Model wstawiania żył: odpowiedni model do badania drożności przeszczepu bypassów

Summary

Ten film demonstruje model do badania rozwoju przerostu mięśniowo-wewnętrznego, po operacji wstawiania żył u szczurów.

Abstract

Bypass jest uznaną metodą leczenia choroby wieńcowej. Drożność przeszczepów nadal jest piętą achillesową przeszczepów żyły odpiszczelowej. Modele badawcze dotyczące niepowodzenia pomostowania są niezbędne do lepszego zrozumienia procesów patobiologicznych i patofizjologicznych zachodzących podczas utraty drożności przeszczepu. Duże modele zwierzęce, takie jak świnie czy owce, przypominają ludzkie struktury anatomiczne, ale wymagają specjalnych urządzeń i sprzętu. Ten film opisuje model wstawiania żył szczurów w celu zbadania utraty drożności przeszczepu żyłowego. Szczury są niedrogie i łatwe w obsłudze. W porównaniu z modelami mysimi, dogodny rozmiar szczurów pozwala na lepszą operatywność i umożliwia uzyskanie wystarczającej ilości materiału do dalszej zróżnicowanej analizy. Krótko mówiąc, dolna żyła nadbrzusza szczura dawcy jest pobierana i wykorzystywana do zastąpienia odcinka tętnicy udowej. Zespolenie przeprowadza się za pomocą pojedynczych szwów i uszczelnia klejem fibrynowe. Drożność przeszczepu można monitorować nieinwazyjnie za pomocą ultrasonografii dwustronnej. Przerost mięśniowo-intimalny, który jest główną przyczyną utraty drożności przeszczepu, rozwija się stopniowo w czasie i można go obliczyć na podstawie przekrojów histologicznych.

Introduction

Choroby wieńcowe i ich powikłania są jednymi z głównych przyczyn zgonów na całym świecie. Obecne strategie terapeutyczne koncentrują się na przywróceniu przepływu krwi, albo poprzez rozszerzenie zwężonego naczynia, albo poprzez stworzenie bypassu. Pomostowanie aortalno-wieńcowe (CABG) przy użyciu autoprzeszczepów żył zostało po raz pierwszy opisane w 1968 roku i przez lata było udoskonalane. Oprócz rewaskularyzacji lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej najczęściej stosuje się przewody żyły odpiszczelowej¹. Jednak drożność przeszczepu pozostaje piętą achillesową przeszczepów żyły odpiszczelowej (SVG). Rok po operacji drożność przeszczepu wynosi 85%, a po dziesięciu latach spada do 61%^2,3. Odkrycie mechanizmów patofizjologicznych i przyczyn utraty drożności SVG jest zatem ważnym zadaniem.

Ten film demonstruje model wstawiania żył szczurów do badania utraty przeszczepu żyłowego. Ogólnym celem tej metody jest zbadanie procesów patobiologicznych i fizjologicznych leżących u podstaw progresji choroby oraz opracowanie odpowiedniego modelu do testowania leków lub opcji terapeutycznych. Przeszczepiając powierzchowną żyłę nadbrzusza do układu tętniczego, model ten ściśle naśladuje warunki kliniczne pomostowania aortalno-wieńcowego. Uraz chirurgiczny, niedokrwienie i stres ściany są ważnymi wyzwalaczami patologicznych zmian naczyniowych i są naśladowane w opisanym modelu.

Dostępne są różne modele i gatunki do badania utraty drożności przeszczepów żyłowych. Duże modele zwierzęce, takie jak^świnie4,^{owce5, psy6} i^małpy7, przypominają ludzkie naczynia krwionośne i struktury anatomiczne, a tym samym^{umożliwiają testowanie} złożonych strategii terapeutycznych, takich jak stentowanie bypassów lub nowe techniki chirurgiczne8. Wymagane jest jednak specjalne zakwaterowanie, sprzęt i personel. Ponadto wysokie koszty i konieczność dodatkowego anestezjologa podczas operacji utrudniają ich szersze zastosowanie. Małe zwierzęta, w tym szczury, są łatwe w obsłudze, nie wymagają specjalnego trzymania i mają możliwe do opanowania koszty. W porównaniu z modelami mysim^9,10, modele szczurze mają tę zaletę, że są lepiej operowalne, a tym samym mają mniejszą zmienność wyników. Szczury są fizjologicznie i genetycznie bardziej podobne do ludzi niż myszy^11,12. Ponadto większość myszy typu dzikiego rozwija tylko ograniczoną miointimę¹³, co sprawia, że modele myszy są podatne na błędy typu II. Histologia głównych żył myszy, takich jak żyła główna dolna, składa się tylko z kilku warstw komórkowych i utrudnia wczesną ocenę¹³. Kolejną wadą jest niewielka ilość tkanki dostępnej do późniejszej analizy po odzyskaniu przeszczepu.

Model opisany w tym filmie jest powtarzalny, tani i łatwy do wykonania, a także może być szybko i niezawodnie ustalony. Jest szczególnie przydatny do oceny drogich eksperymentalnych środków terapeutycznych, takich jak wektory wirusowe do terapii genowej, w ekonomiczny sposób.

Protocol

Zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z Przewodnikiem po zasadach postępowania ze zwierzętami laboratoryjnymi, przygotowanym przez Instytut Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych i opublikowanym przez National Institutes of Health. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez właściwe władze lokalne ("Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (Urząd Zdrowia i Ochrony Konsumentów) Hamburg").

1. Opieka nad zwierzętami

1. Pozyskać szczury Lewisa (LEW/Crl) i transgeniczne szczury ROSA/lucyferazy-LEW o wadze 300-350 g z Instytutu Zwierząt Laboratoryjnych.
2. Trzymaj szczury w konwencjonalnych warunkach w wentylowanych szafkach i karm je standardową karmą dla szczurów i wodą w autoklawie ad libitum.
3. Wykonaj przeszczep przy użyciu transgenicznych szczurów ROSA/lucyferazy-LEW jako dawców i syngennych szczurów LEW/Crl jako biorców.

2. Przygotowanie Szczura-dawcy

1. Użyj komory indukcyjnej, aby znieczulić szczura izofluranem (2,5-3%).
2. Połóż szczura na plecach i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski zakrywającej usta i nos. Sprawdź, czy znieczulenie jest wystarczająco głębokie, ściskając tylne łapy i sprawdzając brak odruchów. Nałóż trochę maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
3. Rozłóż tylne nogi i ustal ich pozycję za pomocą taśmy.
4. Ogolić włosy pachwinowe maszynką do strzyżenia włosów i zdezynfekować cały obszar za pomocą jodu powidonu, a następnie 80% etanolu. Powtórz krok dezynfekcji dwukrotnie.
   UWAGA: Obszar operacyjny, gaza i narzędzia chirurgiczne należy wysterylizować. Utrzymuj sterylne pole przez cały zabieg i noś jednorazowe, sterylne rękawiczki chirurgiczne, maski i czepki.
5. Pod mikroskopem wykonaj pionowe nacięcie wzdłuż linea inguinalis. Użyj dwóch kleszczy, aby delikatnie oddzielić tkanki podskórne i odsłonić powierzchowną żyłę nadbrzusza od jej początku na żyle udowej. Ostrożnie odizoluj powierzchowną żyłę nadbrzusza od otaczających tkanek.
6. Zatrzymaj przepływ krwi w powierzchownej żyle nadbrzusza za pomocą dwóch mikrozacisków.
7. Zbierz około 0,5 do 1 cm odcinka żyły, ostrożnie podnosząc izolowaną żyłę kleszczami i przecinając naczynie mikronożyczkami. Pozostaw mikrozaciski na kikutu naczynia, aby zapobiec utracie krwi. Umieść usunięty kawałek żyły na sterylnej gazie. Ostrożnie umieścić igłę 30 G w jednym końcu pobranej żyły i przepłukać naczynie heparyną (50 jednostek/ml).
   UWAGA: Z żyłą należy obchodzić się ostrożnie i unikać uszkodzeń podczas podnoszenia, cięcia i spłukiwania. Upewnij się, że przeszczep został przepłukany odpowiednią ilością heparyny.
8. Utrzymuj segment naczynia w 1% lidokainie na lodzie do czasu przeszczepu szczurowi biorcy, aby zapobiec skurczowi naczynia.
9. Poddaj eutanazji szczura dawcę, zwiększając znieczulenie do 5% izofluranu. Po 2-3 minutach otwórz brzuch wzdłuż kresy białej, przetnij przeponę i usuń serce, aby zatrzymać krążenie.

3. Przygotowanie Szczura Odbiorcy

1. Znieczulić i utrwalić szczura biorcę w taki sam sposób, jak szczura dawcy.
2. Ogol przyśrodkową stronę nóg maszynką do strzyżenia włosów i trzykrotnie zdezynfekuj za pomocą jodu powidonu i 80% etanolu.
3. Monitoruj głębokość znieczulenia i upewnij się, że jest ona wystarczająca, sprawdzając brak odruchów podczas szczypania tylnych łap.
4. Wykonaj środkowe nacięcie kości udowej od kolana do fałdu pachwinowego. Pod mikroskopem użyj 2 kleszczyków, aby oddzielić tętnicę udową od jej otoczenia.
5. Użyj mikro zacisków, aby zatrzymać przepływ krwi. Najpierw umieść proksymalny zacisk, a następnie dystalny zacisk.
6. Wytnij krótki odcinek zaciśniętej tętnicy udowej za pomocą mikronożyczek i wyrzuć go. Skróć pozostały kikut tętnicy za pomocą mikronożyczek, tworząc szczelinę o 1-2 mm większą niż przeszczep żyły. Przepłukać kikut tętnicy heparyną za pomocą igły 30 G.
   UWAGA: Jeśli przydanka wystaje nieco poza kikut naczynia, użyj kleszczy, aby przeciągnąć ją lekko nad końcem naczynia i usunąć kawałek.
7. Umieść pobraną żyłę z kroku 2.8 między kikutami tętniczymi i dostosuj długość tak, aby odpowiednio pasowała do szczeliny. Zwróć uwagę na kierunek żyły.
8. Najpierw wykonaj zespolenie proksymalne za pomocą szwu prolenowego 10-0. Przeprowadzaj pojedyncze ściegi w pokazanej kolejności (Rysunek 1D). Zacznij od szwu po każdej stronie bocznej, a następnie dodaj trzy kolejne szwy po stronie brzusznej. Następnie umieść trzy szwy na grzbietowej stronie naczynia, aby zakończyć zespolenie.  
9. Połączyć dystalne naczynia z przeszczepem przy użyciu tej samej techniki, co w przypadku zespolenia bliższego opisanego w kroku 3.8. Ponownie zacznij od szwu po każdej stronie bocznej, a następnie umieść trzy szwy po stronie brzusznej i grzbietowej.
10. Załaduj dwie strzykawki o pojemności 1 ml z klejem fibrynowym 1 i 2. Ostrożnie podnieś przeszczep kleszczami i wrzuć pod przeszczep około 100 μl kleju fibrynowego składnika 1, a następnie składnika 2,
    UWAGA: Upewnij się, że składniki 1 i 2 są nakładane w stosunku 1:1.
11. Umieść przeszczep z powrotem na swoim miejscu i upuść dodatkowe 100 μl składników 1 i 2 na wierzch przeszczepu. Należy upewnić się, że klej pokrywa zarówno przeszczep, jak i zespolenie, aby zapobiec niewydolności zespolenia i nadmiernemu rozdęciu przeszczepu żyły.  
12. Ostrożnie otwórz dystalny zacisk, a następnie proksymalny.
13. Potwierdź udaną operację, sprawdzając, czy w przeszczepionej żyle i tętnicy dystalnej przeszczepu jest widoczny puls
.
14. Usuń nadmiar kleju, który utrudnia zamykanie skóry. Za pomocą kleszczy podnieś utwardzony klej i usuń jego nadmiar mikronożyczkami. Zamknij warstwy skóry za pomocą szwów prolenowych 5-0.
15. Wstrzyknąć 4-5 mg/kg karprofenu podskórnie przed umożliwieniem szczurowi przebudzenia. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku. Trzymaj zwierzę w jednej klatce, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
16. Dodaj Metamizol do wody pitnej (50 mg Metamizolu na 100 ml) jako lek przeciwbólowy przez następne 3 dni i codziennie monitoruj zwierzę.

4. Ultrasonografia dupleksowa

UWAGA: Użyj ultrasonografii duxplex, aby nieinwazyjnie zobrazować przepływ krwi u szczurów¹⁴.

1. Znieczulić szczura w komorze indukcyjnej (izofluran 2%). Połóż szczura na plecach i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski zakrywającej nos.
2. Użyj maszynki do strzyżenia włosów i kremu do depilacji, aby usunąć włosy wokół uda.
3. Nałóż żel ultradźwiękowy na udo. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Rejestruj dupleksowe obrazy ultrasonograficzne za pomocą przetwornika MS 400 (częstotliwość środkowa: 30 MHz) z szybkością odświeżania 230-400 klatek/s.

5. Histopatologia

UWAGA: Zbierz i zabarwij naczynie trichromowym barwieniem Massona do analizy morfometrycznej¹⁵.

1. Utrwal pobrane naczynie w 4% paraformaldehydzie przez noc i odwodnij je w rosnących stężeniach etanolu. Zanurz próbkę w parafinie i pokrój ją na plastry o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu.
   UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ze szczególną ostrożnością.
2. Odparafinować szkiełka przed zabarwieniem ich roztworem barwiącym trichrom. Odwodnić poplamione szkiełka, oczyścić je ksylenem i zamontować w podłożu montażowym. Po wysuszeniu szkiełek obejrzyj próbki pod mikroskopem.

6. Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI)

UWAGA: Przeszczep pooperacyjny był śledzony w czasie in vivo, mierząc sygnał bioluminescencyjny¹⁶.

1. Rozpuścić 1 g soli potasowej D-Lucyferyny w 22 ml PBS i wstrzyknąć ją dootrzewnowo szczurowi (375 mg/kg masy ciała). Odczekaj 15 minut, aż lucyferyna zacznie krążyć w zwierzęciu.
2. Umieść szczura w bioluminescencyjnym systemie kwantyfikacji w czasie rzeczywistym i uzyskaj dostęp do sygnału bioluminescencji.

Results

Model wstawiania żył szczurów jest odpowiedni do badania rozwoju przerostu mięśni włosowych i niewydolności przeszczepów żyłowych. Zwierzęta dobrze wracają do zdrowia po operacji i wykazują doskonałą kondycję fizyczną po operacji. Rycina 1 przedstawia kluczowe etapy chirurgiczne. Po nacięciu skóry wzdłuż linea inguinalis identyfikuje się żyłę powierzchowną nadbrzusza i tętnicę udową (ryc. 1A). Pobieranie przeszczepu powinno być wykonywane ostrożnie, bez uszkadzania przeszczepu (...

Discussion

Ten film przedstawia model wstawiania żył szczurów w celu zbadania utraty przeszczepu żyłowego i umożliwienia eksploracji leżących u podstaw procesów patologicznych oraz testowania nowych leków lub opcji terapeutycznych.

Znieczulenie jest kluczowym aspektem zabiegów chirurgicznych. Zalecany jest system ciągłego znieczulenia wziewnego, ponieważ jest to bezpieczna i łatwa metoda, zwłaszcza podczas długotrwałych operacji. Może to mieć ogromne znaczenie w fazie treningu, kiedy operacja trwa dłużej...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szczur LEW/Crl	Charles River	Numer stada 004
Szczur LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	Instytut Zwierząt Laboratoryjnych, Uniwersytet w Kioto, Japonia	NBPR numer szczura 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
PFA 4%	Mikroskopia elektronowa	#157135S	20%
maszynka do strzyżenia włosów	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	AbbVie	PZN 10182054 Art.Nr.: B506	z izofluranu
	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine -
aplikator zaciskowy	Fine Science Tools	18056-14
krem do depilacji	Rufin kosmetyczny	27618
Powidon-jod	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
10-0 Szew Ethilon	Ethicon	2814G
Szew prolenowy 5-0	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	Carprofen
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Heparyna	Rotexmedica	PZN: 3862340	25.000 I.E./ ml
Xylocain 1%	AstraZeneca	PZN: 1137907	Lidocain
EVICEL	J& J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE	klej fibrynowy
NaCl 0,9%	B.Braun	PZN 06063042 Nr art.: 3570160
System mikroobrazowania Vevo 770 o wysokiej rozdzielczości in vivo	VisualSonics		duplex ultrasonografia
Ecogel 100 żel ultradźwiękowy Eco-med		30GB
D-Luciferin Firefly, sól potasowa	Biosynth	L-8220
PBS pH 7,4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	Perkin Elmer		obrazowanie bioluminescencyjne
Weigerts żelazo Zestaw hematoksyliny	Merck	1.15973.0002	Barwienie trichromowe
Rezorcyna-Fuksyna Weigert Waldeck		2.00E-30	Barwienie trichromowe
Kwas Fuksyna	Sigma-Aldrich	F8129-25G	Barwienie trichromowe
Roztwór Pąsek	Serva Elektroforeza	33427	Barwienie trichromowe
Azoflosyna	Waldeck	1B-103	Barwienie trichromowe
Hydrat kwasu molibdetofosforowego	Merck	1.00532.0100	Barwienie trichromowe
Pomarańczowy G	Waldeck	1B-221	Barwienie trichromowe
Jasnozielony SF	Waldeck	1B-211	Barwienie trichromowe
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Lodowaty kwas octowy	Sigma-Aldrich	537020
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Ksylen	Th. Geyer	3410
Parafina	Leica biosystems	REF 39602004
Etanol absolutny	Th. Geyer	2246
Etanol 96%	Th. Geyer	2295
Etanol 70%	Th. Geyer	2270
Stojak na slajdy	Ted Pella	21057
Naczynie do barwienia	Ted Pella	21075
Bepanthen Maść do oczu	Bayer	1578675	Maść do oczu