Metoda ekstrakcji pigmentów z kałamarnicy Doryteuthis pealeii

Podsumowanie

Przedstawiono protokół ekstrakcji pigmentów z nanostrukturalnych granulek w chromatoforach kałamarnicy Doryteuthis pealeii.

Streszczenie

Głowonogi mogą ulegać szybkim i adaptacyjnym zmianom w ubarwieniu skóry w celach wyczuwania, komunikacji, obrony i reprodukcji. Zdolności te są częściowo wspierane przez powierzchniowe rozszerzanie i cofanie pigmentowanych narządów znanych jako chromatofory. Chociaż wiadomo, że chromatofory zawierają na uwięzi sieć pigmentowanych granulek, ich właściwości strukturalno-funkcjonalne nie zostały w pełni szczegółowe. Opisujemy metodę izolowania nanostrukturalnych granulek w chromatoforach kałamarnicy Doryteuthis pealeii i pokazujemy, w jaki sposób związane z nimi pigmenty można ekstrahować w kwaśnych rozpuszczalnikach. Aby to osiągnąć, warstwa skórna zawierająca chromatofor jest najpierw ręcznie izolowana za pomocą powierzchownej sekcji, a granulki pigmentu są usuwane za pomocą cykli sonikacji, wirowania i mycia. Pigmenty zamknięte w oczyszczonych granulkach są następnie ekstrahowane za pomocą kwaśnych roztworów metanolu, pozostawiając nanostruktury o mniejszych średnicach, które są pozbawione widocznego koloru. Ta procedura ekstrakcji daje 58% wydajności rozpuszczalnych pigmentów wyizolowanych z granulek. Za pomocą tej metody można określić skład pigmentów chromatoforowych i wykorzystać je do uzyskania wglądu w mechanizm adaptacyjnego ubarwienia u głowonogów.

Wprowadzenie

Głowonogi, takie jak kałamarnice, mątwy i ośmiornice, mają zdolność dynamicznej zmiany swojego wyglądu w celu kamuflażu i sygnalizacji. ^1-6 Zdolność ta jest częściowo wspierana przez selektywną ekspansję powierzchniową pigmentowanych narządów znanych jako chromatofory. ^4,7-9 Chromatofory to miękkie siłowniki, które zawierają sieć nanostrukturalnych granulek pigmentu zamkniętych w cytoelastycznym woreczku, który jest zakotwiczony promieniowo przez włókna mięśniowe. ^1,3 Po uruchomieniu chromatofory rozszerzają się o 500% na przedstawionej powierzchni, rozprowadzając granulki w całym narządzie. ^3,7,10,11 Gdy to działanie jest skoordynowane przez kilka chromatoforów, ogólne ubarwienie zwierzęcia ulega zmianie. Chociaż wiadomo, że granulki pigmentu przyczyniają się do tej zmiany koloru, ich skład pozostaje nieznany. Opisujemy procedurę izolacji i oczyszczania pigmentów chromatoforowych, która może być dostosowana do przyszłych badań kompozycyjnych.

Izolacja granulek pigmentu obejmuje wieloetapową procedurę ekstrakcji, homogenizacji i oczyszczania. ^3,12 Tkanka zawierająca chromatofor jest pobierana poprzez staranne wytępienie z głowonoga. Następnie stosuje się proces trawienia i homogenizacji w celu dysocjacji otaczającej tkanki i oddzielenia komórek chromatoforu. Nanostrukturalne granulki są następnie izolowane i oczyszczane z pozostałych chromatoforów za pomocą wielokrotnej sonikacji i wirowania. Po oczyszczeniu pigmenty są ekstrahowane z granulek w procesie, który jest dostosowany do ekstrakcji widocznego koloru ze skrzydeł motyla za pomocą kwaśnych roztworów metanolu. ¹³ Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i spektrofotometria są stosowane w celu potwierdzenia, że pigmenty chromatoforowe zostały pomyślnie wyekstrahowane w tym procesie.

Ta metoda opisuje izolację granulek chromatoforu, która jest używana do badania molekularnego wkładu w ubarwienie u głowonogów. ¹² Ekstrakcja małych cząsteczek z całych zwierząt często bywa długim i żmudnym procesem. Celem jest poinformowanie przyszłych badaczy o skutecznym i łatwym w obsłudze protokole pozyskiwania pigmentów z nanostrukturalnych granulek u głowonogów.

Protokół

Badania na zwierzętach bezkręgowych prowadzone w niniejszym dokumencie nie są regulowane w Stanach Zjednoczonych, dlatego Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania nie ma uprawnień do przeglądu takich protokołów. W związku z tym, że badania te nie podlegają jurysdykcji regulacyjnej w Stanach Zjednoczonych, autorzy niniejszym stwierdzają, że badania te zostały przeprowadzone ze szczerym wysiłkiem na rzecz etycznego wykorzystania, opieki i leczenia tych zwierząt, liczba osobników została zminimalizowana i wysiłki te są zgodne z Deklaracją Bazylejską i wytycznymi etycznymi Międzynarodowej Rady Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (ICLAS).

1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Sekcja

1. Kup pozbawioną głowy kałamarnicę D. pealeii w Departamencie Zasobów Morskich w Morskim Laboratorium Biologicznym w Woods Hole, MA lub na dowolnym targu świeżych ryb. Nie należy używać próbek, które zostały filetowane lub wcześniej zmienione w celu zastosowania tej procedury. W szczególności warstwa chromatoforu musi być nadal nienaruszona na próbce.
   1. Jeśli zwierzęta nie zostaną natychmiast wykorzystane, należy je przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Aby rozmrozić próbki, umieść je w wodzie o temperaturze pokojowej na 1 godzinę przed preparacją.
2. Za pomocą prostych nożyczek do preparowania ze stali nierdzewnej przeciąć wzdłuż tylnej strony zwierzęcia. Zacznij od podstawy płaszcza brzusznego i zakończ w okolicy płetwy.
3. Usuń wszystkie narządy wewnętrzne (żołądek, skrzela, gruczoł atramentowy, narządy rozrodcze, serce układowe i serce ramienne), podnosząc je kleszczami preparacyjnymi i przecinając ich tkankę łączną za pomocą nożyczek preparacyjnych. Wyrzuć narządy do worka na próbki.
4. Użyj szpilek do preparowania T, aby przypiąć płaszcz (płetwą do góry) w standardowej aluminiowej misce preparacyjnej 11-1/2" x 7-1/2" x 1-1/2" zawierającej elastyczną podkładkę do preparacji. Zanurz tkankę w 250 ml wody morskiej, która została przefiltrowana przez jednorazowy system filtracji próżniowej z polistyrenu o wielkości porów 0,2 μm.
5. Ostrożnie usuń warstwę naskórka (nieprzezroczysty kolor) za pomocą kleszczy preparacyjnych, utrzymując nienaruszoną warstwę skóry zawierającą chromatofor. Po usunięciu warstwy naskórka wyrzuć ją do worka na próbki.
6. Wyciąć małe (1 cm x 1 cm) odcinki warstwy chromatoforu za pomocą kleszczy i nożyczek preparacyjnych. Pobrać próbki do mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml (wypełnić połowę każdej pustej probówki wypreparowaną tkanką).
7. Dodać 500 μl przefiltrowanej wody morskiej do probówek zawierających tkankę. Próbki można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.

2. Izolowanie granulek pigmentu chromatoforowego

1. Trawienie tkankowe
   1. Przygotowanie papainy/kolagenazy
      1. Odważ 30 mg kolagenazy i 5 mg papainy za pomocą papieru o wymiarach 4 x 4 cale o niskiej zawartości azotu. Przenieś je do probówki wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml z zakrętką.
      2. Odmierz 10 ml wody dejonizowanej za pomocą pipety miarowej. Dodać bezpośrednio do fiolki zawierającej papainę/kolagenazę. Wiruj na najwyższym ustawieniu, aż roztwór będzie klarowny.
   2. Usuwanie tkanki zewnątrzkomórkowej
      1. Odwirować zebraną tkankę chromatoforu z kroku 1.7 przez 5 minut przy 14 000 x g. Wyrzuć górną warstwę wody morskiej do plastikowego wiadra na odpady.
      2. Dodać 500 μl roztworu papainy/kolagenazy do tkanki za pomocą jednokanałowej mikropipety P1000 o zmiennej objętości. Wiruj każdą próbkę przez 1-2 minuty na najwyższym ustawieniu.
      3. Sonikować próbki przez 5 minut z częstotliwością 40 kHz w celu dysocjacji komórek od otaczającej tkanki.
      4. Wirować przez 5 minut przy 14 000 x g. Wyrzucić supernatant do plastikowego wiadra na odpady.
      5. Odwirować zebraną tkankę chromatoforu przez 5 minut przy 14 000 x g. Wyrzuć górną warstwę wody morskiej do plastikowego wiadra na odpady. Powtórz jeszcze raz.
      6. Ręcznie usuń wszelkie pozostałe duże odcinki tkanki, które nie zostały strawione w tym procesie, za pomocą kleszczy przed przejściem do następnego kroku.
2. Izolowanie granulek pigmentu
   1. Przygotowanie buforu homogenizacyjnego
      1. Odważyć 2,38 g kwasu (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanasulfonowego) (HEPES, 100 mM), 0,095 g chlorku magnezu (10 mM), 0,856 g asparaginianu potasu (50 mM) i 0,015 g ditiotreitolu (1 mM). Przenieść do pojemnika z polistyrenu o pojemności 150 ml z zakrętką. Dodaj jedną komercyjną mini tabletkę inhibitora proteazy.
      2. Odmierz 100 ml wody dejonizowanej za pomocą cylindra z podziałką. Dodać bezpośrednio do pojemnika zawierającego sole homogenizacyjne. Wirować, aż roztwór będzie klarowny.
   2. Homogenizacja granulek pigmentu
      1. Odwirować każdą próbkę z etapu 2.1 przy 14 000 x g przez 5 minut. Wyrzucić sklarowany osad do plastikowego pojemnika na odpady. Ta próbka powinna być pozbawiona tkanki zewnątrzkomórkowej.
      2. Dodać 500 μl buforu homogenizacyjnego do każdej probówki i wirować przez 1-2 minuty każda, aby dokładnie wymieszać próbki. Sonikować próbki przez 30 minut (~40 kHz), a następnie przez 5 minut wirować przy 14 000 x g.
      3. Wyrzuć sklarowany osad do plastikowego pojemnika na odpady i powtórz poprzedni krok 2-3 razy, aby zapewnić całkowite roztrawienie woreczka chromatoforowego i pęt białkowych. Pozostały roztwór powinien zawierać jasnożółty supernatant i czerwoną osadkę zawierającą izolowane granulki pigmentu.

3. Ekstrakcja pigmentu

1. Otrzymywanie metanolu kwaśnego (HCl-MeOH)
   1. Ostrożnie dodać 25 μl stężonego (36,5–38 % (m/w)) kwasu solnego (HCl) do 5 ml metanolu (MeOH). Roztwór HCl-MeOH należy przechowywać w szklanej fiolce na próbkę z zakręcaną nakrętką. Delikatnie zamieszać, aby równomiernie wymieszać roztwór.
      UWAGA: Im bardziej kwaśny roztwór, tym więcej pigmentu zostanie wyekstrahowane podczas pierwszej ekstrakcji.
2. Ekstrakcja pigmentu
   1. Odwirować zawiesinę granulek pigmentu (z ppkt 2.2.2) przez 5 minut przy 14 000 x g i wyrzucić supernatant do plastikowego pojemnika na odpady.
   2. Dodać 500 μl roztworu HCl-MeOH i wirować każdą próbkę przez ~3-4 min. Sonikować próbki przez 10 min (~40 kHz), a następnie wirować przez 5 min przy 14 000 x g.
   3. Za pomocą pipety transferowej zebrać supernatant do szklanej fiolki o pojemności 1 grama, z zakręcaną nakrętką. Supernatant powinien mieć kolor ciemnoczerwony.
   4. Powtórz etap ekstrakcji 3.2.2, aż nie zostanie usunięty dalszy kolor (~4-5 prań).
      UWAGA: Każda ekstrakcja da ~1,5 ml pigmentu. Pozostała bezbarwna osadka to granulki wyekstrahowane z pigmentu. UWAGA: Zarówno bezbarwne granulki, jak i wyekstrahowane pigmenty można przechowywać w wodzie o temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

4. Charakterystyka w całym procesie ekstrakcji

1. Skaningowa mikroskopia elektronowa
   1. Zobrazować granulki (nieprzereagowane z kroku 2.2.1 i ekstrahowane pigmentem z kroku 3.2.3) za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) w celu sprawdzenia czystości procesu ekstrakcji.
   2. Aby przygotować próbki granulek do obrazowania, najpierw odwiruj zarówno nieprzereagowane granulki, jak i granulki ekstrahowane pigmentem przez 5 minut przy 14 000 x g, a następnie wyrzuć supernatant do plastikowego wiadra na odpady. Ponownie zawiesić je w 1 ml etanolu i nanieść 2-3 krople zawiesiny granulatu na aluminiowe króćce SEM za pomocą pipety transferowej.
   3. Po wysuszeniu próbek przez noc, napylać powłokę złoto-platynową przez 3 minuty, aby uzyskać powłokę o długości 15 nm.
   4. Obraz za pomocą SEM z emiterem Schottky'ego i wtórnym detektorem elektronów. Do obrazowania tych materiałów należy użyć napięcia wiązki 5-7 kV i odległości roboczej od 8 do 9 mm.
2. Pomiary spektrofotometryczne w ultrafiolecie widzialnym (UV-vis)
   1. Monitorować profile absorbancji dla wszystkich 3 warunków (nieprzereagowany granulat z 2.2.2, wyekstrahowany pigment z 3.2.3 i granulki ekstrahowane pigmentem z 3.2.4) za pomocą spektrofotometru dwuwiązkowego od 200-800 nm.
   2. Zebrać ślepą próbę pomiaru za pomocą wody dejonizowanej w kuwecie o pojemności 1 ml dla nieprzereagowanych granulek i granulek wyekstrahowanych pigmentem. Zebrać widma absorpcyjne UV-VIS dla obu próbek.
   3. Pobrać ślepą próbę przy użyciu kwaśnego roztworu metanolu w kuwecie o pojemności 1 ml dla wyekstrahowanego pigmentu. Pobrać widmo absorpcyjne UV-VIS dla próbki.
   4. Określić maksymalną długość fali każdej próbki, określając długość fali, przy której pik absorbancji osiąga maksymalną wysokość względną.

Wyniki

Chromatofory są wycinane z płaszcza grzbietowego D. pealeii (Rysunek 1A, 1B). Po ich usunięciu chromatofory są lizowane i oczyszczane za pomocą cykli wirowania i mycia w celu wyizolowania pigmentowanych granulek (ryc. 2A, 2B). Kwaśne roztwory metanolu (HCl-MeOH) stosuje się do ekstrakcji pigmentu z granulek (ryc. 2C), uzyskując rozpuszczalny ekstrakt pigmentowy i nierozpuszczalne, bezbarwne granu...

Dyskusja

Pokazaliśmy metodę ekstrakcji pigmentów z granulek chromatoforu kałamarnicy. Poprzez ukierunkowanie na granulki, naszym celem jest określenie ich roli w pośredniczeniu w adaptacyjnym ubarwieniu. Metoda ta różni się od poprzednich doniesień mających na celu scharakteryzowanie pigmentów głowonogów przy użyciu próbek tkanek¹⁴ lub liofilizowanej skóry¹⁵.

Chociaż protokół ten jest skuteczny w ekstrakcji pigmentów chromatoforowych, jest ograniczony do małych skal reakcji. Rozbi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenaza	Alfa Aesar	9001-12-1	Brak zagrożenia
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3482-12-3	Działa drażniąco, ostra toksyczność
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9	Łagodny środek drażniący
Kwas solny	EMD Chemicals	7647-01-0
k-asparaginian	Sigma-Aldrich	1115-63-5	Reaguje gwałtownie z utleniaczami
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	7786-30-3	Łagodny środek drażniący oczy
Metanol	Pharmco-AAPER	67-56-1	Wysoce łatwopalny
inhibitor środka w mini tabletkach	Sigma-Aldrich	469315-90-01	Działa żrąco na metal i skórę
Papaina	Sigma-Aldrich	9001-73-4	Działa drażniąco