Artykuł metodologiczny

Opracowanie i identyfikacja nowej subpopulacji ludzkich fagocytów olbrzymich pochodzących z neutrofili in vitro

16.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54826

⸱

25 stycznia 2017

 ,  ,  ,  , 
1The Lloyd Rigler Sleep Apnea Research Laboratory, Unit of Anatomy and Cell Biology, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion-Israel Insitute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj metodę uzyskiwania i identyfikowania nowo scharakteryzowanej subpopulacji gigantycznych fagocytów pochodzących z neutrofili. Komórki te rozwijają się w hodowli ze świeżych neutrofili ludzkiej krwi i charakteryzują się fagocytozą, autofagią, niezwykle dużymi rozmiarami i wydłużoną żywotnością. Metoda ta jest niezbędna do dalszego badania tej unikalnej subpopulacji pochodzącej z neutrofili.

Streszczenie

Neutrofile (PMN) są najbardziej znane ze swoich funkcji fagocytarnych przeciwko atakującym patogenom i mikroorganizmom. Mają najkrótszy okres półtrwania wśród leukocytów, a w stanie nieaktywowanym są konstytutywnie zaangażowane w apoptozę. Po rekrutacji do miejsc zapalnych w celu rozwiązania stanu zapalnego, wytwarzają szereg cząsteczek cytotoksycznych o silnym działaniu przeciwbakteryjnym. Jednak gdy te silne cząsteczki cytotoksyczne są uwalniane w niekontrolowany sposób, mogą uszkodzić otaczające tkanki. Jednak w ostatnich latach coraz częściej potwierdza się wszechstronność neutrofili, wykazując plastyczność i funkcje immunoregulacyjne. Niedawno zidentyfikowaliśmy nową subpopulację pochodzącą z neutrofili, która rozwija się spontanicznie w standardowych warunkach hodowli bez dodatku cytokin / czynników wzrostu, takich jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (GM-CSF) / interleukina (IL)-4. Ich zdolności fagocytarne pozostałości neutrofili w dużej mierze przyczyniają się do ogromnego zwiększenia ich rozmiaru; dlatego nazwano je gigantycznymi fagocytami (Gφ). W przeciwieństwie do neutrofili, Gφ są długowieczne w kulturze. Wyrażają one klaster markerów różnicowania (CD) neutrofili CD66b/CD63/CD15/CD11b/mieloperoksydaza (MPO)/elastaza neutrofilowa (NE) i są pozbawione markerów linii monocytowej CD14/CD16/CD163 i markerów dendrytycznych CD1c/CD141. Pobierają również lateks i zymozan i reagują wybuchem oksydacyjnym na stymulację opsonizowanym zymozanem i PMA. Gφ wyrażają również receptory zmiataczy CD68 / CD36 i, w przeciwieństwie do neutrofili, internalizują utlenioną lipoproteinę o niskiej gęstości (oxLDL). Co więcej, w przeciwieństwie do świeżych neutrofili lub hodowanych monocytów, reagują na wychwyt oxLDL zwiększoną produkcją reaktywnych form tlenu (ROS). Dodatkowo fagocyty te zawierają wakuole pokryte białkiem lekkim 3B (LC3B) związanym z mikrotubulami, co wskazuje na aktywację autofagii. Stosując specyficzne inhibitory, oczywiste jest, że zarówno fagocytoza, jak i autofagia są warunkami wstępnymi ich rozwoju i prawdopodobnego ROS zależnego od oksydazy NADPH. Opisujemy tutaj metodę przygotowania tej nowej subpopulacji długowiecznych komórek fagocytarnych pochodzących z neutrofili w hodowli, ich identyfikację i obecnie znane cechy. Protokół ten jest niezbędny do uzyskania i scharakteryzowania Gφ w celu dalszego zbadania ich znaczenia i funkcji.

Wprowadzenie

Wielojądrowe neutrofile (PMN) stanowią najliczniejszą populację leukocytów we krwi, pełniąc rolę pierwszej linii obrony przed naciekającymi patogenami poprzez produkcję szerokiego spektrum cząsteczek cytotoksycznych. Tradycyjny pogląd zakładał, że są to krótko żyjące, wyspecjalizowane fagocyty krążące we krwi, które jako pierwsze docierają do miejsc ostrego stanu zapalnego, aby zwalczać infekcje oraz pomagać w usuwaniu patogenów i szkodliwych cząsteczek.1 W stanie nieaktywowanym neutrofile są konstytutywnie zaprogramowane do apoptozy. Podczas migracji z krwi do ognisk zapalnych neutrofile ulegają aktywacji w celu wygaszenia stanu zapalnego. Fagocytują i zabijają naciekające mikroorganizmy, produkując szereg cząsteczek cytotoksycznych, takich jak reaktywne formy tlenu (ROS), enzymy lityczne, m.in. elastazę neutrofilową (NE) i katepsyny o silnym działaniu mikrobójczym. Aby uwięzić patogeny, neutrofile uwalniają również zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs), które składają się z nici chromatyny jądrowej zawierających peptydy przeciwbakteryjne i różne enzymy lityczne. Jednak niekontrolowane uwalnianie tych cząsteczek cytotoksycznych z neutrofili może również podtrzymywać odpowiedzi zapalne i prowadzić do uszkodzenia otaczających tkanek.2 Dlatego skuteczne usuwanie apoptotycznych neutrofili przez makrofagi (Mϕ) i komórki dendrytyczne (DC) jest kluczowe dla wygaszenia stanu zapalnego.3,4,5,6

W ostatnich latach staje się jednak coraz bardziej oczywiste, że neutrofile są komórkami niezwykle wszechstronnymi, których funkcje wykraczają daleko poza fagocytozę i zabijanie patogenów.6,7 Dzięki procesom primingu lub aktywacji, plastyczność neutrofili stopniowo zyskuje uznanie. Wykazano na przykład, że neutrofile poddane działaniu bakterii i mykobakterii wydzielają interleukinę (IL)-10 i kontrolują odpowiedź zapalną, co sugeruje obecność odpowiedzi immunoregulacyjnych.8 Wykazano, że neutrofile pomitotyczne mogą transdiferencjować w komórki typu Mϕ lub komórki typu DC, trawiąc i prezentując fragmenty antygenów pod wpływem cytokin i czynników wzrostu,9,10 pełniąc tym samym kluczową rolę w integrowaniu odpowiedzi wrodzonej i nabytej.3,6 Aktywacja czynnikami wzrostu promowała pochłanianie apoptotycznych neutrofili lub szczątków komórkowych, co ułatwiało usuwanie zanieczyszczeń z miejsc zapalnych oraz wygaszanie stanu zapalnego,3,9 szczególnie w sytuacjach, gdy system oczyszczania Mϕ/DC jest niewystarczający lub przeciążony,11,12 co sugeruje potencjalną „samoregulację” pomagającą w rozdzieleniu odpowiedzi zapalnej. Wynika to z faktu, że apoptoza jest formą regulowanej śmierci komórkowej, która może hamować pozakomórkowe uwalnianie związków cytotoksycznych, a tym samym zapobiegać uszkodzeniu sąsiednich tkanek.6

Wydłużone przeżycie jest kolejną cechą aktywacji neutrofili, co zostało wykazane poprzez zastosowanie różnych czynników pochodzenia gospodarza, takich jak czynnik stymulujący kolonie granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF), cytokiny zapalne, takie jak interferon (IFN)-γ, czynnik martwicy nowotworu (TNF)-α oraz/lub produkty pochodzenia patogenów, co pozwala neutrofilom modulować odpowiedź przeżyciową.6 W rzeczywistości przeżycie neutrofili jest warunkiem wstępnym ich plastyczności i wiąże się z ich zdolnością do fagocytozy.6,13 Wykazano również, że wiąże się ono ze zmianami fenotypowymi i funkcjonalnymi, które zależały od zwiększonej ekspresji genów poprzez indukcję syntezy nowych białek zaangażowanych w wydłużenie czasu życia neutrofili oraz zmniejszenie apoptozy.10

W przeciwieństwie do neutrofili, które żyją krótko i konstytutywnie ulegają apoptozie w hodowli, lub opisanych powyżej neutrofili aktywowanych cytokinami/czynnikami wzrostu, które mają wydłużony czas życia, zidentyfikowaliśmy niedawno nową, niewielką subpopulację neutrofili, która rozwija się spontanicznie w przedłużonych standardowych warunkach hodowli z nowo wyizolowanych neutrofili ludzkiej krwi, bez zewnętrznego dodawania cytokin lub czynników wzrostu.14 Komórki te, pochodzące z neutrofili i wcześniej nieopisane w literaturze, nazwano fagocytami olbrzymimi (Gϕ). Gϕ mają wydłużony czas życia w hodowli, są w pełni rozwinięte w ciągu 5-7 dni i charakteryzują się unikalnymi cechami morfologicznymi, ekspresją fenotypową oraz funkcjami. Są one znacznie powiększone z powodu autofagocytozy szczątków martwych neutrofili, są wakuolizowane i zawierają fagolizosomy. Gϕ wykazują ekspresję specyficznego markera ziarnistości neutrofili – klastra różnicowania (CD)66b, markerów ziarnistości azurofilnych – CD63 i mieloperoksydazy (MPO) oraz dodatkowych markerów neutrofili, takich jak CD11b, NE, CD15, podjednostek NADPH oksydazy gp91-phox i p22-phox oraz markera autofagii – LC3BII.14,15 Funkcjonalnie aktywnie pochłaniają kuleczki lateksowe i cząsteczki zymosanu oraz generują ROS w odpowiedzi na stymulację zymosanem i forbolem 12-mirystynianem 13-octanem (PMA). Co ciekawe, w przeciwieństwie do świeżych neutrofili, Gϕ intensywnie wykazują również ekspresję receptorów scavengerowych CD68 i CD36, pochłaniają utlenione lipoproteiny o niskiej gęstości (oxLDL) i generują ROS w odpowiedzi na stymulację oxLDL. Ponadto Gϕ są pozbawione markerów linii monocytowej CD14, CD16 i CD163 oraz markerów dendrytycznych CD1c i CD141. Co więcej, fagocytoza, autofagia oraz prawdopodobnie funkcjonalna NADPH oksydaza są warunkami niezbędnymi do ich rozwoju. Wskazuje na to fakt, że inhibitor fagocytozy cytochalazyna B, inhibitory autofagii 3-metyloadenina (3-MA) i bafilomycyna (BafA1) oraz inhibitor NADPH oksydazy – jodki diphenylenowe (DPI) – zapobiegały ich rozwojowi. Dodatkowo kokultury monocytów/neutrofili, jak i ekspozycja na przerywaną hipoksję utrudniały ich rozwój, podczas gdy adaptacja neutrofili do trwałej hipoksji była wyraźna.14,15 Sugerowany mechanizm ich rozwoju w hodowli przedstawiono na Rysunku 1. Protokół w niniejszej pracy opisuje krok po kroku przygotowanie Gϕ z nowo wyizolowanych krążących neutrofili ludzkiej krwi, ich rozwój, identyfikację oraz niektóre podstawowe charakterystyki. Protokół ten może być wykorzystany do dalszych badań i odkrywania szerokiego spektrum oraz ról tych nowo opisanych i intrygujących Gϕ pochodzących z neutrofili, w celu scharakteryzowania ich znaczenia i potencjalnych funkcji.

Proces apoptozy neutrofili, schemat; przedstawia apoptozę, szczątki apoptyczne oraz neutrofile olbrzymie.
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie rozwoju komórek olbrzymich w 7-dniowych kulturach neutrofili. Sugeruje się, że w miejscach stanu zapalnego (1) neutrofile ulegają apoptycznej śmierci komórkowej i (2) uwalniają otoczone błoną fragmenty zawierające szczątki jądrowe, ziarnistości (kropki zielone i czerwone) oraz inne składniki subkomórkowe, które uruchamiają mechanizmy autofagii. (3) Fagocyty olbrzymie (Gϕ) rozwijają się w długoterminowych kulturach neutrofili pozbawionych cytokin lub czynników wzrostu poprzez internalizację ciał apoptotycznych i szczątków neutrofili, zachowując przy tym funkcjonalnąy NADPH oksydazę. Charakteryzują się one różnymi markerami neutrofilowymi CD66b+/CD63+/MPO+/ CD15+/CD11b+/NE, dużymi fagosomami zawierającymi ziarnistości i szczątki komórkowe oraz receptorami scavenger CD36 i CD68. Gϕ są głównie komórkami jednojądrowymi, zdolnymi do internalizacji również różnych cząsteczek i utlenionego LDL oraz do generowania ROS. Błony wakuoli wypełniających Gϕ zawierają LC3B (zaznaczone na ciemnoniebiesko), marker błony autofagosomu, co sugeruje ścisły związek między autofagią a formowaniem się fagocytów olbrzymich. Gϕ nie rozwijają się w medium zawierającym GM-CSF/IL-4. Ponadto inhibitory, takie jak inhibitor NADPH oksydazy – jodopek diphenylenowy (DPI), inhibitory autofagii 3-metyladenina (3-MA) i bafilomycyna (BafA1) oraz inhibitor fagocytozy cytochalazyna B (Cyto. B), znoszą ich powstawanie. (4) Potencjalne funkcje Gϕ in vivo mogą obejmować właściwości przeciw- lub prozapalne oraz udział w procesach miażdżycowych (rysunek oparty na naszych wynikach14,15 i zmodyfikowany z towarzyszącego komentarza redakcyjnego Bertona20). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

Protokół został zatwierdzony przez lokalną Komisję Etyczną ds. Badań z Udziałem Ludzi zgodnie z deklaracją helsińską, a wszyscy uczestnicy podpisali formularz świadomej zgody.

1. Izolacja neutrofili i różnicowanie Gϕ w hodowli

UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzić przy użyciu sterylnych roztworów klasy tkankowej wolnych od lipopolisacharydu (LPS) w komorze z laminarnym przepływem powietrza (dygestorze). Do pożywki Roswell park memorial institute (RPMI)-1640 nie należy dodawać antybiotyków, cytokin ani czynników wzrostu.

  1. Pobierz co najmniej 40 ml krwi żylnej od młodych, zdrowych dorosłych osób, używając sterylnego zestawu do nakłuć żył (igły motylkowej). Krew pobierz do probówek typu vacutainer zawierających sól K3 kwasu etylendiaminotetraoctowego (K3EDTA) i delikatnie wymieszaj. Krew przechowuj w temperaturze pokojowej.
  2. Wyizoluj neutrofile za pomocą dwustopniowego nieciągłego gradientu gęstości, stosując polisacharoza o gęstości 1,119 i 1,077 g/ml. Przed użyciem doprowadź roztwory do temperatury pokojowej.
    UWAGA: Podczas wirowania erytrocyty (RBCs) są agregowane przez polisacharozę i szybko osiadają na dnie. Komórki mononuklearne (monocyty/limfocyty) znajdują się pomiędzy górnym interfejsem osocze/polisacharoza-1,077, natomiast neutrofile znajdują się tuż nad erytrocytami, na interfejsie polisacharoza-1,077/1,119 (patrz Rysunek 2). Metoda ta pozwala na jednoczesne oddzielenie komórek mononuklearnych i neutrofili od tego samego dawcy.

Rozdział komórek krwi, schemat wirowania; gradient polisacharozy, osocze, warstwy komórek jedynojądrowych.
Rycina 2: Izolacja neutrofili z pełnej krwi ludzkiej. Polisacharoza o gęstości 1,077 g/ml jest ostrożnie naniesiona na warstwę polisacharozy 1,119 g/ml w celu utworzenia gradientu nieciągłego. Następnie rozcieńczona pełna krew jest naniesiona na warstwę polisacharozy 1,077 g/ml. Probówki są bezzwłocznie poddawane wirowaniu przy 700 x g przez 30 min w temperaturze pokojowej bez hamowania. Obserwuje się trzy wyraźne pasma: (A) komórki jedynojądrowe, (B) komórki wielojądrowe (PMN) oraz (C) erytrocyty (RBC) na dnie probówki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Do dna sterylnej stożkowej probówki wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml należy dodać 12 ml polisacharozy-1119.
  2. Ostrożnie nanieś 12 ml polisukrozy-1077 warstwą na polisukrozę-1119.
  3. Rozcieńczyć 10–12 ml krwi pełnej do końcowej objętości 24 ml krwi za pomocą wolnego od jonów soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) zawierającej 2% inaktywowanego ciepłem płodowego surowicy cielęcej (HI-FCS). Ostrożnie nanieść 24 ml rozcieńczonej krwi pełnej na górną warstwę gradientu w probówce.
  4. Wirować przy 700 x g przez 30 min w temperaturze pokojowej (20 - 24 °C) bez hamulca.
    UWAGA: Wirowanie w niższych temperaturach może prowadzić do agregacji komórek i niskiej wydajności ich odzysku.
  5. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki, aby nie zakłócić gradientu. Powinny być widoczne dwie nieprzezroczyste warstwy (A: komórki mononuklearne i B: PMN, przedstawione w Rysunek 2).
  6. Odssać i usunąć ciecz do poziomu 0,5 cm powyżej warstwy A. Przenieść (lub usunąć) komórki z tej warstwy do probówki oznaczonej jako „Mononuclear”.
  7. Odssać i odrzucić pozostałą ciecz do poziomu 0,5 cm powyżej warstwy B. Przenieść komórki z tej warstwy do probówki oznaczonej jako „PMN”.
  8. Połączyć PMN z każdej z dwóch probówek z gradientem i przemyć buforem PBS zawierającym 2% HI-FCS do uzyskania końcowej objętości 30 ml. Wirować przez 12 min przy 200 x g, a następnie odlać i usunąć nadsącz.
  9. Aby usunąć zanieczyszczające czerwone krwinki (RBC), dodać 3 ml hipotonicznego, lodowatego, sterylnego roztworu NaCl o stężeniu 0,2%, resuspendując osad poprzez delikatne zasysanie i wypuszczanie cieczy za pomocą sterylnego końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Przechowywać w lodzie przez 30 s.
  10. Po 30 s przywrócić izotoniczność, dodając do probówki 3 ml sterylnego, schłodzonego do temperatury lodowej 1,6% NaCl.
  11. Do 6 ml soli fizjologicznej dodać 6 ml uprzednio ogrzanej (37 °C) pożywka RPMI-1640 uzupełniona 2% HI-FCS i wirować przy 250 x g przez 12 min. Odrzucić nadsącz. Osad PMN nie powinien zawierać zanieczyszczeń z erytrocytów.
    UWAGA: W przypadku zanieczyszczenia erytrocytami osad PMN ma czerwonawy kolor.
  12. Jeśli pozostały zanieczyszczające próbkę erytrocyty, powtórz kroki 9 i 10 jeszcze raz.
  13. Resuspender osad komórkowy w 4 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej o 10% HI-FCS, a następnie policzyć komórki, aby określić ich stężenie i żywotność metodą wykluczania błękitu trypanowego.
  14. Dostosuj stężenie do wartości 1,25 - 1,5 x 106 PMN/ml (w zależności od potrzeb doświadczalnych) i nanieść 1,0 ml/dołek na płytkę 24-dołkową.
    UWAGA: Czystość neutrofili w populacji granulocytów zawsze przekraczała 95%, co oceniono za pomocą barwienia metodą May-Grünwalda-Giemsy i mikroskopii świetlnej.
  15. Po wysianiu umieścić komórki w uwilżony 5% CO22 inkubator w temperaturze 37 °C.
  16. Wymieniaj pożywkę co 3 dni, delikatnie aspirując połowę objętości medium i dodając taką samą ilość świeżej pożywki RPMI-1640 uzupełnionej o 10% HI-FCS. Należy stosować roztwory i związki wolne od LPS oraz HI-FCS o niskim stężeniu LPS (0,05 ng/ml lub mniej).
    UWAGA: Niezbędna jest delikatna wymiana medium, ponieważ Gϕ rozwijające się w hodowli nie przylegają ściśle do naczynia hodowlanego, a intensywne płukanie może doprowadzić do wypłukania rozwijających się komórek. Pojawienie się Gϕ jest zauważalne w 3. – 4. dniu hodowli PMN, w zależności od dawcy krwi. Większość opisanych tutaj analiz i testów wykonuje się między 6. a 7. dniem hodowli, kiedy Gϕ osiągają bardzo duże rozmiary. Należy zauważyć, że dodatek 1–10 ng/ml LPS do medium RPMI-1640 nie wpłynął na rozwój Gϕ w hodowli.14

2. Konfokalna mikroskopia skaningowa

  1. Przygotować preparaty cytospinowe16 z nowo wyizolowanych neutrofili oraz z kultur Gϕ hodowanych przez 7 dni (przygotowanych w sekcji 1).
    UWAGA: Aby zwiększyć stężenie Gϕ w naczyniu do celów poszczególnych analiz, należy delikatnie usunąć połowę medium. Należy upewnić się, że w usuniętym medium nie ma Gϕ, badając je pod mikroskopem świetlnym. Następnie intensywnie pipetować pozostałe medium, aby usunąć słabo przylegające Gϕ. Odwirować medium przez 10 min przy 200 x g i resuspender osad w 100 - 120 µl medium.
    1. Użyć 100 - 120 µl medium z komórkami na każdy preparat. Przygotować duplikaty lub triplikaty preparatów dla każdego wariantu badania. Wirować przez 7 min przy 84 x g.
  2. Wysuszyć wirowane komórki i utrwalić je 4 % paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 10 min pod dygestorium chemicznym. Przemyć 3x w PBS (~100 µl przez kilka sekund podczas każdego przemywania). W przypadku barwienia wewnątrzkomórkowego, przeprowadzić permeabilizację komórek 0,5% Tritonem X-100 w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 min, a następnie przemyć 5x w PBS.
    UWAGA: Na wszystkich etapach należy stosować odpowiednią objętość buforu/roztworu, aby pokryć obszar komórek na szkiełku. Do wyznaczenia obrysu komórek można użyć hydrofobowego pisaka do barier.
    Ostrzeżenie: Paraformaldehyd jest toksyczny. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
  3. Zablokować komórki 10% normalnym surowicą kozią w medium RPMI-1640 i inkubować przez noc w 4 ºC lub w temperaturze pokojowej przez 40 min. Przemyć w PBS.
  4. Inkubować z pojedynczym przeciwciałem (Ab) lub kombinacją mysich i króliczych przeciwciał pierwszorzędowych (Abs) w rozcieńczeniu 1:100 (~100 µl). Inkubować przez noc (18 - 20 h) w 4 °C.
    UWAGA: W tym kroku zastosowano mysie przeciwciała monoklonalne: anty-CD14, anty-CD63, anty-CD66b, anty-CD1c, anty-CD15 oraz anty-łańcuch lekki cytochromu b-245 (identyfikacja p22-phox). Królicze przeciwciała poliklonalne obejmowały: anty-CD68, anty-CD36, anty-LC3B, anty-mieloperoksydazę, anty-elastazę neutrofilową (NE) oraz przeciwciała anty-Nox2/gp91-phox . Kontrole izotypowe obejmowały oczyszczone mysie IgG1 i IgG2 oraz królicze IgG. Przygotować przeciwciała zgodnie z instrukcją producenta i użyć odpowiedniej objętości (około 100 µl), aby pokryć obszar komórek.
  5. Przemyć komórki i inkubować z przeciwciałami wtórnymi w rozcieńczeniu 1/400: kozimi przeciwciałami anty-króliczymi IgG sprzężonymi z Cy2-CF (488A) (zielony) i/lub kozimi przeciwciałami anty-mysimi IgG sprzężonymi z Cy5 (CF 647) (czerwony) w temperaturze pokojowej przez 40 min.
    UWAGA: Rozcieńczyć i przygotować przeciwciała zgodnie z instrukcją producenta.
  6. Po przemyciu zamontować szkiełka, nakładając jedną kroplę medium montażowego zawierającego 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) do barwienia jąder, a następnie natychmiast nałożyć szkiełko nakrywkę.
  7. Przeanalizować preparaty za pomocą konfokalnego skanującego systemu laserowego przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego i immersyjnego obiektywu olejowego Plan Apo 40X. Analizę przeprowadzić od 30 min do 2 h po przygotowaniu preparatów lub przechowywać je w 4 °C przez noc.
    1. Obliczyć pole powierzchni komórek i intensywność fluorescencji za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (np. Image J). W przypadku kolokalizacji, przeprowadzić kwantyfikację za pomocą oprogramowania, stosując współczynnik nakładania Mandersa (MOC)17.
      UWAGA: Tylko komórki z MOC >0,6 można uznać za komórki z istotną kolokalizacją.

3. Transmigracja PMN przez komórki śródbłonka: wpływ IL-8 na tworzenie się gigantycznych fagocytów (Gϕ)

UWAGA: Do badania transmigracji komórek należy użyć przepuszczalnych wkładów do hodowli komórkowej z 24 dołkami.

  1. Pokryć górną komorę wkładki 150 µl fibronektyny o stężeniu 50 µg/ml i pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 min.
  2. Do górnej komory dodać 5 x 104 komórek śródbłonka EA.hy926/dołka, zawieszonych w 150 µl zmodyfikowanej pożywki Eagle'a Dulbecco (kompletna pożywka wzrostowa).
    UWAGA: Przed użyciem należy upewnić się, że monowarstwa śródbłonka jest konfluentna.
  3. Do dolnej komory dodać 700 µL kompletnej pożywki wzrostowej.
  4. Umieścić przepuszczalne wkładki do hodowli komórkowych w tackach skupiających i hodować komórki śródbłonka EA.hy926 przez 2 dni w temperaturze 37 °C w 5% CO2.
    UWAGA: Równolegle, drugiego dnia przygotować świeże PMN (zgodnie z opisem w sekcji 1).
  5. Po 2 dniach wymienić pożywkę w dolnych i górnych komorach wkładek.
    1. Do dolnej komory dodać pożywkę RPMI-1640 uzupełnioną o 10% IH-FCS oraz interleukinę (IL)-8 w końcowym stężeniu 50 nM/ml. Do dolnych komór kontrolnych nie dodawać IL-8.
    2. Do każdej górnej komory dodać 106 świeżych PMN w 100 µl pożywki RPMI-1640 uzupełnionej o 10% IH-FCS.
  6. Inkubować tacki skupiające w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 90 min.
  7. Po 90 min inkubacji osobno pobrać komórki z górnej i dolnej komory i policzyć każdą subpopulację. Liczbę komórek w każdej komorze wyrazić jako procent całkowitej liczby dodanych komórek.
    UWAGA: Komórki z górnej komory należy pobierać ostrożnie za pomocą pipety, aby uniknąć usunięcia komórek śródbłonka, i przenieść do sterylnej probówki. Komórki z dolnej komory należy pobrać poprzez pipetowanie i przemycie dolnej komory 500 µl, a następnie przenieść do drugiej sterylnej probówki.
  8. Połączyć 106 komórek z kilku dołków frakcji PMN transmigrujących (dolna komora) i nietransmigrujących (górna komora), a następnie hodować każdą z nich przez 7 dni bez czynników wzrostu, zgodnie z opisem w krokach 14 - 16 (sekcja 1).
  9. Wywirować komórki na szkiełka16 i przeanalizować rozwinięte komórki dla każdego warunku hodowli za pomocą mikroskopii konfokalnej, zgodnie z opisem w sekcji 2.

Wyniki

Autofagocytoza i rozwój neutrofili w hodowli

Autofagocytoza neutrofilów oraz ich różnicowanie w Gϕ w ciągu 7 dni hodowli przedstawiono w Rycina 3 i 4W dniach 4–7 ich rozmiar znacznie się zwiększył.,15 autofagosytoza była widoczna już po 90 min od współhodowli neutrofili z fluorescencyjnymi barwnikami błonowymi (PKH-26, czerwony; PKH-67, zielony).14 Jako kontrolę dla tej subpopulacji neutrofili, niektóre hodowle neutrofili poddano również działaniu GM-CSF/IL-4. Komórki traktowane cytokinami zwiększyły swój rozmiar w ciągu 7–14 dni hodowli, zgodnie z wcześniejszymi opisami.18,19 Były jednak mniejsze od Gϕ i posiadały wypustki cytoplazmatyczne przypominające komórki podobne do DC (Rysunek 5), jak zgłoszono wcześniej przez Oehlera i wsp..19 Ponadto komórki traktowane GM-CSF/IL-4 były ujemne lub wykazywały niską ekspresję CD66b,15 wyraźnie wykazując różnice morfologiczne, a potencjalnie również funkcjonalne.

Mikroskopia poklatkowa, fluorescencja komórkowa, schemat; śledzenie lokalizacji białek, markery czerwono-zielone.
Rysunek 3: Autofagocytoza w rozwijających się gigantycznych fagocytach (Gϕ) w hodowli. Świeżo wyizolowane, oczyszczone neutrofile znakowano w czasie zero fluorescencyjnymi barwnikami błonowymi PKH-67 (zielony) lub PKH-26 (czerwony), a następnie poddano wspólnej hodowli z obserwacją do siedmiu dni. Komórki naniesiono przez wirowanie na szkiełka przedmiotowe, jądra barwiono DAPI, a próbki analizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Autofagocytoza jest zauważalna już po 90 min wspólnej hodowli. Połączenie barwy czerwonej i zielonej w żółtą i pomarańczową jest wyraźnie widoczne w rozwijających się Gϕ. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Proces różnicowania komórek w ciągu siedmiu dni, obrazy mikroskopowe, zmiany morfologii komórkowej, skala 20 μm.
Rycina 4: Rozwój gigantycznych fagocytów (Gϕ) w hodowli. Świeżo wyizolowane, oczyszczone neutrofile monitorowano przez 7 dni w hodowli. Komórki naniesiono przez wirowanie na szkiełka przedmiotowe w określonych odstępach czasu, zabarwiono metodą May-Grunwalda-Giemsy i analizowano za pomocą mikroskopii w polu jasnym. Dla porównania przedstawiono osobę z niewielką liczbą eozynofilów. Należy zauważyć, że rozmiar eozynofilów w hodowli pozostaje niezmieniony. Powiększenie 100X, imersja olejowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Barwienie metodą May-Grunwalda-Giemsy; mikroskopia fluorescencyjna komórek traktowanych GM-CSF/IL-4, skala 20 μm.
Rycina 5: Porównanie rozwoju gigantycznych fagocytów (Gϕ) oraz neutrofili traktowanych GM-CSF/IL w hodowli. (A) Neutrofile barwione metodą May-Grunwalda-Giemsy, hodowane przez 7 dni bez (Gϕ) oraz z dodatkiem GM-CSF/IL-4. Próbki analizowano za pomocą mikroskopii w polu jasnym. Powiększenie X40. Komórki rozwinięte w hodowlach w medium uzupełnionym o GM-CSF/IL-4 wykazują rozległe wypustki cytoplazmatyczne, lecz są mniejsze niż Gϕ. (B) Świeżo wyizolowane neutrofile znakowano barwnikiem PKH-26 (czerwony) i hodowano w medium wolnym od cytokin przez 7 dni lub znakowano barwnikiem PKH-67 (zielony) i hodowano w medium uzupełnionym o GM-CSF/IL-4 przez 7 dni. Następnie rozwinięte komórki zmieszano w stosunku 1:1 i współhodowano przez 2 hr. Komórki utrwalono i analizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła15. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Aby dokładniej zbadać przebieg rozwoju Gϕ, śledzono również ich zmiany morfologiczne za pomocą mikroskopii poklatkowej. Video-1 (dzień 3 do dnia 4) oraz video-2 (dzień 4 do dnia 5) przedstawiają ich rozwój w oczyszczonych kulturach neutrofili. Te Gϕ są nieprzylegające lub słabo przylegające, o ograniczonej zdolności do poruszania się i aktywnie pochłaniają otaczające szczątki i debris neutrofili. W video-3 porównano ruch Mϕ pochodzących z monocytów oraz Gϕ w mieszanej kulturze monocytów i neutrofili. Mϕ aktywnie pełza (po lewej, nieznakowana komórka). Gϕ (po prawej) to jasna komórka znakowana PKH-26.

Obraz mikroskopowy komórek, przedstawiający strukturę komórkową w skali szarości, analiza badań biologicznych.
Wideo-1: Prezentacja rozwoju gigantycznych fagocytów w oczyszczonych kulturach PMN w dniach 3. - 4. za pomocą mikroskopii time-lapse.Neutrofile były monitorowane w hodowli od 3. do 4. dnia za pomocą mikroskopii time-lapse. System mikroskopii time-lapse składa się z odwróconego zautomatyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego oraz czarno-białej kamery CCD o wysokiej rozdzielczości z inkubatorem na stoliku przedmiotowym. Przechwytywanie obrazów w technice time-lapse odbywało się co 10 min. Pierwotnie opublikowano w referencji14 Prosimy kliknąć tutaj, aby obejrzeć ten film.

Obraz mikroskopowy monowarstwy komórek ilustrujący morfologię komórek do badań biologicznych.
Wideo 2: Przedstawia rozwój gigantycznych fagocytów w oczyszczonej kulturze PMN w dniach 4–5 przy użyciu mikroskopii poklatkowej. Neutrofile monitorowano w hodowli od 4. do 5. dnia za pomocą mikroskopii poklatkowej. System mikroskopii poklatkowej składa się z odwróconego zmotoryzowanego mikroskopu fluorescencyjnego oraz czarno-białej kamery CCD o wysokiej rozdzielczości wraz z inkubatorem na stoliku przedmiotowym. Akwizycję obrazów w trybie poklatkowym przeprowadzano co 10 min. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.

Obraz mikroskopowy mikroorganizmów, struktur komórkowych, analiza mikroskopowa, badania biologiczne.
Wideo-3: Gigantyczny fagocyt i makrofag rozwinięte w ko-kulturze. Ko-kultura monocytów/neutrofili była monitorowana od 4. do 5. dnia za pomocą mikroskopii poklatkowej. Makrofag pochodzenia monocytarnego (po lewej); jasny (komórka barwiona PKH-26) gigantyczny fagocyt pochodzenia neutrofilnego (po prawej). System mikroskopii poklatkowej użyty do nagrania wideo składa się z odwróconego zmotoryzowanego mikroskopu fluorescencyjnego oraz czarno-białej kamery CCD o wysokiej rozdzielczości, z inkubatorem na stoliku mikroskopu. Przechwytywanie obrazów w trybie poklatkowym odbywało się co 10 min. Pierwotnie opublikowano w odniesieniu14 Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.

Ekspresja markerów w fagocytach olbrzymich

Neutrofilne pochodzenie Gϕ zostało potwierdzone poprzez pozytywną ekspresję następujących markerów neutrofili: CD66b/CD63/MPO/NE/CD15 (Rysunek 6). Gϕ wykazywały również ekspresjęy NADPH oksydazy, receptorów dla oxLDL – CD68 i CD36, oraz zawierały powlekane LC3B wakuole i agregaty (zidentyfikowane metodą Western blotting jako LC3BII15), co wykazało obecność markera autofagii. Jednakże były one negatywne pod kątem markerów linii monocytowej (CD14, CD16 i CD163) oraz komórek dendrytycznych (CD1c i CD141), co sugeruje, że Gϕ nie pochodziły z zanieczyszczających monocytów.

Markery ziarnistości neutrofili, obrazy z mikroskopii immunofluorescencyjnej, uwydatniające białka komórkowe.
Rycina 6: Ekspresja różnych markerów neutrofili, monocytów i komórek dendrytycznych w fagosytach olbrzymich (Gϕ) po 7 dniach hodowli. Pozytywna ekspresja swoistego dla neutrofili markera ziarnistości CD66b, markerów ziarnistości azurofilnych CD63 i MPO, elastazy neutrofilowej oraz CD15. Negatywna ekspresja markerów dendrytycznych CD1c i CD141 oraz markerów linii monocytarnych CD14, CD16 i CD163. Dodatkowo Gϕ wykazywały ekspresję markera autofagii LC3B, receptorów scavengerowych CD68 i CD36 oraz podjednostek NADPH oksydazy gp91-phox/p22-phox. Jądra komórkowe barwiono DAPI, a próbki analizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Rycina została zmodyfikowana na podstawie referencji14,15 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Funkcje Gϕ – aktywacja NADPH-oksydazy, produkcja ROS i fagocytoza:

W komórkach Gϕ stwierdzono fagocytozę kulek lateksowych i opsonizowanego zymosanu. Komórki Gϕ generowały również bazowy poziom ROS (Rysunek 7A) oraz reagowały na stymulację zymosanem i PMA poprzez wyrzut oksydacyjny (Rysunek 7B-D). Jednak w przeciwieństwie do monocytów lub neutrofili, komórki Gϕ generowały ROS także w odpowiedzi na stymulację oxLDL i zostały zabarwione Oil Red O (Rysunek 7B, F). Warto zauważyć, że traktowanie świeżych neutrofili inhibitorem NADPH oksydazy – DPI – nie tylko zahamowało produkcję ROS, ale także zapobiegło formowaniu się Gϕ w hodowli, co sugeruje, że sygnalizacja ROS jest niezbędna do powstawania Gϕ.14,15

Mikroskopia fluorescencyjna komórek poddanych działaniu preparatów; barwienie na ROS i LysoTracker, testy fagocytozy.
Rycina 7: Przesunięcie tlenowe, fagocytoza i wychwyt oxLDL przez gigantyczne fagocyty (Gϕ). (A) Bazowa produkcja ROS jest widoczna w lizosomach Gϕ. (B) Produkcja ROS w odpowiedzi na utlenione LDL (oxLDL), PMA oraz zymosan (cząsteczki zymosanu są wyraźnie zaznaczone). (C) Test nitro błękitu tetrazolium (NBT) w Gϕ wykazujący aktywność wyrzutu oddechowego bez i z dodatkiem PMA (preparaty są niebarwione, ale wstawki są barwione metodą May-Grunwald-Giemsa). (D) Test NBT i Gϕ barwione metodą May-Grunewald-Giemsa z dodatkiem PMA oraz PMA/DPI, który zahamował oksydazę NADPH i ROS. (E) Fagocytoza lateksu i opsonizowanego IgG zymosanu w komórkach barwionych PKH-26 (czerwony). (F) Barwienie Oil Red O w nieleczonych i traktowanych oxLDL Gϕ. Rycina została zmodyfikowana na podstawie referencji.14,15 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Transmigracja PMN przez komórki śródbłonka

W celu zidentyfikowania potencjalnych subpopulacji neutrofilów, które mogą przekształcić się w Gϕ, określono migrację neutrofilów przez monowarstwy komórek śródbłonkowych (Rycyna 8A). Po 90 min 62,3 ± 12,2% neutrofilów przemiegrowało przez komórki śródbłonkowe w kierunku IL-8 znajdującej się w dolnej komorze. Warto zauważyć, że Gϕ wykazujące pozytywny wynik dla CD66b/CD15/LC3B rozwinęły się wyłącznie z populacji neutrofilów, które przemiegrowały, podczas gdy komórki powstałe z frakcji neutrofilów niemigrujących były mniejsze i nie wykazywały ekspresji markerów neutrofilowych CD66b/CD15 (Rycina 8B, 8C).

Schemat transmigracji; wpływ IL-8 na neutrofile. Obrazy konfokalne: ekspresja LC3B/CD66b, CD15.
Rysunek 8: Wpływ zależnej od IL-8 transmigracji PMN przez komórki śródbłonka na powstawanie gigantycznych fagocytów (Gϕ). (A) Schemat ilustrujący test transmigracji neutrofili przez monowarstwy komórek śródbłonka (ECs) w kierunku IL-8. Test ten może być uznany za model rekrutacji neutrofili do miejsc ostrego stanu zapalnego. (B-C) W teście migracji komórek (opisanym w protokole 3), frakcje neutrofili transmigrujących (B) i nietransmigrujących (C) hodowano przez siedem dni bez czynników wzrostu (podobnie jak w protokole 1). Następnie komórki naniesiono metodą wirowania na szkiełka przedmiotowe i przeanalizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Utrwalone komórki barwiono pod kątem CD66b (czerwony), LC3B (zielony) i CD15 (czerwony). Jądra komórkowe barwiono DAPI (niebieski). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Fagocyty olbrzymie (Gφ) to nowo zdefiniowana subpopulacja komórek pochodzących z neutrofili wykazujących ekspresję podstawowych i specyficznych markerów neutrofilowych, takich jak CD66b/CD15/CD63/MPO/NE. Ten typ fagocytów pochodzących z neutrofili nie był wcześniej opisywany w literaturze. W przeciwieństwie do neutrofili, które żyją krótko i ulegają apoptozie, Gφ są aneksynami V-ujemnymi i wykazują wydłużoną żywotność. Jednak, podobnie jak neutrofile, Gφ również internalizują cząstki i wytwarzają ROS zależne od oksydazy NADPH w odpowiedzi na te cząstki i PMA. Jednak ich zdolności do internalizacji OxLDL, a w konsekwencji do produkcji ROS, są unikalnymi cechami Gφ. 14

Wykazano, że na ich rozwój w kulturze wpływa szereg czynników. Niezbędny jest brak zewnętrznych cytokin lub czynników wzrostu w pożywce wzrostowej (w szczególności GM-CSF/IL-4). Jednak migracja neutrofili w kierunku IL-8 okazała się czynnikiem odróżniającym te, które rozwinęły się w Gφ, i te, które tego nie zrobiły. Wykazano również, że internalizacja szczątków powstających z apoptotycznych neutrofili, ekspresja białek autofagii (LC3B) i funkcjonalna oksydaza NADPH są niezbędne do ich rozwoju, ponieważ ich hamowanie zapobiegało tworzeniu się Gφ (ryc. 1). Najwyraźniej rozwój tych gigantycznych komórek powstających z neutrofili różni się od tego, który charakteryzuje tworzenie się gigantycznych komórek w linii monocytów/makrofagów. Te ostatnie tworzą wielojądrzaste olbrzymie komórki związane z różnymi przewlekłymi chorobami zapalnymi,20,21 podczas gdy opisane tutaj neutrofilowe Gφ rozwijają się poprzez autofagocytozę, pochłaniając resztki komórek i pozostają w większości jednojądrowe przez cały okres ich rozwoju,14 (rzadko jednak, czasami można zaobserwować drugie jądro). Co więcej, szereg osób kontrolnych ustaliło ich neutrofilowe pochodzenie: (1) ekspresję specyficznych markerów neutropilicznych i brak markerów linii dendrytycznej i monocytowej, (2) ich utrudniony rozwój w kokulturach monocytów/PMN, (3) ich różne wzorce ruchu w hodowli od makrofagów (o czym świadczy obrazowanie żywych komórek i mikroskopia poklatkowa),14 (4) ich lekkie przyleganie do plastikowych naczyń oraz (5) ich rozwój z czystego CD15+/CD14- PMN uzyskany metodą cytometrii przepływowej.

Niektóre z funkcji zidentyfikowanych in vitro mogą dać nam wskazówki co do ich potencjalnych funkcji in vivo. Na przykład zdolność Gφ do zużywania dużych ilości granulek i szczątków neutrofili, obecność dużych wakuoli i ekspresja LC3B - białka autofagii, które przyczynia się do zmniejszenia stanu zapalnego poprzez interakcje regulacyjne z wrodzonymi szlakami sygnalizacji immunologicznej,22 - z których wszystkie wspierają zdolności wymiatające. W związku z tym odkrycia te wskazują również, że Gφ może funkcjonować w miejscach zapalnych, w których system Mφ/DC jest niewystarczający lub przeciążony, a tym samym przyczyniać się do ustąpienia stanu zapalnego. Za tym stwierdzeniem może przemawiać fakt, że w mieszanych kulturach monocytów/neutrofili rozwój Gφ jest utrudniony. 14 Ponadto, biorąc pod uwagę, że Gφ wyrażają receptory zmiatające oxLDL (CD36, CD68), internalizują oxLDL i wytwarzają ROS w odpowiedzi na to, może to wskazywać, że są one zaangażowane w procesy miażdżycowe w celu rozwiązania stanu zapalnego. Ponieważ Gφ rozwinął się tylko z neutrofili, które migrowały w kierunku IL-8, a transmigracja neutrofili przez monowarstwy śródbłonka w kierunku IL-8 reprezentuje rekrutację neutrofili do ostrych miejsc zapalnych, odkrycie to może również wspierać funkcje przeciwzapalne. I odwrotnie, działanie Gφ w niektórych stanach zapalnych może umożliwić im rozładowanie składników ziarnistości i ROS, przyczyniając się w ten sposób do uporczywego stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek. 20 Jednak ogólnie rzecz biorąc, ich zdolności autofagiczne wskazują, że Gφ są prawdopodobnie zaangażowane w zmniejszanie reakcji zapalnej, a nie jej utrwalanie.

Co ciekawe, niedawno zidentyfikowaliśmy obecność Gφ w blaszkach miażdżycowych u ludzi. (w przygotowaniu). Jednak wiele pytań pozostaje jeszcze nierozwikłanych. Na przykład, czy Gφ są pro- czy przeciwzapalne? Jakie czynniki decydują o ich powstawaniu i funkcjonowaniu in vitro lub in vivo? Która konkretna subpopulacja neutrofili jest ich komórką prekursorową, która ułatwia ich rozwój do Gφ? Czy są one związane z pewnymi patologiami, a które z nimi? Zbiorowo, stawiając interesujące pytania dotyczące ich pochodzenia i potencjalnych funkcji.

Należy jednak pamiętać o krytycznych krokach i pułapkach w protokole. Kluczowym krokiem w rozwoju Gφ jest hodowla czystych neutrofili w pożywce pozbawionej cytokin, czynników wzrostu lub antybiotyków. Kolejnym krytycznym krokiem jest wykluczenie, że Gφ rozwijają się z zanieczyszczających monocytów i ustalenie neutrofilowego pochodzenia Gφ. Tak więc, po separacji krwi za pomocą nieciągłego gradientu, neutrofile poddano dodatkowemu etapowi oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem bramkowania granulocytów i markerów CD15+/CD14- . Opracowane Gφ uzyskane z neutrofili, które zostały dodatkowo oczyszczone przez separację metodą cytometrii przepływowej, nie różniły się od tych, które nie zostały poddane temu etapowi oczyszczania. Dlatego większość eksperymentów przeprowadzono bez etapu oczyszczania metodą cytometrii przepływowej ze względu na dodatkową utratę komórek. Warto zauważyć, że w niektórych rzadkich przypadkach w kulturze odnotowano niektóre eozynofile. Ich wielkość pozostała niezmieniona przez cały okres kultury. Powinniśmy również zauważyć, że chociaż istnieje wiele metod separacji neutrofili od ludzkiej krwi, opisana tutaj metoda jest jedyną zastosowaną przez nas metodą i dlatego nie możemy porównywać rozwoju Gφ z innymi dostępnymi metodami separacji neutrofili.

Poważna pułapka w badaniu Gφ wynika z niemożności uzyskania wystarczającej liczby czystej populacji Gφ odpowiedniej do różnych testów biochemicznych. Jest to w zasadzie niemożliwe w warunkach, w jakich przeprowadzano nasze eksperymenty. Po pierwsze, wydajność Gφ jest niska. Od 1,0 x 106 PMN wysianych około 100 - 200 Gφ rozwija się po siedmiu dniach w hodowli, w zależności od dawcy krwi. Po drugie, w tej chwili w zasadzie trudno jest oddzielić rozwinięte w kulturze Gφ od pozostałych szczątków neutrofili w naczyniu. Ograniczenia te praktycznie uniemożliwiły analizę komórek metodami biochemicznymi lub biologii molekularnej. Dlatego protokół ten koncentruje się na opisie identyfikacji i funkcji Gφ za pomocą mikroskopii świetlnej i konfokalnej. Ich morfologiczna transformacja z neutrofili do Gφ w hodowli była również śledzona za pomocą obrazowania żywych komórek i mikroskopii poklatkowej. 14 Wydaje się, że do zastosowania metod biologii biochemicznej lub biologii molekularnej i przezwyciężenia niskiej wydajności uzyskanej oraz oddzielenia żywotnych Gφ od szczątków neutrofili w naczyniu może być potrzebne znacznie większe objętości krwi.

Podsumowując, niedawno po raz pierwszy opisaliśmy rozwój Gφ w kulturze, subpopulacji długowiecznych fagocytów pochodzenia neutrofilowego. Dlatego jest to jedyna obecnie dostępna metoda otrzymywania Gφ w hodowli, chociaż należy przezwyciężyć dwa główne ograniczenia wymienione powyżej (niska wydajność Gφ uzyskanego w kulturze i niemożność oddzielenia rozwiniętego Gφ od szczątków neutrofili w szalce hodowlanej). Mimo to ich przygotowanie i identyfikacja, przedstawione w tym protokole, jest niezbędne dla naukowców zainteresowanych reakcjami zapalnymi oraz biologią i plastycznością neutrofili, w celu dalszego zbadania potencjalnego znaczenia i funkcji Gφ.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Edith Suss-Toby za jej nieocenioną pomoc w badaniach mikroskopii konfokalnej. Badanie to było wspierane przez Ministerstwo Absorpcji Imigracyjnej oraz Komitet ds. Planowania i Budżetowania Rady ds. Szkolnictwa Wyższego w ramach programu KAMEA (LD i AP). Wyrażamy również wdzięczność za wsparcie ze strony pracownika naukowego z Lady Davis Foundation Post-Doctoral Research Fellowship (OR).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sterylny zestaw żył skóry głowy (21GX3/4) Biodiagnostyka Sp. z o.o.# 20080312Igła do żyły
VACUETTE HOLDEX Jednorazowy uchwyt PPGreiner Bio-One# 450263Do zabezpieczania podczas nakłucia żyły 
Probówka VACUETTE K3E K3EDTA (16 x 100/9 mL)Greiner Bio-One# 455036Sterylna probówka do pobierania krwi
Nunclon MultiDish (24 dołki x 1 ml)Thermo Scientific# 142475
Polipropylenowa stożkowa probówka wirówkowa (50 ml)Greiner Bio-One# E14103PJ
Transwell-24 studzienka (test transmigracji)Corning# CA-3415Membrana poliwęglanowa, średnica 6,5 mm, 3 μ m pory) 
RPMI-1640 mediumBioIndustries# 01-100-1ANie dodawaj antybiotyków   
EA.hy926 (CRL2922 ATCC)   BioIndustries# CRL-2922
Dulbecco opracowany przez ATCC s  Zmodyfikowany orzeł" s MediumBioIndustries# 302002kompletne podłoże
wzrostowe Polisaroza - Histopaque1119Sigma-Aldrich# 1119-1Polisaroza klasy kulturowej
tkankowej - Histopaque1077Sigma-Aldrich# 1077-1Klasa kultury tkankowej 
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) - bez jonówBioIndustries# 02-023-1AKlasa biologii komórki i biologii molekularnej
Inaktywowana termicznie Surowica cielęca płodu (HI-FCS)BioIndustries# 04-121-1BKlasa biologii komórki lub klasa hodowli tkankowej, niska klasa LPS
NaClSigma# S3014Klasa biologii molekularnej, odpowiednia do hodowli komórkowych
Paraformaldehyd, 16%Mikroskopia elektronowa Nauki# 15710Klasa bologii komórkowej lub klasa hodowli tkankowej (tylko 16% PFA)
Triton X-100Sigma-Aldrich# 9002-93-1Klasa biologii molekularnej 
Normalna surowica koziaBioIndustries# 04-009-1Biologia komórki i biologia molekularna klasa
Trypan blueBioIndustries# 031021BKlasa hodowli tkankowej 
Może-Grü nwaldSigma-Aldrich# MG500Klasa biologii komórki-(procedura nr GS-10)
Zestaw barwników GiemsaSigma# 48900Klasa biololgii komórek-(procedura nr GS-10)
FibronectinBioIndustries# 03090105
Ludzka interleukina-8 (CXCL8)PeproTech# 200-08-5
Anti-CD14 (klon 5A3B11B5)Santa Cruz Biotechnologies# sc-58951Mysz IgG2b; wyrażony przez  monocyty
Anty-CD63 (klon MX-49.129.5)Santa Cruz Biotechnologies# sc-5275Mysz IgG1; wyrażony przez neutrofile
Anty-CD66b (klon 80H3)AbD Serotec# MCA216Mysz IgG1; wyrażony przez neutrofile
Anty-CD1c (BDCA-1) (klon AD5-8E7)MACS Miltenyi Biotec# 130-090-695Mysz IgG2a; wyrażony przez  komórki dendrytyczne
Anty-CD15 (klon MY-1)Abcam# ab754Mysia IgM; wyrażane przez neutrofile
Łańcuch lekki antycytochromu b-245 (p22-phox) (klon 44.1)BioLegend# 650001IgG2a myszy; rozpoznawanie kompleksu oksydazy neutrofilowej NADPH
Białko anty-CD68Tech# 16192-1-APIgG królika; rozpoznanie receptora wymiatającego oxLDL 
Anty-LC3BSigma# L7543Królik IgG 
Anty-mieloperoksydazaAbcam# ab45977IgG królika
Elastaza antyneutrofilowaCalbiochem# 481001IgG królika 
Anty-NOX2 (gp91-phox)Abcam# ab131083IgG królika
anty-CD36 (SR-B3)Novus Biologicals# NB400-144IgG
królika oczyszczona mysz IgG1, κ Kontrola izotypu (klon MG1-45)BioLegend# 401401Przeciwciało stosowane jako kontrola izotypu
Oczyszczona mysz IgG2a, κ Kontrola izotypu (klon MOPC-173)BioLegend# 400263Przeciwciało stosowane jako kontrola izotypu
Normalna królicza IgGSanta Cruz Biotechnologies# sc-2027Przeciwciało stosowane jako kontrola izotypu
CF488A Kozia anty-królicza IgG (H+L)Biotium # 20012Anti-Rabbit IgG z zielonym barwnikiem fluorescencyjnym CF488A
CF647 Kozia IgG Anty-Królicza (H+L)Biotium # 20043Anti-Rabbit IgG z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym CF647
CF488A Kozia IgG Anty-Mysia IgG (H+L)Biotium # 20010Anti-Mouse IgG z zielonym barwnikiem fluorescencyjnym CF488A
CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Biotium # 20040Anti-Mouse IgG z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym CF647
Fluorescencyjne podłoże montażowe z DAPIVectashield H-1000; Vector Lab Inc.# E19-18do barwienia jądrowego
(LSM 700)     Carl ZeissSer.# 3523000380Cel olejku immersyjnego Plan Apo 40X   
Oprogramowanie Zeiss CLSM (ZEN 2010)Carl Zeiss MicroImaging GmbHwersja 6.0Do analizy kolokalizacyjnej
Oprogramowanie ImageJWayne Rasband, NIH, USAwersja 1.49kDo oznaczania powierzchni komórek i intensywności fluorescencji
Mikroskop świetlny (Axiovert 25)Carl ZeissSer.# 201060153Badanie komórek w hodowli
Wirówka (Megafuge 1.0 R)Heraeus Instruments# D-37520Separacja komórek od krwi; przygotowanie cytospinów
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny (Zeiss Axio Observer Z.1)Carl ZeissSer.# 3834001470Demonstracja rozwoju gigantycznych fagocytów
System inkubacji z kontrolowaną temperaturą (Cube& Box)Life Imaging ServicesSystem kontroli temperatury dla mikroskopów
Wysoki  Cyfrowa kamera CCD o rozdzielczości (AxioCam HRm)Carl ZeissSer.# 117090279Do przechwytywania danych obrazowych o wysokim kontraście z badanych obiektów komórkowych
Długopis bariery hydrofobowej (Elite PAP Pen)Diagnostic Biosystems# K039Do określania obwodu komórek do barwienia immunofluorescencyjnego
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy

Bibliografia

  1. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  2. Silva, M. T., Correia-Neves, M. Neutrophils and macrophages: the main partners of phagocyte cell systems. Front. Immunol. 3, 174(2012).
  3. Cowburn, A. S., Condliffe, A. M., Farahi, N., Summers, C., Chilvers, E. R. Advances in neutrophil biology: clinical implications. Chest. 134, 606-612 (2008).
  4. Duffin, R., Leitch, A. E., Fox, S., Haslett, C., Rossi, A. G. Targeting granulocyte apoptosis: mechanisms, models, and therapies. Immunol. Rev. 236, 28-40 (2010).
  5. Silva, M. T. Macrophage phagocytosis of neutrophils at inflammatory/infectious foci: a cooperative mechanism in the control of infection and infectious inflammation. J. Leukoc. Biol. 89, 675-683 (2011).
  6. Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
  7. Cassatella, M. A., Locati, M., Mantovani, A. Never underestimate the power of a neutrophil. Immunity. 31, 698-700 (2009).
  8. Zhang, X., Majlessi, L., Deriaud, E., Leclerc, C., Lo-Man, R. Coactivation of Syk kinase and MyD88 adaptor protein pathways by bacteria promotes regulatory properties of neutrophils. Immunity. 31, 761-771 (2009).
  9. Araki, H., et al. Reprogramming of human postmitotic neutrophils into macrophages by growth factors. Blood. 103, 2973-2980 (2004).
  10. Iking-Konert, C., et al. Up-regulation of the dendritic cell marker CD83 on polymorphonuclear neutrophils (PMN): divergent expression in acute bacterial infections and chronic inflammatory disease. Clin. Exp. Immunol. 130, 501-508 (2002).
  11. Rydell-Tormanen, K., Uller, L., Erjefalt, J. S. Neutrophil cannibalism--a back up when the macrophage clearance system is insufficient. Resp. Res. 7, 143(2006).
  12. Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
  13. Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. J. Leukoc. Biol. 90, 271-284 (2011).
  14. Dyugovskaya, L., Berger, S., Polyakov, A., Lavie, L. The development of giant phagocytes in long-term neutrophil cultures. J. Leukoc. Biol. 96, 511-521 (2014).
  15. Dyugovskaya, L., Berger, S., Polyakov, A., Lavie, P., Lavie, L. Intermittent Hypoxia Affects the Spontaneous Differentiation In Vitro of Human Neutrophils into Long-Lived Giant Phatocytes. Oxid. Med. Cell. Longev. , 9636937(2016).
  16. Mihalache, C. C., et al. Inflammation-associated autophagy-related programmed necrotic death of human neutrophils characterized by organelle fusion events. J. Immunol. 186, 6532-6542 (2011).
  17. Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of Colocalization of Objects in Dual-Color Confocal Images. J. Microsc. 169, 375-382 (1993).
  18. Matsushima, H., et al. Neutrophil differentiation into a unique hybrid population exhibiting dual phenotype and functionality of neutrophils and dendritic cells. Blood. 121, 1677-1689 (2013).
  19. Oehler, L., et al. Neutrophil granulocyte-committed cells can be driven to acquire dendritic cell characteristics. J. Exp. Med. 187, 1019-1028 (1998).
  20. Berton, G. Editorial: Gigantism: a new way to prolong neutrophil life. J. Leukoc. Biol. 96, 505-506 (2014).
  21. Milde, R., et al. Multinucleated Giant Cells Are Specialized for Complement-Mediated Phagocytosis and Large Target Destruction. Cell. Rep. 13, 1937-1948 (2015).
  22. Deretic, V., Saitoh, T., Akira, S. Autophagy in infection, inflammation and immunity. Nat. Rev. Immunol. 13, 722-737 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Różnicowanie neutrofilihodowla komórkowacytometria przepływowamikroskopia konfokalnawybucht tlenowydetekcja autofagiiekspresja markerówtest fagocytozyprodukcja ROS
Opracowanie i identyfikacja nowej subpopulacji ludzkich fagocytów olbrzymich pochodzących z neutrofili in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.