Udar noworodkowy jest istotną przyczyną wczesnego uszkodzenia mózgu, wymagającym modelu translacyjnego ze spójnymi wzorcami urazów ogniskowych i wysoką odtwarzalnością, aby umożliwić badanie. W pracy opisano szczegółową procedurę chirurgiczną mającą na celu stworzenie niekrwotocznego, jednostronnego ogniskowego uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego u gryzoni o długości równoważnej.
Artykuł metodologiczny
Przemijający model niedrożności tętnicy środkowej mózgu udaru noworodka u szczurów P10
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wiele modeli zwierzęcych zostało wykorzystanych do badania uszkodzeń niedotlenieniowo-niedokrwiennych, urazów, globalnego niedotlenienia lub trwałego niedokrwienia zarówno w niedojrzałym, jak i dojrzałym mózgu. Udar mózgu występuje powszechnie w okresie okołoporodowym u ludzi, a przemijające niedokrwienie-reperfuzja jest najczęstszą formą udaru u noworodków. Faza reperfuzji jest krytycznym elementem progresji urazu, która występuje w okresie od kilku dni do tygodni, oraz endogennej odpowiedzi na uraz. Ten szczurzy model przejściowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (tMCAO) w dniu poporodowym 10 (p10) tworzy jednostronne, niekrwotoczne ogniskowe uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne, które można wykorzystać do badania mechanizmów uszkodzenia ogniskowego i naprawy w mózgu równoważnym w pełnym terminie. Wzorzec urazu, który jest wytwarzany przez tMCAO, jest spójny i wysoce powtarzalny i można go potwierdzić za pomocą rezonansu magnetycznego lub analiz histologicznych. Ciężkością urazu można manipulować poprzez zmiany czasu okluzji i inne metody, które zostaną omówione.
Wprowadzenie
Udar mózgu w okresie noworodkowym jest istotną przyczyną śmierci i niepełnosprawności, występującą aż u 1 na 2 300 żywych urodzeń1. Prowadzi to do zmiany rozwoju ośrodkowego układu nerwowego i zwiększonej długoterminowej zachorowalności, w tym zwiększonej częstości występowania padaczki, porażenia mózgowego, upośledzenia umysłowego i innych rodzajów dysfunkcji motorycznych lub poznawczych. Trwające całe życie skutki wczesnego udaru mózgu sprawiają, że translacyjne modele zwierzęce są niezbędne do badania mechanizmów urazów i napraw w tej populacji, w tym strategii ochrony uszkodzonego mózgu lub poprawy naprawy.
Różne modele niedokrwienia były używane do badania uszkodzeń mózgu u dorosłych zwierząt, i podczas gdy procedura Rice-Vannucci (Modified Levine)2 jest powszechnie stosowana do badania uszkodzeń niedotlenieniowo-niedokrwiennych w rozwijającym się mózgu, ogniskowe niedokrwienie-reperfuzja jest odrębnym mechanizmem urazu powodującego uraz ogniskowy, z uszkodzonym rdzeniem i półcieniem oraz nieuszkodzoną tkanką zdalną. Modele Koizumi3 i Longa4 zostały opracowane u dorosłych szczurów w celu uzyskania przejściowej niedrożności tętnicy środkowej mózgu poprzez odpowiednio tętnicę szyjną wspólną (CCA) i tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA). W obu modelach trwałe podwiązanie i kauteryzacja gałęzi tętnic są ważne w celu zminimalizowania krwawienia i usprawnienia zabiegu chirurgicznego, co również ma niekorzystny wpływ na zdolność zwierzęcia do karmienia i przybierania na wadze po urazie. Co więcej, w niedojrzałym mózgu istnieją wyraźne mechanizmy urazów i w rezultacie obserwuje się określone wzorce urazów.
Ostatnio do badania udaru u noworodków i dorosłych wykorzystano udar fotozakrzepowy (metoda Róży-Bengalu)5 i stałe podwiązanie MCA6. Zarówno udar fotozakrzepowy, jak i podwiązanie MCA powodują trwałe zmiany w przepływie krwi w mózgu, które skutkują brakiem reperfuzji. Reperfuzja jest kluczowym elementem rozwoju i progresji uszkodzenia ogniskowego, ze zwiększoną ekscytotoksycznością, tworzeniem wolnych rodników i produkcją tlenku azotu prowadzącą do opóźnionej śmierci komórki, która obejmuje kaskady sygnalizacyjne, które różnią się od fazy niedokrwiennej7. Niedotlenienie-niedokrwienie polega na trwałym jednostronnym podwiązaniu tętnicy szyjnej, po którym następuje globalne niedotlenienie, które również różni się od przyczyny uszkodzenia niedotlenieniowo-niedokrwiennego u ludzi i nie powoduje spójnego wzorca urazu ogniskowego, co utrudnia badanie uszkodzonego rdzenia i półcienia.
Wcześniej opisaliśmy model niekrwotocznego udaru niedokrwienno-reperfuzyjnego u niedojrzałego szczura przy użyciu przejściowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO)8,9,10. Jest to mniej inwazyjna metoda, która uzyskuje dostęp i zamyka MCA przez tętnicę szyjną wewnętrzną bez trwałego podwiązania lub kauteryzacji. W ten sposób otrzymujemy model urazu podobny do najczęstszej przyczyny udaru mózgu w okresie okołoporodowym11,12. Ten niedokrwienno-reperfuzyjny model urazu powoduje uszkodzenie ipsilateralnego prążkowia i kory ciemieniowo-skroniowej. Ten model tMCAO pozwala również na kontrolę ciężkości urazu poprzez zmianę czasu trwania okluzji. Badanie szlaków sygnałowych i zmian histologicznych w uszkodzonym rdzeniu i półcieniu oraz w nieuszkodzonej tkance ipsilateralnej i przeciwległej może dokładniej wyjaśnić mechanizmy uszkodzenia i naprawy w niedojrzałym mózgu. To badanie zademonstruje ten ważny model uszkodzenia dla rozwijającego się mózgu.
Protokół
Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Badań na Zwierzętach Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Departament Zdrowia i Opieki Społecznej USA, publikacja nr 85-23, 1985). Zwierzęta były ściśle monitorowane przez weterynarzy z UCSF Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), akredytowanych przez AAALAC. Pozyskano jedną samicę szczura rasy Sprague-Dawley z 8-dniowym miotem (10 młodych w miocie). Matce i jej szczeniętom podawano jedzenie i wodę ad libitum i umieszczano je w placówce opieki nad zwierzętami o kontrolowanej temperaturze i świetle z codziennym wzbogacaniem, zgodnie z protokołem IACUC, aż do ukończenia przez szczenięta 10 dni. Wszystkie narzędzia chirurgiczne użyte w tej procedurze zostały zautoklawowane w celu zapewnienia sterylności. Sterylność końcówek narzędzi jest utrzymywana przez cały czas trwania zabiegu.
1. Niedrożność tętnicy środkowej mózgu
- Zważ szczeniaka i upewnij się, że ma odpowiednią wagę (19-21 g). Znieczulij szczenię 3% izofluranem w 100%O2 i upewnij się, że nie ma reakcji na uszczypnięcie stopy. Utrzymuj temperaturę powierzchni ciała w zakresie od 35,5 °C do 37 °C za pomocą poduszki grzewczej pod sceną chirurgiczną.
- Zabezpiecz zwierzę w pozycji leżącej taśmą w poprzek ramion. Za pomocą sterylnych wacików bawełnianych przetrzyj przedni obszar szyjki macicy roztworem jodu powidonu, a następnie wacik z 70% etanolu w podwójnie destylowanej wodzie, naprzemiennie między każdym roztworem w sumie cztery waciki.
- Miejscowo naciekać 0,25% bupiwakainy do planowanego miejsca nacięcia. Za pomocą stereoskopu wykonaj nacięcie przedniej części szyjki macicy w linii środkowej od 5 do 7 mm, aby odsłonić tętnicę szyjną wspólną (CCA). Umieść 2-4 retraktory, aby ubytek był otwarty, a tętnica odsłonięta.
- Zlokalizuj tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA), tętnicę potyliczną (OA) i tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA). Zadbaj o tętnice, aby uzyskać wyraźny widok. Uważaj, aby nie naruszyć nerwu błędnego.
UWAGA: W przypadku szczeniąt operowanych pozorowanych nacięcie pozostawia się otwarte, a tętnice są odsłonięte, po czym nacięcie jest zszywane zamykane. Całkowity czas znieczulenia jest równy czasowi operacji okluzji. - Wytnij 1,5 cm jedwabnej nici do szycia 6-0 z jedwabiu. Rozpleć szew, wyciągając pojedyncze pasma. Upewnij się, że pojedyncze pasma są schludne i nie są postrzępione.
UWAGA: W razie potrzeby wygładź postrzępione końcówki, zanurzając pojedyncze pasmo w sterylnej wodzie i pielęgnując pasmo końcówkami kleszczyków. - Trzymając pasmo szwu kleszczami pod kątem 45 stopni, przesuwaj kleszcze szerokim ruchem łukowym, aby przejść pod ICA, tak aby końcówki kleszczy wyłoniły się między ICA a OA.
UWAGA: Jeśli sekcja zostanie wykonana dobrze, ten krok będzie stosunkowo łatwy. Jeśli ICA i choroba zwyrodnieniowa stawów stykają się, należy uważać, aby nie pęknąć tętnic podczas używania kleszczy do izolowania ICA. Jeśli wystąpi krwawienie, uciskaj tętnicę kleszczami, aż krwawienie ustanie. Wchłonąć krew sterylnym wacikiem. - Chwyć koniec pasma szwu, który jest przytrzymywany przez kleszcze i pociągnij go tak, aby koniec był łatwo dostępny. Zwolnij pasmo z kleszczy i wycofaj kleszcze spod ICA, odwracając ruch w kroku 1.5 (Rysunek 1A).
- Zawiąż tymczasową ligaturę wokół ICA u podstawy, najbliżej miejsca, w którym oddziela się od CCA.
UWAGA: Ważne jest, aby zawiązać węzeł tak, aby koniec pasma, które zostanie pociągnięte w celu usunięcia węzła, był wystarczająco długi (większy niż 1 mm, mniej niż 3 mm), aby można go było łatwo chwycić kleszczami, upewniając się, że po drugiej stronie węzła znajduje się odpowiednia ilość pasma szwu do zwinięcia. - Ostrożnie schuj ICA na boki i użyj klipsa, aby przymocować pasmo do nadmiaru skóry w pobliżu okolicy pachy po stronie przeciwnej do nacięcia. Upewnij się, że to cofające się pasmo jest wystarczająco napięte, aby zatrzymać przepływ krwi przed przejściem do następnego kroku, aby zminimalizować ryzyko niekontrolowanego krwawienia. Zauważ, że tętnica jest płaska i blada.
UWAGA: Nie chowaj się nadmiernie, ponieważ może to spowodować częściowe lub całkowite rozdarcie ICA. Wycofanie można regulować tuż przed wykonaniem arteriotomii, pociągając za pasmo po stronie przeciwnej do klipsa. - Użyj kleszczy pod kątem 45°, aby chwycić kolejne nieplecione pasmo szwu i owinąć je pod i wokół ICA, jak w kroku 1.5. Ustaw to pasmo bocznie do pasma wciągającego (Rysunek 1B).
UWAGA: Ten krok można również wykonać przed wycofaniem. Jeśli nie masz pewności co do jakości zwijania, ten węzeł można bardzo luźno zawiązać przed następnym krokiem. - Wytnij arteriotomię 0,2 mm w połowie odległości między zawiązanymi i niezwiązanymi więzadłami, błądząc bliżej zawiązanej ligatury.
UWAGA: Krew pozostała w zawiązanej tętnicy może opróżnić się przez arteriotomię, ale nie powinna przekraczać 5 μl. Jeśli krwawienie utrzymuje się, ostrożnie pociągnij pasmo retrakcji, aby zwiększyć retrakcję, uważając, aby uniknąć uszkodzenia tętnicy z powodu nadmiernego napięcia. - Za pomocą linijki metrycznej zmierz szew okluzyjny i przetnij szew z dodatkowym naddatkiem 2-3 mm na usunięcie okludera podczas reperfuzji. Przytrzymaj okluder kleszczami pod kątem 45 stopni i użyj prostych kleszczy, aby utworzyć zgięcie na odpowiedniej długości, aby dotrzeć do MCA, wyznaczając punkt zatrzymania dla postępu.
UWAGA: Długość okluzji 10 mm od końca silikonowej końcówki do zgięcia jest używana dla szczeniąt szczurów P10 Sprague Dawley lub Long Evans w tym zakresie wagowym. - Za pomocą kleszczy 45° wprowadź nylonowy szew okluzyjny pokryty silikonem do arteriotomii i przesuń szew do zgięcia, które wyznacza wcześniej ustaloną odległość do MCA (ryc. 1C). Upewnij się, że postęp jest płynny; Natychmiast zatrzymaj postęp, jeśli wyczujesz opór. Podczas przesuwania należy skierować szew w kierunku równoległym do CC/ECA, w kierunku głowy.
UWAGA: Jeśli szew jest wysunięty grzbietowo, w kierunku kręgosłupa zwierzęcia, może przebiegać do tętnicy skrzydłowo-podniebiennej (PTA). Jeśli opór jest odczuwalny po 3-5 mm posunięcia, szew uderzył w złącze PTA. Cofnij okluder z tętnicy, aż silikonowa głowica znajdzie się w pobliżu arteriotomii przed dostosowaniem kierunku postępu. Nie jest konieczne całkowite usunięcie okludera z arterionomii. - Zabezpiecz okluder, zawiązując tymczasową ligaturę, używając nici z kroku 1.10 (Rysunek 1D).
- Zdejmij zacisk zwijacza. Przytnij pasma obu tymczasowych ligatur tak, aby pasmo węzła, które jest ciągnięte w celu usunięcia węzła, było łatwe do uchwycenia prostymi kleszczami i było dłuższe niż pasmo ciągnięte w celu zaciśnięcia węzła.
UWAGA: Pasemka muszą być na tyle krótkie, aby po zamknięciu nie plątały się w jamie. - Usuń retraktory i zamknij ubytek za pomocą plecionego jedwabiu 6-0, aby utworzyć trzy do czterech przerwanych szwów.
- Wyjmij szczeniaka ze znieczulenia i umieść go na poduszce grzewczej w powietrzu w pomieszczeniu. Monitoruj młode, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżący mostek i upewnij się, że w pełni wyzdrowiało przed powrotem do matki. Upewnij się, że szczenię utrzymuje temperaturę powierzchni ciała w zakresie od 35,5 °C do 37 °C.
- Podczas okluzji można zastosować obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego ważonego dyfuzją (DW-MRI) w znieczuleniu izofluranem w celu sprawdzenia odpowiedniej indukcji urazu. Rycina 2 przedstawia trwające uszkodzenie niedokrwienne wykryte przez DW-MRI podczas tMCAO9.
UWAGA: Obrazowanie płaskie echa spinowego ważone dyfuzją wykonuje się 10-15 minut przed reperfuzją. Cały mózg jest obrazowany za pomocą szeregowych odcinków koronalnych o grubości 2 mm przy użyciu następujących ustawień sekwencji impulsów: TR/TE=5,000/60 ms, 4 średnie, pole widzenia = 35 mm, matryca danych = 128x128, czas trwania gradientu dyfuzji = 20 ms, separacja = 29,7 ms, amplituda = 70 mT/m i współczynnik b = 1,045 s/mm2. Wyklucza się zwierzęta wykazujące brak zajęcia kory mózgowej lub nietypowe uszkodzenie niedokrwienne, takie jak pień mózgu.
2. Reperfuzja
UWAGA: Okluzja jest wykonywana przez 3 godziny, aby spowodować umiarkowane do ciężkiego uszkodzenia obejmujące prążkowie i korę.
- Po około 2 godzinach i 50 minutach od zamknięcia MCA znieczulić szczenię 3% izofluranem w 100%O2. Utrzymuj temperaturę powierzchni ciała w zakresie od 35,5 °C do 37 °C za pomocą poduszki grzewczej pod sceną chirurgiczną.
- Usuń przerwane szwy z kroku 1.16 i zlokalizuj połączenie, które jest oznaczone przez dwie ligatury i końcowy koniec szwu okluzyjnego.
UWAGA: Zwierzęta operowane pozorami są indukowane i pozostają pod narkozą przez równoważny okres czasu jak zwierzęta poddane okluzji. Nacięcie jest ponownie otwierane i zszywane zamykane. W przypadku zwierząt poddanych pozorowanym operacjom należy przejść do kroku 2.11. - Ostrożnie rozwiąż najbardziej boczny węzeł zawiązany wcześniej w kroku 1.14, pociągając za dłuższe pasmo.
UWAGA: Jeśli występuje opór w rozwiązywaniu węzła, zatrzymaj się, aby upewnić się, że ciągnie się właściwe pasmo węzła. Jeśli opór będzie się utrzymywał, zwiększ powiększenie, aby uzyskać lepszy widok. Zachowaj ostrożność podczas rozwiązywania, ponieważ na tym etapie możliwe jest uszkodzenie tętnicy. - Usuń pasmo szwu z jamy brzusznej.
- Dokładnie po 3 godzinach od niedrożności MCA powoli wycofaj szew zamykający z tętnicy. Nie będzie oporu.
UWAGA: W większości przypadków nie wystąpi krwawienie. Jeśli wystąpi niewielka ilość krwawienia, należy przyłożyć ucisk do tętnicy w miejscu arteriotomii. - Użyj kleszczy, aby wywrzeć nacisk na arteriotomię, ponieważ następnym krokiem jest przywrócenie przepływu krwi ICA do reperfuzji.
- Ostrożnie rozwiąż węzeł przyśrodkowy, stosując tę samą metodę, co w kroku 2.3.
- Usuń pasmo szwu z ciała i nałóż środek hemostatyczny na arteriotomię, aby zatrzymać krwawienie.
- Upewnij się, że krwawienie zostało zatrzymane.
UWAGA: Powrót pierwotnego kształtu tętnicy i czerwonego koloru potwierdza, że przepływ krwi ICA został przywrócony. - Usuń retraktory i zamknij ubytek trzema lub czterema przerwanymi szwami z plecionego jedwabiu 6-0.
- Wyjmij szczeniaka ze znieczulenia i umieść go na poduszce grzewczej w powietrzu w pomieszczeniu. Monitoruj go, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżący mostek i zapewnić pełne wyzdrowienie przed powrotem do matki. Upewnij się, że szczenię utrzymuje temperaturę powierzchni ciała w zakresie od 35,5 °C do 37 °C.
- Sprawdzaj szczenięta codziennie przez 5 dni. Zrewiduj ich wagę i dokładnie sprawdź miejsca nacięć pod kątem prawidłowego gojenia. Zdejmij szwy po 7-14 dniach. W razie potrzeby uraz po tMCAO można zobrazować za pomocą rezonansu magnetycznego9.
UWAGA: Zwierzęta mogą stracić do 1 g masy ciała pierwszego dnia, ale zazwyczaj odzyskują wagę bez interwencji i znajdują się w podobnym zakresie wagowym jak grupa kontrolna do 4-5 dni. Rzadko szczenię może stracić nadmierną wagę lub mieć trudności z karmieniem, co wymaga doustnego karmienia przez zgłębnik przez 2-3 dni. - W P21 uraz można wiarygodnie ocenić za pomocą sensomotorycznych testów behawioralnych, takich jak rotarod lub wychowywanie cylindryczne. Testy kognitywne można przeprowadzić już w wieku 4-6 tygodni za pomocą ocen, takich jak rozpoznawanie nowych obiektów lub labirynt wodny Morris13.
- Poddać szczury eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie Euthasolu (50 mg/kg) w celu pobrania mózgu11,12.
- Analizę histologiczną w celu oceny objętości urazu lub odpowiedzi na interwencje można przeprowadzić za pomocą fioletu krezylowego lub barwienia H&E (ryc. 3)10.
Wyniki
Stopień nasilenia uszkodzenia spowodowanego tMCAO jest w dużym stopniu zależny zarówno od czasu okluzji, jak i doświadczenia chirurga. Okluzja trwająca 90 min często powoduje lekki do umiarkowanego obraz uszkodzenia, podczas gdy 3 h powoduje uszkodzenie od umiarkowanego do ciężkiego. Stopień nasilenia uszkodzenia można ocenić za pomocą różnych metod, w tym MRI, histologii lub krótkoterminowych i długoterminowych analiz behawioralnych. Rycina 2 przedstawia przykład DW-MRI wykonanego w 75. minucie 90-minutowej okluzji, potwierdzający uszkodzenie niedokrwienne obejmujące półkulę ipsilateralną. Obrazowanie dyfuzyjne wykazuje zwiększoną dyfuzję w prążkowiu ipsilateralnym oraz w większości kory ipsilateralnej, bez zmian po stronie kontralateralnej, podczas ostrej fazy niedokrwienia. Koreluje to z umiarkowanym stopniem długoterminowego uszkodzenia obejmującego zarówno korę, jak i głęboką istotę szarą.
Zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (MCA) prowadzi do śmierci komórek, która w przypadku mniej nasilonych uszkodzeń rozpoczyna się w prążkowiu, a przy dłuższym czasie okluzji i cięższym przebiegu urazu rozwija się w postaci pogarszających się uszkodzeń kory i hipokampa. Podczas optymalizacji techniki chirurgicznej, np. w celu ustalenia długości wprowadzanego szwu, wysoce zalecane jest zastosowanie MRI, ponieważ pozwala ono na potwierdzenie prawidłowego umieszczenia szwu oraz wizualizację obrzęku i postępu uszkodzeń podczas okluzji14,15,16. W przypadku braku dostępu do MRI, barwienie H&E lub fioletem krezylowym stanowią proste i niezawodne metody histologiczne pozwalające określić morfologię uszkodzeń, które mogą być stosowane zarówno we wczesnych, jak i późnych punktach czasowych po tMCAO. Rycina 3 przedstawia obraz uszkodzenia o nasileniu od umiarkowanego do ciężkiego w badaniu histopatologicznym po 3-godzinnej okluzji, wykazując tworzenie się torbieli oraz ich objętość w prążkowiu i korze po stronie ipsilateralnej.
Obiektywna kwantyfikacja stereologiczna przekrojów barwionych fioletem krezylowym w celu obliczenia stosunku objętości półkuli ipsilateralnej do kontralateralnej potwierdza wystąpienie ipsilateralnego uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego. W szczególności, po znieczuleniu zwierzęcia preparatem Euthasol, mózg pobrano poprzez perfuzję transkardialną w 0,1 M PBS z 4% paraformaldehydem. Po całonocnej postfiksacji i równoważeniu w 30% sacharozie, cały mózg pocięto w odstępach 50 µm, a co dwunasty przekrój wybrano, zamocowano i zabarwiono fioletem krezylowym10.
Nawet przy łagodnym urazie w okresie okluzji odnotowuje się zmiany lokomotoryczne, takie jak krążenie i hemipareza. W przypadku cięższego urazu zmiany te utrzymują się po reperfuzji. Do oceny stopnia ciężkości urazu można wykorzystać dodatkowe testy behawioralne, w tym test rotarod lub test w cylinderze (cylinder rearing test) do oceny funkcji sensoromotorycznych oraz wodny labirynt Morrisa do oceny funkcji poznawczych13.
Rycina 1: Zdjęcia śródoperacyjne procedury tMCAO. (A) Pierwszy fragment nici zostaje zapętlony wokół ICA, zgodnie ze szczegółami w kroku 1.6. (B) Pierwsza tymczasowa ligatura zostaje zawiązana, a ICA odciągnięta. Drugi fragment nici zostaje zapętlony wokół ICA, bocznie w stosunku do pierwszego fragmentu nici, zgodnie ze szczegółami w kroku 1.9. (C) Nitka okluzyjna pokryta silikonem zostaje wprowadzona do miejsca arteriotomii, zgodnie ze szczegółami w kroku 1.12. (D) Druga tymczasowa ligatura zostaje zawiązana, aby unieruchomić okluder w miejscu, zgodnie ze szczegółami w kroku 1.14. Pasek skali = 1 mm.
Rycina 2: MRI podczas okluzji wykazuje odpowiednie jednostronne uszkodzenie.Przekroje obrazów w płaszczyźnie czołowej (od przodu do tyłu) wykonanego DW-MRI podczas 90 min okluzji wykazują zwiększoną dyfuzję w półkuli ipsilateralnej (strzałki), co jest zgodne z postępującym uszkodzeniem niedokrwiennym w fazie ostrej. Przedrukowano za zgodą czasopisma Stroke11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Jednostronne uszkodzenie obejmujące prążkowie i korę 4 tygodnie po tMCAO. Przekroje czołowe mózgu barwione fioletem krezylowym (każdy o grubości 50 µm), pobrane od zwierząt w wieku P38 i przedstawione od strony tylnej do przedniej, wykazują dość rozległe uszkodzenie (strzałki wskazują tworzenie się torbieli po stronie ipsilateralnej oraz zmniejszenie objętości kory i prążkowia) po 3 h tMCAO w wieku P10. Okrągły otwór po lewej stronie stanowi znacznik półkuli kontralateralnej. Pasek skali = 5 mm. Przedrukowano za zgodą Neurobiology of Disease12. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Krytyczne kroki w ramach protokołu
Po pierwsze, ważne jest, aby utrzymać normotermię od rozpoczęcia znieczulenia do pełnego wyzdrowienia, ponieważ znany jest wpływ zarównohipotermii17, jak i hipertermii18 na postęp uszkodzenia mózgu zarówno u niedojrzałych, jak i dojrzałych zwierząt. Po drugie, podczas zabezpieczania zwierzęcia i cofania nacięcia niezbędne jest optymalne ustawienie w celu monitorowania oddechu i zapewnienia, że tchawica jest wolna od ucisku. Po trzecie, unikaj ściskania lub rozciągania nerwu błędnego, ponieważ może to spowodować zmiany w częstości akcji serca przy stymulacji nerwu błędnego. Po czwarte, ponieważ wycofanie ICA jest konieczne do opanowania krwawienia podczas arterionomii, należy zwrócić uwagę na stopień napięcia podczas retrakcji, aby uniknąć uszkodzenia tętnicy. Jeśli tętnica pęknie w wyniku retrakcji lub jeśli nastąpi słabe nacięcie arteriotomii, zwierzę powinno zostać wykluczone z analizy ze względu na ryzyko krwotoku i słabej reperfuzji.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Korzystając z MRI jako przewodnika, długość szwu można zoptymalizować, aby zapewnić, że silikonowa końcówka prawidłowo zamyka MCA, tworząc ogniskowe niedokrwienie. Jeśli rezonans magnetyczny nie jest dostępny, młode mogą zostać poddane eutanazji przed reperfuzją w celu przeprowadzenia sekcji, aby uwidocznić umieszczenie szwu. W razie potrzeby dostosuj długość szwu. Waga szczeniąt jest silnie skorelowana z wymaganiami dotyczącymi długości szwów okluzyjnych. Czas okluzji można modyfikować, aby dostosować stopień ciężkości urazu.
Ponadto kształt i długość szwu mają kluczowe znaczenie. Z naszego doświadczenia wynika, że dla szczurów P10 Sprague-Dawley i Long Evans o wadze 19-21 g, optymalna długość wprowadzenia wynosi 10 mm. Dalsze wprowadzenie szwu okluzyjnego może skutkować perforacją MCA. Co więcej, spójność w kształcie włókna okluzyjnego w każdej operacji spowoduje zwiększenie spójności wzorca urazu19,20. Z tego powodu zalecamy stosowanie profesjonalnie wykonanych szwów do tego konkretnego celu. Ważne jest również, aby pamiętać, że wzorzec kontuzji może się różnić między praktykującymi z powodu pozornie drobnych różnic w technice.
Ograniczenia techniki
Wykonanie tej techniki u małego, rozwijającego się gryzonia wymaga znacznego doświadczenia. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, chirurg jest w stanie spowodować bardzo spójny wzorzec urazów u zwierząt o różnych rozmiarach i osiągnąć wskaźnik przeżycia większy niż 95%. Ponadto niezbędne są odpowiednie narzędzia chirurgiczne. Narzędzia chirurgiczne muszą być dobrze utrzymane, aby zapewnić, że wszystkie końcówki narzędzi są prawidłowo przybliżone.
Znaczenie tej techniki w odniesieniu do istniejących lub alternatywnych metod
Podczas gdy niedotlenienie-niedokrwienie lub model Rice'a-Vannucciego2 jest najczęściej stosowany do badania uszkodzenia niedotlenieniowo-niedokrwiennego w rozwijającym się mózgu, ważne jest, aby zauważyć, że ten model tMCAO różni się od HI tym, że występuje przejściowe ogniskowe niedokrwienie bez globalnego niedotlenienia, po którym następuje faza reperfuzji, gdy przeszkoda zostaje usunięta i przywrócony jest przepływ krwi. Powoduje to bardziej spójny i powtarzalny uraz i jest bardziej translacyjny klinicznie, powodując wzorzec urazu podobny do tego, który obserwuje się w donoszonym udarze noworodkowym. Umożliwia to badanie wzorców urazów ogniskowych i reakcji kompensacyjnych w nieuszkodzonej tkance.
Przyszłe zastosowania po opanowaniu tej techniki
Model ten jest podobny do najczęstszej przyczyny udaru mózgu u noworodków, przemijającej zakrzepy okluzyjnej, która występuje w okresie okołoporodowym11,21. Etiologia nie jest do końca jasna i najprawdopodobniej jest wieloczynnikowa, ale przypuszcza się, że w większości przypadków wynika z przejścia zatoru z łożyska11. Ponadto u wielu noworodków z podejrzeniem udaru okołoporodowego często występuje późniejsza aktywność napadowa lub subtelne ogniskowe nieprawidłowości w badaniu neurologicznym22. To sprawia, że kluczowe znaczenie ma zastosowanie spójnego, translacyjnego modelu urazu w celu identyfikacji mechanizmów progresji urazu i możliwych strategii terapeutycznych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Finansowanie zostało zapewnione przez granty NIH K08 NS064094 i UCSF REAC. Autorzy pragną podziękować Nikicie Derguinowi, Zinalda Vexler i Joelowi Faustino za ich pomoc w rozwoju tej techniki.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Izoflouran | Henry Schein | 50033 | środek znieczulający, w stężeniu 3% |
| Trójokularowy Surgioskop | Świat Instrumenty precyzyjne | PSMT5N | |
| Poduszka grzewcza | Sunbeam | 000731-500-000 | niskie i średnie ustawienie |
| Termometr na podczerwień | Extech Instruments | 72-5270 | |
| Zestaw do wciągania dla małych zwierząt | Narzędzia do nauki pięknej | 18200-20 | |
| Nożyczki CermaCut | Narzędzia do nauki pięknej | 14958-09 | |
| Kleszcze do #5SF Dumont | Narzędzia do nauki pięknej | 112522-00 | 2x |
| Kleszcze Dumont #5/45 | Narzędzia do nauki o naprawie | 11251-35 | 2x |
| B-2 Micro Clamp | Narzędzia do nauki o | 00398-02 | |
| Uchwyty do aplikacji zacisków | Fine Science Tools | 00072-14 | |
| Nożyczki Micro Vannas | Narzędzia do nauki o naprawie | 15000-03 | Szwy |
| okluzyjne | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
| Linijka | Narzędzia | ||
| Środek hemostatyczny | Avitene | DVL1010590 | |
| 6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSheture | Ethicon | 769G | |
| Euthasol | Virbac | 710101 | 0,22 mL/kg |
| Aplikatory z końcówką bawełnianą | Henry Schein | 100-9249 | |
| Taśma laboratoryjna | VWR | 89097-990 |
Bibliografia
- Grunt, S., et al. Incidence and outcomes of symptomatic neonatal arterial ischemic stroke. Pediatrics. 135 (5), 1220-1228 (2015).
- Rice, J. E., Vannucci 3rd, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8 (8), (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. J Vis Exp. (76), (2013).
- Renolleau, S., Aggoun-Zouaoui, D., Ben-Ari, Y., Charriaut-Marlangue, C. A model of transient unilateral focal ischemia with reperfusion in the P7 neonatal rat: morphological changes indicative of apoptosis. Stroke. 29 (7), 1454-1460 (1998).
- Perlman, J. M. Intervention strategies for neonatal hypoxic-ischemic cerebral injury. Clin Ther. 28 (9), 1353-1365 (2006).
- Derugin, N., Ferriero, D. M., Vexler, Z. S. Neonatal reversible focal cerebral ischemia: a new model. Neurosci Res. 32 (4), 349-353 (1998).
- Gonzalez, F. F., et al. Erythropoietin increases neurogenesis and oligodendrogliosis of subventricular zone precursor cells after neonatal stroke. Stroke. 44 (3), 753-758 (2013).
- Larpthaveesarp, A., Georgevits, M., Ferriero, D. M., Gonzalez, F. F. Delayed erythropoietin therapy improves histological and behavioral outcomes after transient neonatal stroke. Neurobiol Dis. , (2016).
- Rutherford, M. A., Ramenghi, L. A., Cowan, F. M. Neonatal stroke. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 97 (5), 377-384 (2012).
- van der Aa, N. E., Benders, M. J., Groenendaal, F., de Vries, L. S. Neonatal stroke: a review of the current evidence on epidemiology, pathogenesis, diagnostics and therapeutic options. Acta Paediatr. 103 (4), 356-364 (2014).
- Gonzalez, F. F., et al. Erythropoietin sustains cognitive function and brain volume after neonatal stroke. Dev Neurosci. 31 (5), 403-411 (2009).
- Dudink, J., et al. Evolution of unilateral perinatal arterial ischemic stroke on conventional and diffusion-weighted MR imaging. AJNR Am J Neuroradiol. 30 (5), 998-1004 (2009).
- Derugin, N., et al. Magnetic resonance imaging as a surrogate measure for histological sub-chronic endpoint in a neonatal rat stroke model. Brain Res. 1066 (1-2), 46-56 (2005).
- Dzietko, M., Wendland, M., Derugin, N., Ferriero, D. M., Vexler, Z. S. Magnetic resonance imaging (MRI) as a translational tool for the study of neonatal stroke. J Child Neurol. 26 (9), 1145-1153 (2011).
- Mancuso, A., Derugin, N., Hara, K., Sharp, F. R., Weinstein, P. R. Mild hypothermia decreases the incidence of transient ADC reduction detected with diffusion MRI and expression of c-fos and hsp70 mRNA during acute focal ischemia in rats. Brain Res. 887 (1), 34-45 (2000).
- Kasdorf, E., Hyperthermia Perlman, J. M. Inflammation, and Perinatal Brain Injury. Pediatric Neurology. 49 (1), 8-14 (2013).
- Bouley, J., Fisher, M., Henninger, N. Comparison between coated vs. uncoated suture middle cerebral artery occlusion in the rat as assessed by perfusion/diffusion weighted imaging. Neurosci Lett. 412 (3), 185-190 (2007).
- Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 161-165 (2006).
- Kirton, A., deVeber, G. Paediatric stroke: pressing issues and promising directions. Lancet Neurol. 14 (1), 92-102 (2015).
- Nelson, K. B. Perinatal ischemic stroke. Stroke. 38, 742-745 (2007).
Przedruki i uprawnienia
