Procedury chirurgiczne i metodyka przedklinicznego mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo

Podsumowanie

Brakuje modeli przedklinicznych oceniających terapię adjuwantową ukierunkowaną na przerzuty raka piersi. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy mysi model przerzutów de novo gruczolakoraka sutka do płuc, w którym terapie stosowane w trybie adjuwantowym (pooperacyjna resekcja guzów pierwotnych) mogą być oceniane pod kątem skuteczności w oddziaływaniu na wcześniej zasiane przerzuty do płuc.

Streszczenie

Ograniczającym szybkość aspektem transgenicznych mysich modeli gruczolakoraka sutka jest to, że pierwotne obciążenie guzem w tkance sutkowej zazwyczaj definiuje punkty końcowe badania. W związku z tym badania koncentrujące się na wyjaśnieniu mechanizmów przerzutów de novo w późnym stadium są zagrożone, podobnie jak badania oceniające skuteczność terapii przeciwnowotworowych ukierunkowanych na mediatory przerzutów w leczeniu adiuwantowym. Liczne modele mysiego raka sutka zostały opracowane poprzez ukierunkowaną ekspresję dominujących onkoprotein do komórek nabłonka sutka, dając modele zmiennie naśladujące histopatologiczne i zdefiniowane transkryptomem podtypy raka piersi powszechne u kobiet1. Chociaż wiele nauczyliśmy się na temat biologii karcynogenezy sutka za pomocą tych modeli, ich użyteczność w identyfikacji cząsteczek regulujących wzrost przerzutów w późnym stadium jest zagrożona, ponieważ myszy są zwykle poddawane eutanazji we wcześniejszych punktach czasowych z powodu znacznego obciążenia guzem pierwotnym. Ponadto, ponieważ znaczny odsetek kobiet, u których zdiagnozowano raka piersi, otrzymuje terapię uzupełniającą po chirurgicznej resekcji guzów pierwotnych, a przed pojawieniem się wykrywalnej choroby przerzutowej, pilnie potrzebne są przedkliniczne modele przerzutów de novo jako platformy do oceny nowych terapii ukierunkowanych na ogniska przerzutowe. Aby rozwiązać te niedobory, opracowaliśmy mysi model przerzutów de novo raka sutka, w którym pierwotne guzy sutka są chirurgicznie wycinane, a następnie ogniska przerzutowe rozwijają się w ciągu 115 dni po operacji. Ta długa latencja zapewnia wykonalny model do identyfikacji funkcjonalnie istotnych regulatorów progresji przerzutów u myszy bez guza pierwotnego, a także model do oceny przedklinicznej skuteczności terapeutycznej środków mających na celu blokowanie funkcjonalnie istotnych cząsteczek wspomagających przeżycie i wzrost guza.

Wprowadzenie

Kobiety w Ameryce Północnej mają ~12% ryzyko zachorowania na raka piersi w ciągu całego życia²; większość z tych osób będzie miała usunięte guzy pierwotne poprzez operację, a następnie, w zależności od podtypu nowotworu, zostanie poddana celowanej, endokrynologicznej, chemioterapii i/lub radioterapii w trybie uzupełniającym³. Przykłady obejmują kobiety, u których zdiagnozowano nowotwory z dodatnim receptorem hormonalnym, otrzymujące terapie antyestrogenowe oraz kobiety z guzami HER2-dodatnimi, otrzymujące terapie ukierunkowane na HER2 z radioterapią/chemioterapią, podczas gdy żadne terapie celowane nie są jeszcze dostępne dla guzów potrójnie ujemnych³. Pomimo postępów w radioterapii, chemioterapii, spersonalizowanych i opartych na hormonach terapiach, które uzupełniają resekcję chirurgiczną, choroba nawraca u 30-70% kobiet, u których zdiagnozowano chorobę w stadium II lub III⁴, ponieważ terapie są w dużej mierze nieskuteczne w zwalczaniu choroby przerzutowej w odległych narządach, w tym w płucach, kościach, mózgu i/lub wątrobie⁵. Jest to szczególnie istotne, biorąc pod uwagę, że gdy choroba przerzutowa występuje przy braku pierwotnego wzrostu guza, oznacza to, że rozsiane komórki nowotworowe prawdopodobnie były już obecne w narządach wtórnych w momencie ostatecznej operacji. Dlatego pilnie potrzebne są terapie zdolne do wyeliminowania lub spowolnienia wzrostu guzów przerzutowych.

Podczas gdy mysie modele de novo kancerogenezy sutka były niezwykle pouczające w ujawnianiu mechanizmów regulujących postęp nowotworowy¹, istniejące modele również mają kilka ograniczeń. Jednym z nich jest fakt, że modele transgeniczne de novo zazwyczaj rozwijają guzy pierwotne w wielu gruczołach sutkowych, przy czym obciążenie pierwotnym guzem ogranicza czas trwania badań. Podczas gdy pierwotna ucieczka komórek nowotworowych i wysiewanie przerzutów prawdopodobnie występują na wczesnym etapie progresji nowotworu w tych modelach, szczery rozwój guzów przerzutowych następuje późno i, w zależności od modelu myszy i tła szczepu, często jest częściowo penetrant¹. To jeszcze bardziej ogranicza użyteczność modeli de novo do odkrywania cząsteczek regulujących przerzuty w narządach wtórnych oraz do oceny przedklinicznej skuteczności terapii w warunkach adiuwantowych.

Aby obejść te ograniczenia, opracowaliśmy de novo autochtoniczny model przerzutów raka sutka do płuc. Rodzicielskie transgeniczne samice (tj. MMTV-PyMT na tle szczepu FVB/n dla badań opisanych w niniejszym dokumencie) z późnymi nowotworami sutka de novo są w wieku ~100 dni⁶, w którym to momencie ich pierwotne guzy są chirurgicznie wycinane i enzymatycznie dysocjowane w zawiesiny pojedynczych komórek. Zawiesiny (1 x 10⁶ komórek) są z kolei ortotopowo eksplantowane do 6-7-tygodniowych syngenicznych samic myszy, u których pojedyncze pierwotne guzy sutka rozwijają się w okresie od 38 do 60 dni (Figura 1A). Przy określonej wielkości guza (od 172 do 450 mm³) myszy biorcy są znieczulane, a guzy pierwotne są chirurgicznie wycinane tak, aby zminimalizować odrost guza w miejscu operacji, co jest zgodne z operacją u kobiet (rysunek uzupełniający 1). Na tle szczepu FVB/n myszy rozwijają histologicznie wykrywalne ogniska przerzutowe w płucach z penetracją 45% przez ~ 115 dni po operacji (Figura 1B). Dzięki wydłużonemu opóźnieniu wzrostu guza z przerzutami, model ten jest wyjątkowo przygotowany do dostarczania terapii uzupełniającej oraz do wyjaśniania i oceny podstawowej biologii wpływającej na progresję przerzutów po chirurgicznym usunięciu guzów pierwotnych.

Protokół

Zwierzęta użyte w poniższym protokole są objęte Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Oregon Health & Science University, który został zaprojektowany tak, aby był zgodny z przepisami Ustawy o Dobrostanie Zwierząt i Polityki Publicznej Służby Zdrowia (PHS).

Utrzymanie sterylnych warunków: Sterylizowane narzędzia powinny być używane i między myszami, powinny być wytarte do czysta sterylną gazą, wypłukane w PBS, a następnie sterylizowane środkiem dezynfekującym 70% etanolu przez co najmniej 15 minut. Do operacji przetrwania należy nosić czepek chirurgiczny, maskę na twarz, fartuch i rękawiczki. Przedoperacyjne przygotowanie zwierzęcia do operacji przeżycia jest zawarte w poniższym protokole. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z listą odczynników i sprzętu.

1. Izolacja i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z pierwotnych guzów sutka

1. Znieczulić 100-dniowe transgeniczne myszy MMTV-PyMT (FVB/n) dawczyni i utrzymać je w ciągłej sedacji, podając 2% izofluranu przez maskę znieczulającą. Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona z brakiem odruchu szczypania stopy.
2. W sterylnym otoczeniu należy wyciąć pierwotne guzy sutka od 100-dniowych transgenicznych samic myszy MMTV-PyMT (FVB / n), oddzielając guz sutka od leżącej nad nim skóry i otaczającej tkanki tłuszczowej i / lub węzłów chłonnych za pomocą sterylnych nożyczek. Poddaj znieczulone myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
3. Za pomocą sterylnych nożyczek lub skalpela ręcznie zmiel pierwotne guzy na małe kawałki (~1,0 mm³). Umieść fragmenty guza w 3,0 mg / ml kolagenazy A i 4,0 U / ml DNazy I rozpuszczonej w DMEM. Użyj ~10 ml powyższej pożywki trawiącej na guz o średnicy 1,0 cm.
   1. Trawienie należy przeprowadzać w sterylnej butelce o pojemności 25 ml ze sterylnym mieszadłem przy ~125 obr./min i temperaturze 37 °C przez 40 min.
4. Zatrzymać trawienie, dodając płodową surowicę bydlęcą (FBS) do końcowego rozcieńczenia 10% i umieścić całą mieszaninę na mokrym lodzie, gdzie jest utrzymywana.
5. Przefiltruj strawioną zawiesinę guza przez nylonowe sitko o wielkości 0,7 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wyrzuć guz pozostały w sitku. Odwirować supernatant przy 300 x g w temperaturze 4 °C.
6. Ponownie zawiesić osad w 10 ml DMEM na 1,0 cm guza i ponownie przefiltrować przez nylonowe sitko o wielkości 0,7 μm. Policzyć stężenie komórek, a następnie odwirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C.
7. Zawiesić osad w 10% dimetylosulfotlenku z 90% FBS w stężeniu 2 x 10⁷ żywych komórek/ml. Zawiesiny jednokomórkowe całego guza pierwotnego należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Ortotopowe wstrzyknięcie guza sutka

1. Częściowo rozmrozić zamrożone zawiesiny guza pierwotnego w temperaturze 37 °C, aż zamrożony osad będzie mógł zostać uwolniony z probówki kriogenicznej do 20 ml DMEM i policzyć komórki. Odwirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić komórki w DMEM 1:1: preparat błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu, wyekstrahowany z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) w stężeniu 1 x 10⁷ komórek/ml (patrz tabela materiałów).
2. Umieść znieczuloną biorcę samicy myszy syngenicznej brzuszną stroną do góry i utrzymuj w ciągłej sedacji, podając 2% izofluranu przez maskę anestezjologiczną.
3. Wysterylizuj prawe 4. miejsce wstrzyknięcia gruczołu sutkowego za pomocą aerozolu 70% etanolu i nałóż poli(winylopirolidon)-jod za pomocą sterylnego wacika.
4. Wstrzyknąć 100 μl (1 x 10⁶ żywych komórek z zamrożonych zawiesin guza pierwotnego) ukośnie do góry do nieoczyszczonej prawej czwartej gruczołu sutkowego 6 do 10 tygodniowej samicy myszy FVB/n za pomocą strzykawki insulinowej 29 G 0,3 ml.

3. Chirurgiczna resekcja ortotopowego guza sutka

1. 38-60 dni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych należy poddać eutanazji myszy niewykazujące ortotopowej objętości guza w zakresie od 172 do 450 mm³ objętości [długość x (szerokość²)/2] (około 75% myszy, którym wstrzyknięto).
2. Umieść znieczulone myszy wykazujące odpowiednią wielkość guza brzuszną stroną do góry pod ciągłą sedacją, podając 2% izofluranu przez maskę anestezjologiczną i potwierdź, że mysz jest odpowiednio znieczulona z brakiem odruchu szczypania stopy. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas sedacji.
3. Rozpyl 70% etanolu, aby wysterylizować obszar chirurgiczny otaczający guz pierwotny, a następnie nałóż poli(winylopirolidon)-jod za pomocą sterylnego bawełnianego wacika.
   UWAGA: Depilacja w miejscu operacji spowodowała przeczosy skóry i/lub infekcje u ~5% myszy i dlatego została wykluczona z tego etapu (dane nie pokazane).
4. Jak pokazano w Rysunek 1C, wykonaj wstępne nacięcie skóry za pomocą nożyczek przyśrodkowo-ogonowych do guza.
5. Następnie wykonaj górne wycięcie skóry (Rysunek 1C) przyśrodkowo do guza. Zwróć uwagę na konieczność kauteryzacji wszelkich naczyń krwionośnych odżywiających guz znajdujący się na skórze przed przedłużeniem nacięcia.
6. Kontynuuj nacięcie skóry bocznie (z tyłu guza), a następnie wykonaj górne wycięcie skóry (bocznie do guza) i wycięcie przyśrodkowe (powyżej guza) (Rysunek 1C).
7. Po wycięciu skóry na obwodzie wokół guza (Ryc. 1C), podnieś leżącą na powierzchni skórę przyczepioną do guza za pomocą kleszczy, jednocześnie tępo wycinając guz z dala od mięśni ściany brzucha i utrzymując gruczoły sutkowe w stanie nienaruszonym.
8. Zidentyfikuj (przez rozwarstwienie) i kauteryzuj duże naczynia biegnące przez 4. i 5. gruczoły sutkowe.
Wyciąć około połowy 4 i 5 gruczołów sutkowych w miejscu kauteryzacji, aby uwolnić guz, leżącą nad nim skórę i segmenty gruczołów sutkowych (Rysunek 1C).
10. W przypadku krwawienia zidentyfikuj aktywnie krwawiące naczynia i natychmiast je przyżegaj. Jeśli utracisz więcej niż 250 μl krwi, wyklucz mysz z badania i poddaj ją eutanazji.
11. Zamknij miejsca wycięć klipsami do ran za pomocą aplikatora do klipsów do ran (Rysunek 1C).
    UWAGA: Usuń klipsy do ran 10 dni po operacji za pomocą środka do usuwania klipsów do ran.
12. Podawać podskórnie ciepłą, sterylną sól fizjologiczną (4% masy ciała zwierzęcia) i utrzymywać zwierzę w cieple za pomocą lampy grzewczej. Sprawdzaj zwierzęta co 5-10 minut podczas rekonwalescencji po znieczuleniu.
    UWAGA: Podawanie bupiwakainy lub lidokainy zwiększało śmiertelność pooperacyjną (dane nie pokazane). Myszy, które wykazywały oznaki bólu (garbienie się, niechęć do ruchu, brak pielęgnacji) 1 godzinę po operacji zostały poddane eutanazji.
    1. Gdy mysz w pełni wyzdrowieje, zwróć ją do towarzystwa innych myszy.

4. Izolacja i przetwarzanie krwi i płuc do cytometrii przepływowej i histologii

1. W punktach końcowych badania należy w razie potrzeby przygotować myszy do różnych ocen histopatologicznych. 90 minut przed eutanazją podać każdej myszy dootrzewnowe wstrzyknięcie bromodeoksyurydyny (BrdU, 50 μg/g masy myszy) w stężeniu 6,25 μg/μL w 1x PBS.
   UWAGA: Zamrożone zapasy rozpuszczonej bromodeoksyurydyny zużyć w ciągu 1 miesiąca po przygotowaniu.
2. 10 minut przed eutanazją, przy znieczuleniu myszy, należy pobrać krew zadoczodołową (>500 μl) za pomocą heparynizowanych kapilarek, a następnie przenieść do probówek pokrytych dipotasowym EDTA trzymanych na lodzie.
3. Aby usunąć płuca i pozostałą tkankę sutkową, wykonaj nacięcie w linii środkowej nożyczkami od dolnej części brzucha do ust, aby odsłonić jamę piersiową i otrzewnową (Rycina 2A) i złuść skórę z boku, aby odsłonić również pozostałe prawe 4 i 5 gruczoły sutkowe.
4. Wytnij pozostałą tkankę gruczołu sutkowego i zbadaj ją, aby wykluczyć odrost pierwotnego guza, oceniając seryjnie ciętą tkankę zatopioną w parafinie (FFPE) utrwaloną w formalinie za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) (Uzupełniające Ryc. 1).
5. Aby usunąć płuca, otwórz ścianę brzucha do przepony nożyczkami, a następnie poddaj zwierzę eutanazji, przecinając aortę brzuszną w celu odprowadzenia krwi przed perfuzją płuc (Rysunek 2B-2C).
6. Przetnij przeponę wzdłuż klatki piersiowej od strony brzucha, unikając płuc i serca. Następnie odsłoń klatkę piersiową, przecinając boczne boki klatki piersiowej (Rysunek 2D).
7. Używając igły o rozmiarze 23 na strzykawce o pojemności 20 ml, wykonaj perfuzję płuc za pomocą ~5,0 ml DPBS (~10 ml / min) przez prawą komorę serca, aż płuca staną się całkowicie białe (Rysunek 2E-2F). Natychmiast odetnij serce od głównych naczyń, aby krew nie przedostała się ponownie do płuc.
8. Aby tkanka płucna została utrwalona i przetworzona do oceny histopatologicznej, wstrzyknij ~ 1,0 ml 10% formaliny w temperaturze 4 °C do odsłoniętej tchawicy skośnie stroną w kierunku płuc za pomocą igły o rozmiarze 23 (Rysunek 2G-2H). Przerwij wstrzykiwanie, gdy płuca zostaną całkowicie rozszerzone i wypełnione utrwalaczem (Rysunek 2I).
9. Wyciąć płaty płuc z tchawicy i emersji utrwalić tkankę płucną w neutralnie buforowanej formalinie w celu późniejszego zatopienia parafiny lub zamrożenia pożywki OCT, zgodnie ze standardowymi procedurami histopatologicznymi.
10. Ilościowo oceń obciążenie przerzutami w płucach przez seryjne cięcie tkanki płucnej FFPE i oceń skrawki mikrotomów (100 μm, trzynaście sekcji), przez barwienie H&E (Rysunek 1B).

Wyniki

Ponad 75% myszy biorców, które otrzymały 1 x 10⁶ komórki z pierwotnych guzów piersi pochodzące od myszy MMTV-PyMT, rozwijają pojedyncze gruczolakowate raki piersi o rozmiarach od 172 do 450 mm³ w ciągu 38–60 dni (dane nie przedstawiono). Myszy kwalifikujące się do randomizacji są następnie włączane do grup badawczych po chirurgicznym usunięciu guzów pierwotnych, jak pokazano (Rysunek 1C). Nawroty guza pierwotnego zidentyfikowano u mniej ...

Dyskusja

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów:

Podczas wycinania guza z dala od ściany jamy brzusznej, guz może pozostać przylegający do ściany jamy brzusznej. Zaobserwowano to u <5% myszy, którym wstrzyknięto guz (dane nie pokazane). W przypadku myszy z guzami przylegającymi do ściany jamy brzusznej mysz powinna zostać poddana eutanazji, ponieważ resekcja jest trudna bez pierwotnego wzrostu guza.

Ograniczenia modelu/techniki:

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Zamówienie na receptę
Kolagenaza A		Roche 11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 ml butelka Pyrex	Sigma-Aldrich	CLS139525
Surowica bydlęca	Atlanta Bio	S11150
0,7 i mikro; M Nylonowe sitko	Corning	352350
Rurka stożkowa 50 ml	VWR	89039-658
Sulfotlenek dimetylu	Sigma-Aldrich	D2650
Matrigel o obniżonym współczynniku wzrostu	BD	354230	Preparat rozpuszczalnej błony podstawnej o obniżonym czynniku wzrostu, ekstrahowany z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)
Poli(winylopirolidon)– Kompleks jodu	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0,3 ml strzykawka insulinowa	BD	324702
Zestaw do kauteryzacji małych naczyń	FST	18000-00
Klipsy do ran	Texas Scientific	205016
AutoClip aplikator do nawijania ran	BD	427630
Narzędzie do usuwania klipsów do nawijania AutoClip	BD	427637
Bromodeoksyurydyna	Roche	10280879
Heparynizowane rurki kapilarne	Rurki Fisher	22362566
Microtainer z dipotasem EDTA
20 ml	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
Oct-medium zamrażające	VWR	25608930
Formalina, buforowana, 10% (bufor fosforanowy)	Fisher	SF100-4
23g igła	Fisher	14-826-6B
FVB/n mysz	Jackson	Laboratories 001800

Strzykawka BD 365974