Usuwanie biofilmu za pomocą aerozoli dwutlenku węgla bez przedmuchiwania azotem

Podsumowanie

Biofilmy na powierzchniach mogą być skutecznie i szybko usuwane za pomocą okresowego strumienia aerozoli dwutlenku węgla bez przedmuchiwania azotem.

Streszczenie

Biofilmy mogą powodować poważne problemy w wielu zastosowaniach. Mogą one nie tylko powodować straty ekonomiczne, ale mogą również stanowić zagrożenie dla zdrowia publicznego. Dlatego bardzo pożądane jest usuwanie biofilmów z powierzchni. W wielu badaniach nad czyszczeniem aerozolowym CO₂ stosowano przedmuchiwanie azotem w celu zwiększenia skuteczności usuwania biofilmu poprzez zmniejszenie kondensacji wilgoci powstającej podczas czyszczenia. Jednak w tym badaniu zastosowano okresowe strumienie aerozoli CO₂ bez przedmuchiwania azotem w celu usunięcia biofilmów Pseudomonas putida z polerowanych powierzchni ze stali nierdzewnej. Aerozole CO₂ są mieszaninami stałego i gazowego CO₂ i są powstające, gdy gaz CO₂ pod wysokim ciśnieniem jest adiabatycznie rozprężany przez dyszę. Te szybkie aerozole nałożono na biofilm, który był hodowany przez 24 godziny. Skuteczność usuwania wahała się od 90,36% do 98,29% i była oceniana poprzez pomiar intensywności fluorescencji biofilmu, ponieważ czas zabiegu zmieniał się od 16 s do 88 s. Przeprowadziliśmy również eksperymenty, aby porównać skuteczność usuwania z przedmuchiwaniem azotem i bez niego; Zmierzona skuteczność usuwania biofilmu nie różniła się istotnie od siebie (test T, p > 0,55). Dlatego technika ta może być stosowana do czyszczenia różnych powierzchni skażonych biologicznie w ciągu jednej minuty.

Wprowadzenie

Biofilmy to złożone struktury społeczności bakteryjnej, w których komórki bakteryjne są osadzone w samodzielnie wytworzonych matrycach zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych, trzymanych razem i chronionych przed środowiskiem zewnętrznym. Biofilmy mogą stanowić zagrożenie dla zdrowia publicznego i powodować straty ekonomiczne, ponieważ mogą tworzyć się na różnych powierzchniach, w tym na materiałach i urządzeniach implantów medycznych, sprzęcie do przetwarzania żywności i wymiennikach ciepła. W rzeczywistości stwierdzono, że biofilmy są związane z 65% wszystkich bakteryjnych chorób zakaźnych u ludzi, zgodnie z Centers for Disease Control and Prevention¹.

Autoklawy i środki dezynfekujące, takie jak chlor, były zazwyczaj używane do inaktywacji biofilmów. Jednak zastosowanie autoklawu jest ograniczone w przypadku powierzchni, które nie są w stanie wytrzymać pary o wysokiej temperaturze ani nie mogą zostać umieszczone w autoklawie. Środki dezynfekujące nie nadają się do powierzchni wrażliwych na obróbkę chemiczną lub podatnych na gromadzenie toksycznych produktów utleniania². Ponadto biofilm powinien być nie tylko inaktywowany, ale także usuwany, aby zapobiec przyczepianiu się nowych komórek do powierzchni, tworząc w ten sposób nowy biofilm³. Jednak trudno jest usunąć biofilmy przy użyciu metod opartych na ścinaniu lepkiej cieczy, ponieważ prędkość przepływu w pobliżu powierzchni jest prawie zerowa, a siła ścinająca zwykle nie jest w stanie pokonać sił adhezyjnych substancji o rozmiarach mikronowych i submikronowych. Ponadto wiadomo, że matryca biofilmu działa jako bariera fizyczna i chemiczna¹.

Wiele fizycznych i mechanicznych technik zostało opracowanych do usuwania biofilmów z powierzchni, w tym wibracje ultradźwiękowe¹, prądy elektryczne⁴, naświetlanie laserowe⁵ i rozpylanie wody pod wysokim ciśnieniem⁶. Każda technika ma swoje wady i zalety. Wibracje ultradźwiękowe i prąd elektryczny mogą być wykorzystywane do kontrolowania tworzenia biofilmu; Wymagają one jednak odpowiednio określonej konfiguracji i powierzchni przewodzących, co wymaga dodatkowego naprężenia ścinającego^{1, 4}. Naświetlanie laserowe może być stosowane na ograniczonym obszarze i na twardych powierzchniach; Jednak niektóre żywe i martwe komórki pozostają na powierzchni⁵. Zraszacze wodne pod wysokim ciśnieniem skutecznie usuwają biofilmy; Jednak ich duży pęd może spowodować uszkodzenie miękkich podłoży⁶.

Usuwanie biofilmu za pomocą aerozoli CO₂ zostało wcześniej zaproponowane. Wykazał obiecujące wyniki, z wysoką wydajnością usuwania w krótkim czasie^7-11. Aerozole CO₂ są wytwarzane w wyniku adiabatycznego rozprężania gazu CO₂ pod wysokim ciśnieniem przez dyszę i są nakładane na powierzchnie zanieczyszczone biofilmem. Ta technika czyszczenia wykorzystuje przenoszenie pędu stałych cząstek CO₂ i działanie rozpuszczalnikowe stopionych cieczy CO_{2 ,} a następnie aerodynamiczną siłę ścinającą gazu CO₂ ¹². W porównaniu z wysokociśnieniowymi strumieniami gazu_N2, strumienie aerozoli CO₂ przy tym samym ciśnieniu stagnacji są znacznie skuteczniejsze w usuwaniu biofilmów E. coli ⁷. Co więcej, chociaż pęd stałego CO₂ , który jest dostarczany bakteriom, jest znacznie wysoki, pęd całkowitego strumienia aerozolu przyłożonego do powierzchni ciała stałego jest znacznie niższy niż pęd strumieni wody. Dzięki temu możliwe jest czyszczenie bez uszkodzeń przy użyciu tej techniki aerozolowej CO₂ .

W tym protokole, okresowe strumienie aerozoli CO₂ bez przedmuchiwania azotem były używane do usuwania biofilmów Pseudomonas putida z polerowanej powierzchni ze stali nierdzewnej. W rzeczywistości przedmuchiwanie azotem było stosowane w wielu badaniach aerozoli CO₂ w celu zwiększenia skuteczności usuwania poprzez zmniejszenie kondensacji wilgoci powstającej podczas czyszczenia, mimo że zastosowano również ogrzewanie za pomocą płyty grzejnej lub lamp na podczerwień i stosowanie suchych komór¹². Tworzenie biofilmu powierzchniowego i zoptymalizowane procedury czyszczenia opisano poniżej. Skuteczność usuwania oceniano, mierząc intensywność fluorescencji biofilmu na powierzchni.

Protokół

1. Przygotowanie powierzchni do tworzenia biofilmu

1. Pociąć płyty ze stali nierdzewnej 304 o grubości 1 mm na wióry (10 × 10 mm²) za pomocą noża mechanicznego.
2. Wykonuj ultradźwiękowe czyszczenie wiórów w acetonie, metanolu i wodzie dejonizowanej (DI) sekwencyjnie przez 10 minut każdy. Użyj pojemnika odpornego na rozpuszczalniki, wykonanego z substancji takich jak szkło, aby usunąć zanieczyszczenia organiczne.
3. Opłucz frytki płynącą wodą DI przez 3-5 sekund.
4. Suszyć wióry za pomocą przepływu gazu N₂ przez 3-5 sekund.

2. Przygotowanie kultury bakteryjnej

1. Weź zapas P. putida KT2440 (uprzejmie dostarczony przez prof. Sung Kuk Lee, UNIST, Korea Południowa) przechowywany w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
2. Rozmrozić w temperaturze pokojowej po 1 minutach, a wierzchnia warstwa zamrożonego roztworu podstawowego zamieni się w błoto pośniegowe. Zanurz pętlę w stopionej warstwie roztworu podstawowego.
3. Użyj tej pętli, aby umieścić bakterie na płytce Luria-Bertani (LB) zawierającej 1,5% agaru.
4. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 30 °C, aby wyhodować kolonie bakterii.
5. Wybierz pojedynczą kolonię z talerza za pomocą świeżej pętli.
6. Zaszczepić 10 ml bulionu LB w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z pętlą zawierającą pojedynczą kolonię bakteryjną.
7. Bulion inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem przez 16 godzin w temperaturze 30 °C i prędkości 160 obr./min.

3. Tworzenie się biofilmu na powierzchni

1. Podnieś każdy z przygotowanych chipsów pęsetą i zanurz je w 70% etanolu 5 razy na 1-2 sekundy każdy, aby wysterylizować powierzchnię każdego chipsa. Upewnij się, że frytki są trzymane pęsetą podczas zanurzania.
2. Zanurz każdy chips w autoklawowanej wodzie DI i bulionie LB sekwencyjnie, 5 razy po 1-2 sekundy, aby usunąć pozostały etanol.
3. Umieść te chipsy na 6-dołkowych płytkach hodowlanych z 2 frytkami i 5 ml bulionu LB na studzienkę.
4. Rozcieńczyć kulturę bakteryjną do momentu, gdy stężenie w bulionie LB osiągnie 8 × 10⁸ komórek/ml (gęstość optyczna przy długości fali 600 nm: ~0,8).
5. Zaszczepić każdą studzienkę 50 μl rozcieńczonej kultury bakteryjnej.
6. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C bez wytrząsania przez 24 godziny w celu wytworzenia biofilmu.

4. Czyszczenie aerozolu CO₂

1. Zanurz wióry utworzone w biofilmie w 10 mM buforze octanu amonu (lotnym) 5 razy, aby usunąć luźno przyczepione i planktonowe bakterie.
2. Wysuszyć te wióry w komorze bezpieczeństwa biologicznego, w której powietrze przepływa łagodnie.
3. Natychmiast po wysuszeniu umieścić wiór w miejscu załadunku, które znajduje się 20 mm od dyszy CO₂ wzdłuż osi strumienia. Przechyl oś strumienia pod kątem 40°.
4. Ustawić ciśnienie stagnacji gazu CO₂ i N₂ odpowiednio na 5,3 MPa i 0,7 MPa za pomocą regulatorów ciśnienia gazu.
5. Nałóż strumień aerozolu na środkową część chipa. Białe aerozole, w tym stały CO_{2 ,} powinny być widoczne. Włączać elektrozawór CO₂ na 5 sekund, a następnie okresowo wyłączać go na 3 sekundy (cykl: 8 sekund) za pomocą przełącznika sterowanego ręcznie. Jeśli konieczne jest użycie przedmuchiwania azotem, włącz zawór elektromagnetyczny, aby zapewnić ciągłe dostarczanie N₂.
6. Traktuj wióry aerozolami CO₂ przez 16, 40 i 88 sekund z przedmuchiwaniem azotem i bez niego. Zachować wióry bez obróbki jako kontroli negatywnej.

5. Analiza skuteczności usuwania

1. Przygotuj 1 μM barwienie kwasem nukleinowym z zielonej fluorescencji (długość fali wzbudzenia/emisji: 480/500 nm) w wodzie DI, aby zabarwić komórki bakteryjne na chipach kontrolnych i aerozolowych.
2. Umieść wióry w roztworze barwiącym.
3. Inkubować wióry w inkubatorze bez światła, w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
4. Po inkubacji delikatnie spłucz wióry płynącą wodą DI, aby usunąć nadmiar barwnika fluorescencyjnego.
5. Wysuszyć wióry przepływem gazu N₂.
6. Wykonaj obrazy mikroskopowe fluorescencji 5 losowych pól widzenia (321 × 240 μm²) dla każdego chipa za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, obiektywu 40X i kamery CCD.
7. Uzyskaj intensywność fluorescencji dla każdego obrazu za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu, takiego jak ImageJ. W ImageJ użyj funkcji "Odejmij tło" w menu "Proces" i wybierz "Zintegrowana gęstość" w oknie "Ustaw pomiary" w menu "Analizuj". Wykonaj "Pomiar" w menu "Analizuj", aby uzyskać intensywność fluorescencji.
8. Obliczyć skuteczność usuwania biofilmu według następującego wzoru: 100% × (I chipów kontrolnych - I chipów poddanych obróbce)/(I chipów kontrolnych), gdzie I jest obliczoną intensywnością fluorescencji.
9. Uzyskaj średnią wydajność usuwania i odchylenia standardowe. Użyj co najmniej 4 żetonów w każdym przypadku.

Wyniki

Do usuwania biofilmu P. putida z powierzchni SUS304 wykorzystano aerozole CO₂ (Rycina 1). Po 24 h wzrostu większość powierzchni była pokryta biofilmem. Większość biofilmu usunięto przy użyciu aerozoli CO₂ (Rycina 2). Zgodnie z oczekiwaniami, Rycina 3 wykazuje wzrost wydajności usuwania biofilmu wraz z wydłużeniem czasu traktowania aerozolem CO₂. Dla czasu traktowania wynoszącego 88 sec wydajność usuwania określono na odpowiednio ...

Dyskusja

Wcześniej przeprowadziliśmy badania optymalizacyjne dotyczące ciśnienia gazu CO₂ , kąta strumienia i odległości od powierzchni ciała stałego w czyszczeniu aerozolem CO₂ ⁷. W przeciwieństwie do naszych poprzednich badań, w obecnym badaniu przedmuchiwanie azotem nie było zawarte w aerozolu (ryc. 1). Co więcej, w tym protokole zastosowano stal nierdzewną 304, ponieważ jest to jedna z najpopularniejszych stali nierdzewnych i jest szeroko stosowana w przemyśle spożywczym. Wypo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stal nierdzewna 304	Steelni (Korea Południowa)		Polerowane i pokrojone w kostkę
Myjka ultradźwiękowa	Branson (USA)	5510E-DTH
Luria-Bertani (LB)	Becton, Dickinson and Company (USA)	244620	500 g
Agar	Becton, Dickinson and Company (USA)	214010	500 g
6-dołkowa płytka hodowlana	SPL Life Sciences (Korea Południowa)	32006
Bufor octanu amonu	Sigma-Aldrich (USA)	667404	10 mM
Podwójna jednostka gazowa	Applied Surface Technologies (USA)	K6-10DG	Jedna dysza do CO2 gaz i 8 dysz do gazu N2
SYTO9	Thermo Fissher Scientific (USA)	Wzbudzenie Invitrogen	: 480 nm Emisja: 500 nm
Mikroskop epifluorescencyjny	Nikon (Japonia)	Obiektyw Eclipse 80i
40X	Nikon (Japonia)	Plan Fluor	NA: Aparat CCD 0,75
	Fotometria (USA)	Fajny SNAP HQ2	monochromatyczny