Artykuł metodologiczny

Mysi model szczepu Clostridium difficile R20291 leczony cefoperazonem

DOI:

10.3791/54850

⸱

10 grudnia 2016

 ,  ,  , 
1Department of Population Health and Pathobiology, North Carolina State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia mysi model zakażenia Clostridium difficile (CDI) cefoperazonu przy użyciu klinicznie istotnego i genetycznie podatnego szczepu, R20291. Nacisk na kliniczne monitorowanie choroby, liczenie bakterii C. difficile, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne w całym CDI w modelu mysim są szczegółowo opisane w protokole.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile jest beztlenowym, Gram-dodatnim, przetrwalnikowym patogenem jelitowym, który jest związany ze wzrostem zachorowalności i śmiertelności, a w konsekwencji stanowi pilne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Częstość nawrotów zakażenia C. difficile (CDI) po skutecznym leczeniu antybiotykami jest wysoka i występuje u 20-30% pacjentów, co wymaga odkrycia nowych metod leczenia tego patogenu. Obecne modele zwierzęce CDI skutkują wysoką śmiertelnością, a zatem nie przybliżają przewlekłych, podstępnych objawów choroby obserwowanych u ludzi z CDI. Aby ocenić skuteczność terapii przeciwko C. difficile, potrzebny jest mysi model zbliżony do choroby człowieka z wykorzystaniem klinicznie istotnego szczepu. Protokół ten przedstawia mysi model CDI cefoperazonu przy użyciu klinicznie istotnego i genetycznie podatnego szczepu R20291. Techniki klinicznego monitorowania choroby, liczenie bakterii C. difficile, cytotoksyczność toksyny i zmiany histopatologiczne w CDI w modelu mysim są szczegółowo opisane w protokole. W porównaniu z innymi mysimi modelami CDI, model ten nie jest jednolicie śmiertelny przy podawanej dawce, co pozwala na obserwację przedłużonego klinicznego przebiegu infekcji zgodnego z chorobą człowieka. W związku z tym mysi model CDI cefoperazonu stanowi cenną platformę eksperymentalną do oceny wpływu nowych terapii na łagodzenie objawów klinicznych choroby i przywrócenie odporności na kolonizację C. difficile.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile to beztlenowa, Gram-dodatnia, tworząca przetrwalniki pałeczka, która powoduje zagrażającą życiu biegunkę1. Zakażenie C. difficile (CDI) wiąże się ze zwiększoną zachorowalnością i śmiertelnością ludzi i powoduje ponad 4,8 miliarda dolarów kosztów opieki zdrowotnej rocznie1-4. W 2013 roku Centers for Disease Control and Prevention sklasyfikowało C. difficile jako pilne ryzyko oporności na antybiotyki, wskazując, że stanowi pilne zagrożenie dla zdrowia publicznego1. Obecnie antybiotykoterapia wankomycyną i metronidazolem jest uważana za standard leczenia CDI5. Niestety, nawroty CDI po skutecznym leczeniu antybiotykami są wysokie i występują u 20 - 30% pacjentów2,5-7. Dlatego konieczne jest odkrycie nowych metod leczenia przeciwko temu patogenowi jelitowemu. Aby ocenić skuteczność leczenia C. difficile, potrzebny jest model zwierzęcy zbliżony do choroby ludzkiej w klinicznie istotnym szczepie.

Początkowo, postulaty Kocha zostały ustalone dla C. difficile w 1977 roku przy użyciu modelu8 chomika syryjskiego leczonego klindamycyną. Model ten jest nadal wykorzystywany do badania wpływu toksyn C. difficile na patogenezę9,10. Jednak CDI w modelu chomika powoduje wysoką śmiertelność i nie przybliża przewlekłych podstępnych objawów choroby, które można zaobserwować u ludzi z CDI 10,11. Opierając się na dostępności i dostępności odczynników mysich platform w badaniach, istotny jest mysi model CDI.

W 2008 roku stworzono solidny mysi model CDI, lecząc myszy koktajlem antybiotyków w wodzie pitnej (kanamycyna, gentamycyna, kolistyna, metronidazol i wankomycyna) przez 3 dni, a następnie wstrzyknięto dootrzewnowo klindamycynę12. To sprawiło, że myszy były podatne na CDI i ciężkie zapalenie jelita grubego. W zależności od podanej dawki inokulum, przy użyciu tego modelu można zaobserwować szereg objawów klinicznych i śmiertelność. Od tego czasu badano różne schematy antybiotykowe, które zmieniają mikrobiotę jelitową myszy, zmniejszając oporność na kolonizację do punktu, w którym C. difficile może skolonizować przewód pokarmowy (przegląd w Best i wsp. oraz Lawley & Young)13,14.

Ostatnio cefalosporyna o szerokim spektrum działania, cefoperazon, podawana w wodzie pitnej przez 5 lub 10 dni, w sposób powtarzalny czyni myszy podatnymi na CDI15. Ponieważ podawanie cefalosporyn trzeciej generacji wiąże się ze zwiększonym ryzykiem CDI u ludzi, zastosowanie modelu cefoperazonu dokładniej odzwierciedla naturalnie występującą chorobę16. Myszy leczone cefoperazonem podatne na C. difficile zostały poddane prowokacji zarówno zarodnikami C. difficile, jak i komórkami wegetatywnymi różnych szczepów o różnym znaczeniu klinicznym i zjadliwości17. Pomimo niektórych oryginalnych badań wykorzystujących komórki wegetatywne C. difficile jako formę zakaźną, zarodniki C. difficile są uważane za główny sposób przenoszenia18.

W ostatniej dekadzie pojawił się C. difficile R20291, szczep NAP1/BI/027, powodując epidemie CDI19,20. Staraliśmy się określić kliniczny przebieg choroby, gdy myszy leczone cefoperazonem zostały poddane próbie klinicznie istotnego i genetycznie podatnego szczepu C. difficile, R20291. Protokół ten szczegółowo opisuje przebieg kliniczny, w tym utratę masy ciała, kolonizację bakteryjną, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne w przewodzie pokarmowym myszy poddanych zakażeniu zarodnikami C. difficile R20291. Ogólnie rzecz biorąc, ten mysi model okazuje się być cenną platformą eksperymentalną dla CDI przybliżającej chorobę człowieka. Ten scharakteryzowany model myszy może być zatem wykorzystany do oceny wpływu nowych terapii na złagodzenie choroby klinicznej i przywrócenie odporności kolonizacyjnej na C. difficile.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne:
Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) przy North Carolina State University College of Veterinary Medicine (NCSU) zatwierdził to badanie. Polityka NCSU dotycząca opieki nad zwierzętami i ich użytkowania stosuje standardy i wytyczne określone w ustawie o dobrostanie zwierząt i ustawie o przedłużeniu badań zdrowotnych z 1985 r. Obiekty zajmujące się zwierzętami laboratoryjnymi w NCSU przestrzegają wytycznych zawartych w Przewodniku dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich użytkowania. Stan zdrowia zwierząt był oceniany codziennie, a zwierzęta w stanie agonalnym były humanitarnie uśmiercane przez uduszenie CO2 , a następnie zastosowanie środków wtórnych. Podczas tego badania przeszkoleni technicy zwierząt lub weterynarz przeprowadzili hodowlę zwierząt w placówce akredytowanej przez AAALAC.

1. Podawanie antybiotyku cefoperazonu w wodzie pitnej w celu uzyskania podatności na kolonizację i chorobę C. difficile

UWAGI: 5- do 8-tygodniowe myszy C57BL / 6 WT (samice i samce) zakupiono i poddano kwarantannie przez 1 tydzień przed rozpoczęciem podawania antybiotyku. Po kwarantannie myszy zostały umieszczone w autoklawie z jedzeniem, ściółką i wodą. Zmiany koszyka były wykonywane co tydzień przez personel laboratoryjny w okapie z przepływem laminarnym.

  1. Przygotować cefoperazon (0,5 mg/ml) w sterylnej wodzie destylowanej na 7 dni przed docelowym dniem próby prowokacyjnej (ryc. 1).
  2. Napełnij autoklawowane butelki z wodą cefoperazonową (0,5 mg/ml) i umieść je w każdej klatce dla myszy.
    UWAGA: Świeżo przygotowana woda z cefoperazonu powinna być przygotowywana i wymieniana co 2 dni przez okres 5 dni, jak opisano w krokach 1.1 i 1.2. Zaleca się prawidłowe usuwanie wody cefoperazone zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi ochrony środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa.
  3. Po 5 dniach przyjmowania cefoperazonu należy wymienić butelki na autoklawowane butelki wypełnione sterylną wodą destylowaną. Podawaj myszom tę wodę pitną na czas trwania eksperymentu.

2. Przygotowanie inokulum zarodników C. difficile i zgłębnik jamy ustnej myszy

UWAGA: Przed rozpoczęciem upewnij się, że następujące elementy są umieszczone w komorze beztlenowej na co najmniej 24 godziny: 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS; patrz Materiały), płytki taurocholatu cycykleryny cefoksytyny fruktozy (TCCFA) (patrz Materiały i plik dodatkowy) oraz sterylny rozsiewacz w kształcie litery L.

UWAGA: Myszy zarażone zarodnikami C. difficile powinny być trzymane w obiekcie dla zwierząt o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.

  1. Otrzymać zapas przetrwalników C. difficile pożądanego szczepu (w tym przypadku R20291), który został przygotowany wcześniej i przechowywany w temperaturze 4 °C w sterylnej wodzie21,22. Określ liczbę tych zarodników przed użyciem.
  2. Na podstawie znanego stężenia (zarodniki/ml) szczepu przetrwalników, obliczyć pożądane rozcieńczenie, aby uzyskać10-5 zarodników na 25 μl. Upewnij się, że objętość inokulum jest wystarczająca do zaszczepienia wszystkich myszy w eksperymencie (25 μl na mysz), do przeprowadzenia liczenia inokulum (około 30 μl) i do uwzględnienia błędu pipetowania.
  3. Odwiruj oryginalny zapas zarodników C. difficile. Następnie ponownie zawiesić obliczoną objętość (z kroku 2.2) oryginalnego wywaru zarodników C. difficile w sterylnej wodzie w zakręcanej probówce do mikrowirówki. Wykonaj to tlenowo w okapie z przepływem laminarnym. Zidentyfikuj tę rozcieńczoną mieszaninę jako "inokulum zarodników".
  4. Umieść inokulum zarodników w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C i podgrzewaj przez 20 min.
    UWAGA: Ten krok zapewni, że po obróbce cieplnej pozostaną tylko aktywne zarodniki C. difficile.
  5. Do okapu z przepływem laminarnym weź 50 μl podgrzanego inokulum zarodników, umieść je w sterylnej probówce do mikrowirówek i przelej do komory beztlenowej23. Użyj tej próbki do wyliczania zarodników.
  6. W kapturze z przepływem laminarnym załaduj pozostały podgrzany inokulum zarodników do 1-mililitrowej strzykawki przymocowanej do sterylnej igły żołądkowej zakończonej gruszką. Użyj ręcznego krokowca strzykawkowego, aby zapewnić dokładne i szybkie powtarzanie dawkowania między myszami. Upewnij się, że igła do zgłębnika jest wypełniona podgrzanym inokulum zarodników przed użyciem.
    UWAGA: Nowa sterylna igła do głębka dla każdej myszy nie jest wymagana. Jeśli jednak podaje się różne dawki zarodników C. difficile, dla każdej dawki zaleca się nową igłębnik.
    UWAGA: Zarodniki C. difficile są wysoce odporne na tradycyjne środki dezynfekujące. Dlatego konieczne jest stosowanie sporobójczego środka dezynfekującego, takiego jak #62 Perisept Sporicidal Disinfectant. Producent zaleca 2-minutowy czas kontaktu w celu zniszczenia zarodników C. difficile.
  7. Zgłębnik każdej myszy za pomocą 25 μl inokulum zarodników. Każdą mysz należy delikatnie powstrzymać, chwytając zwierzę za luźną skórę szyi i grzbietu, aby unieruchomić głowę. Za pomocą palca wskazującego dodatkowo unieruchamić głowę zwierzęcia i wydłużyć przełyk. Upewnij się, że zwierzę nie wokalizuje ani nie wykazuje innych oznak niepokoju podczas krępowania.
    UWAGA: Całkowita objętość podawana myszom przez zgłębnik nie powinna przekraczać 10 ml/kg masy ciała (0,1 ml/10 g).
  8. Utrzymuj mysz w pionowej, pionowej pozycji i delikatnie wsuń igłębkę w bok ust. Skieruj igłębnik wzdłuż podniebienia i powoli wsuń igłębnik do przełyku.
    UWAGA: Jeśli napotkasz jakikolwiek opór, igła do wbijania w zgłębnik może wchodzić w tchawicę i dlatego NIE należy jej przesuwać, ale raczej natychmiast usunąć i ponownie położyć.
  9. Po tym, jak igła do zgłębnika znajdzie się mniej więcej w połowie drogi do przełyku, wstrzyknąć 25 μl podgrzanego inokulum zarodnikowego i delikatnie wyjąć igłębnik z przełyku.
    UWAGA: Mocne przesuwanie igły do zgłębnika może prowadzić do pęknięcia przełyku lub żołądka. Dlatego, jeśli napotkasz opór podczas przesuwania igły do zgłębnika, najlepiej natychmiast wyjąć igłębnik i zmienić jego położenie.
  10. Zwierzę należy umieścić z powrotem w klatce i obserwować, czy nie ma kaszlu lub objawów niewydolności oddechowej, ponieważ może to wskazywać na niezamierzone podanie tchawicy lub aspirację podgrzanego inokulum przetrwalników.
    UWAGA: Myszy są wyjątkowo podatne na C. difficile po leczeniu antybiotykami; Dlatego niezbędne są środki ostrożności zapobiegające zanieczyszczeniu krzyżowemu między klatkami. Jest to szczególnie ważne w przypadku myszy leczonych antybiotykami, ale nieleczonych jako kontrolnych.
  11. Po zaszczepieniu wszystkich myszy, umieść pozostały podgrzany inokulum zarodników w sterylnej probówce mikrowirówkowej i przełóż go do komory beztlenowej w celu zliczenia zarodników.
  12. W celu zliczenia podgrzanego inokulum zarodnikowego (od kroku 2.4) i pozostałego podgrzanego inokulum zarodnikowego z zgłębnikami, należy wykonać seryjne rozcieńczenia każdego inokulum w stosunku 1:10 w 1x PBS. Zaleca się wykonanie i podanie na talerzu 4 - 5 rozcieńczeń (tj. 10-1 do 10-5).
  13. Stosując technikę aseptyczną, przenieść 100 μl każdego seryjnego rozcieńczenia na pojedynczą płytkę TCCFA.
  14. Za pomocą sterylnego rozsiewacza w kształcie litery L równomiernie rozprowadź rozcieńczenie nałożone na podłoże na płytce. Nawet rozprowadzenie rozcieńczonego inokulum jest niezbędne do dokładnego zliczenia zarodników.
  15. Inkubować płytki beztlenowo przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach można policzyć jednostki tworzące kolonie (CFU) C. difficile, aby uzyskać dawkę infekcyjną podawaną myszom w objętości 25 μl (0,025 ml) (patrz plik uzupełniający "Przykładowe obliczenia"). Kolonie C. difficile są płaskie i bladożółte, mają nieregularne krawędzie i wygląd szlifowanego szkła24,
    UWAGA: Granica wykrywalności dla oznaczania liczby bakterii wynosi 102 jtk.

3. Monitorowanie utraty masy ciała myszy i klinicznych objawów choroby podczas infekcji C. difficile

  1. Zważyć zwierzęta przed i po 5-dniowej kuracji antybiotykami cefoperazonu, po 2-dniowej rekonwalescencji po antybiotykach (dzień 0), a następnie przez cały czas trwania eksperymentu.
    UWAGA: Uzyskuj ciężary o stałej porze każdego dnia. Masy uzyskane w dniu próby prowokacyjnej (dzień 0) powinny być użyte jako początkowa masa wyjściowa do porównania w całym zakażeniu C. difficile.
  2. Umieść wagę cyfrową w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Umieść sterylną plastikową zlewkę na wadze i staruj wagę plastikowej zlewki. Następnie delikatnie podnieś mysz za podstawę ogona i umieść ją w plastikowej zlewce.
    1. Umieść zlewkę z powrotem na wadze. Najedź dłonią na górną część zlewki, aby upewnić się, że mysz nie ucieknie. Uzyskanie stabilnej wagi może zająć 2-3 sekundy. Następnie delikatnie umieść mysz z powrotem w klatce. Zapisz tę wagę i powtórz proces dla każdej myszy w tej klatce.
      UWAGA: Konieczne jest podjęcie środków ostrożności w celu zapobieżenia zanieczyszczeniu krzyżowemu między koszykami podczas uzyskiwania masy. Każda klatka myszy powinna mieć własną plastikową zlewkę do ważenia. Plastikowe zlewki należy dezynfekować środkiem sporobójczym między każdym użyciem i przykrywać sterylną folią aluminiową.
  3. Monitoruj prowokowane zwierzęta dwa razy dziennie (co najmniej) pod kątem objawów klinicznie ciężkiej infekcji C. difficile, w tym letargu, utraty apetytu, biegunki i zgarbionej postawy.
  4. Humanitarna eutanazja zwierząt, które tracą 20% swojej początkowej wyjściowej masy ciała i/lub rozwijają się ciężkie objawy kliniczne zakażenia C. difficile (wymienione w kroku 3.3).
    UWAGA: Myszy, które wykazują kliniczne objawy zakażenia C. difficile, powinny być ważone w razie potrzeby podczas eksperymentu, aby upewnić się, że nie straciły 20% swojej początkowej wyjściowej masy ciała. We wczesnych punktach czasowych eksperymentu może to oznaczać pomiary dwa razy dziennie.

4. Oznaczanie liczby bakterii C. difficile na podstawie kału myszy i zawartości jelita ślepego

UWAGA: Przed rozpoczęciem upewnij się, że następujące elementy zostały umieszczone w komorze beztlenowej na co najmniej 24 godziny: 1x PBS (patrz Materiały), płytki TCCFA (patrz Materiały), sterylny rozsiewacz w kształcie litery L oraz sterylne probówki do mikrowirówek i/lub płytki PCR do rozcieńczeń.

  1. Pobieranie próbek do oznaczania liczby C. difficile
    UWAGA: Przed uzyskaniem kału lub zawartości jelita ślepego należy zważyć sterylne probówki do mikrowirówek na wadze analitycznej. Zapisz masę probówki z boku tuby, zaokrąglając do czterech miejsc po przecinku (np. 0,9864 g). Oznacz tę masę jako "wagę probówki". Każdą pobraną próbkę należy umieścić w sterylnej, zważonej probówce do mikrowirówki.
    1. Sterylne zbieranie mysich odchodów
      1. Delikatnie przytrzymuj każdą mysz, chwytając zwierzę za luźną skórę szyi i grzbietu, aby unieruchomić głowę. Użyj małego palca, aby delikatnie przytrzymać ogon zwierzęcia, odsłaniając w ten sposób odbyt. Upewnij się, że zwierzę nie wokalizuje ani nie wykazuje innych oznak niepokoju podczas krępowania.
      2. Trzymaj sterylną, zważoną probówkę do mikrowirówki bezpośrednio pod odbytem zwierzęcia. Konieczne jest, aby rurka nie stykała się bezpośrednio z myszą.
        1. Gdy zwierzę się wypróżnia, zbierz granulki kału do probówki. Trzymaj probówkę w temperaturze pokojowej, aż wszystkie próbki kału zostaną zebrane. Mysz może potrzebować kilku minut, aby się wypróżnić, co wymaga powtórnych prób zebrania kału.
      3. Zważyć probówki zawierające kał na wadze analitycznej. Zapisz wagę tuby, zaokrąglając do czterech miejsc po przecinku (np. 1,0021 g). Oznacz uzyskaną masę jako "końcową masę rury".
      4. Bezpośrednio po pobraniu kału należy przekazać próbki kału do komory beztlenowej w celu zliczenia bakterii.
    2. Sterylne pobieranie zawartości jelita ślepego myszy w czasie sekcji zwłok
      1. Po humanitarnej eutanazji przez uduszenie CO2 , a następnie zastosowaniu środków wtórnych, należy przeprowadzić sekcję zwłok w celu uzyskania jelita ślepego25. Jelito ślepe to duża, przecinkowata część przewodu pokarmowego.
      2. Umieść jelito ślepe na sterylnej plastikowej szalce Petriego. Użyj jednorazowego, sterylnego ostrza skalpela nr 10, aby rozciąć jelito ślepe od ślepego końca torebki, aby odsłonić zawartość jelita ślepego.
        1. Delikatnie usuń zawartość jelita ślepego, lekko uciskając ostrzem skalpela i przesuwając zawartość w kierunku naciętej części jelita ślepego.
          UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie naruszyć tkanki jelita ślepego, która zostanie przekazana do badania histopatologicznego.
      3. Umieść zawartość jelita ślepego w sterylnej, zważonej probówce do mikrowirówki natychmiast po pobraniu. Tylko około 10 mg zawartości jelita ślepego jest potrzebne do oznaczenia liczby bakterii.
      4. Zważyć probówki zawierające zawartość jelita ślepego na wadze analitycznej. Zapisz wagę tuby, zaokrąglając do czterech miejsc po przecinku (np. 1,0021 g). Oznacz uzyskaną masę jako "końcową masę rury".
      5. Próbki zawartości jelita ślepego należy przekazać do komory beztlenowej w celu oznaczenia liczby bakterii.
  2. Oznaczanie liczby bakterii C. difficile
    1. Obliczyć końcową masę zawartości (kału lub jelita ślepego), która zostanie policzona dla C. difficile. Wykonano to, odejmując "końcową wagę rury" od "wagi rury".
    2. Obliczyć rozcieńczenie zawartości w stosunku 1:10 do 1X PBS i odpowiednio zawiesić. W przypadku granulek kału należy użyć końcówki pipety, aby delikatnie rozbić osad na roztwór (patrz plik uzupełniający "Przykładowe obliczenia").
    3. Zawiesiny próbek należy inkubować beztlenowo w temperaturze pokojowej przez 30 minut, pozwalając zawartości na opadanie.
    4. Wykonać seryjne rozcieńczenia dla każdej próbki w 1x PBS w celu wyliczenia jtk na g zawartości (kał lub kał). Wykonaj to beztlenowo.
    5. Stosując technikę aseptyczną, przenieść 100 μl każdego seryjnego rozcieńczenia na płytki TCCFA. Za pomocą sterylnego rozsiewacza w kształcie litery L rozprowadź nałożony rozcieńcz na podłoże, aby równomiernie rozprowadzić go na płytce. Równomierne rozprowadzenie rozcieńczenia jest niezbędne do dokładnego zliczenia kolonii.
    6. Inkubować płytki beztlenowo przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. W tym czasie należy wyliczyć kolonie C. difficile, aby uzyskać CFU na g zawartości (kał lub jelito ślepe). Kolonie C. difficile są płaskie i bladożółte, mają nieregularne krawędzie i wygląd szlifowanego szkła24,
      UWAGA: Protokół ten może być używany do wyliczania C. difficile z innej zawartości przewodu pokarmowego u myszy, w tym zawartości jelita krętego i okrężnicy. Płytki PCR mogą być używane do wykonywania seryjnych rozcieńczeń.

5. Test cytotoksyczności komórek Vero w celu ilościowego określenia cytotoksyczności toksyny C. difficile

UWAGA: Zaleca się, aby test ten został przeprowadzony po ukończeniu modelu mysiego na próbkach pobranych podczas sekcji zwłok i przechowywanych w temperaturze -80 °C. Techniki aseptycznej hodowli komórkowej są niezbędne do zapobiegania zanieczyszczeniu komórek Vero podczas tego testu. Wykonanie tego protokołu trwa 2 dni. Cały kał i zawartość jelitowa wykorzystana w tym teście muszą być przechowywane w zważonej, sterylnej probówce do mikrowirówki (oznaczonej "wagą probówki", patrz sekcja powyżej). Ostateczna masa probówki (wraz z zawartością) jest mierzona za pomocą wagi analitycznej z dokładnością do czterech miejsc po przecinku (patrz sekcja powyżej). Do tego testu zaleca się użycie pipety wielokanałowej.

UWAGA: Przed rozpoczęciem upewnij się, że dostępne są następujące elementy: Vero Cells, modyfikacja pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco 1x z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% pożywką penicyliny/streptomycyny (oznaczoną jako "pożywka DMEM 1x; " patrz Materiały i plik uzupełniający), 0,25% trypsyna-EDTA, 1x PBS, 0,4% błękit trypanowy, 96-dołkowa płytka z płaskim dnem do hodowli komórkowych, 96-dołkowa płytka filtracyjna, Clostridium difficile Toksyna A (podwielokrotność w 3 μl przy 1 μg/μl w ultraczystej wodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C), antytoksyna Clostridium difficile, arkusz roboczy (do obliczeń i map płytowych; patrz pliki uzupełniające).

UWAGA: Podczas tego testu należy zachować ostrożność w przypadku narażenia personelu na C. difficile i jego toksynę.

  1. Dzielenie komórek Vero (dzień 1)
    1. Podgrzej DMEM 1x pożywka, 0,25% trypsyny-EDTA i 1x PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Pobrać kolbę komórek Vero z inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C i 5% CO2 ) i umieścić ją w sterylnym okapie do hodowli komórkowych o przepływie laminarnym. Użyj 70% etanolu, aby wytrzeć maskę i sprzęt przed użyciem. Za pomocą pipety serologicznej odessać pożywkę z kolby do hodowli tkankowej, aby usunąć ją z komórek Vero i wyrzucić do pojemnika na odpady.
    3. Przepłukać komórki Vero 5 ml 1x PBS (wstępnie podgrzanego) w kolbie do hodowli tkankowej. Odessać PBS i wyrzucić go do pojemnika na odpady.
    4. Dodać 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA do kolby do hodowli tkankowej. Czas kontaktu wynosi 2 - 3 minuty. W tym czasie obserwuj, jak komórki zaczynają schodzić z powierzchni kolby. Delikatnie kołysz kolbą kultur tkankowych na boki, aby poluzować komórki Vero.
    5. Po czasie kontaktu z Trypsin-EDTA, natychmiast dodać 5 ml pożywki DMEM 1x do kolby do hodowli tkankowej. To zneutralizuje Trypsynę-EDTA. Użyj tego roztworu, aby delikatnie zmyć wszelkie nieprzyłączone komórki Vero z tylnej części kolby. Następnie za pomocą pipety serologicznej przenieś tę mieszaninę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    6. Odwirować komórki Vero w stożkowej probówce przez 5 minut w temperaturze 180 x g i temperaturze 25 °C. Upewnij się, że wirówka jest odpowiednio zrównoważona. Po odwirowaniu obserwuj widoczne osady komórek Vero na dnie stożkowej probówki. Uważaj, aby nie zakłócić tego granulatu. Odessać supernatant ze stożkowej rurki i wyrzucić go.
    7. Ponownie zawiesić komórki Vero w 3 ml pożywki DMEM 1x.
  2. Liczenie komórek Vero
    1. Dodać 100 μl zawiesiny komórek Vero (wykonanej w kroku 5.1.7) do 100 μl 0,4% błękitu trypanowego. Delikatnie wymieszaj, pipetując roztwór w górę i w dół.
    2. Dodać 10 μl tej mieszaniny do każdej komory hemocytometru.
    3. Policz liczbę żywotnych komórek w czterech kwadrantach hemocytometru. Martwe komórki Vero przyjmą błękit trypanowy, a tym samym zostaną zabarwione na niebiesko (komórek tych nie należy liczyć). Zapisz te liczby w dostarczonym "Arkuszu komórkowym Vero".
    4. Zsumuj całkowitą liczbę żywotnych komórek Vero we wszystkich czterech kwadrantach i oblicz średnią. Pomnóż przez współczynnik rozcieńczenia, który wynosi 2, ponieważ 100 μl komórek znajduje się w sumie 200 μl cieczy.
    5. Pomnóż przez współczynnik korekcyjny, aby uzyskać "liczbę komórek/ml". Podczas korzystania z hemocytometru współczynnik korekcyjny wynosi zawsze 104. Pomnóż przez całkowitą objętość, aby uzyskać "całkowitą liczbę komórek".
  3. Określanie liczby studzienek wymaganych dla każdego eksperymentu
    UWAGA: Pojedyncza próbka (kał lub zawartość jelit) wymaga wykonania 24 oddzielnych studzienek w dwóch egzemplarzach. Wymagane jest stężenie 105 komórek Vero na studzienkę (całkowita objętość 90 μl).
    UWAGA: Jeśli ktoś pragnie inkubować 96-dołkowe płytki z komórek Vero przez noc w temperaturze 37 °C, zaleca się stężenie 103 komórek Vero na studzienkę, aby uwzględnić wydłużony czas inkubacji. Obliczenia w arkuszu Vero Cell musiałyby zostać dostosowane, aby uwzględnić tę zmianę.
    1. Określ liczbę studzienek, które można wykorzystać, w oparciu o ilość dostępnych komórek Vero (z kroku 5.2; użyj dostarczonego arkusza komórek Vero).
    2. Określ objętość zawiesiny komórek Vero potrzebną do wypełnienia liczby pożądanych dołków (na podstawie liczby badanych próbek). Upewnij się, że dodano dodatkowy objętość w celu uwzględnienia błędu pipetowania (użyj dostarczonego arkusza Vero Cell).
    3. Rozcieńczyć zawiesinę komórek Vero (otrzymaną w kroku 5.1.7) w pożywce DMEM 1x, aby uzyskać objętość wymaganą do eksperymentu.
  4. Wysiewanie komórek Vero do 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej
    1. Korzystając z ponownego zawieszenia komórek Vero z kroku 5.3.2, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 90 μl zawiesiny komórek Vero do każdego dołka 96-dołkowej płytki z płaskim dnem do hodowli komórek.
    2. Inkubować płytkę z komórkami Vero w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 4 godziny przed dodaniem toksyny (próbek) do studzienek. Ten czas inkubacji pozwoli komórkom Vero przylegać do dna każdej studzienki.
  5. Tworzenie roztworów podstawowych z próbek (kał lub zawartość jelitowa)
    UWAGA: Wszystkie próbki powinny mieć "wagę probówki" i "końcową masę probówki" zmierzoną za pomocą wagi analitycznej. Użyj arkusza Vero Cell do obliczeń.
    1. Oblicz wagę zawartości. Przelicz g na mg, a następnie mg na μl. Obliczyć końcową całkowitą liczbę μl roztworu potrzebną do uzyskania rozcieńczenia w stosunku 1:10 w 1x PBS. Obliczyć całkowitą ilość 1x PBS do dodania do próbki.
    2. Dodać całkowitą objętość 1x PBS (obliczoną powyżej) do próbki. Wykonaj to w sposób tlenowy i aseptyczny. W przypadku granulek kału użyj końcówki pipety, aby delikatnie rozbić osad w roztworze.
    3. Próbki należy wirować, a następnie odwirowywać je przy stężeniu 3,522 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że wirówka jest odpowiednio zbalansowana. Należy uważać, aby nie zakłócić osadu i ponownie zawiesić próbkę w roztworze.
      UWAGA: W kroku 5.5.3, jeśli przetwarzanych jest tylko kilka próbek, zawartość można wysterylizować, przepuszczając ją przez pojedynczy filtr 0,22 μm zamiast przy użyciu 96-dołkowej płytki filtracyjnej. Niektóre próbki mogą wymagać wielu filtrów, aby wysterylizować całą zawartość objętości przy użyciu tej techniki.
    4. Wysterylizuj mieszaninę próbka/PBS, pobierając 150 μl supernatantu i umieszczając go w oddzielnych studzienkach na 96-dołkowej płycie filtracyjnej. Umieść płytkę filtracyjną bezpiecznie na 96-dołkowej płytce z płaskim dnem do hodowli komórkowych, tak aby zawartość przefiltrowała się do tej płytki.
    5. Odwirować stos płytek filtracyjnych/płytek do hodowli komórkowych o masie 431 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że wirówka jest odpowiednio wyważona i że płytka filtracyjna/płytka do hodowli komórkowej są ściśle wyrównane i nie przesuwają się podczas wirowania.
      UWAGA: Ta przefiltrowana zawartość to zapas 10-1, który zostanie wykorzystany w płytkach rozcieńczających.
    6. Umieść płytkę z przefiltrowanymi próbkami na lodzie.
  6. Tworzenie płytki rozcieńczającej #1
    UWAGA: Płytka rozcieńczająca #1 (DP#1) będzie wymagała 6 dołków na próbkę, w tym kontroli dodatnich (C. difficile Toxin A) i ujemnych (1x PBS) (patrz układ DP#1 w arkuszu Vero Cell).
    1. Aby przygotować kontrolę pozytywną (toksyna C. difficile A) do tego testu, należy otrzymać 3 μl podwielokrotności (1 μg/μl) w temperaturze -80 °C i dodać 297 μl ultraczystej wody, uzyskując końcowe stężenie 0,01 μg/μl. Umieścić na lodzie.
    2. Oznaczyć studzienki ich rozcieńczeniami (10-1 do 10-6) dla każdej próbki i wskazać kontrole dodatnie i ujemne (patrz układ DP#1).
    3. Dodaj odpowiednie ilości 1x PBS do każdej studzienki. W studzienkach 10-1 nie dodaj PBS. W przypadku 10-2 do 10-6 dołków dodać 90 μl 1x PBS.
    4. Dodać odpowiednie ilości próbek do każdego dołka. Do studzienek 10-1 dodać 100 μl podstawki 10-1 dla każdej próbki (patrz krok 5.5.7 z płytki filtracyjnej). W przypadku studzienek od 10-2 do 10-6 należy wykonać seryjne rozcieńczenia; Zacznij od pobrania 10 μl z dołka 10-1 i dodania go do dołka 10-2. Kontynuować seryjne rozcieńczenia aż do rozcieńczenia 10-6.
    5. Przykryj płytkę DP#1 przezroczystą plastikową uszczelką samoprzylepną i umieść ją na lodzie.
  7. Tworzenie płytki rozcieńczającej #2
    UWAGA: Płytka rozcieńczająca (DP#2) będzie wymagała 2 torów po 6 dołków dla każdej próbki, w tym kontroli dodatnich i ujemnych (patrz układ DP#2 w arkuszu Vero Cell).
    1. Oznaczyć studzienki ich rozcieńczeniami (10-1 do 10-6) dla każdej próbki i wskazać kontrole dodatnie i ujemne (patrz układ DP#2). Oznacz studzienki nazwą próbki (oznaczoną jako "studzienki na próbki") lub nazwą próbki antytoksyną (oznaczoną jako "studzienki antytoksynowe").
    2. Oblicz ilość antytoksyny wymaganą do tego testu. UWAGA: Antytoksyna jest 25-krotnym roztworem podstawowym, który należy rozcieńczyć w stosunku 1:25 w 1x PBS. Umieść przygotowany roztwór antytoksyny 1x na lodzie.
    3. W przypadku "studzienek na próbki" dodać 20 μl 1x PBS do każdej studzienki na wszystkie rozcieńczenia (10-1 do 10-6) tej próbki. W przypadku "studzienek antytoksynowych" dodać 20 μl 1x antytoksyny do każdej studzienki na wszystkie rozcieńczenia (10-1 do 106) tej próbki.
    4. Przenieś 20 μl rozcieńczonej próbki do studzienek z DP#1 do wyznaczonych dołków na DP#2 dla rzędów 1 - 6 i rzędów 7 - 12 (patrz układ DP#2 w arkuszu Vero Cell). Delikatnie wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół.
    5. Przykryj DP#2 przezroczystą plastikową uszczelką samoprzylepną i pozostaw na 40 minut inkubacji w temperaturze pokojowej. Ta inkubacja ma na celu umożliwienie antytoksynie związania się, a tym samym inaktywacji i neutralizacji toksyny C. difficile.
    6. Po inkubacji dodaj 10 μl mieszaniny z DP#2 do odpowiednich studzienek komórek Vero (patrz układ płytki komórkowej Vero na arkuszu komórek Vero). Delikatnie wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół, uważając, aby nie naruszyć komórek Vero, które są przyklejone do dolnej powierzchni studzienek.
    7. Inkubować płytkę komórkową Vero przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  8. Oceń komórki Vero pod kątem zaokrąglenia za pomocą mikroskopu świetlnego (dzień 2)
    UWAGA: Przypomnijmy, że współczynnik rozcieńczenia zmienia się o współczynnik 10 podczas dodawania mieszanin próbek do płytki komórkowej Vero (np. 10-3 wynosi teraz 10-4). Studnie, w których obecna jest antytoksyna, powinny mieć niewiele lub nie zauważyć zaokrąglenia komórek Vero. Zaokrąglenie komórek Vero (cytotoksyczność) zostanie odnotowane w próbkach zawierających toksynę C. difficile. Jeżeli aktywność cytotoksyczna zostanie zneutralizowana w rozcieńczeniu zawierającym próbkę i antytoksynę, potwierdza się obecność toksyny C. difficile powodującej cytotoksyczność komórek Vero.
    1. Zbadaj zaokrąglenie komórek Vero za pomocą mikroskopu świetlnego przy 200-krotnym powiększeniu. W przypadku studzienek na próbki (w tym kontroli dodatniej) należy odnotować rozcieńczenie studzienki, w której jako ostatnia odnotowano zaokrąglenie komórek Vero na poziomie 80%.
    2. Obliczyć miano cytotoksyczne, które definiuje się jako odwrotność największego rozcieńczenia, które spowodowało zaokrąglenie 80% komórek Vero na g próbki. Na przykład, jeśli najwyższe rozcieńczenie wynosi 10-5, to współczynnik rozcieńczenia wyniesie 10-6 dla tej próbki. Zatem logarytm [końcowy współczynnik rozcieńczenia]/g próbki byłby log[106], co daje odwrotne miano 6,
      UWAGA: Komórki Vero muszą przejść co najmniej 3 - 4 pasaże i nie więcej niż 30 pasaży przed ich użyciem w tym teście26.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas reprezentatywnego badania, 5-tygodniowe myszy C57BL/6 WT były wstępnie leczone cefoperazonem w wodzie pitnej (0,5 mg/ml) przez 5 dni i pozwolono im na 2-dniowe płukanie zwykłą wodą pitną. Myszy prowokowano 105 zarodnikami C. difficile R20291 przez zgłębnik doustny w dniu 0 (Figura 1A). Myszy monitorowano pod kątem utraty masy ciała i objawów klinicznych (letarg, brak apetytu, biegunka i zgarbiona postawa) CDI przez 14 dni. Wyzwanie myszy C57BL ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten charakteryzuje przebieg kliniczny, w tym utratę masy ciała, kolonizację bakteryjną, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne w przewodzie pokarmowym, myszy leczonych antybiotykiem poddanych działaniu zarodników C. difficile R20291. W protokole jest kilka krytycznych kroków, w których niezbędna jest dbałość o szczegóły. Dokładne obliczenie inokulum zarodników C. difficile ma kluczowe znaczenie. Obliczenia te opierają się na oryginalnym spisie zarodników C. difficile , które...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają w tej chwili nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Trevorowi Lawleyowi z Wellcome Trust Sanger Institute za zarodniki C. difficile R20291 oraz Jamesowi S. Guyowi z North Carolina State University College of Veterinary Medicine za komórki Vero, oba wykorzystane w tym manuskrypcie. Histopatologia zwierząt została przeprowadzona w LCCC Animal Histopathology Core Facility na Uniwersytecie Karoliny Północnej w Chapel Hill, przy specjalnej pomocy Traci Raley i Amandy Brown. LCCC Animal Histopathology Core jest częściowo wspierany przez NCI Center Core Support Grant (2P30CA016086-40) dla UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Chcielibyśmy również podziękować Vincentowi Youngowi, Annie Seekatz, Jhansi Leslie i Cassie Schumacher za pomocne dyskusje na temat protokołu testu cytotoksyczności komórek Vero. JAW jest finansowany przez Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Research Training grant T32OD011130 przez NIH. CMT jest finansowany z grantu na rozwój kariery w dziedzinie metabolomiki K01GM109236 przez NIGMS NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#62 Perisept Sporydicial Disinfectant Cleaner SSS Navigator48027Ten produkt będzie wymagał rozcieńczenia zgodnie z zaleceniami producenta
0,22 μ m filtrFisherbrand09-720-3Alternatywa dla płyty filtracyjnej dla indywidualnych próbek testowanych w teście Vero Cell Assay
0,25% Trypsyna-EDTAGibco25200-056Musi być podgrzewany w łaźni wodnej w temperaturze 37 &; C przed użyciem
0,4% Trypan BlueGibco15250-061
1% Peniciilin/StreptomycinGibco15070-063
10% inaktywowany termicznie FBSGibco16140-071Musi być podgrzewany w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni; C przed użyciem
1 ml plastikowa strzykawka Zaopatrzenie medyczne BD309628
1x PBSGibco10010-023
2 ml Zakrętka do mikrowirówekCorning430917
96-dołkowa płaska płytka dolna do hodowli komórkowychCostar CorningCL3595
96-dołkowa płytka filtracyjnaMilliporeMSGVS2210
ThermoScientificAB-0558
Bacto AgarBecton Dickinson214010Część płytek TCCFA (patrz poniżej)
Bacto Proteose PeptoneBecton Dickinson211684Część płytek TCCFA (patrz poniżej)
CefoperazoneMP Bioworks199695
CefoxitineSigmaC47856Część płytek TCCFA (patrz poniżej)
Clostridium difficile Zestaw antytoksynTech LabsT5000Używany jako kontrola do testu komórek Vero
Clostridium difficile Lista toksyn ALaboratoria biologiczne152CKontrola pozytywna dla testu komórek Vero
D-cykloserynaSigmaC6880Część płytek TCCFA (patrz poniżej)
Woda destylowanaGibco15230
DMEM 1x MediaGibco11965-092Musi być podgrzany w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni; C przed użyciem
FruktozaFisherL95500Część płytek TCCFA (patrz poniżej)
HemocytometrBright-Line, SigmaZ359629
KH2PO4FisherP285-500Część płytek TCCFA (patrz poniżej)
MgSO4 (bezwodny)SigmaM2643Część płytek TCCFA (patrz poniżej)
Millex-GS 0,22 μ m filtrMillex-GSSLGS033SSFiltr do płyt TCCFA 
Na2HPO4SigmaS-0876Część płytek TCCFA (patrz poniżej)
NaClFisherS640-3Część płytek TCCFA (patrz poniżej)Jednorazowe
ostrze skalpela numer 10Miltex, Inc4-410
Talerze PCRFisherbrand14230244
Plastikowa szalka PetriegoKord-Valmark Marka2900
Sterylny plastikowy rozsiewacz komórek w kształcie litery LFisherbrand14-665-230
Strzykawka stepperowaDymax CorporationT15469
TaurocholateSigmaT4009Część płytek TCCFA (patrz poniżej)
Ultraczysta woda destylowanaInvitrogen10977-015
C57BL/6J MyszyThe Jackson Laboratory664Myszy powinny mieć od 5 do 8 tygodni
Mikroskop świetlny Olympus BX43FAparat fotograficzny Olympus Life Science
DP27Olympus Life Science
cellOprogramowanie Sens Dimension Olympus Nauki przyrodnicze

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
  3. Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
  4. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, Suppl 2 88-92 (2012).
  5. Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
  6. Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
  7. Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
  8. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
  9. Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. , (2016).
  10. Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
  11. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
  12. Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  13. Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
  14. Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
  15. Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
  16. Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, Suppl 1 19-31 (2008).
  17. Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
  18. Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
  19. Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
  20. He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
  21. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
  22. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 9, Unit9A.1 (2009).
  23. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50787(2013).
  24. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  25. Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S. Comparative Anatomy and Histology. Dintzis, S. M. , Academic Press. 15-40 (2012).
  26. Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. , Appendix 4, Appendix 4E (2008).
  27. Clostridium difficile Toxin/Antitoxin Kit Cat No.T5000. , TECHLAB. Available from: http://www.techlab.com/wp-content/uploads/2013/06/t5000isert_rev_0307.pdf (2007).
  28. Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114(2014).
  29. Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
  30. Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045(2016).
  31. Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
  32. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
  33. Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102(2009).
  34. Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cefoperazone Mouse ModelClostridium difficile InfectionBacterial EnumerationToxin CytotoxicityHistopathologic ChangesFecal Sample CollectionSpore Inoculum PreparationAnaerobic Chamber UseClinical Disease MonitoringColony Forming Units

Powiązane artykuły