tygodniach wzrostu. Podziałka wynosi 200 μm. B. Kryształy SERT-8B6 dyfrakcjonują promieniowanie rentgenowskie do 3,15 A. Niebieski pierścień reprezentuje 3,15 A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Ekran krystalizacji dla kompleksu SERT-8B6 związanego z S-citalopramem. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

Określenie struktury białek błonowych za pomocą technik biofizycznych pozostaje trudnym przedsięwzięciem dla wielu istotnych z medycznego punktu widzenia transporterów, receptorów i kanałów¹¹. Tutaj dzielimy się szczegółową wiedzą specjalistyczną opracowaną w celu określenia struktury ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem. Przewidujemy, że metody te będą przydatne do określania struktur SERT w innych stanach konformacyjnych, a także struktur innych trudnych białek błonowych. Co więcej, opisane tutaj techniki biochemiczne mogą być również wykorzystane do badania funkcji oczyszczonego SERT w detergentach i prawie natywnym środowisku lipidowym.

Krystalizacja SERT opierała się na opracowaniu kilku narzędzi i technik. Po pierwsze, poprawa termostabilności transportera pozwoliła na uzyskanie wariantów SERET, które zachowywały się dobrze w różnych micelach detergentowych po ekstrakcji transportera z membran⁶. Po drugie, zastosowanie ligandu S-citalopramu o wysokim powinowactwie podczas oczyszczania i krystalizacji jeszcze bardziej poprawiło stabilność i zmniejszyło niejednorodność konformacyjną. Po trzecie, opracowanie systemu ekspresji BacMam⁷ pozwoliło na produkcję dużych ilości SERT w krótkim okresie 2 tygodni, ułatwiając zarówno immunizację, jak i krystalizację. Wreszcie, opracowanie strategii selekcji przeciwciał o wysokim powinowactwie, które rozpoznają epitopy 3D, pozwoliło na odkrycie przeciwciała 8B6, które sprzyja dobrze uporządkowanemu pakowaniu kompleksów przeciwciał SERT w kryształy.

Istnieje szereg krytycznych kroków i odczynników, a także typowych problemów, które często występują w całym protokole. Po pierwsze, generowanie wirusa SERT P2 o wysokim mianie może być problematyczne. Dodanie niskich stężeń wirusa P1 w celu wygenerowania wirusa P2, jak opisano w tym protokole, zwykle łagodzi ten problem, aw przypadkach, gdy miano wirusa P2 jest niskie, wirus P3 może być wytwarzany przy użyciu wirusa przy MOI 0,0001. Wirusy o mianie mniejszym niż 1 x 10⁸ cząsteczek wirusa/ml nie powinny być stosowane i prawie zawsze powodują niską wydajność białka. Do ekspresji wybrano ^{HEK293S komórki} GnTI, ponieważ nie mają one aktywności N-acetyloglukozaminylotransferazy I, a zatem nie mogą syntetyzować złożonych N-glikanów, zamiast tego wytwarzając tylko N-glikany o wysokiej zawartości mannozy. EndoH rozszczepia glikozylację sprzężoną z N glikanów o wysokiej zawartości mannozy w dwóch miejscach w pętli zewnątrzkomórkowej 2 (EL2), pozostawiając N-acetyloglukozaminę przyłączoną do asparaginy. Trawienie cukrów sprzężonych z N zmniejsza entropię powierzchniową EL2, która jest prawdopodobnie ważna dla krystalizacji. Do wytwarzania przeciwciał do immunizacji należy użyć_{układu scalonego} SERT. GFP jest wysoce immunogennym¹² i nie powinien być używany jako znacznik fuzyjny do generowania przeciwciał, ponieważ jest trudny do całkowitego usunięcia przez SEC. Elastyczny N- i C-koniec SERT również nie został uwzględniony w konstrukcie, aby uniknąć przeciwciał przeciwko tym regionom. Myszy można uodpornić 30 μg odtworzonego białka; Kontynuuj immunizację myszy, aż do momentu, gdy będzie można wykryć wysokie stężenia przeciwciał w surowicy i wytworzyć komórki hybrydoma, jak opisano¹³. Konstrukt termostabilizowany jest zwykle najlepszym wyborem do immunizacji; Jeśli transporter zachowuje się dobrze i zachowuje aktywność biologiczną po oczyszczeniu, często wystarcza to do wytworzenia przeciwciał. Przeciwciało 8B6 zostało podniesione przeciwko WT SERT. Do krystalizacji należy połączyć i zagęścić tylko frakcje pikowe z SEC zawierające kompleks monodyspersyjny, zgodnie z oceną FSEC. Kryształy SERT-8B6 rosną w wąskim zakresie warunków i istnieje szereg kroków, które należy podjąć, aby rozwiązać problemy związane ze wzrostem kryształów SERT. Baza Tris dostosowana HCl nie powinna być stosowana w roztworze zbiornikowym, ponieważ bufor ten nie wspomaga wzrostu kryształów; dlatego tak ważne jest, aby zamiast tego stosować Tris dostosowany za pomocą NaOH. Kryształy SERT rosną w wąskim zakresie stężeń PEG 400, więc jeśli kryształy nie rosną lub jeśli obserwuje się wiele małych kryształów, zaleca się nawet niewielki wzrost lub spadek stężenia PEG 400. Co więcej, dodatek kwasu 6-aminoheksanowego został również wykorzystany w zoptymalizowanym badaniu przesiewowym w celu poprawy zarodkowania. Stosunek kropli roztworu białko do studni jest również kluczowym czynnikiem decydującym o wzroście kryształów. Zalecane są proporcje kropli 1,5 - 2:1, przy czym proporcje kropli bliższe 2:1 zazwyczaj wspierają wzrost większych trójwymiarowych kryształów. Wreszcie, zastosowanie niskoprofilowych płytek 24-dołkowych ma również kluczowe znaczenie dla wzrostu kryształów, prawdopodobnie ze względu na modyfikację szybkości dyfuzji pary.

Opracowano alternatywne podejście do metody SPA w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w kierunku mutantów, które stabilizują szczurzy transporter serotoniny w konformacji związanej z kokainą przy użyciu testu wiązania filtra⁵. W przeciwieństwie do tego, test oparty na SPA pozwala na sekwencyjne etapy ogrzewania następujące po określeniu frakcji SERT, która pozostaje związana z ligandem. Pozwala to na szybkie określenie temperatury topnienia na podstawie niewielkiej liczby próbek. Metoda SPA opiera się na dostępności znakowanego radioaktywnie liganda o wysokim powinowactwie, a jeśli nie są znane żadne ligandy, które wiążą się z powinowactwem submikromolowym, konieczne będzie alternatywne podejście. Wiele innych metod jest powszechnie stosowanych do pomiaru stabilności białek, takich jak wiązanie barwników fluorescencyjnych i kalorymetria¹⁴ , ale są one niskoprzepustowe i albo nie są w stanie bezpośrednio mierzyć funkcji, albo wymagają dużych ilości białka. Jeżeli nie można zastosować metody SPA, jednym z alternatywnych podejść o wysokiej przepustowości jest test termostabilności¹⁵ oparty na FSEC (FSEC-TS), w którym próbka jest podgrzewana, a następnie oddzielana jest frakcja pozostałego transportera. FSEC-TS jest użytecznym podejściem do uzyskiwania dostępu do zachowania chromatograficznego i stanu oligomerycznego oraz jest potężnym narzędziem uzupełniającym, które może być stosowane wraz z metodą SPA.

Stwierdzono również, że porównanie różnych powszechnych systemów ekspresji białek sprzyja wykorzystaniu komórek ssaków do ekspresji SERT¹⁶ i, co nie jest zaskakujące, jest to prawdopodobne w przypadku wielu białek pochodzenia ssaków. Metody, których użyliśmy do odciągania pokarmu, zostały dostosowane do SERC, ale prawdopodobnie można je łatwo dostosować. Warunki, które sprzyjają wysokim poziomom ekspresji, powinny być starannie zidentyfikowane poprzez zmianę czasu ekspresji, temperatury, stężenia wirusa i obecności inhibitorów deacetylazy histonowej, takich jak maślan sodu.

Generalnie zalecamy oczyszczanie powinowactwa w łagodnym detergentie o długich łańcuchach, takim jak C12M, wraz z CHS przed rozpuszczeniem, aby zachować wiązanie ligandów o wysokim powinowactwie. Rekonstytucja przy użyciu absorpcji hydrofobowej jest łagodną techniką, która okazała się skuteczna w przypadku kilku innych transporterów i receptorów. Jeśli to się nie powiedzie, można zastosować usuwanie detergentów o wysokich krytycznych stężeniach miceli za pomocą dializy, rozcieńczania lub SEC¹⁷ pod warunkiem, że antygen jest wystarczająco stabilny w takich detergentach. W przypadkach, gdy nie znaleziono odpowiednich przeciwciał, prawie zawsze stwierdzamy, że problem jest spowodowany utratą funkcji lub denaturacją antygenu i w takich przypadkach z powodzeniem przeprowadziliśmy nowe immunizacje, zwracając szczególną uwagę na biochemię białek. Wreszcie, ligandy i przeciwciała, które wiążą się z wysokim powinowactwem, powinny stanowić podstawę do racjonalnie zaplanowanego eksperymentu krystalizacji, a wykorzystując wariant termostabilny, można przebadać szerszy zakres warunków, zmieniając właściwości różnych detergentów. Ponadto krystalizacja w mezofazie^{lipidowej 18} lub przy użyciu biceli¹⁹ powinna być zawsze brana pod uwagę jako alternatywa dla krystalizacji w miceli.

Te zasady i metody mogą być stosowane z pewnymi modyfikacjami dla wielu innych białek transbłonowych, które są trudne do ekspresji i oczyszczenia z innych gospodarzy ekspresyjnych, i będą szczególnie przydatne do określania struktury celów leków o wysokim powinowactwie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DH10Bac	Invitrogen	10361-012
Kanamycyna		Fisher BP906-5
Gentamycyna	Fisher	BP918-1
Tetracyklina	Sigma	T-7660
Bluo-gal	Invitrogen	15519-028	5-bromo-3-indolyl β-D-galaktopiranozyd
izopropylowy beta-D-1-tiogalaktopiranozyd	Anatrace	I1003	IPTG
Zestaw do miniprzygotowania	Qiagen	27106
Cellfectin II	Invitrogen	10362-100	Odczynnik do transfekcji Sf9
Sf9	ATCC	CRL-1711
Sf-900 III SFM media	Life Technologies	12658-027
HEK-293S GnTI-	ATCC	CRL-3022
Freestyle 293 media	Life Technologies	12338-018	293 media ekspresyjne
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Life Technologies	0984018DJ
Maślan sodu	Sigma	303410
S-citalopram	Sigma	E4786	Anagrade
n-dodecyl-beta-D-maltopiranozyd	Anatrace	D310
Hemibursztynian cholesterolu	Sigma	C6013
1-palmitoilo-2-oleoiloilo-sn-glicero-3-fosfocholina	Avanti Polar Lipids	850457P
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina	Avanti Polar Lipids	850757P
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoglicerol	Avanti Polar Lipids	840457P
Leupeptin	Sigma	L2884
Pepstatin A	Sigma	P5318
Aprotinin	Sigma	A1153
PMSF	Sigma	P7626
Desthiobiotin	Iba Life Sciences	2-1000-05
Asolectin	Sigma	11145
Cholesterol	Sigma	C-8667
Lipid A	Sigma	L5399
Lipid polarny mózgu	Avanti Polar Lipids	141101C
Biobeads	Biorad	152-3920	Hydrofobowa żywica absorpcyjna
Kozia anty-mysia IRDye 680RD	Odyssey	926-68070	Stosowana jako przeciwciało wtórne dla western blot
Lauryl maltoza glikol neopentylowy	Anatrace	NG310	Anagrade
Serotonina	Sigma	H9523
pFastBac 8B6			Dostępne u autorów
pEG Bacmam SERT Strep II			SERTIC, Dostępne u autorów
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His			SERTTC, Dostępne u autorów
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His			SERTCC, Dostępne u autorów
Imidazole	Sigma	56749
n-oktyl β-D-maltozyd	Anatrace	O310	Anagrade
Trombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
EndoH	New England Biolabs	P0702
Trizma-HCl	Sigma	T5941	Tris służy do przygotowania zbiorników krystalizacyjnych:
PEG 400	Sigma	91893
Kwas 6-aminoheksanowy	Sigma	7260
Trypsyna-EDTA	Fisher	MT25052CV
Isoplate-96 TC	PerkinElmer	6005070
PolyJet	SignaGen	SL100688	Odczynnik do transfekcji polimerów do komórek sutkowych
Miedziane koraliki HIS-Tag YSI SPA	PerkinElmer	RPNQ0096	His-tag affinity Koraliki SPA
Citalopram, [N-Metylo-3H]	PerkinElmer	NET1039250UC
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023	blok grzewczy do oznaczania termostabilności
ThermoTop	Eppendorf	5308000003
SmartBlock PCR 96, termoblok do płytek PCR	Eppendorf	5306000006
0,2 i mikro; m filtr strzykawkowy	Olympus Plastics	25-243
System filtracyjny 1 L	Corning	430517
2 L płaskodenna kolba do hodowli tkankowych	Genemate	F-5909-2000
L z przegrodą	Genemate	F-5909-2000B
CO2	Thermo Scientific	3950
Forma Orbital Shaker	Thermo Scientific	416
Żywica Strep-Tactin	Iba Life Sciences	2-1208-025	żywicy powinowactwa do paciorkowców
System obrazowania Northern
Koncentrator białka MWCO 100 kDa	Millipore	UFC910096
30 kDa koncentrator białka MWCO	Millipore	UFC903024
Ä kta FPLC	GE Healthcare	UPC-900
HPLC	Shimadzu	51476
Superose 6 (10/300) kolumna	GE Healthcare	17-5172-01	Używana do
aparatu FSEC z przepływem stycznym	Pall Filtron
0,2 i mikro; m filtr styczny komora przepływowa	Pall Filtron	PSM20C11
30 kDa MWCO	Żywica Pall Filtron	OS030T12
Talon	Clonetech	635504	Żywica powinowactwa His-tag używana do oczyszczania Fab
Kolumna HiTrap SP 1 ml	Wymiennik kationowy GE Healthcare 17115101 używany do oczyszczania
Fab Kolumna Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17-5175-01	Służy do separacji SEC
24-dołkowej płytki VDXm	Hampton Research	HR3-306
18 mm Szkiełka nakrywkowe	Hampton Research	HR3-239
Licznik wirusów Virocyt	Virocyt	2100
MicroBeta Trilux	PerkinElmer	1450	96-dołkowy licznik scyntylacyjny
Kolumna HiTrap SP	GE Opieka zdrowotna	17115101
Sertraline	Sigma	S6319