Wytwarzanie platformy testów immunologicznych UV-VIS i spektroskopii Ramana

Podsumowanie

Sondy optyczne oparte na nanocząstkach zostały zaprojektowane jako nośnik do wykrywania antygenów za pomocą spektroskopii Ramana i UV-Vis. W tym miejscu opisujemy protokół przygotowania takich sond do testu immunologicznego spektroskopii UV-Vis/Ramana w taki sposób, aby uwzględnić przyszłe możliwości multipleksowania.

Streszczenie

Testy immunologiczne są używane do wykrywania białek na podstawie obecności powiązanych przeciwciał. Ze względu na ich szerokie zastosowanie w warunkach badawczych i klinicznych, można znaleźć dużą infrastrukturę instrumentów i materiałów do testów immunologicznych. Na przykład 96- i 384-dołkowe płytki polistyrenowe są dostępne na rynku i mają standardową konstrukcję, aby pomieścić maszyny do spektroskopii w ultrafiolecie widzialnym (UV-Vis) różnych producentów. Ponadto dostępna jest szeroka gama immunoglobulin, znaczników detekcyjnych i środków blokujących do niestandardowych projektów testów immunologicznych, takich jak testy immunoenzymatyczne (ELISA).

Pomimo istniejącej infrastruktury, standardowe zestawy ELISA nie spełniają wszystkich potrzeb badawczych, wymagając indywidualnego opracowania testu immunologicznego, co może być kosztowne i czasochłonne. Na przykład zestawy ELISA mają niskie możliwości multipleksowania (wykrywania więcej niż jednego analitu na raz), ponieważ zwykle zależą od metod fluorescencyjnych lub kolorymetrycznych do wykrywania. Analizy kolorymetryczne i fluorescencyjne mają ograniczone możliwości multipleksowania ze względu na szerokie piki spektralne. Natomiast metody oparte na spektroskopii Ramana mają znacznie większe możliwości multipleksowania ze względu na wąskie piki emisji. Kolejną zaletą spektroskopii Ramana jest to, że reporterzy Ramanowcy doświadczają znacznie mniej fotowybielania niż znaczniki fluorescencyjne¹. Pomimo przewagi, jaką reporterzy Ramanowcy mają nad znacznikami fluorescencyjnymi i kolorymetrycznymi, protokoły wytwarzania testów immunologicznych opartych na Ramanie są ograniczone. Celem pracy jest przedstawienie protokołu przygotowania funkcjonalizowanych sond do użycia w połączeniu z płytkami polistyrenowymi do bezpośredniego wykrywania analitów za pomocą analizy UV-Vis i spektroskopii Ramana. Protokół ten pozwoli naukowcom na samodzielne podejście do przyszłego wykrywania wielu analitów, przy jednoczesnym wykorzystaniu wcześniej ustalonej infrastruktury.

Wprowadzenie

Typowe testy immunologiczne typu sandwich pośrednio wykrywają obecność antygenu za pomocą dwóch przeciwciał. Wychwytywane przeciwciało jest związane z powierzchnią ciała stałego i tworzy kompleks przeciwciało-antygen, gdy znajduje się w pobliżu odpowiedniego antygenu. Następnie wprowadzane jest przeciwciało wykrywające, które wiąże się z antygenem. Po umyciu kompleks przeciwciało/antygen/przeciwciało pozostaje i jest wykrywany przez znakowane przeciwciało wykrywające, jak pokazano na rysunku 1A. Typowa detekcja odbywa się za pomocą detektora fluorescencyjnego lub kolorymetrycznego, ograniczającego multipleksowanie do 10 analitów ze względu na szerokie....

Protokół

1. Przygotowanie buforów

1. Fosforanowy bufor solny (PBS)
   1. Rozcieńczyć 50 ml 10x PBS w 450 ml wody klasy HPLC, aby uzyskać stężenie 1x PBS. Przesączyć roztwór przez filtr sterylny 0,22 µm.
   2. Przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej.
2. Przygotowanie buforu Tris-saline z Tween 20 (TBST)
   1. Rozcieńczyć 50 ml 10x buforu Tris-saline (TBS) w 450 ml wody klasy HPLC, aby uzyskać stężenie 1x. Dodać 250 μl Tween-20, aby uzyskać stężenie 0,05% (v/v) Tween-20. Przesączyć roztwór przez filtr sterylny 0,22 μm.
   2. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
3. <....

Wyniki

W niniejszym badaniu do spektroskopii UV-Vis wykorzystano złote nanocząstki o rozmiarze 60 nm. Zebrano widma absorbancji UV-Vis w zakresie od 400 do 700 nm, a pola powierzchni pików dla każdego stężenia AuNP wyznaczono przy użyciu otwartoźródłowego oprogramowania do analizy widmowej⁸. Przed całkowaniem pików zebrane widma poddano korekcji linii bazowej z zastosowaniem dopasowania wielomianowego trójstopniowego. Pola powierzchni pików wykorzystano do wygenerowania logarytmicznej krzywej kalibracyjnej, co przeds.......

Dyskusja

W szczegółowym protokole znajduje się kilka krytycznych punktów, do których należy się odnieść. Jedną z kwestii jest wybór reportera Ramana i nanocząstki złota. Chociaż protokół został napisany tak, aby można go było dostosować do indywidualnego użytku, jako przykład użyto DTTC reportera Ramana. DTTC jest dodatnio naładowanym reporterem i wiąże się z ujemnie naładowanymi powierzchniami, takimi jak AuNP pokryte cytrynianem. Protokół ten można dostosować do ujemnie naładowanych reporterów poprzez zastosowanie nanocząstek z.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nanocząstka złota 60 nm	Ted Pella, Inc.	15708-6	Są to nanocząstki złota pokryte cytrynianem. Proszę zapoznać się z Dyskusją, aby zapoznać się z relacjami między reporterem Ramana a ładunkiem powierzchniowym AuNP i jego wpływem na prawidłowy wybór AuNP i/lub reportera Ramana.
Wodorowęglan sodu	Fisher Scientific	S233-500
Metanol	Pharmco-Aaper	339000000
Tris Sól fizjologiczna buforowana (10x) pH 7,5	Scy Tek	TBD999
Butelkowa jednostka filtracyjna	VWR	97066-202
Tween 20 (polisorbat 20)	Scy Tek	TWN500	Stosowany jako środek emulgujący do etapów mycia.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10x koncentrat, pH 7,4	Ski Tek	PBD999
Białko LoBind Tube 2.0	ml Probówki Eppendorfa	22431102	probówki LoBind zapobiegają wiązaniu białek i AuNP z powierzchniami probówek.
Białko LoBind Tube 0,5  ml	Probówki Eppendorfa	22431064	probówki LoBind zapobiegają wiązaniu białek i AuNP z powierzchniami probówek.
Urządzenia do mikropłytek UniSeal	GE Healthcare	7704-0001	Służy do uszczelniania i przechowywania płytek funkcjonalnych.
Płytka testowa, z pokrywą o niskim parowaniu, 96 studni z płaskim dnem	Costar	3370
Woda klasy HPLC	Sigma Aldrich	270733-4L
3,3′-Diethylthiatricarbocyjanina jodek (DTTC)	Sigma Aldrich	381306-250MG	Raman reporter
mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram	Laysan Bio, Inc.	MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1  gram	Laysan Bio, Inc.	OPSS-PEG-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA ma końcówkę NHS.
Mysia IgG, kontrola całych cząsteczek	Thermo Fisher Scientific	31903	Antygen
Kozioł anty-mysi IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne	Thermo Fisher Scientific	31164
Roztwór blokujący albuminę ludzkiej surowicy	tego można użyć albuminy surowicy bydlęcej Sigma	Aldrich	A1887-1G
Mini wirówka	Fisher Schientific	12-006-900
Spektrofotometr UV-Vis	Thermo Scientific	Nanodrop 2000c
Spektrofotometr UV-Vis	BioTek	Synergy 2
Kolumny odsalające	Thermor Scientific	87766
Zbudowany we własnym zakresie 785  Odwrócony mikroskop Ramana nm	N/A	N/A	Odwrócony mikroskop Ramana najlepiej nadaje się do prawidłowego ustawiania ostrości na powierzchni płytki studzienki. W przeciwnym razie zostanie użyte bardzo małe powiększenie ze względu na wysokość 96-dołkowej płytki. Użyto systemu zbudowanego we własnym zakresie, ponieważ był tańszy niż kupowanie od sprzedawcy. Można jednak użyć dowolnego dostępnego na rynku odwróconego mikroskopu ramanowskiego.

Zamiast .