Artykuł metodologiczny

Charakterystyka proteomiczna egzosomów z komórek zakażonych HIV-1 na podstawie SILAC

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54799

⸱

3 marca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Brown University, 2COBRE Center for Cancer Research, Lifespan Laboratories, Rhode Island and Miriam Hospitals, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Warren Alpert Medical School, Brown University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy ilościową metodę proteomiki wykorzystującą technikę znakowania stabilnych izotopów przez aminokwasy w hodowli komórkowej (SILAC) do analizy wpływu zakażenia HIV-1 na egzosomalne proteomy gospodarza. Protokół ten można łatwo dostosować do komórek w różnych warunkach stresu lub infekcji.

Streszczenie

Proteomika to analiza białek na dużą skalę. Techniki proteomiczne, takie jak tandemowa spektroskopia mas z chromatografią cieczową (LC-MS/MS), mogą charakteryzować tysiące białek jednocześnie. Te potężne techniki pozwalają nam na systemowe zrozumienie zmian komórkowych, zwłaszcza gdy komórki są poddawane różnym bodźcom, takim jak infekcje, stres i określone warunki testowe. Nawet przy najnowszych osiągnięciach analiza proteomu egzosomalnego jest czasochłonna i często wymaga złożonych metodologii. Ponadto uzyskany w ten sposób duży zbiór danych często wymaga solidnej i usprawnionej analizy, aby naukowcy mogli przeprowadzić dalsze badania. W tym miejscu opisujemy protokół oparty na SILAC do charakteryzowania proteomu egzosomalnego, gdy komórki są zakażone wirusem HIV-1. Metoda opiera się na prostym znakowaniu izotopów, izolacji egzosomów z komórek znakowanych różnicowo oraz analizie spektrometrii mas. Następnie następuje szczegółowa eksploracja danych i analiza bioinformatyczna uderzeń proteomicznych. Wynikowe zestawy danych i kandydaci są łatwe do zrozumienia i często oferują bogactwo informacji, które są przydatne do dalszej analizy. Protokół ten ma zastosowanie do innych przedziałów subkomórkowych i szerokiego zakresu warunków testowych.

Wprowadzenie

Wiele chorób ludzkich, w tym infekcje wirusowe, są często związane z charakterystycznymi procesami komórkowymi, które zachodzą w i wokół dotkniętych komórek. Białka, często działające jako ostateczne efektory komórkowe, pośredniczą w tych procesach. Analiza białek często może dostarczyć bezcennych informacji na temat lokalnego środowiska komórek dotkniętych chorobą i pomóc nam zrozumieć mechanizm leżący u podstaw patogenezy choroby. Wśród różnych technik analizy białek proteomika jest szczególnie obiecująca. Jako potężne narzędzie na dużą skalę, proteomika może zapewnić systemowe zrozumienie procesów komórkowych, szczególnie w obszarze funkcji i interakcji białek. Analiza określonych białek jest prostsza dzięki opracowaniu technik znakowania, które pozwalają badaczom monitorować ekspresję składników komórkowych, w szczególności białek, w miejscu badania. Chociaż przeprowadzono wiele analiz proteomicznych w skali proteomu komórkowego, charakterystyki proteomiczne przedziałów subkomórkowych okazały się szczególnie pouczające1. Jest to dobrze zilustrowane w badaniach nad zakażeniem wirusem HIV-1.

Egzosomy, pęcherzyki błonowe o długości 30-100 nm wydzielane przez szeroki zakres typów komórek2,3, są kluczowymi składnikami komunikacji międzykomórkowej i transportu molekularnego. Wcześniej odkryto, że odgrywają one ważną rolę w procesie pączkowania HIV-14,5. Łącząc analizę proteomiczną z funkcjonalnym rozbiorem, odkryliśmy, że egzosomy uwalniane z komórek zakażonych wirusem HIV-1 składają się z unikalnej i ilościowo różnej sygnatury białkowej i zawierają cząsteczki regulatorowe, które wpływają na właściwości komórkowe sąsiednich komórek receptywnych, w tym apoptozę komórkową i proliferację6. Metody są opisane w tym protokole, a mianowicie SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture)7 oparta na proteomicznej charakterystyce egzosomów z komórek zakażonych HIV-1. Podobne podejścia można zastosować w celu lepszego zrozumienia innych przedziałów subkomórkowych podczas patogenezy poprzez dostosowanie stresu eksperymentalnego do określonego przedziału lub frakcji będącej przedmiotem zainteresowania i wprowadzenie niezbędnych zmian w opisanych procedurach.

Biorąc pod uwagę niedawny rozwój ilościowych metod proteomicznych, jest wiele do wyboru przy wyborze najbardziej efektywnej metody dla konkretnego eksperymentu. Wśród nich znajdują się techniki iTRAQ (znaczniki izobaryczne do względnej i bezwzględnej kwantyfikacji)8 oraz bezznacznikowe techniki MRM (multiple reaction monitoring)9. Obie metody są potężnymi narzędziami i są dobrym wyborem dla określonych ustawień. Dla typowego laboratorium pracującego głównie z liniami komórkowymi te dwie metody wiążą się jednak ze stosunkowo wyższymi kosztami i są bardziej czasochłonne w porównaniu z metodą opartą na SILAC. SILAC to technika znakowania oparta na metabolizmie, która włącza nieradioaktywne izotopowe formy aminokwasów z pożywki hodowlanej do białek komórkowych. Zazwyczaj eksperymenty SILAC rozpoczynają się od dwóch populacji komórek, na przykład zakażonych i niezainfekowanych. Każdy z nich jest znakowany różnicowo w swoim specyficznym środowisku izotopowym, aż do uzyskania pełnego znakowania. Znakowane egzosomy tych komórek są następnie poddawane ekstrakcji białek. Po ekstrakcji znakowane białka egzosomalne są analizowane za pomocą tandemowej spektroskopii mas chromatografii cieczowej10. Na koniec wyniki spektrometrii mas i znacząco znakowane białka są poddawane analizom statystycznym i bioinformatycznym oraz rygorystycznej weryfikacji biochemicznej. Nasze poprzednie raporty badawcze sugerują, że procedury SILAC / egzosomy są bardziej odpowiednie dla linii komórkowych niż komórek pierwotnych, ponieważ linie komórkowe są zwykle w stanie aktywnej proliferacji w celu wydajnego znakowania izotopowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i zakażenie wirusem HIV-1

UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentów zaleca się sprawdzenie żywotności komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym11 i ich proliferację za pomocą testu MTT12. Bardzo ważne jest również użycie nowo przygotowanego podłoża SILAC. Można stosować różne linie komórkowe, o ile znajdują się one w fazie aktywnej proliferacji i są podatne na zakażenie wirusem HIV-1 lub wybrany stan testowy. W tym protokole użyj linii komórkowej H9 jako przykładu.

  1. Zasiać 2 x 106 komórek H9 do każdej kolby do hodowli komórkowej. Hoduj jedną grupę w 10 ml oznakowanej pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% dializowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 mg / L 13C6 L-lizyny i 100 mg / L 13C615N4 L-argininy. Hoduj drugą grupę w 10 ml nieznakowanej pożywce RPMI 1640, z 10% dializowanym FBS, 100 mg/L L-lizyną i 100 mg/L L-argininą.
  2. Hoduj komórki przez sześć podwojeń, po czym białka komórek w znakowanej pożywce są praktycznie całkowicie znakowane (>99%) ciężkimi aminokwasami. Dodawaj nowe nośniki lub zmieniaj je regularnie (co 1-3 dni, w zależności od typu komórki. W przypadku komórki H9 zmieniaj pożywkę co 3 dni). Pod koniec znakowania zwiększ objętość kultury (np. ~30 ml), aby dostosować się do wzrostu większej liczby komórek.
    UWAGA: Określ dokładny czas podwajania komórek na początku eksperymentu za pomocą barwienia błękitem trypanowym i zliczania komórek.
  3. Zakażone znakowane komórki wirusemHIV-1 NL4-3 należy zainfekować przy użyciu standardowego protokołu zakażenia HIV-113 przez 48 godzin. Inkubować komórki z odpowiednią ilością wirusa o wielokrotności infekcji (MOI) około 0,3. Sprawdź zakażenie HIV-1 poprzez kwantyfikację p24 supernatantów hodowli przy użyciu zestawu ELISA antygenu p24 HIV-1. Wykonaj test immunofluorescencyjny14, aby potwierdzić udaną infekcję komórek. Kontynuuj hodowlę nieznakowanych komórek na nieznakowanym podłożu bez zakażenia HIV-1.
  4. Zebrać supernatanty z obu grup pod koniec infekcji (krok 2.1).

2. Izolacja egzosomów

UWAGA: Poprzez serię etapów ultrawirowania, frakcje egzosomalne z supernatantów hodowlanych są wzbogacane15. Wykonać wszystkie poniższe czynności w temperaturze 4 °C, za pomocą wirnika ultrawirówki, który może osiągnąć prędkość co najmniej 100 000 x g.

  1. Zebrać supernatanty z kultur w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml, omijając komórki. Wirować je przez 10 minut przy 300 x g, aby usunąć pozostałe komórki.
  2. Zebrać supernatanty do nowych stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować je przez 10 minut przy 2 000 x g w celu usunięcia martwych komórek. Przenieś powstałe supernatanty do komercyjnych probówek kompatybilnych z wirnikiem, które są w stanie wytrzymać ultrawirowanie.
  3. Pamiętaj, aby wyważyć probówki ultrawirówkowe. Wirować probówki przez 30 minut przy 10 000 x g, aby usunąć resztki komórek.
  4. Zebrać supernatanty do probówek ultrawirówek i wirować przez 70 minut przy 100 000 x g. Odrzucić supernatanty.
  5. Zawiesić granulki bogate w egzosomy w 5 ml świeżego PBS. Przenieść roztwory do świeżych probówek ultrawirówek i ponownie odwirować przez 70 minut przy 100 000 x g.
  6. Odrzucić supernatanty. Aby przechowywać egzosomy przez długi czas, ponownie zawieś granulki w 50 μl PBS i przechowuj w temperaturze -80 °C. Alternatywnie przejdź bezpośrednio do ekstrakcji białek, jak pokazano poniżej.

3. Ekstrakcja i przygotowanie białka

  1. Rozpuść izolowane granulki egzosomalne w 100-200 μl buforu do lizy i ekstrakcji RIPA z dodatkiem koktajli inhibitorów proteazy. Bufor składa się z 25 mM trischlorowodorku, 150 mM chlorku sodu, 1% NP-40, 1% deoksycholanu sodu i 0,1% SDS (dodecylosiarczanu sodu) o pH 7,6. Koktajle inhibitorów proteazy powinny zawierać różne inhibitory proteazy, takie jak aprotynina, bestatyna, leupeptyna, pepstatyna A i EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), które mogą hamować pełną gamę proteaz.
  2. Rozpuszczone roztwory odwirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 x g (4 °C) i przenieść oczyszczone supernatanty do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  3. Określ ilościowo stężenie białka w każdej próbce egzosomów za pomocą kwasu bicinchoninowego (BCA) lub testu Bradforda16.
  4. Wymieszać równą ilość białek (2 μg) z znakowanych i nieznakowanych próbek i uruchomić równą mieszaninę na 4-20% żelu SDS-PAGE przy 120 mA/200 V przez 30 minut.
  5. Odbarwić żel Coomassie Blue, a następnie odbarwić17.
  6. Za pomocą żyletki odetnij pas próbki od żelu. Następnie pokrój pas żelowy na 10-15 równych kawałków. Umieść każdy kawałek w świeżej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, co daje w sumie 10-15 probówek.
  7. Zanurz kostki w 25 mM NH4HCO3 w 50% acetonitrylu, wirze i odrzuć supernatanty. Powtórz dwa razy. Suszenie kostek w koncentratorze próżniowym18,19.
  8. Uwodnić kostki za pomocą 10 mM ditiotreitolu (DTT), odwirować i krótko odwirować. Inkubować w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę. Odrzucić supernatant.
  9. Zanurz kostki żelu w 55 mM jodoacetamidu, wiruj i wiruj. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 45 minut. Odrzucić supernatant.
  10. Zanurz kostki w 25 mM NH4HCO3, wiruj, wiruj i odrzuć supernatant.
  11. Zanurz kostki w 25 mM NH4HCO3 w 50% acetonitrylu, wirze i wirowaniu. Powtórzyć czynności 3.9 i 3.10.
  12. Wysuszyć kostki w koncentratorze próżniowym. Dodać 25 μl zmodyfikowanej trypsyny do sekwencjonowania w 25 mM NH4HCO3, inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut i wyrzucić nadmiar roztworu. Zanurzyć kostki w 25 mM NH4HCO3 bez trypsyny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  13. Krótko odwiruj kostki w dół i przenieś powstały ekstrakt peptydowy do nowej probówki. Do kostek dodać 30 μl 5% kwasu mrówkowego w 50% acetonitrylu, wirować przez 30 minut i wirować. Połączyć supernatant z ekstraktem. Wysuszyć ekstrakty peptydowe za pomocą koncentratora próżniowego do objętości mniejszej niż 5 μl.
  14. Prześlij próbki do głównego obiektu spektrometrii mas w celu analizy LC-MS/MS. Dane analityczne MS, które można wygenerować za pomocą oprogramowania typu open source, zazwyczaj zawierają numer dostępu dla każdego zidentyfikowanego białka, wskaźniki znakowane/nieznakowane oraz liczbę zidentyfikowanych unikalnych peptydów.

4. Weryfikacja Western Blotting

UWAGA: Western blot jest zalecany do weryfikacji wyników spektrometrii mas.

  1. Postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami western blotting i upewnij się, że załadowane są równe ilości białka z każdej grupy. Należy stosować przeciwciała przeciwko białkom będącym przedmiotem zainteresowania (np. anektynie A5, dehydrogenazie mleczanowej w łańcuchu B) zidentyfikowanym przez SM. Wykrywanie Western blot, wraz z analizą densytometryczną, może potwierdzić, że identyfikacja i kwantyfikacja białka SM są prawidłowe.

5. Analiza danych proteomicznych

UWAGA: Ocena jakości danych, wstępne przetwarzanie danych, obliczanie i określanie istotnych kandydatów na białka są wykonywane oddzielnie dla każdej kontrpróby MS. Po zakończeniu powyższych analiz analizowane dane z replik są porównywane i łączone6,20,21.

  1. Ocena jakości danych dotyczących państw członkowskich.
    1. Po pierwsze, log2 przekształca znakowane/nieznakowane proporcje białek znakowanych i nieznakowanych SILAC-MS w programie arkusza kalkulacyjnego.
    2. W oprogramowaniu do tworzenia wykresów naukowych i statystyk pogrupuj współczynniki w przedziały proporcji 40-100 i wykreśl liczbę współczynników na pojemnik, aby wygenerować histogram. Rozkład normalny histogramu wskazuje na dobrą jakość danych MS6. Wykonaj ten krok dla wszystkich replik MS.
  2. Aby zwiększyć pewność i dokładność proporcji peptydów MS, rozważ usunięcie białek, które mają mniej niż dwa peptydy określone ilościowo.
  3. Aby określić kandydatów na białka regulowane znacząco w górę i w dół, wykonaj następujące kroki w celu obliczenia progów istotności22.
    1. W oprogramowaniu do tworzenia wykresów naukowych i statystyk wygeneruj regresję nieliniową lub dopasowanie krzywej do danych rozkładu częstotliwości. Ten krok daje wartości, których można użyć do obliczenia wartości odcięcia. Oblicz wartości odcięcia jako medianę ± 1,96 σ dla 95% granic ufności lub 2,56 σ dla 99% granic ufności.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat obliczania wartości odcięcia można znaleźć na stronie Emmott i wsp.22.
    2. Wybierz kandydatów na białka, których współczynniki są większe niż 1,96 (lub 2,56) odchylenia standardowego powyżej mediany (znacznie nadmiernie wyrażone) lub niższe niż 1,96 (lub 2,56) odchylenia standardowe poniżej mediany (znacznie niedostatecznie wyrażone).
  4. Porównaj powtórzenia wyżej zidentyfikowanych istotnych kandydatów, aby osiągnąć spójność. Upewnij się, że spełniają następujące kryteria, aby przejść ten ostatni etap selekcji: kandydaci muszą być spójnie zidentyfikowani we wszystkich powtórzeniach; A powtórzenia kandydata muszą być spójne w swoim kierunku regulacji (najlepiej, aby co najmniej 2 z 3 powtórzeń kandydata były regulowane w górę lub w dół).
  5. Sfinalizuj dane dla kandydatów, którzy spełniają powyższe kryteria, scalając dane ich replik.

6. Weryfikacja i charakterystyka bioinformatyki

UWAGA: Istniejące informacje genomiczne i bioinformatyczne oferują bogactwo informacji dla prawie każdego białka. Eksploracja danych i analiza bioinformatyczna tych informacji mogą pomóc w uzyskaniu dużego wglądu we właściwości i funkcje ważnych kandydatów. Proces ten jest zwykle niezbędny do zaprojektowania odpowiednich dalszych eksperymentów w laboratorium mokrym.

  1. Korzystając z ich numerów dostępu do GenBank lub identyfikatorów UniProt przeszukaj kandydatów w aktualnych bazach danych egzosomów (Exocarta23, Evpedia24), aby sprawdzić, czy białka kandydujące zostały wcześniej znalezione w egzosomie. Ten krok dodaje warstwę pewności, że kandydaci rzeczywiście znajdują się w egzosomach.
    1. Wejdź na http://www.exocarta.org/, kliknij "Zapytanie" i wprowadź nazwę genu lub białka/numer dostępu. Pojawi się strona podsumowania i zostaną pokazane dowody w egzosomie, pod warunkiem, że takie istnieją.
  2. Szukaj kandydatów w bazie danych HIV-1 i Human Protein Interaction Database25. Alternatywnie można przeszukać konkretne bazy danych, które mogą dostarczyć informacji na temat interakcji białek kandydujących i warunków testowych.
    1. Uzyskaj dostęp do bazy danych pod adresem www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInteractions. W polu "białkowa nazwa domeny" wpisz nazwiska kandydatów lub numery dostępu, a następnie kliknij przycisk Szukaj. Wyniki poszukiwań mogą dostarczyć informacji na temat interakcji między HIV-1 a potencjalnymi białkami i zasugerować, które z kandydatów mogą być naprawdę związane z HIV-1.
  3. Zaimportuj numery akcesyjne GenBank lub identyfikatory UniProt kandydatów do oprogramowania do analizy GO (takiego jak FunRich, narzędzie do analizy wzbogacenia funkcjonalnego26) i uruchom oprogramowanie.
    1. Pobierz oprogramowanie pod adresem http://www.funrich.org/. Po instalacji otwórz oprogramowanie, w sekcji analiza wzbogacenia kliknij "Dodaj zestaw danych" i prześlij listę białek/genów. Następnie wybierz typ wykresu, aby zwizualizować analizę języka GO.
      UWAGA: Wyniki analizy GO zostaną zobrazowane w postaci wykresów kołowych. Ten krok pomaga nam uzyskać globalny wgląd w kandydatów w obszarach procesów biologicznych (BP), komponentu komórkowego (CC) i funkcji molekularnych (MF).
  4. Uzyskaj dostęp do DAVID pod adresem http://david.ncifcrf.gov/27, kliknij "Funkcjonalne narzędzie adnotacji" na jego stronie internetowej. Wprowadź listę kandydującą, wybierz "Identyfikator" genu, taki jak "UniProt ID", wybierz "Lista genów" i wyszukaj. Wzbogacone terminy GO, wartości p i inne parametry można znaleźć, klikając stronę "Wyniki podsumowania adnotacji" w kategorii "Gene_Ontology".
  5. Aby zbadać potencjalne interakcje kandydatów z innymi białkami, skorzystaj z ogólnodostępnej bazy danych STRING28, aby wyjaśnić potencjalne interakcje białko-białko i możliwe szlaki biochemiczne.
    UWAGA: Analiza GO i adnotacja funkcjonalna (sekcja 6.3-6.4) można również przeprowadzić przy użyciu najnowszego oprogramowania STRING.
    1. Uzyskaj dostęp do bazy danych pod adresem http://string-db.org/. Wprowadź identyfikator lub sekwencję białka w wyznaczonym polu wyszukiwania i wybierz odpowiednie gatunki do analizy. Kliknij "Szukaj". Wyniki dostarczą informacji na temat powiązań zarówno bezpośrednich (fizycznych), jak i pośrednich (funkcjonalnych). Zostanie wyświetlonych dziesięć pierwszych znanych dopasowań dla kandydata egzosomalnego, które powinny być brane pod uwagę przy istotnej selekcji kandydatów.
      UWAGA: Wiele informacji związanych z kandydatami można przeanalizować, wykonując powyższe kroki. Najważniejsi kandydaci mogą zostać wybrani do dalszej analizy molekularnej i biochemicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1A przedstawia schemat blokowy procedury znakowania metodą SILAC21. W celu oczyszczenia egzosomów próbki muszą zostać poddane wirowaniu w wirówce. Rysunek 1B przedstawia etapy oczyszczania egzosomów za pomocą seryjnej ultrawirowki21. Po oczyszczeniu egzosomy są poddawane eksperymentalnej analizie proteomicznej zgodnie z opisaną procedurą.

<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W procedurach opisanych w tym artykule zademonstrowaliśmy zastosowanie techniki SILAC do zbadania wpływu zakażenia HIV-1 na proteom egzosomalny gospodarza. Początkowo komórki niezakażone i zakażone wirusem HIV-1 są znakowane izotopowo różnicowo. Różnie znakowane egzosomy są następnie oczyszczane przed wykonaniem ekstrakcji białek. Następnie stosuje się chromatografię cieczową z tandemową spektrometrią mas do analizy proteomu egzosomalnego. Na koniec uzyskane dane ze spektrometrii mas i potencjalne białka kandydujące są p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez dodatek ARRA do Lifespan/Tufts/Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693, oraz K24HD080539 do BR. Praca ta była również wspierana przez Lifespan Pilot Research Fund (#701-5857), Rhode Island Foundation Medical Research Grant (#20133969) oraz NIH COBRE URI/RIH Pilot Research Grant (P20GM104317) dla ML. Dziękujemy Jamesowi Myallowi i Vy Dangowi za pomoc w przygotowaniu rękopisu i ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia komórkowa H9ATCCHTB-176
Trypan BlueZestaw
Thermo FisherV13154
Dializowana płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Fisher
ndash; RPMI 1640Thermo Fisher89982Wersja DMEM (89983)
L-Arginina-HCl, 13C6, 15N4 dla SILACThermo Fisher88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 dla SILACThermo Fisher88431
HIV-1 NL4-3NIH AIDS Reagent Program2480
Alliance HIV-1 p24 Zestaw antygenowy ELISAPerkinElmerNEK050001KT
Wirówka superszybka z chłodzeniemEppendorf22628045
Ultrawirówka z chłodzeniemBeckman Coulter363118Powinna być w stanie osiągnąć 100 000 x
g 50 ml stożkowe probówki wirówkoweThermo Fisher14-432-22
Probówki ultrawirówkoweBeckman Coulter326823
SW 32 Ti RotorBeckman Coulter369694
bufor RIPAThermo Fisher89900
Inhibitory proteazyKoktajle Thermo Fisher  78430
Mieszalnik termiczny Eppendorf
BCA Thermo Fisher23250
Biorad1702525
SDS PAGE Aparatura żelowaThermo FisherEI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini GelsNovexXV04200PK20
Odczynnik do barwienia w żeluSigma AldrichG1041
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowaniaPromegaV5111
Koncentrator SpeedVacThermo FisherSPD131DDA
Przeciwciało przeciwko ludzkiej aneksynie A5Abcamab14196
Przeciwciało przeciwko ludzkiej dehydrogenazie mleczanowej B łańcuch Abcamab53292
Oprogramowanie do tworzenia wykresów i statystykSystat Wykres Sigma lub GraphPad Prism
Pakiet oprogramowania do proteomikiilościowej Instytut Biochemii im. Maxa PlanckaMaxquant 
Oprogramowanie i bazy danychRóżni dostawcySzczegółowe informacje można znaleźć w tekście głównym
do oznaczania MTT Thermo Fisher 15250061 Zestaw do oznaczania ilościowego białka SILAC 26400044 &Zestaw do oznaczania białek 5384000020 Spektrofotometr

Bibliografia

  1. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
  2. Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
  3. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
  5. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
  6. Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
  7. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  8. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  9. Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
  10. Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
  11. Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
  13. Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
  14. Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).
  16. Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  17. Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
  18. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  20. Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
  21. Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
  22. Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  24. Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
  25. Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
  26. Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
  27. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  28. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
  29. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
  30. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
  31. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  32. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
  33. Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
  34. Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Proteomika SILACizolacja egzosom wzaka enie HIV 1analiza LC MS MSekstrakcja bia ekultrawirowanieel SDS PAGEanaliza bioinformatycznawzbogacenie GObaza danych STRING

Powiązane artykuły