Artykuł metodologiczny

Model in vitro do badania transformacji komórkowej przez opryszczkę mięsaka Kaposiego

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54828

⸱

25 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

W tym artykule

Podsumowanie

Mięsak Kaposiego (KS) to nowotwór wywołany przez zakażenie wirusem onkogennym ludzkim herpeswirusem-8/herpeswirusem KS (HHV-8/KSHV). Opisany tutaj model hodowli komórek śródbłonka jest wyjątkowo odpowiedni do badania mechanizmów, za pomocą których KSHV przekształca komórki gospodarza.

Streszczenie

Mięsak Kaposiego (KS) to nietypowy nowotwór złożony z proliferujących komórek wrzecionowatych, który jest inicjowany przez zakażenie komórek śródbłonka (EC) KSHV i rozwija się najczęściej w warunkach immunosupresji. Pomimo dziesięcioleci badań, optymalne leczenie KS pozostaje słabo zdefiniowane, a wyniki kliniczne są szczególnie niekorzystne w warunkach ograniczonych zasobów. Zmiany KS są napędzane przez patologiczną angiogenezę, przewlekły stan zapalny i onkogenezę, a w celu zbadania tych procesów opracowano różne modele hodowli komórkowych in vitro. KS powstaje z zakażonych KSHV komórek pochodzenia śródbłonkowego, więc komórki linii EC stanowią najbardziej odpowiednie substytuty prekursora komórek wrzecionowatych in vitro. Jednak ze względu na ograniczoną długość życia in vitro, a mechanizmy onkogenne wykorzystywane przez KSHV są mniej wydajne niż w przypadku innych wirusów rakotwórczych, trudno było ocenić procesy transformacji w EC pierwotnym lub unieśmiertelnionym telomerazą. W związku z tym opracowano nowatorski model hodowli oparty na EC, który łatwo wspiera transformację po zakażeniu KSHV. Ektopowa ekspresja genów E6 i E7 wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 pozwala na rozszerzoną hodowlę EC zakażonego KSHV w zależności od wieku i pasażu oraz wspiera rozwój prawdziwie przekształconego (tj. rakotwórczego) fenotypu w zakażonych kulturach komórkowych. Ten elastyczny i wysoce powtarzalny model KS ułatwił odkrycie kilku podstawowych szlaków sygnałowych o dużym potencjale przełożenia na warunki kliniczne.

Wprowadzenie

Mięsak Kaposiego (KS) to wieloogniskowy nowotwór angioproliferacyjny atakujący miejsca skórne, śluzówkowe i trzewne, który rozwija się najczęściej w warunkach zaawansowanej supresji immunologicznej1. Opisano cztery formy epidemiologiczne: klasyczną, powolną formę, która zwykle dotyka osoby starsze o pochodzeniu śródziemnomorskim i bliskowschodnim; jatrogenne, wynikające z leczenia lekami immunosupresyjnymi po przeszczepieniu narządu; epidemia, rak definiujący AIDS; i endemiczny, niezależna od HIV forma powszechna u dzieci w endemicznych regionach Afryki. Wraz z pojawieniem się skutecznych skojarzonych leków antyretrowirusowych stosowanych w leczeniu HIV, epidemia KS jest znacznie rzadziej diagnozowana w krajach rozwijających się. Jednak klinicznie agresywne formy endemiczne i epidemiczne pozostają jednymi z najczęściej diagnozowanych nowotworów w wielu krajach afrykańskich2,3,4. Dlatego identyfikacja skutecznych leków ukierunkowanych na patogenezę w leczeniu KS jest priorytetem badawczym.

Histologicznie, zmiany KS charakteryzują się rozległą, ale nieprawidłową neowaskularyzacją, w wyniku której wrzecionowate komórki pochodzenia EC tworzą nieciągłe sieci naczyniowe5. Te nieprawidłowe naczynia ("szczeliny naczyniowe") umożliwiają wynaczynienie erytrocytów, które nadają zmianom charakterystyczny kolor. Dodatkowo zmiany zawierają liczne leukocyty, które charakteryzują przewlekły stan zapalny (tj. limfocyty, makrofagi i komórki plazmatyczne). Opisano regresję zmian KS po rekonstytucji immunologicznej, co sugeruje, że KS ma cechy zarówno zmiany hiperproliferacyjnej, jak i prawdziwego nowotworu6,7,8,9.

wirus opryszczki KS (KSHV), czynnik sprawczy KS, został zidentyfikowany w 199410. Od tego czasu opracowano wiele modeli hodowli komórkowych in vitro, aby umożliwić badania patogenezy, w tym komórek eksplantowanych z materiału biopsji guza i EC pierwotnego lub eksprymującego telomerazy zakażonego KSHV in vitro11,12,13,14,15,16,17,18. Żaden z obecnie dostępnych modeli nie podsumowuje w pełni mikrośrodowiska guza KS, ale wszystkie wniosły cenną wiedzę do naszego zrozumienia patobiologii zakażenia KSHV. W przeciwieństwie do innego znanego rakotwórczego ludzkiego wirusa opryszczki wirusa Epsteina-Barr (EBV), KSHV nie przekształca łatwo komórek w hodowli po zakażeniu de novo19,20,21,22. Jednak to ograniczenie zostało przezwyciężone przez transdukcję pierwotnego ludzkiego EC o mieszanym pochodzeniu mikronaczyniowym lub limfatycznym z genami E6 i E7 z wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 przed zakażeniem KSHV23,24. Ekspresja tych egzogennych onkogenów radykalnie zwiększa potencjał transformacyjny KSHV in vitro, częściowo poprzez dalsze hamowanie białka siatkówczaka i p5323,24. Ta metoda transdukcji EC pozwoliła wielu laboratoriom zidentyfikować kluczowe zmiany w ekspresji genów komórek gospodarza, które są indukowane przez zakażenie KSHV i które wydają się ułatwiać przeżycie i proliferację komórek KS25,26,27,28,29,30,31,32. Opisane tutaj protokoły są proste i wysoce powtarzalne, a ich wynikiem będzie generowanie dopasowanych do wieku i pasaży kontrolnych EC zakażonych KSHV oraz prób zakażenia, które mogą być hodowane znacznie dłużej niż komórki pierwotne i pozwolą na badanie mechanizmów onkogennych stosowanych przez KSHV. Chociaż protokół zawiera metodę produkcji dzikiego typu KSHV z pierwotnej linii komórkowej chłoniaka wysiękowego BCBL-1, unieśmiertelnione E6/E7 EC są również wysoce podatne na zakażenie rekombinowanym KSHV-BAC1630. Protokoły przygotowania BAC16 są opisane w innym miejscu33,34.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury opisane w tym protokole powinny być wykonywane w warunkach BSL-2.

1. Przygotowanie zapasów KSHV

  1. Przygotować bufor TNE: rozpuścić 292,24 mg EDTA w ddH2O, doprowadzić do 225 ml i dostosować do pH 8. Rozpuścić 605,7 mg Tris w ddH2O, doprowadzić do 225 ml i dostosować do pH 8. Połączyć roztwory EDTA i Tris, dodać 4,38 g NaCl, dostosować końcową objętość do 500 ml, przefiltrować sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Hodowla linii komórkowej pierwotnego chłoniaka wysiękowego BCBL-1 z dodatnim i ujemnym wynikiem EBV w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C plus 5% CO2 w RPMI, uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) i środkami przeciwdrobnoustrojowymi do około 1 do 1,2 x 106 komórek na ml.
  3. Aby indukować produkcję KSHV, należy podzielić kultury 1:2 ze świeżą pożywką i dodać 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) do końcowego stężenia 20 ng / ml i inkubować kultury przez 5 dni. Alternatywnie należy traktować komórki maślanem sodu (NaB; 0,1 mM) przez 3 dni w celu wywołania litycznej replikacji wirusa.
  4. Aby zebrać cząsteczki wirusa, należy najpierw odwirować supernatant kultury o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać komórki i przenieść supernatanty do świeżych probówek.
  5. W celu dalszego oczyszczenia supernatantu, tak aby uniknąć przenoszenia resztek komórkowych, odwirować przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Jako alternatywę dla wirowania z dużą prędkością w celu klarowania supernatantów hodowlanych, można przeprowadzić filtrację przez sterylny filtr 0,45 μm. Zaobserwowaliśmy znaczny spadek miana przy użyciu filtracji; Dlatego rutynowo wykonujemy drugi etap wirowania.
  6. Następnie nałożyć 5 ml 25% roztworu sacharozy w buforze TNE z około 30 ml sklarowanego supernatantu hodowli w 6 probówkach do ultrawirówek.
  7. Wirować wyważone probówki o sile 75 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C w próżni.
  8. Zdekantować supernatant do hodowli i osuszyć brzeg każdej probówki, aby usunąć jak najwięcej supernatantu i roztworu sacharozy, a następnie ponownie zawiesić osad wirusa, który może być niewidoczny, w 150 μl buforu TNE.
  9. Zebrać wszystkie zawieszone wirusy, dobrze wymieszać i zamrozić 25 μl porcji w temperaturze -80 °C.

2. Transdukcja EC z genami wirusa brodawczaka E6 i E7

UWAGA: Rutynowo używamy standardowych kolb do hodowli tkanek do hodowli pierwotnego EC. Jednakże, jeżeli uzyskuje się niezadowalający wzrost EC, należy rozważyć użycie komercyjnych kolb hodowlanych.

  1. Hodowla pierwotnego ludzkiego mikronaczyniowego lub limfatycznego EC przez skórę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C plus 5% CO2 w pożywce EC (EGM; zawiera podłoże podstawowe EC [EBM] uzupełnione EGM-2 BulletKit [zawierające FBS, hydrokortyzon, ludzki czynnik wzrostu fibroblastów-B, naczyniowy czynnik wzrostu EC, insulinopodobny czynnik wzrostu-1, kwas askorbinowy, ludzki nabłonkowy czynnik wzrostu, antybiotyki i heparynę]) w kolbie do hodowli komórek T75 do około 50% zbiegu.
  2. Do transdukcji posadź komórki PA317 LXSN 16E6E724,35 w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37°C plus 5% CO2 w DMEM uzupełnionym 10% FBS i środki przeciwdrobnoustrojowe w kolbie do hodowli komórek T150, aż osiągną około 90% zlewania się. Następnie inkubować przez noc w 16 ml pożywki.
  3. Sklarować pożywkę PA317 przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć EGM z hodowli EC i nałożyć na komórki 12 ml oczyszczonej pożywki PA317 i inkubować przez 4 godziny
    UWAGA: Odwirowanie 16 ml kondycjonowanej pożywki przy 300 x g przez 5 minut daje zwarty osad, który nie jest zakłócany przez staranne późniejsze usunięcie 12 ml sklarowanego supernatantu. Jeśli jednak przeniesienie komórek PA317 LXSN 16E6E7 do pierwotnych kultur EC jest problemem (linia komórek pakujących szybko przerośnie EC), wówczas można przeprowadzić filtrację kondycjonowanego supernatantu przez filtr 0,45 μm przed transferem.
  5. Zastąp 6 ml pożywki PA317 świeżym EGM i inkubuj przez noc.
  6. Ponownie wprowadzić EC 12 ml świeżego NWZ i inkubować przez kolejne 48 godzin.
  7. W celu subhodowli EC należy usunąć pożywkę i przemyć 12 ml PBS bez kationów, a następnie dodać 3 ml dostępnego w handlu roztworu dysocjacji enzymatycznej (np. TrypLE) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
  8. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić otrzymany osad komórkowy w świeżym NWZ i równomiernie podzielić na 3 kolby T75 o końcowej objętości 12 ml EGM na kolbę.
  9. Aby wybrać EC transdukowane za pomocą E6 i E7, dodaj G418 do końcowego stężenia 200 μg/ml przez dwa pasaże, po czym transdukowany EC można posiać w celu zakażenia lub zamrozić w ciekłym azocie.

3. Zakażenie transdukowanego EC KSHV

  1. W dniu poprzedzającym zakażenie należy pobrać EC przez trawienie enzymatyczne przy użyciu dostępnego w handlu roztworu dysocjacji enzymatycznej, jak opisano powyżej. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml EGM. Użyj 5 μl komórek, aby przygotować rozcieńczenie 1/10 w błękicie trypanowym. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru i zasiaj 2,5 x 105 żywych komórek w 2 ml EGM na dołek w 6 dołkach.
  2. W dniu zakażenia należy usunąć EGM i przemyć komórki 3 ml PBS z wapniem i magnezem na studzienkę, a następnie dodać 2 ml EBM.
    UWAGA: Istotne jest, aby podczas infekcji stosować EBM, a nie EGM, ponieważ heparyna zawarta w EGM hamuje wiązanie cząstek wirusa z docelowym EC, a następnie zakażenie.
  3. Aby zainfekować komórki KSHV, dodaj od 5 do 20 μl zapasu wirusa do każdej studzienki i zawiruj płytkę, aby wymieszać. W przypadku pozorowanych zainfekowanych komórek dodaj równą objętość buforu TNE do każdej studzienki.
  4. Odwirować płytki o sile 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 90 minut.
  5. Jeśli celem badania jest zbadanie wczesnych zdarzeń wymagających synchronicznej infekcji wirusowej, np. wczesnych zdarzeń w zakażeniu de novo, należy w tym momencie usunąć inokulum wirusa. Opłucz komórki i ponownie nakarm je 2 ml świeżego NWZ. W przeciwnym razie dodaj 2 ml EGM i inkubuj kultury przez noc.
  6. Ponownie nakarmić komórki 2 ml EGM dzień po zakażeniu, a następnie co drugi dzień.
  7. Gdy komórki są w około 90% zlewające się, zbierz je przez trawienie enzymatyczne przy użyciu komercyjnego roztworu dysocjacji enzymatycznej, jak opisano powyżej, a następnie połącz komórki z trzech dołków w T75, odnotowując zarówno całkowitą liczbę pasaży, jak i pasaż po infekcji.
  8. Rozszerz makietę EC zainfekowaną KSHV za pomocą podziałów 1:3 przez co najmniej dwa dodatkowe przejścia, w którym to czasie komórki mogą być używane w eksperymentach lub zamrażane w ciekłym azocie.
    UWAGA: Podobnie jak w przypadku rozszczepienia EC transdukowanego przez E6 i E7, hodowle podtrzymujące komórek zakażonych makietą i KSHV powinny zostać podzielone przed osiągnięciem konfluencji (~85 do 90%).

4. Potwierdzanie zakażenia KSHV za pomocą immunofluorescencji

UWAGA: Wykrycie antygenu jądrowego związanego z opóźnieniem KSHV (LANA-1/ORF73) zapewnia wiarygodną ilościową miarę infekcji. Przeciwciała anty-LANA są dostępne w handlu.

  1. Dzień przed barwieniem umieścić dwie studzienki z makietą lub zakażonym KSHV EC na 24-dołkowej płytce w ilości 1 x 105 komórek na studzienkę w 1 ml EGM i inkubować przez noc.
  2. Umyj komórki dwukrotnie 500 μl PBS plus wapń i magniseum. Myj się przez 30 s na bujanej platformie.
  3. W zewnętrznie wentylowanym dygestorii utrwal komórki za pomocą 500 μl 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Przemyć komórki trzykrotnie 500 μl buforu do przemywania (0,1% Triton X-100 plus 0,02% koziej surowicy w PBS plus kationy).
  5. Blokuj komórki 500 μl 2% koziej surowicy w buforze do przemywania przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Przemyć komórki trzykrotnie 500 μl buforu do płukania.
  7. Oznaczyć jedną studzienkę EC zakażonego makietą lub KSHV za pomocą 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w stosunku 1:100 w buforze do przemywania przez 30 minut w temperaturze pokojowej na kołysce. Pozostałe dwie studzienki inkubować tylko w 200 μl buforu do przemywania (ang. soap buffer).
  8. Przemyć komórki trzykrotnie 500 μl buforu do płukania.
  9. Oznaczyć wszystkie cztery studzienki 200 μl przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w stosunku 1:100 w buforze do płukania przez 30 minut w temperaturze pokojowej na kołysce.
  10. Przemyć komórki trzykrotnie 500 μl buforu do płukania.
  11. Do każdej studzienki nanieść 20 μl podłoża montażowego zawierającego DAPI i szkiełko nakrywkowe i ocenić barwienie za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.
  12. Określ procent infekcji komórek zakażonych KSHV, licząc liczbę jąder LANA-dodatnich w co najmniej 200 komórkach. Zakażenie rekombinowanym KSHV-Bac16 można również monitorować poprzez obserwację kultur pod kątem ekspresji GFP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Morfologię pierwotnych komórek śródbłonka (EC) klasycznie opisuje się jako „brukową”, i morfologia ta nie ulega zmianie pod wpływem ekspresji genów E6 i E7 papilomawirusa (Ryc. 1A). Sama ekspresja genów E6 i E7 nie indukuje fenotypu przekształconego; w związku z tym komórki są podatne na hamowanie kontaktowe i zaprzestają podziałów po osiągnięciu konfluencji w hodowli. Komórki będą jednak proliferować i ponownie odrastać do konfluencji po trypsynizacji i ponownym wysianiu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Onkogeneza jest wieloetapowym procesem, który omija ważne zabezpieczenia w organizmie36. Ponieważ zmiany KS występują w spektrum przewlekłego stanu zapalnego do prawdziwych mięsaków, wyjaśnienie pewnych procesów patofizjologicznych, w których pośredniczy KSHV, wymaga przeprowadzenia pewnych badań na modelach hodowli komórkowych, które wspierają transformację9. Należy zauważyć, że utrata zahamowania kontaktu i wzrost zależny od zakotwiczenia, fenotypy wskazujące na transform...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez K12 HD068322 (SCM); R01 CA179921 oraz P51 OD011092 (AVM); oraz nagroda 14PRE20320014 od Amerykańskiego Towarzystwa Kardiologicznego (SB).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki BCBL-1Program odczynników NIH AIDS3233
Komórki PA317ATCCCRL-2203
Noworodkowe komórki mikronaczyniowe śródbłonka skóryLonzaCC-2505
EBM-2 Podłoże podstawoweLonzaCC-3156
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162
anty-KSHV LANA/ORF 73Zaawansowany Biotechnologies13-210-100
TrypLETMExpress, bez czerwieni fenolowejThermoFisher12604013
RPMI
DMEM
PBS z wapniem i magnezem

Bibliografia

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi's sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256(2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi's sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621(2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31(2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi's sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266 (5192), New York, N.Y. 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi's sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma? Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi's sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668(2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770(2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi's sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5(2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424(2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi's Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013(2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi's sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395(2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668(2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder,, Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

zaka enie KSHVkom rki r db onkaonkogeneza wirusowatransformacja kom rkowaekspresja E6 E7oczyszczanie cz stek wirusatest w mi kkim agarzeoporno na anoikozmorfologia kom rek wrzecionowatych

Powiązane artykuły