Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Platforma testów antybiofilmowych dostosowana do eksploracji bibliotek związków naturalnych

17.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54829

⸱

27 grudnia 2016

 ,  , 
1Pharmaceutical Design and Discovery (PharmDD), Faculty of Pharmacy, University of Helsinki

W tym artykule

Podsumowanie

Infekcje biofilmowe wykazują wysoką tolerancję na chemioterapię. Żaden pojedynczy test nie oddaje złożoności biofilmów. Zamiast tego potrzebne są testy uzupełniające. Przedstawiamy platformę przesiewową (opracowaną dla S. aureus), która łączy testy żywotności, biomasy i matrycy biofilmu. Pozwala to na odkrywanie leków przeciwbiofilmowych, w tym ocenę długoterminowych efektów chemioterapeutycznych.

Streszczenie

Biofilmy są uważane za jeden z najtrudniejszych tematów współczesnej biomedycyny i są potencjalnie odpowiedzialne za ponad 80% infekcji tolerujących antybiotyki. Biofilmy wykazują wyjątkowo wysoką tolerancję na chemioterapię, która jest uważana za wieloczynnikową. Na przykład matryca zapewnia fizyczną barierę, która zmniejsza przenikanie antybiotyków do biofilmu. Ponadto komórki w biofilmach są fenotypowo zróżnicowane. Prawdopodobnie odporność biofilmu wynika z połączenia tych i innych, jeszcze nieznanych mechanizmów. Wszystkie obecnie istniejące antybiotyki zostały opracowane przeciwko bakteriom jednokomórkowym (planktonowym). Dlatego jak dotąd istnieje bardzo ograniczony repertuar cząsteczek, które mogą selektywnie działać na dojrzałe biofilmy. Sytuacja ta doprowadziła do postępującej zmiany paradygmatu w odkrywaniu leków, w której poszukiwanie antybiofilmów zostało wezwane do zajęcia bardziej eksponowanego miejsca. Dodatkowym wyzwaniem jest to, że istnieje bardzo ograniczona liczba wystandaryzowanych metod badania biofilmu, zwłaszcza tych, które można wykorzystać do wysokoprzepustowych badań przesiewowych bibliotek chemicznych. W tym miejscu zaprezentowano eksperymentalną platformę antybiofilmową do badań przesiewowych substancji chemicznych. Wykorzystuje trzy testy do pomiaru żywotności biofilmu (z barwieniem resazuryny), całkowitej biomasy (z barwieniem fioletem krystalicznym) i matrycy biofilmu (przy użyciu aglutyniny z kiełków pszenicy, barwienia WGA na bazie fluorescencji poli-N-acetylo-glukozaminy, frakcji PNAG). Wszystkie testy zostały opracowane przy użyciu Staphylococcus aureus jako bakterii modelowych. Przedstawiono przykłady wykorzystania platformy do wstępnych badań przesiewowych, a także do funkcjonalnej charakterystyki zidentyfikowanych uderzeń antybiofilmu. Ta eksperymentalna sekwencja pozwala dodatkowo na klasyfikację trafień na podstawie zmierzonych punktów końcowych. Dostarcza również informacji na temat ich sposobu działania, zwłaszcza na temat długoterminowych i krótkoterminowych skutków chemioterapeutycznych. W związku z tym jest to bardzo korzystne dla szybkiej identyfikacji wysokiej jakości związków trafionych, które mogą służyć jako punkty wyjścia dla różnych zastosowań biomedycznych.

Wprowadzenie

Bakterie mogą przełączać się między dwoma bardzo różnymi stylami życia, planktonicznym i siedzącym, czego najczęstszym przykładem jest biofilm. W biofilmach bakterie tworzą ustrukturyzowane społeczności osadzone w samodzielnie wytworzonej matrycy1. Ta samodzielnie wyprodukowana matryca stanowi barierę między bakteriami a ich środowiskiem zewnętrznym i chroni komórki drobnoustrojów, utrzymując je w bliskiej odległości. Skład macierzy biofilmu różni się w zależności od gatunku, a nawet w jego obrębie, ale głównie składa się ze ścisłej sieci lipopolisacharydów, zewnątrzkomórkowego DNA i białek. Macierz służy jako fizyczna bariera hamująca wnikanie szkodliwych czynników, ale także chroni biofilm przed odwodnieniem i zapobiega ucieczce składników odżywczych z komórki2.

Biofilmy są uważane za jeden z najtrudniejszych tematów współczesnej biomedycyny i są rzekomo odpowiedzialne za ponad 80% infekcji tolerujących antybiotyki3. Wykazują z natury wysoką tolerancję na zagrożenia zewnętrzne: wilgoć, ciśnienie osmotyczne, naprężenia mechaniczne4, ciepło, promieniowanie UV5, środki dezynfekujące, środki przeciwdrobnoustrojowe i układ odpornościowy gospodarza1. Na przykład wykazano, że wymagane stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego wymagane do zabicia biofilmu jest do 1000 razy wyższe w porównaniu z tym, które jest wymagane do zabicia bakterii planktonowych. Wyjaśnienie tej wyższej tolerancji wydaje się być wieloczynnikowe. Matryca zapewnia fizyczną barierę, która zmniejsza przenikanie antybiotyków do biofilmu. Ponadto komórki w biofilmach są fenotypowo zróżnicowane; Przechodzą między różnymi stanami metabolicznymi ze względu na istniejący gradient tlenu, składników odżywczych i metabolitów między wewnętrzną i zewnętrzną częścią biofilmu6. W związku z tym w niektórych regionach biofilmu, takich jak rdzeń, bakterie są pozbawione tlenu i składników odżywczych i żyją w stanie metabolicznie mniej aktywnym lub całkowicie uśpionym7. Całkowicie uśpione komórki są określane jako komórki trwałe i nie są podatne na konwencjonalne leczenie przeciwbakteryjne8. Jest więc prawdopodobne, że odporność biofilmu powstaje w wyniku połączenia obecnie sugerowanych i innych, jeszcze nieznanych mechanizmów. Staphylococcus spp. są nadal jednymi z najbardziej problematycznych bakterii Gram-dodatnich, powodując ciężkie, często związane z biofilmem, infekcje4. Sugeruje się, że do 99% wszystkich bakterii jest związanych z biofilmami, co czyni je dominującym stylem życia bakterii3. Jednak wszystkie obecnie istniejące antybiotyki zostały opracowane przeciwko bakteriom jednokomórkowym (planktonowym). Jak dotąd istnieje bardzo ograniczony repertuar cząsteczek, które mogą selektywnie działać na dojrzałe biofilmy. Sytuacja ta doprowadziła do postępującej zmiany paradygmatu w odkrywaniu leków, w której poszukiwanie antybiofilmów zostało wezwane do zajęcia bardziej eksponowanego miejsca.

Z perspektywy metodologicznej istnieją dodatkowe wyzwania, ponieważ organizacje ustanawiające standardy opracowały tylko ograniczoną liczbę metod biofilmu, zwłaszcza tych, które mają zastosowanie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych bibliotek chemicznych. Wszystkie standaryzowane testy (z jednym wyjątkiem) opierają się na reaktorach biofilmu, a metody te wymagają do badania dużych objętości roboczych i dużych ilości związków, które są zwykle niedostępne we wczesnym etapie badań9-12. Jedynym istniejącym znormalizowanym testem mającym zastosowanie do badań przesiewowych jest tak zwane urządzenie do biofilmu z Calgary, na podstawie którego opracowano dostępny na rynku system minimalnego stężenia eliminującego biofilm (MBEC)13-15. Jednak ograniczeniem tego testu jest to, że biofilmy są hodowane na kołkach i nie wszystkie gatunki bakterii, a nawet szczepy w obrębie tego samego gatunku są w stanie tworzyć biofilmy na tym urządzeniu. Ponadto potrzebne są metody, które mogą być szczególnie stosowane do badania związków naturalnych. W ciągu ostatniego stulecia produkty naturalne były głównym źródłem innowacji w odkrywaniu leków przeciwdrobnoustrojowych16 . Mogą one dostarczyć nowych związków przeciw biofilmowi o unikalnych mechanizmach działania, które mogą być również skuteczne przeciwko komórkom przetrwałym. W związku z tym eksploracja naturalnych i inspirowanych naturą bibliotek ma duże szanse na wytworzenie obiecujących i unikalnych tropów antybiofilmowych.

Tutaj prezentujemy szczegóły eksperymentalne platformy testów, która została opracowana do chemicznego badania przesiewowego związków anty-biofilmu przy użyciu trzech testów do pomiaru wpływu na żywotność, całkowitą biomasę i matrycę biofilmów Staphylococcus aureus. Pierwszy test mierzy żywotność biofilmu i opiera się na barwieniu rezazuryną. Rezazuryna to barwnik redoks, który jest niebieski i niefluorescencyjny w stanie utlenionym i zamienia się w różową, wysoce fluorescencyjną rezorufinę, gdy jest zredukowany przez aktywność metaboliczną bakterii. Jest to bardzo prosta i szybka metoda odpowiednia do wstępnych badańprzesiewowych 17-20. Drugi test, oparty na barwieniu fioletem krystalicznym, mierzy całkowitą masę biofilmu. Fiołek krystaliczny jest szeroko stosowaną barwą do badania bakterii i bakterii w biofilmach19,21-23. Test opiera się na niedrogich odczynnikach i ma prosty odczyt punktu końcowego absorbancji. Wreszcie trzeci test jest ukierunkowany na zewnątrzkomórkową substancję polimerową (EPS) matrycę biofilmu za pośrednictwem aglutyniny z kiełków pszenicy (WGA), która wiąże się specyficznie z resztami poli-N-acetylo-glukozaminy (PNAG) obecnymi w matrycy biofilmów gronkowcowych24. WGA jest sprzężony z fluoroforem, który można wykryć za pomocą czytników intensywności fluorescencji25. Przedstawiamy tutaj przesłanki i szczegóły opracowanej przez nas platformy, w tym przykłady zastosowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla bakterii

  1. Bakterie należy wstępnie wyhodować przez noc w tryptycznym bulionie sojowym (TSB) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 220 obr./min (16-18 godzin).
  2. Rozcieńczyć kulturę wstępną 100-1000 razy (w zależności od tempa wzrostu bakterii; w tym przypadku 1000 razy stosuje się S. aureus) w świeżym TSB i pozwolić mu rosnąć w temperaturze 37 °C i 200 obr./min, aby osiągnąć wykładniczy wzrost (gęstość optyczna przy 595 nm (OD595) między 0,2 a 0,6).
    UWAGA: Ten krok wymaga optymalizacji specyficznej dla szczepu.

2. Tworzenie biofilmu: przed i po ekspozycji

  1. Rozcieńczyć wykładniczo wyrośniętą kulturę 100 razy (odpowiada to około 106 jednostkom tworzącym kolonie na mililitr (CFU/ml)).
  2. Protokół przedekspozycyjny
    1. W przypadku próbek kontrolnych niepoddanych działaniu substancji dodać 200 μl rozcieńczonej kultury bakteryjnej na dołek sterylnej płytki 96-dołkowej.
    2. Dodać 4 μl badanego związku lub antybiotyku kontrolnego (50x roztwór podstawowy) i 196 μl rozcieńczonej kultury bakteryjnej do studzienki.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C na wytrząsarce płytkowej z prędkością 200 obr./min przez 18 godzin.
      Uwaga: Tutaj używamy wytrząsarki z orbitą 2 mm.
  3. Protokół poekspozycyjny
    1. Do wszystkich próbek dodać 200 μl rozcieńczonej kultury bakteryjnej na studzienkę sterylnej płytki 96-mikrodołkowej.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C na wytrząsarce płytkowej z prędkością 200 obr./min przez 18 godzin.
      Uwaga: Tutaj używamy wytrząsarki z orbitą 2 mm.
    3. Ostrożnie usunąć cały roztwór planktonu, nie dotykając biofilmu, za pomocą pipety wielokanałowej.
    4. Dodać 4 μl badanego związku lub antybiotyku kontrolnego (50x roztwór podstawowy) i 196 μl TSB do dołka.
    5. Inkubować w temperaturze 37 °C na wytrząsarce płytkowej z prędkością 200 obr./min przez dodatkowe 24 godziny
      Uwaga: Tutaj używamy wytrząsarki z orbitą 2 mm.

3. Protokół barwienia resazuryny do oceny żywotności biofilmów

  1. Przygotować roztwór podstawowy 0,1 mg/ml rezazuryny (0,4 mM) w sterylnym PBS. Przechowywać ten wywar w sterylnym miejscu, chronić przed światłem i w temperaturze 4 °C.
  2. Rozcieńczyć surowiec rezazuryny w stosunku 1:50 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), aby uzyskać końcowe stężenie 20 μM.
  3. Przenieść cały roztwór planktonowy (pozostawiając biofilmy w studzienkach) ostrożnie, nie dotykając biofilmów ani nie tworząc pęcherzyków powietrza, na oddzielną, czystą 96-dołkową płytkę za pomocą wielokanałowej pipety.
  4. Przemyć biofilmy raz sterylnym PBS, dodając 200 μl na studzienkę, a następnie ostrożnie usunąć za pomocą pipety wielokanałowej.
  5. Dodać 200 μl rozcieńczonej resazuryny do dołka płytki biofilmu za pomocą pipety wielokanałowej.
  6. Inkubować w ciemności, w temperaturze pokojowej (RT) i 200 obr./min, wstrząsając przez około 20 minut, aż niepoddane działaniu biofilmu kontrole staną się równomiernie różowe.
  7. Zmierzyć fluorescencję przy λexc = 560 nm i λem = 590 nm za pomocą czytnika płytek (odczyt górny).

4. Protokół barwienia fioletem krystalicznym do ilościowego oznaczania biomasy biofilmów przy użyciu tej samej płytki, co w kroku 3

  1. Ostrożnie usuń plamę z rezazuryny ze studzienek za pomocą pipety wielokanałowej.
  2. Utrwalić biofilmy za pomocą 200 μl metanolu przez 15 minut.
  3. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.
  4. Dodać 190 μl 0,02% (obj./obj., rozcieńczonego w wodzie dejonizowanej) roztworu fioletu krystalicznego, ostrożnie używając pipety wielokanałowej. Podczas pipetowania należy unikać dotykania boków studzienek plamą i zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków powietrza, nie naciskając pipety w celu całkowitego wydmuchania.
  5. Inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Ostrożnie usuń plamę za pomocą pipety wielokanałowej.
  7. Umyj go dwukrotnie wodą dejonizowaną (za każdym razem 200 μl).
  8. Pozostaw studzienki do wyschnięcia na 5 minut w temperaturze pokojowej i rozpuść pozostałą plamę w 96% etanolu lub 33% kwasie octowym.
  9. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i odczytać absorbancję przy długości fali 595 nm.

5. Ocena bakteriobójczego wpływu na bakterie planktonowe przy użyciu tej samej płytki próbki, co w przypadku biofilmów

  1. Zmierzyć zmętnienie płytki przy długości fali 595 nm roztworem planktonu z 3.3.
  2. Zabarwić bakterie planktonowe resazuryną, dodając 10 μl zapasu rezazuryny na studzienkę. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
  3. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez około 5 minut, aż niepoddane działaniu substancji kontrolki staną się równomiernie różowe.
  4. Zmierzyć fluorescencję przy λexc = 560 nm i λem = 590 nm.

6. Barwienie aglutyniny z kiełków pszenicy do kwantyfikacji matrycy i obrazowania biofilmów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Kwantyfikacja matrycowa
    1. Przygotować roztwór 5 μg/ml sondy WGA w sterylnym PBS.
    2. Do tego barwienia należy użyć równoległej płytki próbki. Usunąć roztwór planktonu ze studzienek i przemyć raz sterylnym PBS (200 μl na studzienkę), ostrożnie używając pipety wielokanałowej, nie dotykając biofilmów.
    3. Dodać 200 μl roztworu WGA na dołek do barwienia.
    4. Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
    5. Usunąć niezwiązaną plamę, myjąc studzienki trzykrotnie 200 μl PBS.
    6. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na 15 minut w temperaturze suchej smości.
    7. Związaną plamę rozpuścić w 33% kwasie octowym, używając 200 μl na studzienkę.
    8. Uszczelnij studzienki nakrętkami paskowymi i poddaj je sonikacji za pomocą sonikatora w łaźni wodnej przez 30 sekund przy częstotliwości RT i 40 kHz.
    9. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    10. Powtórz krok sonikacji. Studzienki mogą pozostać zamknięte pomiędzy etapami sonikacji.
    11. Zmierzyć fluorescencję przy λex = 495 nm i λem = 520 nm za pomocą czytnika płytek (odczyt górny).
  2. Wizualizacja matrycy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
    1. Użyj tego samego protokołu, co powyżej, aż do kroku 6.1.6.
    2. Po etapie suszenia uwidocznić próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, używając filtra FITC (lub innego odpowiedniego zielonego filtra wzbudzenia).

7. Barwienie żywych i martwych komórek w biofilmach do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i kwantyfikacja sygnału dla stosunku zieleni do czerwieni (G/R)

  1. Obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
    1. Przygotuj roztwór każdej sondy (jedna barwi żywe komórki, a druga barwi martwe komórki), zgodnie z wytycznymi producenta.
    2. Usunąć roztwór planktonu ze studzienek i przemyć raz sterylnym PBS (200 μl na studzienkę) za pomocą pipety wielokanałowej.
    3. Dodać 6 μl roztworu barwiącego do studzienki.
    4. Inkubować płytkę w ciemności przez 15 minut.
    5. Przed badaniem mikroskopowym należy ręcznie usunąć nadmiar płynu za pomocą pipety wielokanałowej.
    6. Uchwyć obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, używając na przykład filtra FITC (dla zielonej fluorescencji, żywych komórek) lub filtra TRITC (czerwona fluorescencja, martwe komórki).
  2. Kwantyfikacja sygnału jako stosunek fluorescencji zielonej do czerwonej (G/R)
    1. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem, co w krokach 7.1.1 i 7.1.2.
    2. Dodać 200 μl roztworu barwiącego do dołka i inkubować je przez 15 minut w ciemności.
    3. Zmierz fluorescencję za pomocą czytnika płytek przy długościach fal wzbudzenia/emisji 485/535 nm i 485/635 odpowiednio dla fluorescencji zielonej i czerwonej (odczyt u góry).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W proponowanej platformie ilościowo określono wpływ na żywotność, biomasę oraz macierz biofilmu. W sekwencji roboczej (Rycina 1) jedną płytkę z próbkami barwi się rezazuryną, a następnie fioletem krystalicznym, aby jednocześnie ocenić wpływ na żywotność biofilmu bakteryjnego oraz na całkowitą biomasę biofilmu. Oba testy można wykonać następująco po sobie na tej samej płytce, ponieważ wcześniej wykazano, że pierwsze barwienie rezazuryną nie miało statystycznie istotnego wp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nie ma jednej metody, która mogłaby jednocześnie mierzyć wpływ związku na żywotność, biomasę i matrycę biofilmu. W związku z tym istnieje potrzeba łączenia testów w celu wykrycia wpływu na trzy punkty końcowe, najlepiej na pierwotnym etapie badań przesiewowych.

Rezazuryna to bardzo prosty protokół barwienia składający się jedynie z dodania sondy redoks. Jednak ustalenie optymalnego czasu inkubacji biofilmów za pomocą resazuryny ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego testu. W niektórych szcz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują profesorowi Paulowi Cosowi i LMPH, University of Antwerp, Belgia za wsparcie podczas procesu filmowania w jego laboratorium. Praca ta została sfinansowana w ramach projektów Akademii Fińskiej (projekty 272266 i 282981) oraz Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finland. Docenia się wkład techniczny mgr inż. Janni Kujala.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ResazurinSigma AldrichR7017
Kryształowy fioletSigma AldrichHT90132 
Kiełki pszenicy Agglutynina, Alexa Fluor 488 SprzężonyThermo Fisher ScientificW11261
ŻYWY/MARTWY BacLight Sondy molekularneL7012SYTO 9 do barwienia żywotnych komórek na zielono i jodek propidyny do barwienia martwych komórek na czerwono
Sól fizjologiczna buforowana
Tryptonowy agar sojowyLab M, NeogenLAB011
Bulion sojowy tryptynowyLab M, NeogenLAB004
F96 Płytka studzienkowa Polistyren sterylny przezroczysty płaskie dnoThermo Fisher Scientific161093
MARKOWE nakrętki, paski 8Sigma AldrichBR781413-300EA
Wanna ultradźwiękowa z serii Branson CPXSigma AldrichZ769428-1EA
MultipipetteDozownik Thermo Fisher Scientific
MultidropThermo Fisher Scientific
Biomek 3000Beckman Coulter
Czytnik wielopłytkowy Varioskan FlashThermo Fisher Scientific
Staphylococcus aureusATCC Numer katalogowy: 25923
fosforanem

Bibliografia

  1. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  2. Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
  3. Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
  4. Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
  5. Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
  6. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
  7. Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
  8. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
  9. Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
  10. Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
  11. Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
  12. Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
  13. Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
  14. Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
  15. Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663(2016).
  16. Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
  17. Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
  18. Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
  19. Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
  20. Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
  21. Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
  22. Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
  23. Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
  24. Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
  25. Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
  26. Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
  27. Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
  28. Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
  29. Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
  30. Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
  31. Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
  32. Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
  33. Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
  34. Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
  35. Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
  36. Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
  37. Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Żywotność biofilmubarwienie fioletem krystalicznymbarwienie rezazurynąfluorescencja WGAStaphylococcus aureusprzesiewanie związków naturalnychanaliza macierzy biofilmuprzesiewanie biblioteki chemicznejmikroskopia fluorescencyjna
Platforma testów antybiofilmowych dostosowana do eksploracji bibliotek związków naturalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.