Artykuł metodologiczny

Opracowanie i identyfikacja nowej subpopulacji ludzkich fagocytów olbrzymich pochodzących z neutrofili in vitro

DOI:

10.3791/54826

⸱

25 stycznia 2017

 ,  ,  ,  , 
1The Lloyd Rigler Sleep Apnea Research Laboratory, Unit of Anatomy and Cell Biology, The Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion-Israel Insitute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj metodę uzyskiwania i identyfikowania nowo scharakteryzowanej subpopulacji gigantycznych fagocytów pochodzących z neutrofili. Komórki te rozwijają się w hodowli ze świeżych neutrofili ludzkiej krwi i charakteryzują się fagocytozą, autofagią, niezwykle dużymi rozmiarami i wydłużoną żywotnością. Metoda ta jest niezbędna do dalszego badania tej unikalnej subpopulacji pochodzącej z neutrofili.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile (PMN) są najbardziej znane ze swoich funkcji fagocytarnych przeciwko atakującym patogenom i mikroorganizmom. Mają najkrótszy okres półtrwania wśród leukocytów, a w stanie nieaktywowanym są konstytutywnie zaangażowane w apoptozę. Po rekrutacji do miejsc zapalnych w celu rozwiązania stanu zapalnego, wytwarzają szereg cząsteczek cytotoksycznych o silnym działaniu przeciwbakteryjnym. Jednak gdy te silne cząsteczki cytotoksyczne są uwalniane w niekontrolowany sposób, mogą uszkodzić otaczające tkanki. Jednak w ostatnich latach coraz częściej potwierdza się wszechstronność neutrofili, wykazując plastyczność i funkcje immunoregulacyjne. Niedawno zidentyfikowaliśmy nową subpopulację pochodzącą z neutrofili, która rozwija się spontanicznie w standardowych warunkach hodowli bez dodatku cytokin / czynników wzrostu, takich jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (GM-CSF) / interleukina (IL)-4. Ich zdolności fagocytarne pozostałości neutrofili w dużej mierze przyczyniają się do ogromnego zwiększenia ich rozmiaru; dlatego nazwano je gigantycznymi fagocytami (Gφ). W przeciwieństwie do neutrofili, Gφ są długowieczne w kulturze. Wyrażają one klaster markerów różnicowania (CD) neutrofili CD66b/CD63/CD15/CD11b/mieloperoksydaza (MPO)/elastaza neutrofilowa (NE) i są pozbawione markerów linii monocytowej CD14/CD16/CD163 i markerów dendrytycznych CD1c/CD141. Pobierają również lateks i zymozan i reagują wybuchem oksydacyjnym na stymulację opsonizowanym zymozanem i PMA. Gφ wyrażają również receptory zmiataczy CD68 / CD36 i, w przeciwieństwie do neutrofili, internalizują utlenioną lipoproteinę o niskiej gęstości (oxLDL). Co więcej, w przeciwieństwie do świeżych neutrofili lub hodowanych monocytów, reagują na wychwyt oxLDL zwiększoną produkcją reaktywnych form tlenu (ROS). Dodatkowo fagocyty te zawierają wakuole pokryte białkiem lekkim 3B (LC3B) związanym z mikrotubulami, co wskazuje na aktywację autofagii. Stosując specyficzne inhibitory, oczywiste jest, że zarówno fagocytoza, jak i autofagia są warunkami wstępnymi ich rozwoju i prawdopodobnego ROS zależnego od oksydazy NADPH. Opisujemy tutaj metodę przygotowania tej nowej subpopulacji długowiecznych komórek fagocytarnych pochodzących z neutrofili w hodowli, ich identyfikację i obecnie znane cechy. Protokół ten jest niezbędny do uzyskania i scharakteryzowania Gφ w celu dalszego zbadania ich znaczenia i funkcji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielojądrzaste neutrofile (PMN) stanowią największą populację leukocytów we krwi, służąc jako pierwsza linia obrony przed atakującymi patogenami, wytwarzając szeroki zakres cząsteczek cytotoksycznych. Tradycyjny pogląd od dawna jest taki, że krążące we krwi, krótko żyjące, profesjonalne fagocyty, które jako pierwsze docierają do ostrych miejsc zapalnych, aby zwalczać infekcje i pomagać w usuwaniu patogenów i szkodliwych cząstek. 1 W stanie nieaktywowanym, neutrofile są konstytutywnie zaangażowane w apoptozę. Podczas migracji z krwi do miejsc zapalnych neutrofile ulegają aktywacji w celu rozwiązania stanu zapalnego. Fagocytozą i zabijają inwazyjne mikroorganizmy, wytwarzając szereg cząsteczek cytotoksycznych, takich jak reaktywne formy tlenu (ROS), enzymy lityczne, takie jak elastaza neutrofilowa (NE) i katepsyny o silnym działaniu bakteriobójczym. Aby wychwycić patogeny, neutrofile uwalniają również pułapki zewnątrzkomórkowe (NET), które składają się z nici chromatyny jądrowej zawierających peptydy przeciwbakteryjne i różne enzymy lityczne. Jednak niekontrolowane uwalnianie tych cytotoksycznych cząsteczek z neutrofili może również utrwalać reakcje zapalne i indukować uszkodzenia otaczających tkanek. 2 Dlatego skuteczne usuwanie apoptotycznych neutrofili przez makrofagi (Mφ) i komórki dendrytyczne (DC) jest kluczowe dla rozwiązania stanu zapalnego. 3,4,5,6

W ostatnich latach stało się jednak coraz bardziej oczywiste, że neutrofile są bardzo wszechstronnymi komórkami, których funkcje wykraczają daleko poza fagocytozę i zabijanie patogenów. 6,7 Poprzez proces torowania lub aktywacji, plastyczność neutrofili stopniowo zyskuje na znaczeniu. Na przykład wykazano, że bakterie i prątki prowokowane neutrofilami wydzielają interleukinę (IL)-10 i kontrolują odpowiedź zapalną, co sugeruje obecność odpowiedzi immunoregulacyjnych. 8 Wykazano, że neutrofile po mitocie różnicują się w komórki podobne do Mφ lub komórki podobne do DC, trawiąc i prezentując fragmenty antygenu podczas leczenia cytokinami i czynnikami wzrostu,9,10 pełniąc zatem kluczową rolę w integracji odpowiedzi wrodzonych i adaptacyjnych. 3,6 Aktywacja przez czynniki wzrostu sprzyjała pochłanianiu apoptotycznych neutrofili lub resztek komórkowych, ułatwiając w ten sposób usuwanie zanieczyszczeń w miejscach zapalnych i ustępowanie stanu zapalnego,3,9 szczególnie gdy system oczyszczania Mφ/DC jest niewystarczający lub przeciążony,11,12 sugerując potencjalną "samoregulację", która pomaga rozwiązać reakcję zapalną. Dzieje się tak, ponieważ apoptoza jest formą regulowanej samośmierci, która może hamować zewnątrzkomórkowe uwalnianie związków cytotoksycznych, a tym samym zapobiegać uszkodzeniom otaczających tkanek. 6

Przedłużone przeżycie to kolejna cecha aktywacji neutrofili i została zademonstrowana przez leczenie różnymi czynnikami pochodzącymi od gospodarza, takimi jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), cytokiny zapalne, takie jak interferon (IFN)-γ, czynnik martwicy nowotworów (TNF)-α i/lub produkty pochodzące z patogenów, co pozwala neutrofilom modulować swoją reakcję na przeżycie. 6 W rzeczywistości przeżywalność neutrofili jest warunkiem wstępnym ich plastyczności i była związana z ich zdolnością do przeprowadzania fagocytozy. 6,13 W związku z tym wykazano również, że wiąże się ze zmianami fenotypowymi i funkcjonalnymi, które zależały od zwiększonej ekspresji genów poprzez indukcję syntezy nowych białek zaangażowanych w wydłużenie życia neutrofili i zmniejszenie apoptozy. 10

W przeciwieństwie do neutrofili, które żyją krótko i konstytutywnie przechodzą apoptozę w hodowli, lub neutrofili aktywowanych cytokinami/czynnikami wzrostu, które mają przedłużoną długość życia, niedawno zidentyfikowaliśmy nową, małą subpopulację neutrofili, która rozwija się spontanicznie w przedłużonych standardowych warunkach hodowli ze świeżo wyizolowanych neutrofili ludzkiej krwi bez zewnętrznego dodawania cytokin lub czynników wzrostu.14 Te komórki pochodzące z neutrofili, które nie zostały wcześniej opisane w literaturze, zostały nazwane gigantycznymi fagocytami (Gφ). Gφ mają wydłużoną żywotność w kulturze, są w pełni rozwinięte w ciągu 5-7 dni i charakteryzują się unikalnymi cechami morfologicznymi, ekspresją i funkcjami fenotypowymi. Są one znacznie powiększone w wyniku autofagocytozy martwych pozostałości neutrofili, wakuolizowanych i zawierających fagolizosomy. Gφ wyraża specyficzny marker granul obojętnochłonnych - klaster różnicowania (CD)66b, markery ziarnistości azurofilowej - CD63 i mieloperoksydazę (MPO) oraz dodatkowe markery neutrofili, takie jak CD11b, NE, CD15, podjednostki oksydazy NADPH gp91-phox i p22-phox oraz marker autofagii -LC3BII. 14,15 Funkcjonalnie, aktywnie pobierają kulki lateksowe i cząsteczki zymosanu oraz generują ROS w odpowiedzi na stymulację zymosanu i forbolu 12-mirystynianu 13-octanu (PMA). Co ciekawe, w przeciwieństwie do świeżych neutrofili, Gφ również intensywnie eksprymują receptory zmiataczy CD68 i CD36, pobierają utlenioną lipoproteinę o niskiej gęstości (oxLDL) i generują ROS w odpowiedzi na stymulację oxLDL. Dodatkowo Gφ są pozbawione markerów linii monocytowej CD14, CD16 i CD163 lub markerów dendrytycznych CD1c i CD141. Co więcej, fagocytoza i autofagia oraz prawdopodobna funkcjonalna oksydaza NADPH są warunkami wstępnymi ich rozwoju. To dlatego, że inhibitor fagocytozy cytochalina B, inhibitory autofagii 3-metyladenina (3-MA) i bafilomycyna (BafA1) oraz inhibitor oksydazy NADPH - jodon difenylenowy (DPI) - zapobiegały ich rozwojowi. Ponadto komutacje monocytów i neutrofili, a także narażenie na okresowe niedotlenienie utrudniało ich rozwój, podczas gdy adaptacja neutrofili do długotrwałego niedotlenienia była oczywista. 14,15 Ich sugerowany rozwój w kulturze zilustrowano na rysunku 1. Protokół w niniejszej pracy opisuje krok po kroku przygotowanie Gφ ze świeżo wyizolowanych krążących neutrofili ludzkiej krwi, ich rozwój, identyfikację i niektóre podstawowe cechy. Protokół ten może być wykorzystany do dalszego badania i ujawnienia szerokiego spektrum i roli tych nowo opisanych i intrygujących Gφ pochodzących z neutrofili w celu scharakteryzowania ich znaczenia i potencjalnych funkcji.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie rozwoju komórek olbrzymich w 7-dniowych kulturach neutrofili. Sugeruje się, że w miejscach zapalnych (1) neutrofile ulegają apoptotycznej śmierci komórki i (2) uwalniają otoczone błoną fragmenty zawierające szczątki jądrowe, granulki (zielone i czerwone kropki) i inne subkomórkowe składniki, które uruchamiają mechanizmy autofagii. (3) Gigantyczne fagocyty (Gφ) rozwijają się w długotrwałych kulturach neutrofili pozbawionych cytokin lub czynników wzrostu poprzez internalizację ciał apoptotycznych i szczątków neutrofili, przy jednoczesnym zachowaniu funkcjonalnej oksydazy NADPH. Charakteryzują się różnymi neutrofilnymi markerami CD66b+/CD63+/MPO+/ CD15+/CD11b+/NE, dużymi fagosomami otaczającymi granulki i szczątki komórkowe oraz receptorami zmiatającymi CD36 i CD68. Gφ są w większości komórkami jednojądrowymi, zdolnymi do internalizacji również różnych cząstek i utlenionego LDL oraz generowania ROS. Błony wakuoli wypełniających Gφ zawierają LC3B (oznaczony na ciemnoniebiesko), marker błony autofagosomalnej, co sugeruje ścisły związek między autofagią a tworzeniem gigantycznych fagocytów. Gφ nie rozwijają się w pożywce zawierającej GM-CSF/IL-4. Ponadto inhibitory, takie jak inhibitor oksydazy NADPH – jodon difenylenowy (DPI), inhibitory autofagii 3-metyladenina (3-MA) i bafilomycyna (BafA1) oraz inhibitor fagocytozy cytochalazyna B (Cyto. B) znieść ich formację. (4) Potencjalne funkcje Gφ in vivo mogą obejmować właściwości przeciw- lub prozapalne oraz udział w procesach miażdżycowych (liczba ta jest oparta na naszych ustaleniach14,15 i został zmodyfikowany na podstawie dołączonego artykułu redakcyjnego autorstwa Berton20). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został zatwierdzony przez lokalny Komitet Praw Człowieka zgodnie z deklaracją helsińską, a wszyscy uczestnicy podpisali formularz świadomej zgody.

1. Izolacja neutrofili i rozwój gφ w kulturze

UWAGA: Wszystkie kroki należy wykonywać przy użyciu sterylnych roztworów wolnych od lipopolisacharydów tkankowych (LPS) w kapturze z przepływem laminarnym bezpieczeństwa biologicznego. Nie dodawaj antybiotyków, cytokin ani czynników wzrostu do pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640.

  1. Pobrać co najmniej 40 ml krwi żylnej od młodych, zdrowych osób dorosłych za pomocą sterylnego zestawu żył skóry głowy. Pobrać krew do probówek próżniowych zawierających sólK3 kwasu etylenodiaminotetraoctowego (K3EDTA) i delikatnie wymieszać. Utrzymuj krew w temperaturze pokojowej.
  2. Wyizolować neutrofile za pomocą dwustopniowego nieciągłego gradientu gęstości przy użyciu polisacharozy w stężeniach 1,119 i 1,077 g/ml. Przed użyciem doprowadzić roztwory do temperatury pokojowej.
    UWAGA: Podczas wirowania czerwone krwinki (RBC) są szybko agregowane przez polisarozę i osad. Komórki jednojądrzaste (monocyty / limfocyty) znajdują się między granicą górnego osocza / polisacharozy -1,077, podczas gdy neutrofile znajdują się tuż nad erytrocytami, na granicy faz polisacharozy -1,077/1,119 (patrz ryc. 2). Metoda ta pozwala na jednoczesne oddzielenie komórek jednojądrzastych i neutrofili od tego samego osobnika.

figure-protocol-1
Rycina 2: Izolacja neutrofili z ludzkiej krwi pełnej. Polisacharoza w stężeniu 1,077 g / ml jest ostrożnie nakładana na polisacharozę - 1,119 g / ml, aby utworzyć nieciągły gradient. Rozcieńczoną krew pełną nakłada się następnie warstwami na polisacharozę-1,077. Probówki są natychmiast poddawane wirowaniu przy 700 x g przez 30 minut, w temperaturze pokojowej bez przerwy. Odnotowuje się trzy wyraźne pasma. (A) Komórki jednojądrzaste, (B) komórki wielojądrzaste (PMN) i (C) czerwone krwinki (RBC) na dnie probówki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Dodać 12 ml polisacharozy-1119 na dno sterylnej stożkowej probówki wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml.
  2. Ostrożnie nałożyć 12 ml polisacharozy-1077 na polisacharozę -1119.
  3. Rozcieńczyć 10-12 ml krwi pełnej do końcowej objętości 24 ml krwi solą fizjologiczną buforowaną bezjonowo-fosforanową (PBS) zawierającą 2 % inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (HI-FCS). Ostrożnie nałożyć 24 ml rozcieńczonej krwi pełnej na górny gradient probówki.
  4. Wirować przy 700 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (20 - 24 °C) bez hamulca.
    UWAGA: Wirowanie w niższych temperaturach może spowodować zlepianie się komórek i słabą regenerację.
  5. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki, nie naruszając gradientu. Należy obserwować dwie nieprzezroczyste warstwy (A: komórki jednojądrzaste i B: PMN, przedstawione na rysunku 2).
  6. Odessać i wyrzucić płyn do 0,5 cm powyżej warstwy A. Przenieść (lub wyrzucić) komórki z tej warstwy do probówki oznaczonej jako "Jednojądrowa".
  7. Odessać i wyrzucić pozostały płyn do 0,5 cm powyżej warstwy B. Przenieś komórki z tej warstwy do probówki oznaczonej "PMN".
  8. Zebrać PMN z każdych dwóch probówek gradientowych i przemyć PBS zawierającym 2% HI-FCS do końcowej objętości 30 ml. Wirować przez 12 minut przy 200 x g, usunąć supernatant i wyrzucić.
  9. Aby pozbyć się zanieczyszczających czerwonych krwinek (RBC), dodaj 3 ml hipotonicznego 0,2% lodowacego sterylnego NaCl podczas ponownego zawieszania osadu, delikatnie wciągając i wyjmując sterylną końcówką pipety o pojemności 1 ml. Trzymaj na lodzie przez 30 sekund.
  10. Po 30 s przywróć izotoniczność, dodając do probówki 3 ml sterylnego 1,6% lodowatego NaCl.
  11. Do 6 ml izotonicznego roztworu soli fizjologicznej dodać 6 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 2% HI-FCS i odwirowywać przy 250 x g przez 12 minut. Odrzucić supernatant. Granulat PMN powinien być czysty z zanieczyszczeń RBC.
    UWAGA: W przypadku zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi granulka PMN staje się czerwonawa
    12. .
  12. Jeśli pozostaną jakieś zanieczyszczające erytroiny, powtórz kroki 9 i 10 jeszcze raz.
  13. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml RPMI-1640 uzupełnionym 10% HI-FCS i policzyć komórki, aby określić ich stężenie i żywotność przez wykluczenie błękitu trypanowego.
  14. Dostosuj stężenie do 1,25 - 1,5 x 106 PMN/ml (w zależności od potrzeb eksperymentalnych) i umieść 1,0 ml/dołek na 24-dołkowej płytce.
    UWAGA: Czystość neutrofili w populacji granulocytów zawsze przekraczała 95%, co oceniano za pomocą barwienia Maya Grunewalda-Giemsy i mikroskopii świetlnej.
  15. Po wysianiu umieścić komórki w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  16. Wymieniaj pożywkę co 3 dni, delikatnie zasysając połowę pożywki i dodając taką samą objętość świeżej pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 10% HI-FCS. Używaj roztworów i związków wolnych od LPS oraz niskich poziomów LPS w HI-FCS (0,05 ng/ml lub mniej).
    UWAGA: Konieczna jest delikatna zmiana podłoża, ponieważ Gφ, które rozwijają się w kulturze, nie przylegają mocno do naczynia hodowlanego, a energiczne mycie może również wypłukać rozwijające się komórki. Pojawienie się Gφ jest zauważalne po 3 - 4 dniach od hodowli PMN, w zależności od dawcy krwi. Większość opisanych tutaj analiz i testów wykonuje się w okresie od 6 do 7 dni w hodowli, gdy Gφ są bardzo duże. Należy zauważyć, że dodanie 1 - 10 ng/ml LPS do pożywki RPMI-1640 nie wpłynęło na rozwój Gφ w hodowli. 14

2. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa

  1. Przygotuj cytospins16 ze świeżo wyizolowanych neutrofili i z 7-dniowych rozwiniętych kultur Gφ (przygotowanych w sekcji 1).
    UWAGA: Aby zwiększyć stężenie Gφ w naczyniu do różnych analiz, delikatnie usuń połowę pożywki. Upewnij się, że Gφ nie są wykrywane w usuniętym podłożu, badając podłoże pod mikroskopem świetlnym. Następnie intensywnie odpipetować pozostałą pożywkę, aby usunąć lekko przylegające Gφ. Odwirować pożywkę przez 10 minut przy 200 x g i ponownie zawiesić osad w pożywce o objętości 100 - 120 μl.
    1. Na każde szkiełko należy użyć 100 - 120 μl pożywki zawierającej komórki. Przygotuj zduplikowane lub potrójne preparaty z każdego zabiegu. Wirować przez 7 minut przy 84 x g.
  2. Wysuszyć odwirowane komórki i utrwalić je 4 % paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 10 minut pod kapturem chemicznym. Umyć 3x PBS (~100 μl przez kilka sekund na pranie). W celu barwienia wewnątrzkomórkowego należy przepuszczać komórki 0,5% Triton X-100 w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut i przemywać 5x PBS.
    UWAGA: Na wszystkich etapach należy stosować odpowiednią objętość buforu/roztworu, aby pokryć obwód komórek na szkiełku. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego do określenia obwodu komórek.
    Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
  3. Blokować komórki 10% normalną surowicą kozią w pożywce RPMI-1640 i inkubować przez noc w temperaturze 4 ºC lub w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Przemyć PBS.
  4. Inkubować z pojedynczym przeciwciałem (Ab) lub kombinacją przeciwciał pierwszorzędowych myszy i królika (Abs) w rozcieńczeniu 1:100 (~100 μl). Inkubować przez noc (18 - 20 godzin) w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Tutaj mysie monoklonalne Abs obejmowały: łańcuch lekki anty-CD14, anty-CD63, anty-CD66b, anty-CD1c, anty-CD15 i anty-cytochrom b-245 (identyfikacja p22-phox). Poliklonalne Abs królika obejmowały: anty-CD68, anty-CD36, anty-LC3B, anty-Myeloperoksydazę, elastazę anty-neutrofilową (NE) i anty-Nox2 / gp91-phox Abs. Kontrole izotypu obejmowały oczyszczone mysie IgG1 i IgG2 oraz królicze IgG. Przygotuj Abs zgodnie z instrukcjami producenta i użyj odpowiedniej objętości (około 100 μl), aby pokryć obwód komórek.
  5. Umyć komórki i inkubować z 1/400 przeciwciałami drugorzędowymi Cy2-CF (488A) sprzężonymi z kozimi przeciwciałami anty-króliczymi IgG (zielony) i/lub Cy5 (CF 647) sprzężonymi koziami anty-mysimi IgG (czerwonymi) w temperaturze pokojowej przez 40 min.
    UWAGA: Rozcieńczyć i przygotować Abs zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Po umyciu zamontuj szkiełka z jedną kroplą podłoża montażowego, zawierającego 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) do barwienia jądrowego, a następnie natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe.
  7. Przeanalizuj preparaty za pomocą konfokalnego systemu skanowania laserowego przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego i obiektywu z olejkiem immersyjnym Plan Apo 40X. Analizę należy przeprowadzić w ciągu 30 minut do 2 godzin po przygotowaniu szkiełek lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
    1. Oblicz powierzchnię komórki i intensywność fluorescencji za pomocą oprogramowania do obrazowania (np. Obraz J). W przypadku kolokalizacji należy określić ilościowo za pomocą oprogramowania przy użyciu współczynnika nakładania się Manders (MOC)17.
      UWAGA: Tylko komórki z MOC >0,6 można uznać za komórki o znaczącej kolokalizacji.

3. Transmigracja PMN przez komórki śródbłonka: wpływ IL-8 na tworzenie gigantycznych fagocytów (Gφ)

UWAGA: Do testu transmigracji komórek należy użyć 24-dołkowych przepuszczalnych wkładek do hodowli komórek.

  1. Pokryj górną komorę wkładki 150 μl fibronektyny o stężeniu 50 μg/ml i przechowuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  2. Dodać do górnej komory 5 x 104 komórki śródbłonka EA.hy926 / studzienkę, zawieszone w 150 μl zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle's Medium (kompletna pożywka wzrostowa).
    UWAGA: Przed użyciem upewnij się, że monowarstwa śródbłonka zlewa się.
  3. Do dolnej komory dodać 700 μl kompletnej pożywki.
  4. Umieścić przepuszczalne wkładki do hodowli komórkowych w tacach zbiorczych i hodować komórki śródbłonka EA.hy926 przez 2 dni w temperaturze 37 °C w 5% CO2,
    UWAGA: Równolegle, w drugim dniu należy przygotować świeży PMN (zgodnie z opisem w punkcie 1).
  5. Po 2 dniach wymień pożywkę w dolnej i górnej komorze wkładek.
    1. Do dolnej komory dodać pożywkę RPMI-1640 uzupełnioną 10% IH-FCS i interleukiną (IL)-8 w końcowym stężeniu 50 nM/ml. Nie dodawaj IL-8 do sterowania dolnymi komorami.
    2. Do każdej górnej komory dodać 106 świeżych PMN w 100 μl pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 10% IH-FCS.
  6. Inkubować tace na aparaty udojowe w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 90 minut.
  7. Po 90 minutach inkubacji usuń komórki z górnej i dolnej komory osobno i policz każdą subpopulację. Wyraź komórki w każdej komorze jako procent całkowitej liczby dodanych komórek.
    UWAGA: Ostrożnie wyjmij komórki z górnej komory, delikatnie pipetując, aby uniknąć usunięcia komórek śródbłonka i przeniesienia do sterylnej probówki. Usunąć komórki z dolnej komory, pipetując i przemywając dolną komorę 500 μl i przenieść do drugiej sterylnej probówki.
  8. Pula 10:6 komórek z kilku studzienek transmigrujących (dolna komora) i niemigrujących (górna komora) frakcji PMN i hodowla przez 7 dni bez czynników wzrostu, jak określono w krokach 14 - 16 (sekcja 1).
  9. Zakręć komórki na slides16 i przeanalizuj rozwinięte komórki w każdym stanie hodowli za pomocą mikroskopii konfokalnej, jak opisano w sekcji 2.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autofagocytoza neutrofili i rozwój w kulturze

Autofagocytoza neutrofili i ich rozwój w kulturze do Gφ w ciągu 7 dni jest pokazana na rysunkach 3 i 4. W dniach 4 - 7 ich rozmiar był znacznie powiększony, 15, a autofagozytoza była widoczna już po 90 minutach od kohodowli neutrofili z fluorescencyjnymi barwnikami błonowymi (PKH-26, czerwony; PKH-67, kolor zielony). 14 Jako kontrolę dla tej subpopulacji neutrofili, niektóre kultury neutrofili były również traktowane GM-CSF/IL-4. Komórki traktowane cytokinami zwiększyły swój rozmiar w ciągu 7 - 14 dni w hodowli, jak opisano wcześniej. 18,19 Były jednak mniejsze niż Gφ i miały projekcje cytoplazmatyczne przypominające komórki podobne do DC (Rysunek 5), jak wcześniej opisali Oehler i wsp.19 Ponadto, komórki poddane działaniu GM-CSF/IL-4 były ujemne lub miały niską ekspresję CD66b,15 wyraźnie wykazując również różnice morfologiczne i potencjalnie funkcjonalne.

figure-results-1
Rycina 3: Autofagocytoza w rozwijających się gigantycznych fagocytach (Gφ) w hodowli. Świeżo wyizolowane oczyszczone neutrofile znakowano barwnikami fluorescencyjnymi błony PKH-67 (zielony) lub PKH-26 (czerwony) w czasie zero, a następnie hodowano je wspólnie i obserwowano przez siedem dni. Komórki wirowano na szkiełkach podstawowych, jądra barwiono DAPI, a próbki analizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Autofagocytoza jest zauważalna już po 90 minutach kohodowli. Przenikanie się czerwieni i zieleni z żółcią i pomarańczą jest wyraźnie widoczne w rozwijającym się Gφ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 4: Rozwój gigantycznych fagocytów (gφ) w hodowli. Świeżo wyizolowane oczyszczone neutrofile obserwowano w hodowli do 7 dni. Komórki obracano na szkiełkach podstawowych we wskazanych odstępach czasu, barwiono preparatem May Grunewald-Giemsa i analizowano za pomocą mikroskopii w jasnym polu. Dla porównania przedstawiono osobę z niewielką liczbą eozynofili. Należy zauważyć, że wielkość eozynofili pozostaje niezmieniona w kulturze. Powiększenie 100X olejowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 5: Porównanie rozwoju gigantycznych fagocytów (Gφ) i neutrofili traktowanych GM-CSF/IL w hodowli. (a) Może Grunwald-Giemsa barwione neutrofile hodowane bez (Gφ) i z GM-CSF/IL-4 przez 7 dni. Próbki analizowano za pomocą mikroskopii w jasnym polu. Powiększenie, X40. Komórki rozwinięte w hodowlach z pożywką uzupełnioną GM-CSF/IL-4 wykazują rozległe projekcje cytoplazmatyczne, ale są mniejsze niż Gφ. (B) Świeżo wyizolowane neutrofile znakowano barwnikiem PKH-26 (czerwonym) i hodowano w pożywce wolnej od cytokin przez 7 dni lub znakowano barwnikiem PKH-67 (zielonym) i hodowano w pożywce uzupełnionej GM-CSF/IL-4 przez 7 dni. Następnie rozwinięte komórki wymieszano w stosunku 1:1 i hodowano wspólnie przez 2 godziny. Komórki utrwalono i przeanalizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ten rysunek został zmodyfikowany w stosunku do odniesienia. 15 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby dokładniej zbadać przebieg rozwoju Gφ, ich zmiany morfologiczne były również śledzone przez mikroskopię poklatkową. Wideo-1 (dzień 3 do dnia 4) i wideo-2 (dzień 4 do dnia 5) pokazują ich rozwój w oczyszczonych kulturach neutrofili. Te Gφ nie przylegają lub lekko przylegają o ograniczonej zdolności ruchu i aktywnie połykają otaczające resztki neutrofili i szczątki. W filmie 3 porównano ruch Mφ i Gφ pochodzących z monocytów w mieszanej hodowli monocytów / neutrofili. Mφ aktywnie pełza (lewa, nieoznaczona komórka). Gφ (po prawej) to jasna komórka oznaczona PKH-26.

figure-results-4
Wideo-1: Demonstruje rozwój gigantycznych fagocytów w oczyszczonych kulturach PMN w dniach 3 - 4 za pomocą mikroskopii poklatkowej. Neutrofile obserwowano w hodowli od 3 do 4 dnia za pomocą mikroskopii poklatkowej. System mikroskopii poklatkowej składa się z odwróconego zmotoryzowanego mikroskopu fluorescencyjnego oraz czarno-białej kamery CCD o wysokiej rozdzielczości z inkubatorem na scenie. Akwizycja obrazu poklatkowego była wykonywana co 10 minut. Pierwotnie opublikowane w reference14 Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film.

figure-results-5
Wideo-2: Demonstruje rozwój gigantycznych fagocytów w oczyszczonej kulturze PMN w dniach 4 - 5 za pomocą mikroskopii poklatkowej. Neutrofile obserwowano w hodowli od 4 do 5 dnia za pomocą mikroskopii poklatkowej. System mikroskopii poklatkowej składa się z odwróconego zmotoryzowanego mikroskopu fluorescencyjnego oraz czarno-białej kamery CCD o wysokiej rozdzielczości z inkubatorem na scenie. Przechwytywanie zdjęć poklatkowych było wykonywane co 10 minut. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film.

figure-results-6
Wideo-3: Gigantyczny fagocyt i makrofag rozwinięte w kokulturze. Wspólną hodowlę monocytów i neutrofili obserwowano od 4 do 5 dnia za pomocą mikroskopii poklatkowej. Makrofagi pochodzące z monocytów (po lewej); jasny (PKH-26 barwiony komórka) gigantyczny fagocyt pochodzący z neutrofili (po prawej). System mikroskopii poklatkowej do nagrywania wideo składa się z odwróconego zmotoryzowanego mikroskopu fluorescencyjnego oraz czarno-białej kamery CCD o wysokiej rozdzielczości z inkubatorem na scenie. Akwizycja obrazu poklatkowego była wykonywana co 10 minut. Pierwotnie opublikowane w reference14 Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film.

Ekspresja markerów w gigantycznych fagocytach

Neutrofilowe pochodzenie Gφ zostało zweryfikowane przez pozytywną ekspresję następujących markerów neutrofili: CD66b/CD63/MPO/NE/CD15 (Rysunek 6). Gφ wykazywał również ekspresję oksydazy NADPH, receptorów zmiataczy oxLDL – CD68 i CD36 oraz zawierał wakuole i agregaty pokryte LC3B (zidentyfikowane przez Western blotting jako LC3BII15), co wskazuje na obecność markera autofagii. Były one jednak ujemne dla markerów linii monocytowej (CD14, CD16 i CD163) i komórek dendrytycznych (CD1c i CD141), co sugeruje, że Gφ nie powstał w wyniku zanieczyszczenia monocytów.

figure-results-7
Rycina 6: Ekspresja różnych markerów neutrofili, monocytów i komórek dendrytycznych w gigantycznych fagocytach (Gφ) po 7 dniach w hodowli. Dodatnia ekspresja markera ziarnistości specyficznego dla neutrofili CD66b, markerów granulek azurofilowych CD63 i MPO, elastazy neutrofilowej i CD15. Ujemna ekspresja dendrytycznych markerów CD1c i CD141 oraz monocytowych markerów linii CD14, CD16 i CD163. Dodatkowo Gφ wykazywał ekspresję markera autofagii LC3B, receptorów zmiataczy CD68 i CD36 oraz podjednostek oksydazy NADPH gp91-phox / p22-phox. Jądra barwiono DAPI, a próbki analizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie odniesień. 14,15 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Funkcje Gφ - aktywacji oksydazy NADPH, produkcji ROS i fagocytozy:

Fagocytoza koralików lateksowych i opsonizowanego zymozanu była widoczna w Gφ. Gφ generował również podstawowy ROS (ryc. 7A) i reagował na stymulację zymozanem i PMA przez wybuch oksydacyjny (ryc. 7B-D). Jednak w przeciwieństwie do monocytów lub neutrofili, Gφ generowały ROS również w odpowiedzi na stymulację oxLDL i były barwione przez Oil Red O (Figura 7B, F). Warto zauważyć, że traktowanie świeżych neutrofili inhibitorem oksydazy NADPH – DPI, nie tylko hamowało produkcję ROS, ale także zapobiegało tworzeniu się Gφ w hodowli, co sugeruje, że sygnalizacja ROS jest niezbędna do tworzenia Gφ. 14,15

figure-results-8
Rycina 7: Wybuch oksydacyjny, fagocytoza i wychwyt oxLDL przez gigantyczne fagocyty (Gφ). (A) Podstawowa produkcja ROS jest widoczna w lizosomach Gφ. (B) Produkcja ROS w odpowiedzi na utleniony LDL (oxLDL), PMA i zymosan (wyraźnie zaznaczone są cząsteczki zymozanu). (C) Test tetrazolowy nitroniebieski (NBT) w Gφ wykazujący aktywność impulsów oddechowych bez PMA i z PMA (szkiełka są niebarwione, ale wkładki są barwione farbą May Grunwald-Giemsa). (D) Test NBT i May Grunewald-Giemsa wybarwiły Gφ PMA i PMA/DPI, które hamowały oksydazę NADPH i ROS. (E) Fagocytoza zymozanu lateksowego i IgG-opsonizowanego w komórkach barwionych PKH-26 (na czerwono). (F) Barwienie czerwienią olejową O w niepoddanym obróbce i poddanym działaniu oxLDL Gφ. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie odniesień. 14,15 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Transmigracja PMN przez komórki śródbłonka

W celu zidentyfikowania potencjalnych subpopulacji neutrofili, które mogą przekształcić się w Gφ, określono migrację neutrofili przez monowarstwy komórek śródbłonka (Rysunek 8A). Po 90 minutach 62,3 ± 12,2% neutrofili przeniosło się przez komórki śródbłonka w kierunku IL-8 w dolnym kompartmencie. Warto zauważyć, że Gφ dodatni dla CD66b / CD15 / LC3B rozwinął się tylko z transmigrującej populacji neutrofili, podczas gdy komórki, które rozwinęły się z niemigrującej frakcji neutrofili, były mniejsze i ujemne dla markerów neutrofilowych CD66b / CD15 (Figura 8B, 8C).

figure-results-9
Rycina 8: Wpływ zależnej od IL-8 transmigracji PMN przez komórki śródbłonka na tworzenie gigantycznych fagocytów (Gφ). (A) Schemat ilustrujący test migracji neutrofili przez monowarstwy komórek śródbłonka (EC) w kierunku IL-8. Test ten można uznać za model rekrutacji neutrofili do ostrych miejsc zapalnych. (B-C) W teście migracji komórek (określonym w protokole 3), transmigrujące (B) i niemigrujące (C) frakcje neutrofili hodowano przez siedem dni bez czynników wzrostu (jak w protokole 1). Następnie komórki zostały odwirowane na szkiełkach podstawowych i przeanalizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Stałe ogniwa zostały wybarwione dla CD66b (czerwony), LC3B (zielony) i CD15 (czerwony). Jądra barwiono DAPI (na niebiesko). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagocyty olbrzymie (Gφ) to nowo zdefiniowana subpopulacja komórek pochodzących z neutrofili wykazujących ekspresję podstawowych i specyficznych markerów neutrofilowych, takich jak CD66b/CD15/CD63/MPO/NE. Ten typ fagocytów pochodzących z neutrofili nie był wcześniej opisywany w literaturze. W przeciwieństwie do neutrofili, które żyją krótko i ulegają apoptozie, Gφ są aneksynami V-ujemnymi i wykazują wydłużoną żywotność. Jednak, podobnie jak neutrofile, Gφ również internalizują cząstki i wytwarzają ROS zależne od oksydazy NADPH w odpowiedzi na te cząstki i PMA. Jednak ich zdolności do internalizacji OxLDL, a w konsekwencji do produkcji ROS, są unikalnymi cechami Gφ. 14

Wykazano, że na ich rozwój w kulturze wpływa szereg czynników. Niezbędny jest brak zewnętrznych cytokin lub czynników wzrostu w pożywce wzrostowej (w szczególności GM-CSF/IL-4). Jednak migracja neutrofili w kierunku IL-8 okazała się czynnikiem odróżniającym te, które rozwinęły się w Gφ, i te, które tego nie zrobiły. Wykazano również, że internalizacja szczątków powstających z apoptotycznych neutrofili, ekspresja białek autofagii (LC3B) i funkcjonalna oksydaza NADPH są niezbędne do ich rozwoju, ponieważ ich hamowanie zapobiegało tworzeniu się Gφ (ryc. 1). Najwyraźniej rozwój tych gigantycznych komórek powstających z neutrofili różni się od tego, który charakteryzuje tworzenie się gigantycznych komórek w linii monocytów/makrofagów. Te ostatnie tworzą wielojądrzaste olbrzymie komórki związane z różnymi przewlekłymi chorobami zapalnymi,20,21 podczas gdy opisane tutaj neutrofilowe Gφ rozwijają się poprzez autofagocytozę, pochłaniając resztki komórek i pozostają w większości jednojądrowe przez cały okres ich rozwoju,14 (rzadko jednak, czasami można zaobserwować drugie jądro). Co więcej, szereg osób kontrolnych ustaliło ich neutrofilowe pochodzenie: (1) ekspresję specyficznych markerów neutropilicznych i brak markerów linii dendrytycznej i monocytowej, (2) ich utrudniony rozwój w kokulturach monocytów/PMN, (3) ich różne wzorce ruchu w hodowli od makrofagów (o czym świadczy obrazowanie żywych komórek i mikroskopia poklatkowa),14 (4) ich lekkie przyleganie do plastikowych naczyń oraz (5) ich rozwój z czystego CD15+/CD14- PMN uzyskany metodą cytometrii przepływowej.

Niektóre z funkcji zidentyfikowanych in vitro mogą dać nam wskazówki co do ich potencjalnych funkcji in vivo. Na przykład zdolność Gφ do zużywania dużych ilości granulek i szczątków neutrofili, obecność dużych wakuoli i ekspresja LC3B - białka autofagii, które przyczynia się do zmniejszenia stanu zapalnego poprzez interakcje regulacyjne z wrodzonymi szlakami sygnalizacji immunologicznej,22 - z których wszystkie wspierają zdolności wymiatające. W związku z tym odkrycia te wskazują również, że Gφ może funkcjonować w miejscach zapalnych, w których system Mφ/DC jest niewystarczający lub przeciążony, a tym samym przyczyniać się do ustąpienia stanu zapalnego. Za tym stwierdzeniem może przemawiać fakt, że w mieszanych kulturach monocytów/neutrofili rozwój Gφ jest utrudniony. 14 Ponadto, biorąc pod uwagę, że Gφ wyrażają receptory zmiatające oxLDL (CD36, CD68), internalizują oxLDL i wytwarzają ROS w odpowiedzi na to, może to wskazywać, że są one zaangażowane w procesy miażdżycowe w celu rozwiązania stanu zapalnego. Ponieważ Gφ rozwinął się tylko z neutrofili, które migrowały w kierunku IL-8, a transmigracja neutrofili przez monowarstwy śródbłonka w kierunku IL-8 reprezentuje rekrutację neutrofili do ostrych miejsc zapalnych, odkrycie to może również wspierać funkcje przeciwzapalne. I odwrotnie, działanie Gφ w niektórych stanach zapalnych może umożliwić im rozładowanie składników ziarnistości i ROS, przyczyniając się w ten sposób do uporczywego stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek. 20 Jednak ogólnie rzecz biorąc, ich zdolności autofagiczne wskazują, że Gφ są prawdopodobnie zaangażowane w zmniejszanie reakcji zapalnej, a nie jej utrwalanie.

Co ciekawe, niedawno zidentyfikowaliśmy obecność Gφ w blaszkach miażdżycowych u ludzi. (w przygotowaniu). Jednak wiele pytań pozostaje jeszcze nierozwikłanych. Na przykład, czy Gφ są pro- czy przeciwzapalne? Jakie czynniki decydują o ich powstawaniu i funkcjonowaniu in vitro lub in vivo? Która konkretna subpopulacja neutrofili jest ich komórką prekursorową, która ułatwia ich rozwój do Gφ? Czy są one związane z pewnymi patologiami, a które z nimi? Zbiorowo, stawiając interesujące pytania dotyczące ich pochodzenia i potencjalnych funkcji.

Należy jednak pamiętać o krytycznych krokach i pułapkach w protokole. Kluczowym krokiem w rozwoju Gφ jest hodowla czystych neutrofili w pożywce pozbawionej cytokin, czynników wzrostu lub antybiotyków. Kolejnym krytycznym krokiem jest wykluczenie, że Gφ rozwijają się z zanieczyszczających monocytów i ustalenie neutrofilowego pochodzenia Gφ. Tak więc, po separacji krwi za pomocą nieciągłego gradientu, neutrofile poddano dodatkowemu etapowi oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem bramkowania granulocytów i markerów CD15+/CD14- . Opracowane Gφ uzyskane z neutrofili, które zostały dodatkowo oczyszczone przez separację metodą cytometrii przepływowej, nie różniły się od tych, które nie zostały poddane temu etapowi oczyszczania. Dlatego większość eksperymentów przeprowadzono bez etapu oczyszczania metodą cytometrii przepływowej ze względu na dodatkową utratę komórek. Warto zauważyć, że w niektórych rzadkich przypadkach w kulturze odnotowano niektóre eozynofile. Ich wielkość pozostała niezmieniona przez cały okres kultury. Powinniśmy również zauważyć, że chociaż istnieje wiele metod separacji neutrofili od ludzkiej krwi, opisana tutaj metoda jest jedyną zastosowaną przez nas metodą i dlatego nie możemy porównywać rozwoju Gφ z innymi dostępnymi metodami separacji neutrofili.

Poważna pułapka w badaniu Gφ wynika z niemożności uzyskania wystarczającej liczby czystej populacji Gφ odpowiedniej do różnych testów biochemicznych. Jest to w zasadzie niemożliwe w warunkach, w jakich przeprowadzano nasze eksperymenty. Po pierwsze, wydajność Gφ jest niska. Od 1,0 x 106 PMN wysianych około 100 - 200 Gφ rozwija się po siedmiu dniach w hodowli, w zależności od dawcy krwi. Po drugie, w tej chwili w zasadzie trudno jest oddzielić rozwinięte w kulturze Gφ od pozostałych szczątków neutrofili w naczyniu. Ograniczenia te praktycznie uniemożliwiły analizę komórek metodami biochemicznymi lub biologii molekularnej. Dlatego protokół ten koncentruje się na opisie identyfikacji i funkcji Gφ za pomocą mikroskopii świetlnej i konfokalnej. Ich morfologiczna transformacja z neutrofili do Gφ w hodowli była również śledzona za pomocą obrazowania żywych komórek i mikroskopii poklatkowej. 14 Wydaje się, że do zastosowania metod biologii biochemicznej lub biologii molekularnej i przezwyciężenia niskiej wydajności uzyskanej oraz oddzielenia żywotnych Gφ od szczątków neutrofili w naczyniu może być potrzebne znacznie większe objętości krwi.

Podsumowując, niedawno po raz pierwszy opisaliśmy rozwój Gφ w kulturze, subpopulacji długowiecznych fagocytów pochodzenia neutrofilowego. Dlatego jest to jedyna obecnie dostępna metoda otrzymywania Gφ w hodowli, chociaż należy przezwyciężyć dwa główne ograniczenia wymienione powyżej (niska wydajność Gφ uzyskanego w kulturze i niemożność oddzielenia rozwiniętego Gφ od szczątków neutrofili w szalce hodowlanej). Mimo to ich przygotowanie i identyfikacja, przedstawione w tym protokole, jest niezbędne dla naukowców zainteresowanych reakcjami zapalnymi oraz biologią i plastycznością neutrofili, w celu dalszego zbadania potencjalnego znaczenia i funkcji Gφ.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują dr Edith Suss-Toby za jej nieocenioną pomoc w badaniach mikroskopii konfokalnej. Badanie to było wspierane przez Ministerstwo Absorpcji Imigracyjnej oraz Komitet ds. Planowania i Budżetowania Rady ds. Szkolnictwa Wyższego w ramach programu KAMEA (LD i AP). Wyrażamy również wdzięczność za wsparcie ze strony pracownika naukowego z Lady Davis Foundation Post-Doctoral Research Fellowship (OR).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sterylny zestaw żył skóry głowy (21GX3/4) Biodiagnostyka Sp. z o.o.# 20080312Igła do żyły
VACUETTE HOLDEX Jednorazowy uchwyt PPGreiner Bio-One# 450263Do zabezpieczania podczas nakłucia żyły 
Probówka VACUETTE K3E K3EDTA (16 x 100/9 mL)Greiner Bio-One# 455036Sterylna probówka do pobierania krwi
Nunclon MultiDish (24 dołki x 1 ml)Thermo Scientific# 142475
Polipropylenowa stożkowa probówka wirówkowa (50 ml)Greiner Bio-One# E14103PJ
Transwell-24 studzienka (test transmigracji)Corning# CA-3415Membrana poliwęglanowa, średnica 6,5 mm, 3 μ m pory) 
RPMI-1640 mediumBioIndustries# 01-100-1ANie dodawaj antybiotyków   
EA.hy926 (CRL2922 ATCC)   BioIndustries# CRL-2922
Dulbecco opracowany przez ATCC s  Zmodyfikowany orzeł" s MediumBioIndustries# 302002kompletne podłoże
wzrostowe Polisaroza - Histopaque1119Sigma-Aldrich# 1119-1Polisaroza klasy kulturowej
tkankowej - Histopaque1077Sigma-Aldrich# 1077-1Klasa kultury tkankowej 
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) - bez jonówBioIndustries# 02-023-1AKlasa biologii komórki i biologii molekularnej
Inaktywowana termicznie Surowica cielęca płodu (HI-FCS)BioIndustries# 04-121-1BKlasa biologii komórki lub klasa hodowli tkankowej, niska klasa LPS
NaClSigma# S3014Klasa biologii molekularnej, odpowiednia do hodowli komórkowych
Paraformaldehyd, 16%Mikroskopia elektronowa Nauki# 15710Klasa bologii komórkowej lub klasa hodowli tkankowej (tylko 16% PFA)
Triton X-100Sigma-Aldrich# 9002-93-1Klasa biologii molekularnej 
Normalna surowica koziaBioIndustries# 04-009-1Biologia komórki i biologia molekularna klasa
Trypan blueBioIndustries# 031021BKlasa hodowli tkankowej 
Może-Grü nwaldSigma-Aldrich# MG500Klasa biologii komórki-(procedura nr GS-10)
Zestaw barwników GiemsaSigma# 48900Klasa biololgii komórek-(procedura nr GS-10)
FibronectinBioIndustries# 03090105
Ludzka interleukina-8 (CXCL8)PeproTech# 200-08-5
Anti-CD14 (klon 5A3B11B5)Santa Cruz Biotechnologies# sc-58951Mysz IgG2b; wyrażony przez  monocyty
Anty-CD63 (klon MX-49.129.5)Santa Cruz Biotechnologies# sc-5275Mysz IgG1; wyrażony przez neutrofile
Anty-CD66b (klon 80H3)AbD Serotec# MCA216Mysz IgG1; wyrażony przez neutrofile
Anty-CD1c (BDCA-1) (klon AD5-8E7)MACS Miltenyi Biotec# 130-090-695Mysz IgG2a; wyrażony przez  komórki dendrytyczne
Anty-CD15 (klon MY-1)Abcam# ab754Mysia IgM; wyrażane przez neutrofile
Łańcuch lekki antycytochromu b-245 (p22-phox) (klon 44.1)BioLegend# 650001IgG2a myszy; rozpoznawanie kompleksu oksydazy neutrofilowej NADPH
Białko anty-CD68Tech# 16192-1-APIgG królika; rozpoznanie receptora wymiatającego oxLDL 
Anty-LC3BSigma# L7543Królik IgG 
Anty-mieloperoksydazaAbcam# ab45977IgG królika
Elastaza antyneutrofilowaCalbiochem# 481001IgG królika 
Anty-NOX2 (gp91-phox)Abcam# ab131083IgG królika
anty-CD36 (SR-B3)Novus Biologicals# NB400-144IgG
królika oczyszczona mysz IgG1, κ Kontrola izotypu (klon MG1-45)BioLegend# 401401Przeciwciało stosowane jako kontrola izotypu
Oczyszczona mysz IgG2a, κ Kontrola izotypu (klon MOPC-173)BioLegend# 400263Przeciwciało stosowane jako kontrola izotypu
Normalna królicza IgGSanta Cruz Biotechnologies# sc-2027Przeciwciało stosowane jako kontrola izotypu
CF488A Kozia anty-królicza IgG (H+L)Biotium # 20012Anti-Rabbit IgG z zielonym barwnikiem fluorescencyjnym CF488A
CF647 Kozia IgG Anty-Królicza (H+L)Biotium # 20043Anti-Rabbit IgG z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym CF647
CF488A Kozia IgG Anty-Mysia IgG (H+L)Biotium # 20010Anti-Mouse IgG z zielonym barwnikiem fluorescencyjnym CF488A
CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Biotium # 20040Anti-Mouse IgG z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym CF647
Fluorescencyjne podłoże montażowe z DAPIVectashield H-1000; Vector Lab Inc.# E19-18do barwienia jądrowego
(LSM 700)     Carl ZeissSer.# 3523000380Cel olejku immersyjnego Plan Apo 40X   
Oprogramowanie Zeiss CLSM (ZEN 2010)Carl Zeiss MicroImaging GmbHwersja 6.0Do analizy kolokalizacyjnej
Oprogramowanie ImageJWayne Rasband, NIH, USAwersja 1.49kDo oznaczania powierzchni komórek i intensywności fluorescencji
Mikroskop świetlny (Axiovert 25)Carl ZeissSer.# 201060153Badanie komórek w hodowli
Wirówka (Megafuge 1.0 R)Heraeus Instruments# D-37520Separacja komórek od krwi; przygotowanie cytospinów
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny (Zeiss Axio Observer Z.1)Carl ZeissSer.# 3834001470Demonstracja rozwoju gigantycznych fagocytów
System inkubacji z kontrolowaną temperaturą (Cube& Box)Life Imaging ServicesSystem kontroli temperatury dla mikroskopów
Wysoki  Cyfrowa kamera CCD o rozdzielczości (AxioCam HRm)Carl ZeissSer.# 117090279Do przechwytywania danych obrazowych o wysokim kontraście z badanych obiektów komórkowych
Długopis bariery hydrofobowej (Elite PAP Pen)Diagnostic Biosystems# K039Do określania obwodu komórek do barwienia immunofluorescencyjnego
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  2. Silva, M. T., Correia-Neves, M. Neutrophils and macrophages: the main partners of phagocyte cell systems. Front. Immunol. 3, 174(2012).
  3. Cowburn, A. S., Condliffe, A. M., Farahi, N., Summers, C., Chilvers, E. R. Advances in neutrophil biology: clinical implications. Chest. 134, 606-612 (2008).
  4. Duffin, R., Leitch, A. E., Fox, S., Haslett, C., Rossi, A. G. Targeting granulocyte apoptosis: mechanisms, models, and therapies. Immunol. Rev. 236, 28-40 (2010).
  5. Silva, M. T. Macrophage phagocytosis of neutrophils at inflammatory/infectious foci: a cooperative mechanism in the control of infection and infectious inflammation. J. Leukoc. Biol. 89, 675-683 (2011).
  6. Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
  7. Cassatella, M. A., Locati, M., Mantovani, A. Never underestimate the power of a neutrophil. Immunity. 31, 698-700 (2009).
  8. Zhang, X., Majlessi, L., Deriaud, E., Leclerc, C., Lo-Man, R. Coactivation of Syk kinase and MyD88 adaptor protein pathways by bacteria promotes regulatory properties of neutrophils. Immunity. 31, 761-771 (2009).
  9. Araki, H., et al. Reprogramming of human postmitotic neutrophils into macrophages by growth factors. Blood. 103, 2973-2980 (2004).
  10. Iking-Konert, C., et al. Up-regulation of the dendritic cell marker CD83 on polymorphonuclear neutrophils (PMN): divergent expression in acute bacterial infections and chronic inflammatory disease. Clin. Exp. Immunol. 130, 501-508 (2002).
  11. Rydell-Tormanen, K., Uller, L., Erjefalt, J. S. Neutrophil cannibalism--a back up when the macrophage clearance system is insufficient. Resp. Res. 7, 143(2006).
  12. Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
  13. Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. J. Leukoc. Biol. 90, 271-284 (2011).
  14. Dyugovskaya, L., Berger, S., Polyakov, A., Lavie, L. The development of giant phagocytes in long-term neutrophil cultures. J. Leukoc. Biol. 96, 511-521 (2014).
  15. Dyugovskaya, L., Berger, S., Polyakov, A., Lavie, P., Lavie, L. Intermittent Hypoxia Affects the Spontaneous Differentiation In Vitro of Human Neutrophils into Long-Lived Giant Phatocytes. Oxid. Med. Cell. Longev. , 9636937(2016).
  16. Mihalache, C. C., et al. Inflammation-associated autophagy-related programmed necrotic death of human neutrophils characterized by organelle fusion events. J. Immunol. 186, 6532-6542 (2011).
  17. Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of Colocalization of Objects in Dual-Color Confocal Images. J. Microsc. 169, 375-382 (1993).
  18. Matsushima, H., et al. Neutrophil differentiation into a unique hybrid population exhibiting dual phenotype and functionality of neutrophils and dendritic cells. Blood. 121, 1677-1689 (2013).
  19. Oehler, L., et al. Neutrophil granulocyte-committed cells can be driven to acquire dendritic cell characteristics. J. Exp. Med. 187, 1019-1028 (1998).
  20. Berton, G. Editorial: Gigantism: a new way to prolong neutrophil life. J. Leukoc. Biol. 96, 505-506 (2014).
  21. Milde, R., et al. Multinucleated Giant Cells Are Specialized for Complement-Mediated Phagocytosis and Large Target Destruction. Cell. Rep. 13, 1937-1948 (2015).
  22. Deretic, V., Saitoh, T., Akira, S. Autophagy in infection, inflammation and immunity. Nat. Rev. Immunol. 13, 722-737 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie neutrofilihodowla kom rkowacytometria przep ywowamikroskopia konfokalnawybucht tlenowydetekcja autofagiiekspresja marker wtest fagocytozyprodukcja ROS

Powiązane artykuły