Artykuł metodologiczny

Technika infuzji mikrochirurgicznej myszy do celowanego dostarczania substancji do OUN przez tętnicę szyjną wewnętrzną

DOI:

10.3791/54804

⸱

31 stycznia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2The Jerzy Kukuczka Academy of Physical Education

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje technikę infuzji mikrochirurgicznej u myszy, która skutecznie dostarcza substancje bezpośrednio do mózgu przez tętnicę szyjną wewnętrzną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęce modele chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN), a co za tym idzie, chorób zaburzających barierę krew-mózg, wymagają dostarczania substancji egzogennych do mózgu. Te substancje egzogenne mogą wywoływać szkodliwe skutki lub stanowić strategię terapeutyczną. Najczęstsze metody dostarczania substancji egzogennych do mózgu opierają się na dostarczaniu ogólnoustrojowym, takim jak droga podskórna lub dożylna. Chociaż są powszechnie stosowane, podejścia te mają kilka ograniczeń, w tym niską skuteczność dostarczania do mózgu. Natomiast metody chirurgiczne, które miejscowo dostarczają substancje do OUN, są bardziej specyficzne i zapobiegają wychwytywaniu substancji egzogennych przez inne narządy. Dostępnych jest kilka metod chirurgicznych dostarczania do OUN; Jednak zwykle są one bardzo traumatyczne. W tym miejscu opisujemy technikę mikrochirurgii infuzji u myszy, która skutecznie dostarcza substancje do mózgu przez tętnicę szyjną wewnętrzną, przy minimalnym urazie i bez zakłóceń w normalnej funkcjonalności OUN.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele in vivo chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN) wymagają skutecznego dostarczania do mózgu substancji egzogennych, takich jak leki, patogeny czy egzosomy. Dlatego idealna metoda dostarczania powinna powodować minimalny uraz u zwierzęcia, zachowywać integralność sieci neuronalnej i osiągać wysokie stężenia substancji w mózgu 1.

Opisano kilka metod chirurgicznego dostarczania substancji miejscowych, w tym iniekcji doosłonkowych, domózgowych i dokomorowych lub implantów 2,3,4,5. Podejścia te są jednak uważane za traumatyczne dla OUN i pozwalają na podawanie tylko niewielkich ilości substancji będącej przedmiotem zainteresowania. Ponadto zasugerowano, że substancje egzogenne mogą być szybko usuwane przez płyn mózgowo-rdzeniowy 6, a przy zastosowaniu wyżej wymienionych technik zaobserwowano niski zakres penetracji do miąższu mózgu 7 gdy stosowane są wyżej wymienione techniki. Metody dostarczania ogólnoustrojowego, takie jak droga doustna, płucna, podskórna i dożylna, są częściej stosowane w modelach zwierzęcych, chociaż wykazują niską skuteczność w dostarczaniu substancji do OUN, ze względu na wychwyt przez inne narządy 8,9. W związku z tym te drogi dostarczania wymagają zwiększonych dawek podawanych substancji, co zwiększa ryzyko wystąpienia skutków ubocznych i toksyczności 10,11.

Tutaj opisujemy technikę mikrochirurgii infuzji u myszy, która skutecznie dostarcza substancje bezpośrednio do mózgu przez tętnicę szyjną wewnętrzną. Oprócz ukierunkowania na dostarczanie do OUN, technika ta nie omija normalnych barier fizjologicznych i dlatego jest bardzo istotna dla procesów biologicznych zaangażowanych w przechodzenie leków lub patogenów do mózgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury związane z poniższym protokołem zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Miami (IACUC). Ponadto wszystkie procedury przeprowadzane są w placówkach zatwierdzonych przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC).

1. Przygotowanie myszy do operacji

  1. Znieczulić mysz izofluranem zmieszanym z tlenem, używając laboratoryjnego systemu znieczulającego. Używaj izofluranu przy ustawieniu między 4-5% i przepływie tlenu na poziomie 2 l/min w maszynie komercyjnej (patrz tabela materiałów). Przenieść zwierzę na powierzchnię operowaną pod mikroskopem stereoskopowym i podtrzymać znieczulenie za pomocą stożka nosowego (użyć izofrelanu przy ustawieniu 1,5 - 2,5 i przepływu tlenu na poziomie 2 l/min).
    1. Upewnij się, że częstość oddechów myszy wynosi około 1-2 oddechów/s bez sapania. Ponadto upewnij się, że zwierzę nie wykazuje reakcji stymulacji wąsów i odruchu pedałowania (szczypania palców). Monitoruj częstość oddechów i wysiłek podczas operacji, co najmniej co 5 minut. Postępuj zgodnie z określonymi wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania oraz wytycznymi weterynaryjnymi dotyczącymi monitorowania znieczulenia gryzoni.
  2. Nałóż kroplę lubrykantu okulistycznego na każde oko za pomocą sterylnego wacika, aby zapobiec wysuszeniu. Zaleca się podawanie leków przeciwzapalnych i przeciwbólowych w celu złagodzenia dyskomfortu.
  3. Gdy zwierzę leży na plecach, utrzymuj znieczulenie za pomocą stożka nosowego.
  4. Oczyść obszar szyi zwierzęcia, przecierając go trzykrotnie etanolem 70% i chlorheksydyną. Ogol obszar operacyjny zwierzęcia za pomocą brzytwy (szczegóły poniżej).

2. Rozwarstwienie tętnicy szyjnej wspólnej (CCA)

  1. Całą procedurę mikrochirurgii należy wykonać pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy wykonaj płytkie nacięcie w linii środkowej szyi, od góry mostka do poniżej żuchwy (około 3 do 4 cm).
  2. Za pomocą kleszczy ostrożnie oddziel tkankę tłuszczową i łączną, aby odsłonić tchawicę.
  3. Umieść poduszkę (okrągły przedmiot o średnicy około 0,5 cm) z tyłu szyi myszy, aby przedłużyć szyję, dodatkowo odsłaniając obszar.
  4. Oddziel tkankę za pomocą zwijacza tkanki lub haczyków.
  5. Po lewej stronie tchawicy zwierzęcia ostrożnie rozsuń tkankę łączną, aby odsłonić lewe CCA.
  6. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń całą tkankę łączną, aby odsłonić rozwidlenie CCA i początek tętnic szyjnych zewnętrznych, jak i wewnętrznych.

3. Przygotowanie CCA do infuzji substancji

  1. Wprowadzić dwa segmenty nici nylonowej (około 1 cm każdy) pod tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) za pomocą kleszczy.
  2. Umieść stały węzeł w najwyższym możliwym punkcie ETO.
  3. W najniższym możliwym punkcie ECA, bezpośrednio nad rozwidleniem CCA, umieść rozsuwany węzeł. Ten węzeł powinien być luźny w porównaniu z górnym węzłem.
  4. Zamknij CCA za pomocą zacisku do naczynia, w najniższym możliwym punkcie.
  5. Zamknij tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) za pomocą zacisku do naczynia.
  6. Za pomocą nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji wykonaj małe nacięcie w ECA (około 2 mm), między dwoma węzłami.

4. Infuzja substancji za pomocą ICA

  1. Zmontuj system infuzyjny. Podłącz 6 cali rurki kapilarnej (idealne wymiary: 2,5 mm x 1,2 mm) do strzykawki tuberkulinowej zawierającej 250 μl substancji, która ma być podawana (między innymi leki, patogeny, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe) i delikatnie włóż końcówkę kapilary do nacięcia wykonanego w kroku 3.6.
  2. Kontynuuj przesuwanie się w dół kapilary, aż osiągnie punkt środkowy między rozwidleniem a zaciskiem zamykającym CCA.
  3. Zawiąż dolny węzeł ECA. Sprawdź, czy węzeł jest wystarczająco luźny, aby zapewnić płynność kapilarną i wystarczająco szczelny, aby zapobiec wyciekowi.
  4. Usuń klips z ICA.
  5. Delikatnie docisnąć tłok strzykawki, umożliwiając infuzję substancji w tempie około 10 μl na sekundę.

5. Procedury po infuzji

  1. Umieść klips z powrotem na ICA.
  2. Delikatnie wyjmij rurkę kapilarną.
  3. Całkowicie zwiąż dolny węzeł ECA.
  4. Usuń klipy z ICA i CCA.

6. Zamykanie nacięć i opieka pooperacyjna

  1. Usuń retraktor lub haczyki na chusteczki i poduszkę.
  2. Oczyść obszar szwu za pomocą sterylnej soli fizjologicznej.
  3. Zamknij nacięcie za pomocą nylonowego szwu/igły i kleszczy.
  4. Podawaj leki przeciwzapalne i przeciwbólowe, aby złagodzić dyskomfort pooperacyjny.
  5. Umieść zwierzę w klatce umieszczonej na poduszce grzewczej na co najmniej 1 godzinę i monitoruj powrót do zdrowia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj technika mikrochirurgii infuzji u myszy jest bardzo wszechstronna i była używana do dostarczania różnych substancji bezpośrednio do mózgu, w tym dostarczania komórek nowotworowych w reprezentatywnym modelu powstawania przerzutów do mózgu 1,12.

Ta technika jest również odpowiednia do oceny patologicznych aspektów różnych patogenów w OUN. W mysim modelu zakaż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj mikrochirurgia infuzyjna okazała się bardzo skuteczna w dostarczaniu substancji egzogennych o różnych cechach biologicznych do OUN, zapobiegając niepożądanemu rozprzestrzenianiu się po całym organizmie 1,12. Przerwanie bariery krew-mózg jest patologiczną cechą wielu chorób związanych z OUN; Dlatego ocena związku substancji egzogennych z barierą krew-mózg ma ogromne znaczenie i zainteresowanie.

Przedstawiony model chirurgi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować dr Lei Chen (Icahn School of Medicine at Mount Sinai, NY), która jako pierwsza wprowadziła zastosowanie tego modelu w naszym laboratorium, oraz dr Gretchen Wolff (Niemieckie Centrum Badań nad Rakiem, Heidelberg, Niemcy) za rozpowszechnienie tej techniki w naszym laboratorium. Wspierane częściowo przez HL126559, DA039576, MH098891, MH63022, MH072567, DA027569 i NSC 2015/17/B/NZ7/02985.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przyrząd anestezjologicznyVetequip901806
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tool14558-09
Kleszcze chirurgiczne z prostą końcówkąFine Science Tool00108-11
Kleszcze chirurgiczne z końcówką kątowąFine Science Tool00109-11
Nożyczki sprężynoweFine Science Tool15000-08
Nylonowy szewBraintree ScientificSUT-S 104
Rurka kapilarna (Micro-Renathane 0,010" x 0,005" na stopę) Braintree ScientificMRE01050
Szew zamykającyVWR95057-036
Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazoluIsoflurane
Piramal FisherScientific 50-121-8005

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).
  2. Frisella, W. A., et al. Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII. Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).
  3. Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
  4. Wu, G., et al. Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates. Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).
  5. Pignataro, G., Studer, F. E., Wilz, A., Simon, R. P., Boison, D. Neuroprotection in ischemic mouse brain induced by stem cell-derived brain implants. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 919-927 (2007).
  6. Sugiyama, Y., Kusuhara, H., Suzuki, H. Kinetic and biochemical analysis of carrier-mediated efflux of drugs through the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers: importance in the drug delivery to the brain. J Control Release. 62 (1-2), 179-186 (1999).
  7. Pardridge, W. M. Drug and gene delivery to the brain: the vascular route. Neuron. 36 (4), 555-558 (2002).
  8. Vantyghem, S. A., Postenka, C. O., Chambers, A. F. Estrous cycle influences organ-specific metastasis of B16F10 melanoma cells. Cancer Res. 63 (16), 4763-4765 (2003).
  9. Huang, R. Q., et al. Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer. FASEB J. 21 (4), 1117-1125 (2007).
  10. Liu, R., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Intracarotid delivery of oncolytic HSV vector G47Delta to metastatic breast cancer in the brain. Gene Ther. 12 (8), 647-654 (2005).
  11. Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448 (7149), 39-43 (2007).
  12. Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels. Biol Trace Elem Res. , (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

dostarczanie substancji do OUNtechnika chirurgicznakanulacja naczyniainfuzja kapilarnasubstancja egzogennabariera krew m zgminimalna traumabadania neuronaukowe

Powiązane artykuły