Artykuł metodologiczny

Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

15.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54792

⸱

27 listopada 2016

 ,  , 
1Vollum Institute, Oregon Health & Science University, 2Graduate Group in Biophysics, University of California, San Francisco, 3Howard Hughes Medical Institute, Oregon Health & Science University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem mutacji termostabilizujących, oczyścić ludzki transporter serotoniny, wygenerować przeciwciała o wysokim powinowactwie i skrystalizować kompleks transporter-przeciwciało serotoniny związany z lekiem przeciwdepresyjnym S-citalopram. Protokół ten można dostosować do badania innych trudnych transporterów błonowych, receptorów i kanałów.

Streszczenie

Transporter serotoniny to transporter sprzężony z sodem i chlorkiem, który "pompuje" zewnątrzkomórkową serotoninę do komórek. S-citalopram jest lekiem stosowanym w leczeniu depresji i lęku poprzez wiązanie się z transporterem serotoniny o wysokim powinowactwie, blokującym wychwyt zwrotny serotoniny. Tutaj przedstawiamy skuteczną procedurę i zestaw narzędzi do stabilizacji, ekspresji, oczyszczania i krystalizacji kompleksów transporter-przeciwciało serotoniny związanych z S-citalopramem i innymi lekami przeciwdepresyjnymi. Mutacje, które stabilizują transporter serotoniny, zidentyfikowano za pomocą testu wiązania S-citalopramu. Transporter serotoniny ulegający ekspresji w komórkach GnTI transduk HEK293S owanych przez bakulowirusa został odtworzony w proteoliposomach i wykorzystany do wytworzenia przeciwciał o wysokim powinowactwie. Opracowaliśmy strategię odkrywania przeciwciał, które są przydatne w badaniach strukturalnych. Ustalono również proste podejście do ekspresji fragmentów przeciwciał w komórkach Sf9. Oczyszczone za pomocą tej procedury kompleksy transporter-przeciwciało zachowują się dobrze i łatwo krystalizują, wytwarzając kompleksy z S-citalopramem, które załamują promieniowanie rentgenowskie do rozdzielczości 3-4 A. Opracowane w ten sposób strategie można wykorzystać do określenia struktury innych trudnych białek błonowych.

Wprowadzenie

Transporter serotoniny (SERT) jest integralnym białkiem błonowym, które ułatwia transport serotoniny przez błony komórkowe1. SERT należy do rodziny symporterów neuroprzekaźników sodu (NSS), która obejmuje również transportery dopaminy i noradrenaliny2. SERT jest celem molekularnym powszechnie przepisywanych leków przeciwdepresyjnych i przeciwlękowych, które działają w celu konkurencyjnego hamowania transportu serotoniny3. SERT wykorzystuje energetycznie korzystny kotransport sodu do usuwania neuroprzekaźnika ze szczeliny synaptycznej. Obszerna charakterystyka układu serotoninergicznego wykazała, że zmiany w metabolizmie serotoniny wydają się wpływać na praktycznie wszystkie procesy neurologiczne, w tym nastrój, sen, ból, funkcje poznawcze i zachowaniaagresywne. Funkcja SERT może być modyfikowana poprzez stosowanie leków przeciwdepresyjnych i selektywnych inhibitorów wychwytu zwrotnego serotoniny (SSRI), takich jak S-citalopram, a także przez psychostymulanty i narkotyki uzależniające, takie jak amfetamina i 3,4-metylenodioksy-N-metyloamfetamina lub "ecstasy"1,2.

SSRI są niezwykle ważne w leczeniu zaburzeń nastroju, jednak dokładne strukturalne podstawy ich działania nie są dobrze poznane. WT SERT jest niestabilny w micelach detergentowych, co utrudnia postęp w kierunku trójwymiarowej (3D) struktury SERT5,6. Ostatnio opracowaliśmy warianty Sert , które są solidnie stabilne w szerokiej gamie detergentów i zachowują aktywność wiążącą SSRI6. Te termostabilne warianty SERT zostały wybrane za pomocą scyntylacyjnego testu termostabilności opartego na bliskości. Tutaj opisujemy procedurę wytwarzania przeciwciał o wysokim powinowactwie, które mogą wiązać SERT, oraz oczyszczania i krystalizacji termostabilnego SERT w kompleksie z przeciwciałem i S-citalopramem.

Ten protokół zakłada, że geny SERT i 8B6 zostały pomyślnie sklonowane odpowiednio do wektorów ekspresyjnych BacMam7 i owadów. Aby wytworzyć przeciwciała, reszty kodujące cDNA 73-616 WT SERT sklonowano do wektora BacMam za pomocą C-końcowego znacznika Strep II (SERTIC). Do badania termostabilności użyto pozostałości SERT 73-616 z C-końcowym GFP, Strep II i znacznikami 10-His (SERTTC). Poszczególne mutacje punktowe zostały wygenerowane w tle SERTTC. Do protokołu krystalizacji białko fuzyjne SERT-GFP zastosowano ze znacznikami Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys(GlyGlyGlySer)2GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] i 10-His, przenoszącymi termostabilne mutanty, Y110A, I291A i T439S oraz mutacje cystein powierzchniowych C554A, C580A i C622A (SERTCC). Sekwencje rozszczepienia trombiny (LVPRGS) zostały również wprowadzone do SERTCC po Q76 i T618, aby umożliwić usunięcie N- i C-końców. Plazmid kodujący 8B6 Fab został zaprojektowany do ekspresji zarówno ciężkich, jak i lekkich łańcuchów przeciwciała z sekwencjami wydzielania GP67 pod kontrolą dwóch oddzielnych promotorów poliedryny. C-koniec ciężkiego łańcucha przeciwciała 8B6 został oznaczony znacznikiem 8-His, a miejsce rozszczepienia trombiny zostało wprowadzone między ciężki łańcuch a znacznik.

Protokół

1. Transfekcja przylegających HEK293S ogniw GnTI do ekranu termostabilności

  1. Przygotować 96-dołkowe płytki pokryte poli-D-lizyną (PDL). Wszystkie prace należy wykonywać w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.
    1. Przefiltrować roztwór 25 μg/ml (PDL) o masie cząsteczkowej 70 000-150 000 Da, używając sterylnego filtra 0,2 μm. Dodać 50 μl PDL do każdego dołka na 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej (TC), upewniając się, że dno jest równomiernie pokryte, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    2. Odessać roztwór PDL i przemyć 200 μl sterylnej wody.
    3. Pozostawić płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez 2 godziny przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C. Płytki powlekane PDL można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
  2. Trypsynizacja przylegających komórek HEK293S.
    1. Rosną HEK293S do 80% konfluencji w 10-centymetrowym naczyniu utrzymywanym w temperaturze 37 °C z 8% CO2 . Pojedyncza 10-centymetrowa miska powinna mieć około 10 milionów HEK293S komórek. Nie używaj komórek po 30 przejściach!
    2. Odessać pożywkę i przemyć 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodać 1 ml roztworu trypsyny-EDTA (0,25% trypsyny, 0,02% EDTA) do komórek i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.
    3. Dodać 10 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i ponownie zawiesić komórki, wielokrotnie pipetując w górę iw dół za pomocą pipety serologicznej.
    4. Odpipetować 10 μl komórek i wymieszać z 10 μl roztworu błękitu trypanowego (0,4%). Określ gęstość komórek za pomocą hemocytometru i mikroskopu świetlnego. Nie licz komórek, które są zabarwione na niebiesko, ponieważ są martwe. Upewnij się, że żywotność komórek przekracza 90%.
  3. Dokładnie zawiesić trypsynizowane HEK293S komórki GnTI w DMEM uzupełnionym 10% FBS do gęstości 0,5 x 106 komórek/ml w jednorazowym zbiorniku na pipety. Na każdą płytkę potrzeba około 5 milionów HEK293S komórek. Za pomocą tego protokołu można transfekować łącznie 24 konstrukty na każdej płytce.
  4. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 μl komórek do każdego dołka płytki pokrytej PDL. Po napełnieniu każdej płytki należy ponownie zawiesić komórki w zbiorniku pipety, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 8% CO2 . Po 24 godzinach komórki powinny osiągnąć około 80% zbieżności.
  5. 1 godzinę przed transfekcją wymienić pożywkę. Przygotować kompleksy odczynników do transfekcji DNA do transfekcji.
    1. Dla każdego konstruktu w tle SERTTC, który ma być poddany badaniom przesiewowym, wymieszaj 450 ng DNA z 45 μl DMEM bez surowicy i wymieszaj. Dodać 1,6 μl odczynnika do transfekcji do 45 μl DMEM bez surowicy i wymieszać.
    2. Natychmiast dodać rozcieńczony roztwór odczynnika do transfekcji do roztworu DNA i wymieszać. Nie mieszaj roztworów w odwrotnej kolejności. Odczekaj 10 - 15 minut i dodaj 20 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji/DNA do 4 dołków.
  6. Po transfekcji wszystkich studzienek wymieszać płytkę, delikatnie kołysząc ją w przód i w tył, a następnie powrócić do inkubatora o temperaturze 37 °C.
  7. Po 16 - 24 godzinach zastąp pożywkę DMEM zawierającą surowicę i 10 mM maślanu sodu.
  8. Około 48 godzin po transfekcji usunąć pożywkę i natychmiast przystąpić do badania termostabilnego lub zamrozić komórki w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Komórki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.

2. Scyntylacyjny ekran termostabilny oparty na zbliżeniu z S-citalopramem

  1. Inkubować komórki z 200 nM S-citalopramem w 25 μl TBS (sól fizjologiczna buforowana trisem — 20 mM tris, pH 8, 100 mM NaCl) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Rozpuścić komórki, dodając 25 μl 8 mM n-dodecylo-β-D-maltopyranozydu (C12M), 1 mM hemmibursztynianu cholesterolu (CHS), koktajlu inhibitorów proteazy (2 mM fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF), 0,1 mg/ml aprotyniny, 4 g/ml pepstatyny A i 4 μg/ml leupeptyny) w TBS i inkubując przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Dodaj 50 μl TBS z 20 nM [3H]citalopramem (81,7 Ci/mmol), 0,1% albuminą surowicy bydlęcej i 2 mg/ml kulek zbliżeniowego powinowactwa do scyntylacji (SPA) do trzech studzienek dla każdego konstruktu. Do ostatniego dołka dodać ten sam roztwór, ale uzupełnić 100 μM sertraliną, aby określić niespecyficzne wiązanie. Upewnij się, że kulki SPA o powinowactwie His-tag są dokładnie wymieszane podczas dodawania do płytki 96-dołkowej.
  4. Zmierz wiązanie [3H]citalopram za pomocą 96-dołkowego licznika scyntylacyjnego w RT z 1-minutowym czasem liczenia na dołek. Kontynuuj liczenie płytek, aż całkowita liczba ustabilizuje się (mniej więcej po 36 godzinach).
  5. Podgrzewać płytki przez 15 minut w bloku grzewczym z podgrzewaną pokrywką w temperaturze 33 °C. Zmierzyć [3H]citalopram wiążący ponownie po podgrzaniu, jak opisano w 2.4.
  6. Powtórz krok 2.4 - 2.5 i zmień etap ogrzewania na 36 °C, 39 °C, 45 °C, 48 °C i 51 °C. Dostosuj temperaturę ogrzewania w zależności od pozornej temperatury topnienia (Tm) białka docelowego i termostabilności najbardziej stabilnej konstrukcji. Kontynuuj podgrzewanie płyt, aż wszystkie konstrukcje będą miały niską liczbę właściwą.
  7. Analizuj dane, aby określić wartości Tm.
    1. Określ średnią całkowitą liczbę na minutę (CPM) każdego konstruktu dla studzienek, które nie zawierają sertraliny, uśredniając 3 dołki replikacji. Określ niespecyficzny CPM, uśredniając CPM każdej studzienki zawierającej sertralinę na jednej płytce.
    2. Obliczanie określonego CPM przez odjęcie nieokreślonego CPM od całkowitego CPM.
    3. Oblicz Tm przez nieliniowe dopasowanie do funkcji sigmoidalnej Boltzmanna. Konstrukcje z niskim CPM właściwym na poziomie RT (<10% WT) zazwyczaj nie mają dokładnych wartości Tm. Mutacje z najbardziej termostabilnych konstruktów mogą być łączone ze sobą i badane pod kątem addytywnego wzrostu termostabilności.

3. Ekspresja ludzkiego transportera serotoniny w komórkach HEK293S GnTI

  1. Przekształć chemicznie kompetentne komórki DH10Bac za pomocą 1 ng plazmidu.
    1. Dodaj plazmid do 50 μl komórek DH10Bac i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
    2. Szok termiczny Komórki DH10Bac w temperaturze 42 °C przez 30 sek. Dodać 200 μl pożywki SOC i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny z wytrząsaniem.
    3. Umieść wszystkie bakterie na płytce Luria Bulion (LB) zawierającej 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny, 10 μg/ml tetracykliny, 100 μg/ml 5-bromo-3-indolylu β-D-D-galaktopyranozydu i 40 μg/ml izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG).
  2. Izolować kolonie lacZ (białe kolonie) uprawiane w temperaturze 37 °C przez 2 dni na płytkach agarowych LB.
  3. Hodować kilka kolonii O/N w temperaturze 37 °C w 5 ml LB zawierającego antybiotyki i wyizolować DNA bakterii.
    1. Odwirować bakterie w ilości 1 000 x g w wirówce przez 5 minut. Wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić bakterie za pomocą 200 μl buforu do reprodukcji miniprep.
    2. Poddaj bakterie lizie, delikatnie 10 razy dodając 200 μl buforu do lizy miniprep i probówkę odwracającą. Dodać 200 μl buforu neutralizującego.
    3. Usunąć nierozpuszczalną frakcję, wirując w temperaturze 14 000 x g przez 10 minut w wirówce. Dodać 1 ml izopropanolu do supernatantu i schłodzić w temperaturze -20 °C przez 20 minut w celu wytrącenia DNA.
    4. Wirować w temperaturze 14 000 x g przez 15 minut w wirówce i wyrzucić supernatant.
    5. Przemyć osad DNA 70% EtOH i ponownie wirować w temperaturze 14 000 x g przez 15 minut. Odrzucić supernatant. Suszyć DNA na powietrzu, aż cały EtOH wyparuje i ponownie zawiesić w 50 μl wody.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, DNA Bacmid należy natychmiast transfekować do komórek Sf9, ale może być również przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
  4. Transfekcję bakimidowego DNA do1x10 6 komórek przylegającego Sf9 hodowanych w wilgotnej komorze w temperaturze 27 °C w naczyniu 6-dołkowym. Wszystkie manipulacje związane z hodowlą komórkową należy wykonywać w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.
    1. Usuń pożywkę z komórek i dodaj 2 ml świeżej pożywki Sf9. Dodać 5 μg bakmidowego DNA do 100 μl pożywki Sf9 (roztwór A).
    2. Dodać 8 μl odczynnika do transfekcji kationowo-lipidowej Sf9 do 100 μl pożywki Sf9 (roztwór B). Inkubować probówkę zawierającą roztwór B przez 5 minut.
    3. Zmieszać probówkę zawierającą roztwór A z roztworem B i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie dodać cały roztwór do komórek Sf9.
    4. Po 96 godzinach zebrać supernatant (wirus P1), przechodząc przez filtr 0,2 μm. Wirus P1 może być przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C w ciemności i w razie potrzeby ponownie wykorzystany do wytworzenia wirusa P2.
  5. Dodaj 100 μl wirusa P1 do 1 l komórek Sf9 o gęstości 1 x 106 komórek/ml w pożywce Sf9. Infekować komórki przez 96 godzin, rosnąc w temperaturze 27 °C na wytrząsarce z prędkością 100 obr./min.
  6. Odwirować komórki w wirówce o stężeniu 4 000 x g przez 15 minut i przefiltrować supernatant zawierający cząsteczki wirusa przez filtr 0,2 μm. Wyrzuć osad komórkowy. Określ gęstość wirusa za pomocą testu płytki wirusowej lub licznika wirusów. Gęstość wirusa powinna wynosić >1 x 108 cząstek wirusa na mililitr. Wirus P2 może być przechowywany w temperaturze 4 °C w ciemności i używany przez kilka miesięcy.
  7. Zakażone 10 l komórek HEK293S GnTI7 rosnących w zawiesinie w temperaturze 37 °C z 8% CO2 i wilgotnością 85% na wytrząsarce przy 130 obr./min w 293 pożywkach ekspresyjnych uzupełnionych 2% FBS przy wielokrotności infekcji (MOI) 2 i gęstości 3 x 106 komórek/ml, zwykle 30 - 50 ml wirusa P2 na 800 ml komórek w kolbie z przegrodą o pojemności 2 l.
    UWAGA: Nie zaleca się stosowania więcej niż 80 ml wirusa P2, ponieważ HEK293S komórek GnTI- będzie rosła powoli i może stać się nieżywotna z powodu zmiany pH. Pożywka Sf9 jest bardziej kwaśna niż pożywka ekspresyjna 293.
  8. 12 - 16 godzin po zakażeniu, dodać maślan sodu do stężenia 10 mM z 1 M zapasu. 48 - 60 godzin po zakażeniu, zebrać komórki przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 15 min. Usunąć supernatant.
  9. Zawiesić komórki w 150 ml TBS, 2 μM S-citalopramu lub innych inhibitorów SERT i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do oczyszczenia.

4. Oczyszczanie powinowactwa transportera serotoniny do immunizacji i krystalizacji

  1. Rozmrozić komórki z 10 l kultury w ciepłej wodzie (około 30 °C) i ponownie zawiesić, szybko przepuszczając przez pipetę o pojemności 10 ml do uzyskania jednorodności.
  2. Przygotuj roztwór detergentu do solubilizacji (150 ml): 80 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl zawierający 40 mM C12M, 5 mM CHS i koktajl inhibitorów proteazy.
  3. Dodaj wszystkie komórki do zlewki z mieszadłem i dodaj cały roztwór detergentu do komórek, mieszając. Rozpuszczać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę z mieszaniem.
  4. Wirować lizat przy 8 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić osad i zdekantowany supernatant do czystych probówek ultrawirówek. Wirować z prędkością 100 000 x g przez 1 godzinę w ultrawirówce. Wyrzuć osad i przefiltruj supernatant przez filtr 0,2 μm.
  5. Przepuścić lizat przez 10 ml żywicy powinowactwa do Strep upakowanej w kolumnę za pomocą pompy perystaltycznej zrównoważonej w buforze do przemywania : 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, 5% glicerolu, 25 μM lipidów (1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina, 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfoetanoloamina i 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoglicerol w stosunku molowym 1:1:1) i 1 μM S-citalopram lub SSRI w TBS.
  6. Podłączyć kolumnę powinowactwa do paciorkowca do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) i przemywać kolumnę z prędkością 2 ml / min z 66 ml (6,6 objętości kolumny) buforu do przemywania się. Elute oczyszczone białko w tym samym buforze uzupełnionym 5 mM destiobiotyną w tempie 0,5 ml/min przy użyciu 33 ml (objętość 3,3 kolumny) buforu. Zbierz frakcje o pojemności 1 ml; frakcje szczytowe wyniosą ~10 ml. Oczyszczone białko może być przechowywane w temperaturze 4 °C przez 2 - 3 dni, jeśli jest to pożądane.
    UWAGA: Całkowita wydajność wyniesie 3 - 4 mg SERTCC i 1 mg SERTIC. Absorpcja 2 j.a. przy 280 nm jest równa 1 mg/ml SERT.

5. Rekonstytucja transportera do liposomów w celu immunizacji

  1. Przygotuj liposomy zawierające asolektynę: cholesterol, lipid A, lipid polarny mózgu (stosunek molowy 60:17:3:20). Rozpuścić lipidy w 1 ml chloroformu i dodać 40 mg całkowitego stężenia lipidów do szklanej kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml we wskazanym stosunku molowym.
    1. Odparowywać chloroform przez co najmniej 1 godzinę w próżni przy obracającej się kolbie okrągłodennej w ciepłej wodzie o temperaturze około 30 °C.
    2. Uwodnić lipidy, dodając 10 ml TBS. Inkubować w buforze przez 10 minut.
    3. Zamrozić lipid, umieszczając kolbę w cieczyN2.
    4. odwilż. Zanurzyć kuliste dno kolby w zlewce wypełnionej ciepłą wodą o temperaturze około 30 °C. Sonikować w kąpieli sonikatora na 5 minut.
    5. Wirować i powtarzać kroki 5.1.3 - 5.1.4 10 razy lub do momentu, gdy lipid zostanie całkowicie zawieszony od dna i utworzy mętną zawiesinę.
    6. Wytłacz całą mieszaninę lipidów dwukrotnie przez filtry 200 nm. Lipid pojawi się jako mleczna zawiesina przed wytłaczaniem; potem będzie półprzezroczysty. Nie dodawaj całej mieszaniny lipidów do ekstrudera od razu, ponieważ może się ona zatkać, powodując utratę próbki.
    7. Wiruj lipidy w temperaturze 100 000 x g przez 20 minut i ponownie zawieś w 0,5 - 1 ml TBS w stężeniu 40 mg/mL.
  2. Zagęścić oczyszczonySERT IC do 250 - 500 μL za pomocą koncentratora białek wirówki MWCO o mocy 100 kDa do 2 - 4 mg / ml i nasycić liposomy 5 mM C12M. Dodać oczyszczony SERT do mieszaniny detergent:lipid w 1 ml końcowej objętości
    3. .
  3. Usuń C12M przez 3 kolejne dodatki hydrofobowej żywicy absorpcyjnej o stężeniu 80 mg/mL. Przez pierwsze 2 dodatki inkubować z żywicą na przemian przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Usunąć żywicę, przepuszczając przez watę szklaną. Wykonaj końcową inkubację z żywicą przez noc.
  4. Zagęścić proteoliposomy przez odwirowanie przy 100 000 x g przez 20 minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 - 500 μl TBS.
  5. Dodać 10 μM końcowego stężenia S-citalopramu do odtworzonego białka po ostatecznym usunięciu żywicy.
  6. Rozpuścić 2,5 μl proteoliposomów w buforze ładującym SDS-PAGE (62,5 mM Tris, pH 6,8, 10% glicerol, 2% SDS, 0,01% błękitu bromofenolowego, 100 mM DTT) i uruchomić na żelu SDS-PAGE przy 200 V przez 1 godzinę, aby upewnić się, że SERT został pomyślnie odtworzony. Proteoliposomy mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach do długotrwałego przechowywania i rozmrażane na lodzie przed każdym szczepieniem.

6. Badania przesiewowe na obecność przeciwciał rozpoznających epitopy 3D

  1. Badanie przesiewowe linii komórkowych hybrydoma za pomocą western blot. Przeciwciała, które rozpoznają SERT po western blot, prawdopodobnie wiążą liniowe epitopy i prawdopodobnie nie będą przydatne w badaniach strukturalnych.
    1. Wymieszaj 1 μg oczyszczonego SERTIC lub SERTCC i uruchom na 4 - 15% żelu SDS-PAGE przy 200 V przez 1 godzinę.
    2. Przenieść do membrany nitrocelulozowej o natężeniu 200 mA przez 30 minut przy użyciu buforu Towbin (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 20% (v/v) metanolu, 0,1% SDS). Membranę można suszyć i przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej.
    3. Ponownie zwilżyć membranę 10% metanolem i przepłukać PBS (10 mM fosforan, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
    4. Blok z 5% mlekiem w proszku w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Przemyć PBS i inkubować z 1 μg/ml przeciwciała w PBS z 0,1% mlekiem.
    6. Umyj obficie PBS zawierającym 0,1% Tween-20.
    7. Inkubować z kozim przeciwciałem anty-mysim sprzężonym z barwnikiem IR rozcieńczonym 1:10 000 w PBS z 0,1% Tween 20 i 0,1% mlekiem.
    8. Dokładnie umyj i zeskanuj za pomocą systemu obrazowania.
  2. Zmieszaj supernatant hybrydoma zawierający zachodnie przeciwciała ujemne z białkiem 100 nM SERTCC przy użyciu stosunku molowego 1:2 (SERT:mAb) w 200 μl TBS z 1 mM C12M, 0,2 mM CHS i 1 μM S-citalopram. Wirować przy 100 000 x g przez 20 min. Analizować supernatant zawierający kompleksy SERT-mAb i analizować za pomocą chromatografii wykluczającej z detekcją fluorescencji (FSEC)8. Wyrzuć granulkę.
    1. Uruchomić 100 μl supernatantu na kolumnie wykluczającej wielkość z prędkością 0,5 ml/min przy użyciu systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) wyposażonego w detektor fluorescencyjny (wzbudzenie: 480 nm, emisja: 510 nm) przy użyciu działającego buforu zawierającego TBS, 0,4 mM glikolu neopentylowo-maltozowego laurylu i 1 μM S-citalopramu. Przeciwciała, które tworzą kompleksy, spowodują, że białko fuzyjne GFP zostanie wymywane wcześniej niż wolny transporter z kolumny wykluczającej rozmiar.
    2. Rozcieńczyć kompleksy do 10, 1, 0,1 nM w 200 μL TBS z 1 mM C12M, 0,2 mM CHS i 1 μM S-citalopram i ponownie uruchomić FSEC. Przeciwciała, które nadal mogą przesuwać pik transportera przy niskich stężeniach nanomolowych, są spoiwami o wysokim powinowactwie i dobrymi kandydatami do badań strukturalnych.
  3. Powtórz test wiązania przez FSEC w obecności 1 mM serotoniny. Przeciwciała, które specyficznie rozpoznają konformację związaną z SSRI, nie będą wiązać się w obecności substratu. Przeciwciała, które rozpoznają epitop 3D, który nie zmienia się w wyniku konformacji, zwiążą się niezależnie od obecnego liganda.
  4. Wymieszaj parami różne kombinacje przeciwciał i test wiązania przez FSEC. Przeciwciała, które rozpoznają różne epitopy, spowodują wcześniejszą elucję SERT po połączeniu w porównaniu z wiązaniem pojedynczego przeciwciała.
  5. Do wstępnych badań strukturalnych wybierz przeciwciała o najwyższym powinowactwie, które rozpoznają epitopy 3D.

7. Ekspresja fragmentu przeciwciała w komórkach Sf9

  1. Sklonuj zmienne i stałe domeny Fab metodą PCR do systemu ekspresji owadów w celu ekspresji w komórkach Sf9 przy użyciu standardowych protokołów.
  2. Transfekcja 1 x 106 komórek Sf9 z 5 μg DNA Bacmid kodującego lekkie i ciężkie łańcuchy 8-His oznaczonego 8B6 Fab sekwencją wydzielania GP67 (zgodnie z sekcją 3.4).
  3. Zebrać wirusa P1 96 godzin po transfekcji i dodać 500 μl wirusa P1 do 1 l komórek Sf9 o gęstości 1 x 106 komórek/ml w kolbie o pojemności 2 litrów, aby uzyskać wirusa P2. Infekować komórki przez 96 godzin w temperaturze 27 °C.
  4. Zebrać wirusa P2 (zgodnie z sekcją 3.6).
  5. Zakażone 6 l komórek Sf9 o gęstości 2 - 3 x 106 komórek/ml MOI 2 z wirusem P2, zwykle 40 - 50 ml na kolbę z 1 litrem komórek Sf9 w każdej kolbie o pojemności 2 litrów.
  6. Zbierz komórki około 96 godzin po zakażeniu. Dodać do komórek 50 ml buforu fosforanowego o pH 8 i końcowym stężeniu 50 mM i wirować w temperaturze 4000 x g przez 20 minut. Wyrzuć osad ogniwa i przefiltruj supernatant przez styczną celę przepływową filtra 0,2 μm. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 dni, jeśli jest to pożądane.

8. Oczyszczanie fragmentów przeciwciał z supernatantu Sf9

  1. Stężyć supernatant Sf9 za pomocą celi o odcięciu masy cząsteczkowej (MWCO) o masie cząsteczkowej 30 kDa do około 400 - 800 ml.
  2. Dodać imidazol o pH 8 przy końcowym stężeniu 10 mM i 10 ml żywicy o powinowactwie do His-tag. Mieszać w zlewce przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  3. Zebrać żywicę o powinowactwie His-tag przez odwirowanie w stężeniu 2 000 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant.
  4. Zapakuj żywicę powinowactwa His-tag do kolumny i podłącz do FPLC.
  5. Przemyć żywicę powinowactwa His-tag z prędkością 2 ml/min 66 ml (objętość 6,6 kolumny) o 50 mM fosforanie pH 8, 150 mM NaCl, 25 mM imidazolu.
  6. Elute 8B6 Fab w 33 ml 50 mM fosforanu pH 8, 150 mM NaCl, 250 mM imidazolu. Zbierz frakcje o pojemności 1 ml.
  7. Rozcieńczony Fab oczyszczony z powinowactwa z 10-krotną objętością lodowatego octanu 20 mM o pH 5.
  8. Zwiąż Fab z kolumną kationowymienną o pojemności 1 ml za pomocą pompy perystaltycznej o prędkości 1 ml/min.
  9. Oddziel Fab za pomocą 30 ml gradientu liniowego NaCl (0 - 500 mM) w octanie 20 mM o pH 5,5 za pomocą FPLC. Fab będzie eluować jako pojedynczy pik przy ~300 mM NaCl.
  10. Przeprowadzić analizę na 12,5% żelu SDS-PAGE przy użyciu buforu próbki zawierającego 100 mM DTT. Ciężkie i lekkie łańcuchy 8B6 Fab będą pracować odpowiednio z prędkością 27 i 25 kDa na redukcyjnym żelu SDS-PAGE.
  11. Frakcje zbiorcze zawierające Fab i koncentrat do co najmniej 10 - 15 mg/ml za pomocą koncentratora białka MWCO o stężeniu 30 kDa w wirówce kubełkowej wahadłowej o sile 3 000 x g.
  12. Dostosuj do pH 8, dodając 1 M Tris pH 8 do końcowego stężenia 50 mM i przechowuj oczyszczony Fab przez długi czas w temperaturze 4 °C. Całkowita wydajność wyniesie 25 - 30 mg. Absorbancja 1,4 j.a. przy 280 nm jest równa 1 mg/ml 8B6 Fab.

9. Tworzenie kompleksów transporter-przeciwciało i rozdzielanie przez chromatografię wykluczającą wielkość

  1. W celu krystalizacji należy oczyścić SERTCC za pomocą chromatografii powinowactwa do paciorkowców w C12M, jak opisano wcześniej (sekcja 4).
  2. Trawić trombiną w celu usunięcia znaczników (1:100 w/w) i EndoH (1:10 w/w) O/N przy RT. Skoncentrować do 250 - 300 μL za pomocą koncentratora białka wirówki MWCO o stężeniu 100 kDa do stężenia białka 10 mg/ml.
  3. Zmieszać skoncentrowany SERT z Fab w stosunku molowym 1:1,2 w objętości mniejszej niż 500 μL. Odwirować przy 100 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min. Zebrać supernatant zawierający kompleks SERT-Fab. Wyrzuć granulkę.
  4. Rozdzielać metodą chromatografii wykluczania według wielkości (SEC) przy użyciu FPLC na kolumnie wykluczającej wielkość zrównoważoną w TBS uzupełnionej 40 mM n-oktylo-β-D-maltozydem (C8M), 0,5 mM CHS, 5% glicerolu, 25 μM lipidu (tak samo jak w kroku 4.5) i 1 μM S-citalopram w stężeniu 0,5 ml/min.
  5. Zebrać frakcje 0,5 ml i przeanalizować na 4 - 15% żelach SDS-PAGE, a także za pomocą fluorescencji tryptofanu metodą SEC. SERT oznaczony GFP będzie działał przy około 80 kDa na żelu SDS-PAGE. Po usunięciu końcówek i cukrów sprzężonych z N będzie działać jako białko o masie 45 kDa.
  6. Określić, które frakcje należy połączyć, łącząc tylko te frakcje, które są monodyspersyjne, jak oceniono na podstawie analizy frakcji za pomocą fluorescencji tryptofanu SEC (wzbudzenie: 280, emisja: 335 nm).
  7. Oczyszczony kompleks SERT-8B6 należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.

10. Krystalizacja kompleksów transporter-przeciwciało przez wiszącą kroplę

  1. Przed krystalizacją należy zagęścić frakcje pikowe z separacji SEC kompleksu SERT-8B6 do 2 mg/ml za pomocą koncentratora białek wirówki MWCO o mocy 100 kDa. Absorbancja 2 j.a. przy 280 nm jest równa 1 mg/ml.
  2. Dodaj dodatkowy Fab w stosunku 1:0,05 complex:free Fab. Dodaj 10 μM wolnego S-citalopramu.
  3. Wirować przy 100 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Zebrać supernatant zawierający kompleks SERT-Fab. Wyrzuć granulkę.
  4. Ustawić wiszący 24-dołkowy ekran w temperaturze 4 °C zgodnie z tabelą 1. Hoduj kryształy o jakości dyfrakcyjnej na roztworach zbiornikowych zawierających 100 mM Tris-NaOH, pH 8,5, 25 - 125 mM KCl, 32,5 - 34% PEG 400 i 0,5% kwasu 6-aminoheksanowego.
    UWAGA: Jako bufor należy stosować Tris dostosowany z NaOH do pH 8,5. Nie stosować bazy Tris wyregulowanej HCl. Sito można przygotować w probówkach o pojemności 2 ml i używać do końca. Zadbaj o dokładne pipetowanie PEG 400 za pomocą pipety wyporowej, ponieważ jest ona wyjątkowo lepka!
    1. Odpipetować 500 μl roztworu z każdego zbiornika na niskoprofilowej płytce 24-dołkowej z uszczelniaczem nałożonym na każdą studzienkę. Odpipetować 1,5, 1,75 i 2 μl kompleksu SERT-8B6 na 18 mm szkiełko nakrywkowe ze szkła silikonowanego. Odpipetować 1 μl roztworu rezerwuarowego na próbkę białka.
      UWAGA: Płyta została zakupiona z uszczelniaczem już nałożonym na krawędź studni.
    2. Przyłóż szkiełko zakrywające do 24-dołka z kroplami skierowanymi w stronę roztworu zbiornika i natychmiast uszczelnij, dociskając szkiełko przykrywkowe do szczeliwa wstępnie nałożonego do każdej studzienki.
    3. Kontynuuj, aż wszystkie 24 dołki zostaną ustawione.
    4. Gotową płytę pozostawić w dobrze izolowanym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C. Nie przeszkadzaj talerzom przez co najmniej 3 dni
      UWAGA: Monokryształy pojawią się w ciągu około 3 dni i urosną do 100-175 μm po 14 dniach.
  5. Zbieraj kryształy w kriopętlach i bezpośrednio schładzaj w cieczyN2 przed zebraniem danych dyfrakcji rentgenowskiej.
  6. W razie potrzeby znajdź dodatkowe warunki krystalizacji poprzez szerokie przesiewanie z wiszącymi kroplami. Użyj trzech kropli o proporcjach białko do strącania 2:1, 1,5:1, 1:1. Jeśli robot jest dostępny, umieść 100-150 nL kropli na 70 μl roztworu rezerwuarowego na 96-dołkowej płytce. Większe kryształy 3D można hodować w 24 dołkach.
  7. Wynik na podstawie wyglądu kropli: 0, przezroczysty; 1, pył; 2, osad ziarnisty; 3, separacja faz; 4, mikrokrystaliczny; 5, igły; 6, płytki; 7, kryształy 3D.
  8. Ustaw krystalizację metodą zawieszania kropli w 24 dołkach, jak opisano powyżej, wokół nowo zidentyfikowanych warunków.

Wyniki

W celu przesiewania mutacji termostabilizujących stworzono bibliotekę pojedynczych mutantów punktowych w tle SERTTC. Poszczególne mutanty wygenerowano przy użyciu standardowej mutagenezy. Protokół przesiewania wykorzystuje przejściowo transfektowane komórki HEK293S oraz test termostabilności oparty na bliskości scyntylacyjnej, aby szybko zidentyfikować mutacje przydatne do krystalizacji, zgodnie z opisem na Rysunku 1A. Wykres zależności wartości Tm od ilości związanego [3H]citalopramu w temperaturze pokojowej pozwala zidentyfikować konstrukty o wysokiej termostabilności i poziomach ekspresji odpowiednich do oczyszczania białka (Rysunek 1B). Trzy mutanty (Y110A, I291A i T439S) połączono w celu wytworzenia wysoce stabilnego konstruktu (Rysunek 1C). Termostabilność koreluje również ze zwiększoną stabilnością w detergentach o krótkich łańcuchach, które są niezbędne do krystalizacji kompleksu SERT-Fab.

Ekspresja ludzkiego SERT na dużą skalę z wykorzystaniem komórek HEK293S GnTI- transdukowanych bakulowirusami może zająć mniej niż 2 tygodnie i pozwolić na uzyskanie ilości rzędu miligramów, co zilustrowano na Rysunku 2A. Zastosowanie białka SERTCC z tagiem GFP umożliwia wygodne śledzenie SERT podczas ekspresji i oczyszczania za pomocą fluorescencji (Rysunek 2B). Nasza strategia oczyszczania obejmowała: 1) solubilizację SERT związanego z S-citalopramem z komórek HEK293S GnTI- w C12M w obecności CHS jako stabilizującego lipidu; 2) wiązanie SERT do macierzy powinowactwa Strep; 3) usuwanie zanieczyszczających białek poprzez intensywne przemywanie; oraz 4) elucję funkcjonalnego SERT buforem zawierającym desthiobiotynę (Rysunek 2C). Eluowane białko jest w dużej mierze wolne od innych wykrywalnych białek w barwieniu błękitem Coomassie i jest monodyspersyjne w ocenie FSEC (Rysunek 2D, E).

Podobną strategię zastosowano w celu oczyszczenia SERT z tagiem Strep II, który wykorzystano do rekonstytucji i immunizacji (Rysunek 3A, B). Wprowadzenie SERT do proteoliposomów zwiększa okres półtrwania w surowicy oraz stabilność SERT i poprawia prawdopodobieństwo wyizolowania przeciwciał o wysokim powinowactwie. Ponadto dodatek lipidu A, składnika bakteryjnej ścian komórkowej, służy jako silny adjuwant9. Liposomy wielowarstwowe przygotowano poprzez dodanie buforu do wysuszonej mieszaniny lipidowej w probówkach szklanych, a następnie resuspensowano w buforze. Ekstruzja liposomów przez filtry o rozmiarze porów 200 nm pozwala na otrzymanie monodyspersyjnych zawiesin liposomów jednowarstwowych. Liposomy nasyca się następnie detergentem, po czym dodaje oczyszczony SERT w detergencie. Na koniec detergent usuwa się poprzez dodanie hydrofobowej żywicy absorpcyjnej do mieszaniny lipidy:detergent. Do zrekonstytuowanej próbki należy dodać dodatkowy ligand, aby wyselekcjonować przeciwciała rozpoznające konformację związaną z lekiem przeciwdepresyjnym. Obecność SERT w proteoliposomach należy potwierdzić poprzez solubilizację niewielkiej próbki za pomocą barwnika do dociążania SDS-PAGE lub C12M, a następnie przeprowadzenie elektroforezy SDS-PAGE oraz FSEC (Rysunek 3C, D).

Linie komórkowe hybrydomy wykazujące ekspresję przeciwciał przeciwko SERT można przeszukiwać w celu znalezienia binderów o wysokim powinowactwie, które rozpoznają epitopy 3D. Właściwości te są kluczowe dla ostatecznego sukcesu krystalizacji, ponieważ przeciwciało musi pozostać silnie związane ze ustrukturyzowanym regionem, aby promować upakowanie kryształów jednorodnych, dobrze uporządkowanych domen. W pierwszym kroku identyfikuje się przeciwciała rozpoznające regiony nieustrukturyzowane. SERT jest denaturowany i przenoszony na membranę nitrocelulozową; przeciwciała wiążące denaturowany SERT będą pozytywne w analizie western i prawdopodobnie rozpoznają epitopy liniowe. Na Rysunku 4A przedstawiamy 2 przykłady przeciwciał, które są pozytywne w analizie western i prawdopodobnie nie będą przydatne w promowaniu krystalogenezy. Na Rysunku 4B pozostałe przeciwciała negatywne w analizie western są inkubowane z 100 nM SERT-GFP i rozdzielane za pomocą FSEC. Przeciwciała wiążące SERT przesuną piki GFP-dodatni na wcześniejszą pozycję. Kompleksy SERT-przeciwciało mogą być dalej rozcieńczane w detergencie w celu ustalenia, czy mogą wiązać się z powinowactwem nanomolarnym, a następnie poddane analizie FSEC. Dodanie serotoniny powoduje zmiany konformacyjne w transporterze, zatem przeciwciała można ponownie przesiać, aby sprawdzić, czy specyficznie rozpoznają konformację związaną z SSRI. Na Rysunku 4C pokazano, że przeciwciała wiążą SERT w obecności serotoniny, co wykazuje, że epitopy nie zmieniają się przy przejściu ze stanu związanego z SSRI do stanu związanego z substratem. Wreszcie, na Rysunku 4D testowane są kombinacje przeciwciał pod kątem ich zdolności do wiązania odrębnych epitopów, co skutkuje dalszym przesunięciem w lewo. W tym przypadku przeciwciała 15B8 lub 8A11 rozpoznają epitop inny niż 8B6.

Przeciwciało 8B6 wybrano do dalszych analiz strukturalnych na podstawie wstępnego przesiewu krystalograficznego fragmentu Fab poddanego działaniu papainy. Geny fragmentu Fab przeciwciała 8B6 sklonowano do wektora ekspresyjnego dla komórek owadziej. Fab może być ekspresowany i wydzielany przez komórki Sf9 hodowane w zawiesinie. Fragment 8B6 Fab można oczyścić z supernatantu komórek Sf9 za pomocą chromatografii powinowactwa do znaczników His (Rysunek 5A, B) oraz kationowymiennej (Rysunek 5C, D), co pozwala na uzyskanie białka, które na żelach SDS-PAGE wydaje się wolne od zanieczyszczeń. Na Rysunku 5E pokazano, że rekombinowany fragment 8B6 Fab wiąże SERT i jest wykorzystywany w kolejnych eksperymentach biochemicznych i biofizycznych.

Oczyszczony metodą powinowactwa SERTCC jest trawiony trombiną i EndoH, a następnie mieszany z Fab 8B6 w obecności S-citalopramu w celu utworzenia kompleksu. Kompleks transporter-przeciwciało jest następnie rozdzielany za pomocą SEC w C8M (Rysunek 6A), a frakcje szczytowe zawierają zarówno SERT, jak i Fab, co wykazano w SDS-PAGE (Rysunek 6B). Zastosowanie C8M jest kluczowe dla formowania kryształów, prawdopodobnie dlatego, że detergent o krótkim łańcuchu umożliwia lepsze upakowanie cząsteczek w sieci krystalicznej. FSEC jest wykorzystywany do określenia, które frakcje należy połączyć w celu krystalizacji (Rysunek 6C); nie należy łączyć frakcji, które nie są monodyspersyjne i/lub zawierają duże ilości wolnego SERT lub Fab.

Kryształy przeciwciał przeciwko SERT o kształcie pryzmatu można hodować w obecności S-citalopramu zgodnie z niniejszym protokołem, wykorzystując metodę dyfuzji pary w kropli wiszącej (Rysunek 7A). Uzyskane kryształy dyfrakują promienie rentgenowskie do rozdzielczości 3,15 Å10 (Rysunek 7B).

Analiza stabilności termicznej mutantów SERT; A: schemat procesu, B: wykres Tm w funkcji wiązania, C: wykres wiązania w funkcji temperatury.
Rysunek 1: Analiza termostabilności oparta na metodzie bliskościowej zliczania promieniowania (SPLAT). A. Przegląd protokołu przesiewania termostabilności w obecności [3H]citalopramu. B. Maksymalne wiązanie [3H]citalopramu w funkcji pozornej temperatury topnienia (Tm). Linie przerywane reprezentują wartości dla transportera WT. Oznaczono 3 najstabilniejsze termicznie mutanty. Szary obszar reprezentuje mutanty, które wykazują mniej niż 10% wiązania [3H]citalopramu w stosunku do WT, a zatem posiadają niedokładne wartości Tm ze względu na niski stosunek sygnału do szumu. C. Krzywe termostabilności dla WT SERTTC oraz 3 najlepszych mutantów. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe (S.D.). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

System ekspresji bakulowirusowej; schemat procesu ekspresji białka, mikroskopia fluorescencyjna, wyniki chromatografii, SDS-PAGE, analiza widma fluorescencji.
Rycina 2: Przegląd heterologicznej ekspresji białek ssaków. A. Schematyczny przegląd generowania wirusa BacMam i ekspresji SERT w komórkach HEK293S GnTI-. B. Komórki HEK293S GnTI- wykazujące ekspresję SERTCC (fluorescencja GFP). C. Profil elucji SERTCC na żywicy powinowactwa Strep. Zielona linia reprezentuje stężenie desthiobiotyny, 0 - 100% (0 - 5 mM). D. Analiza oczyszczonego metodą powinowactwa SERTCC na żelu SDS-PAGE 4 - 15%. E. FSEC oczyszczonego metodą powinowactwa SERTCC wykrytego za pomocą fluorescencji GFP (Wzbudzenie: 480 nm; Emisja: 510 nm). Pik eluujący przy 15 mL to SERT (#), a przy 18 mL to wolne GFP (*). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rekonstytucja liposomów, insercja SERT, proces immunizacji; chromatogram, elektroforeza w żelu, wykres fluorescencji.
Rycina 3: Reprezentatywne oczyszczanie powinowactwem i rekonstytucja SERTIC. A. Schematyczny przegląd generowania przeciwciał. B. Profil elucji obserwowany przy 280 nm podczas oczyszczania powinowactwem SERTIC na żywicy powinowactwa Strep. Zielona linia reprezentuje stężenie desthiobiotyny, 0 - 100% (0 - 5 mM). C. Analiza oczyszczonego powinowactwem i rekonstytuowanego SERT na żelu SDS-PAGE 4 - 15%. D. FSEC solubilizowanego SERT po rekonstytucji. Do detekcji SERT wykorzystano fluorescencję reszt tryptofanu (Wzbudzenie: 280 nm; Emisja: 335 nm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykresy western blot i chromatografii; analiza białek; fluorescencja vs. objętość; testy SERT.
Rysunek 4: Analiza reprezentatywnych przeciwciał przeciwko SERT. A. Przesiewowe badanie przeciwciał metodą western blot. Około 1 µg SERTCC z GFP lub bez GFP naniesiono na żel SDS-PAGE 4 - 15% i przeniesiono na membranę nitrocelulozową. Wiązanie wykryto przy użyciu koziego przeciwciała anty-mysiego sprzężonego z IR Dye. 2G4 i 10F2 są pozytywne w western blot. B. Wiązanie przeciwciał do 100 nM SERT znakowanego GFP i detekcja metodą FSEC przy użyciu fluorescencji GFP. C. Wiązanie wybranych fragmentów Fab do 100 nM SERT znakowanego GFP w obecności 1 mM serotoniny. D. Wiązanie fragmentów Fab 8A11 lub 15B8 do Fab SERT-8B6. Małe piki eluujące przy 18 mL to wolne GFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Żele SDS-PAGE, wykresy chromatograficzne, analiza fluorescencyjna wyników oczyszczania białka.
Rycina 5: Reprezentatywne oczyszczanie fragmentu Fab 8B6 z komórek Sf9. A. Profil elucji obserwowany przy 280 nm podczas oczyszczania fragmentu Fab 8B6 za pomocą chromatografii powinowactwa do znaczników His. Zielona linia reprezentuje stężenie imidazolu, 0 - 50% (0 - 250 mM). B. Żel SDS-PAGE w warunkach nieredukujących i redukujących po oczyszczaniu powinowactwem do znaczników His. Białko wędrujące w okolicy 50 kDa to nieredukowany fragment Fab (#), a niewielka frakcja przy 25 kDa to zredukowany fragment Fab (*). C. Profil elucji obserwowany przy 280 nm podczas oczyszczania fragmentu Fab 8B6 za pomocą wymiany kationowej, wykazujący pojedynczy symetryczny pik eluowany w liniowym gradiencie chlorku sodu. Zielona linia reprezentuje stężenie NaCl, 0 - 100% (0 - 500 mM). D. Analiza fragmentu Fab 8B6 na żelu SDS-PAGE 12,5% po oczyszczaniu metodą wymiany kationowej. E. Wiązanie fragmentu Fab 8B6 z 10 nM SERT znakowanym GFP, wykryte przy użyciu fluorescencji GFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki chromatografii; A: Wykres absorbancji; B: Żel białkowy; C: Wykres fluorescencji; analiza SERT.
Rysunek 6: Reprezentatywna chromatografia żelowa kompleksu SERT-8B6 w obecności S-citalopramu. A. Profil elucji z chromatografii żelowej oczyszczonego kompleksu SERT-8B6. Główny pik eluujący przy 11,5 mL to kompleks SERT-8B6. Pik przy 15 - 17 mL zawiera GFP i Fab. B. Analiza oczyszczonego kompleksu SERT-8B6 na żelu SDS-PAGE 4 - 15%. Pozycje SERT oraz łańcuchów ciężkiego i lekkiego Fab są zaznaczone kreską. C. FSEC frakcji rozdzielonych według wielkości. Kompleksy SERT-8B6 wykryto za pomocą fluorescencji tryptofanu. Frakcja 17 zawiera większą ilość SERT, który nie utworzył kompleksu z Fab. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki krystalizacji białka i dyfrakcji rentgenowskiej; kryształy na obrazie mikroskopowym, obraz dyfrakcyjny.
Rycina 7: Krystalizacja kompleksu SERT-8B6 związanego z S-citalopramem. A. Mikroskopia świetlna kryształów kompleksu SERT-8B6 o kształcie prostopadłościanów po 2 tygodniach wzrostu. Pasek skali odpowiada 200 µm. B. Kryształy SERT-8B6 dyfraktują promienie rentgenowskie do 3,15 Å. Niebieski pierścień reprezentuje 3,15 Å. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Tabela 1: Przesiew krystalizacji dla kompleksu SERT-8B6 związanego z S-citalopram. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Określenie struktury białek błonowych za pomocą technik biofizycznych pozostaje trudnym przedsięwzięciem dla wielu istotnych z medycznego punktu widzenia transporterów, receptorów i kanałów11. Tutaj dzielimy się szczegółową wiedzą specjalistyczną opracowaną w celu określenia struktury ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem. Przewidujemy, że metody te będą przydatne do określania struktur SERT w innych stanach konformacyjnych, a także struktur innych trudnych białek błonowych. Co więcej, opisane tutaj techniki biochemiczne mogą być również wykorzystane do badania funkcji oczyszczonego SERT w detergentach i prawie natywnym środowisku lipidowym.

Krystalizacja SERT opierała się na opracowaniu kilku narzędzi i technik. Po pierwsze, poprawa termostabilności transportera pozwoliła na uzyskanie wariantów SERET, które zachowywały się dobrze w różnych micelach detergentowych po ekstrakcji transportera z membran6. Po drugie, zastosowanie ligandu S-citalopramu o wysokim powinowactwie podczas oczyszczania i krystalizacji jeszcze bardziej poprawiło stabilność i zmniejszyło niejednorodność konformacyjną. Po trzecie, opracowanie systemu ekspresji BacMam7 pozwoliło na produkcję dużych ilości SERT w krótkim okresie 2 tygodni, ułatwiając zarówno immunizację, jak i krystalizację. Wreszcie, opracowanie strategii selekcji przeciwciał o wysokim powinowactwie, które rozpoznają epitopy 3D, pozwoliło na odkrycie przeciwciała 8B6, które sprzyja dobrze uporządkowanemu pakowaniu kompleksów przeciwciał SERT w kryształy.

Istnieje szereg krytycznych kroków i odczynników, a także typowych problemów, które często występują w całym protokole. Po pierwsze, generowanie wirusa SERT P2 o wysokim mianie może być problematyczne. Dodanie niskich stężeń wirusa P1 w celu wygenerowania wirusa P2, jak opisano w tym protokole, zwykle łagodzi ten problem, aw przypadkach, gdy miano wirusa P2 jest niskie, wirus P3 może być wytwarzany przy użyciu wirusa przy MOI 0,0001. Wirusy o mianie mniejszym niż 1 x 108 cząsteczek wirusa/ml nie powinny być stosowane i prawie zawsze powodują niską wydajność białka. Do ekspresji wybrano HEK293S komórki GnTI, ponieważ nie mają one aktywności N-acetyloglukozaminylotransferazy I, a zatem nie mogą syntetyzować złożonych N-glikanów, zamiast tego wytwarzając tylko N-glikany o wysokiej zawartości mannozy. EndoH rozszczepia glikozylację sprzężoną z N glikanów o wysokiej zawartości mannozy w dwóch miejscach w pętli zewnątrzkomórkowej 2 (EL2), pozostawiając N-acetyloglukozaminę przyłączoną do asparaginy. Trawienie cukrów sprzężonych z N zmniejsza entropię powierzchniową EL2, która jest prawdopodobnie ważna dla krystalizacji. Do wytwarzania przeciwciał do immunizacji należy użyćukładu scalonego SERT. GFP jest wysoce immunogennym12 i nie powinien być używany jako znacznik fuzyjny do generowania przeciwciał, ponieważ jest trudny do całkowitego usunięcia przez SEC. Elastyczny N- i C-koniec SERT również nie został uwzględniony w konstrukcie, aby uniknąć przeciwciał przeciwko tym regionom. Myszy można uodpornić 30 μg odtworzonego białka; Kontynuuj immunizację myszy, aż do momentu, gdy będzie można wykryć wysokie stężenia przeciwciał w surowicy i wytworzyć komórki hybrydoma, jak opisano13. Konstrukt termostabilizowany jest zwykle najlepszym wyborem do immunizacji; Jeśli transporter zachowuje się dobrze i zachowuje aktywność biologiczną po oczyszczeniu, często wystarcza to do wytworzenia przeciwciał. Przeciwciało 8B6 zostało podniesione przeciwko WT SERT. Do krystalizacji należy połączyć i zagęścić tylko frakcje pikowe z SEC zawierające kompleks monodyspersyjny, zgodnie z oceną FSEC. Kryształy SERT-8B6 rosną w wąskim zakresie warunków i istnieje szereg kroków, które należy podjąć, aby rozwiązać problemy związane ze wzrostem kryształów SERT. Baza Tris dostosowana HCl nie powinna być stosowana w roztworze zbiornikowym, ponieważ bufor ten nie wspomaga wzrostu kryształów; dlatego tak ważne jest, aby zamiast tego stosować Tris dostosowany za pomocą NaOH. Kryształy SERT rosną w wąskim zakresie stężeń PEG 400, więc jeśli kryształy nie rosną lub jeśli obserwuje się wiele małych kryształów, zaleca się nawet niewielki wzrost lub spadek stężenia PEG 400. Co więcej, dodatek kwasu 6-aminoheksanowego został również wykorzystany w zoptymalizowanym badaniu przesiewowym w celu poprawy zarodkowania. Stosunek kropli roztworu białko do studni jest również kluczowym czynnikiem decydującym o wzroście kryształów. Zalecane są proporcje kropli 1,5 - 2:1, przy czym proporcje kropli bliższe 2:1 zazwyczaj wspierają wzrost większych trójwymiarowych kryształów. Wreszcie, zastosowanie niskoprofilowych płytek 24-dołkowych ma również kluczowe znaczenie dla wzrostu kryształów, prawdopodobnie ze względu na modyfikację szybkości dyfuzji pary.

Opracowano alternatywne podejście do metody SPA w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w kierunku mutantów, które stabilizują szczurzy transporter serotoniny w konformacji związanej z kokainą przy użyciu testu wiązania filtra5. W przeciwieństwie do tego, test oparty na SPA pozwala na sekwencyjne etapy ogrzewania następujące po określeniu frakcji SERT, która pozostaje związana z ligandem. Pozwala to na szybkie określenie temperatury topnienia na podstawie niewielkiej liczby próbek. Metoda SPA opiera się na dostępności znakowanego radioaktywnie liganda o wysokim powinowactwie, a jeśli nie są znane żadne ligandy, które wiążą się z powinowactwem submikromolowym, konieczne będzie alternatywne podejście. Wiele innych metod jest powszechnie stosowanych do pomiaru stabilności białek, takich jak wiązanie barwników fluorescencyjnych i kalorymetria14 , ale są one niskoprzepustowe i albo nie są w stanie bezpośrednio mierzyć funkcji, albo wymagają dużych ilości białka. Jeżeli nie można zastosować metody SPA, jednym z alternatywnych podejść o wysokiej przepustowości jest test termostabilności15 oparty na FSEC (FSEC-TS), w którym próbka jest podgrzewana, a następnie oddzielana jest frakcja pozostałego transportera. FSEC-TS jest użytecznym podejściem do uzyskiwania dostępu do zachowania chromatograficznego i stanu oligomerycznego oraz jest potężnym narzędziem uzupełniającym, które może być stosowane wraz z metodą SPA.

Stwierdzono również, że porównanie różnych powszechnych systemów ekspresji białek sprzyja wykorzystaniu komórek ssaków do ekspresji SERT16 i, co nie jest zaskakujące, jest to prawdopodobne w przypadku wielu białek pochodzenia ssaków. Metody, których użyliśmy do odciągania pokarmu, zostały dostosowane do SERC, ale prawdopodobnie można je łatwo dostosować. Warunki, które sprzyjają wysokim poziomom ekspresji, powinny być starannie zidentyfikowane poprzez zmianę czasu ekspresji, temperatury, stężenia wirusa i obecności inhibitorów deacetylazy histonowej, takich jak maślan sodu.

Generalnie zalecamy oczyszczanie powinowactwa w łagodnym detergentie o długich łańcuchach, takim jak C12M, wraz z CHS przed rozpuszczeniem, aby zachować wiązanie ligandów o wysokim powinowactwie. Rekonstytucja przy użyciu absorpcji hydrofobowej jest łagodną techniką, która okazała się skuteczna w przypadku kilku innych transporterów i receptorów. Jeśli to się nie powiedzie, można zastosować usuwanie detergentów o wysokich krytycznych stężeniach miceli za pomocą dializy, rozcieńczania lub SEC17 pod warunkiem, że antygen jest wystarczająco stabilny w takich detergentach. W przypadkach, gdy nie znaleziono odpowiednich przeciwciał, prawie zawsze stwierdzamy, że problem jest spowodowany utratą funkcji lub denaturacją antygenu i w takich przypadkach z powodzeniem przeprowadziliśmy nowe immunizacje, zwracając szczególną uwagę na biochemię białek. Wreszcie, ligandy i przeciwciała, które wiążą się z wysokim powinowactwem, powinny stanowić podstawę do racjonalnie zaplanowanego eksperymentu krystalizacji, a wykorzystując wariant termostabilny, można przebadać szerszy zakres warunków, zmieniając właściwości różnych detergentów. Ponadto krystalizacja w mezofazielipidowej 18 lub przy użyciu biceli19 powinna być zawsze brana pod uwagę jako alternatywa dla krystalizacji w miceli.

Te zasady i metody mogą być stosowane z pewnymi modyfikacjami dla wielu innych białek transbłonowych, które są trudne do ekspresji i oczyszczenia z innych gospodarzy ekspresyjnych, i będą szczególnie przydatne do określania struktury celów leków o wysokim powinowactwie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy D. Cawleyowi za stworzenie przeciwciał monoklonalnych. Dziękujemy A. Penmatsa i K. Wang za podzielenie się pomysłami i wiedzą specjalistyczną opracowaną na podstawie transportera dopaminy. L. Vaskalis za pomoc przy rysunkach, H. Owen za pomoc w przygotowaniu manuskryptu i inni członkowie laboratorium Gouaux za pomocne dyskusje. J.A.C. jest wspierany przez stypendium podoktorskie Banting z Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. jest wspierany przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship. Jesteśmy szczególnie wdzięczni Berniemu i Jennifer LaCroute za ich hojne wsparcie, a także za finansowanie z NIH (5R37MH070039). E.G. jest badaczem w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DH10BacInvitrogen10361-012
KanamycynaFisher BP906-5
GentamycynaFisherBP918-1
TetracyklinaSigmaT-7660
Bluo-galInvitrogen15519-0285-bromo-3-indolyl β-D-galaktopiranozyd
izopropylowy beta-D-1-tiogalaktopiranozydAnatraceI1003IPTG
Zestaw do miniprzygotowaniaQiagen27106
Cellfectin IIInvitrogen10362-100Odczynnik do transfekcji Sf9
Sf9ATCCCRL-1711
Sf-900 III SFM mediaLife Technologies12658-027
HEK-293S GnTI-ATCCCRL-3022
Freestyle 293 mediaLife Technologies12338-018293 media ekspresyjne
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Life Technologies0984018DJ
Maślan soduSigma303410
S-citalopramSigmaE4786Anagrade
n-dodecyl-beta-D-maltopiranozydAnatraceD310
Hemibursztynian cholesteroluSigmaC6013
1-palmitoilo-2-oleoiloilo-sn-glicero-3-fosfocholinaAvanti Polar Lipids850457P
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminaAvanti Polar Lipids850757P
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoglicerolAvanti Polar Lipids840457P
LeupeptinSigmaL2884
Pepstatin ASigmaP5318
AprotininSigmaA1153
PMSFSigmaP7626
DesthiobiotinIba Life Sciences2-1000-05
AsolectinSigma11145
CholesterolSigmaC-8667
Lipid ASigmaL5399
Lipid polarny mózguAvanti Polar Lipids141101C
BiobeadsBiorad152-3920Hydrofobowa żywica absorpcyjna
Kozia anty-mysia IRDye 680RDOdyssey926-68070Stosowana jako przeciwciało wtórne dla western blot
Lauryl maltoza glikol neopentylowyAnatraceNG310Anagrade
SerotoninaSigmaH9523
pFastBac 8B6Dostępne u autorów
pEG Bacmam SERT Strep IISERTIC, Dostępne u autorów
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep HisSERTTC, Dostępne u autorów
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep HisSERTCC, Dostępne u autorów
ImidazoleSigma56749
n-oktyl β-D-maltozydAnatraceO310Anagrade
TrombinHaematologic TechnologiesHCT-0020
EndoHNew England BiolabsP0702
Trizma-HClSigmaT5941Tris służy do przygotowania zbiorników krystalizacyjnych:
PEG 400Sigma91893
Kwas 6-aminoheksanowySigma7260
Trypsyna-EDTAFisherMT25052CV
Isoplate-96 TCPerkinElmer6005070
PolyJetSignaGenSL100688Odczynnik do transfekcji polimerów do komórek sutkowych
Miedziane koraliki HIS-Tag YSI SPAPerkinElmerRPNQ0096His-tag affinity Koraliki SPA
Citalopram, [N-Metylo-3H]PerkinElmerNET1039250UC
ThermoMixer CEppendorf5382000023blok grzewczy do oznaczania termostabilności
ThermoTopEppendorf5308000003
SmartBlock PCR 96, termoblok do płytek PCREppendorf5306000006
0,2 i mikro; m filtr strzykawkowyOlympus Plastics25-243
System filtracyjny 1 LCorning430517
2 L płaskodenna kolba do hodowli tkankowychGenemateF-5909-2000
L z przegrodąGenemateF-5909-2000B
CO2Thermo Scientific3950
Forma Orbital ShakerThermo Scientific416
Żywica Strep-TactinIba Life Sciences2-1208-025żywicy powinowactwa do paciorkowców
System obrazowania Northern
Koncentrator białka MWCO 100 kDaMilliporeUFC910096
30 kDa koncentrator białka MWCOMilliporeUFC903024
Ä kta FPLCGE HealthcareUPC-900
HPLCShimadzu51476
Superose 6 (10/300) kolumnaGE Healthcare17-5172-01Używana do
aparatu FSEC z przepływem stycznymPall Filtron
0,2 i mikro; m filtr styczny komora przepływowaPall FiltronPSM20C11
30 kDa MWCOŻywica Pall FiltronOS030T12
TalonClonetech635504Żywica powinowactwa His-tag używana do oczyszczania Fab
Kolumna HiTrap SP 1 mlWymiennik kationowy GE Healthcare 17115101 używany do oczyszczania
Fab Kolumna Superdex 200 10/300 GLGE Healthcare17-5175-01Służy do separacji SEC
24-dołkowej płytki VDXmHampton ResearchHR3-306
18 mm Szkiełka nakrywkoweHampton ResearchHR3-239
Licznik wirusów VirocytVirocyt2100
MicroBeta TriluxPerkinElmer145096-dołkowy licznik scyntylacyjny
Kolumna HiTrap SPGE Opieka zdrowotna17115101
SertralineSigmaS6319
2 Inkubator Wytłaczarka Lipids Li-Cor System obrazowania Western Blot Odyssey Kolumna XK16 Kolumna GE Healthcare 28-9889-37 używana do oczyszczania Strep-Tactin i Talon Koncentrator przepływu stycznego SERT-8B6

Bibliografia

  1. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).
  2. Broer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters. Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).
  3. Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters. Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).
  4. Hahn, M. K., Blakely, R. D. The functional impact of SLC6 transporter genetic variation. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).
  5. Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation. J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).
  6. Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation. Plos One. 10 (12), e0145688(2015).
  7. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  8. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  9. De Becker, G., et al. The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells. Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).
  10. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. , (2016).
  11. White, S. H. The progress of membrane protein structure determination. Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).
  12. Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).
  13. Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines. Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).
  14. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  16. Tate, C. G., et al. Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter. Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).
  17. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  18. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
  19. Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wiązanie S-citalopramuekspresja w bakulowirusachkomórki HEK293Srekonstytucja proteoliposomówekspresja fragmentów przeciwciałchromatografia żelowakrystalografia rentgenowskastabilizacja białek błonowych
Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.