Artykuł metodologiczny

Wykluczenie według wielkości i chromatografia jonowymienna online na linii badawczej SAXS

16.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54861

⸱

5 stycznia 2017

 ,  , 
1Structural Biology Group, European Synchrotron Radiation Facility, 2European Molecular Biology Laboratory, 3School of Chemical and Physical Sciences, Keele University, 4Groupe de Microscopie Electronique et Méthodes, Institut de Biologie Structurale

W tym artykule

Podsumowanie

Określenie struktury roztworu białka za pomocą rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) wymaga próbek monodyspersyjnych. W tym miejscu przedstawiamy dwie możliwości zapewnienia minimalnych opóźnień między przygotowaniem próbki a akwizycją danych: chromatografia wykluczania wielkości online (SEC) i chromatografia jonowymienna online (IEC).

Streszczenie

Biologiczne rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (BioSAXS) to potężna technika w biologii molekularnej i strukturalnej, używana do określania struktury roztworu, wielkości i kształtu cząstek oraz stosunku powierzchni do objętości makromolekuł. Technika ta ma zastosowanie do bardzo szerokiej gamy warunków roztworu obejmujących szeroki zakres stężeń, wartości pH, siły jonowej, temperatur, dodatków itp., ale próbka musi być monodyspersyjna. To zastrzeżenie doprowadziło do wdrożenia systemów chromatografii cieczowej na liniach badawczych SAXS. W tym miejscu opisujemy wcześniejszą integrację wykluczania wielkości (SEC) i chromatografii jonowymiennej (IEC) na linii badawczej, różne metody optymalnego odejmowania tła i redukcji danych. Jako przykład opisujemy, w jaki sposób używamy SEC i IEC-SAXS na fragmencie niezbędnego białka wirusa krowianki D5, składającym się z domeny helikazy D5N. Określamy jego ogólny kształt i masę cząsteczkową, pokazując heksameryczną strukturę białka.

Wprowadzenie

BioSAXS to potężne narzędzie do określania kształtu obiektów o rozmiarachnano 1-4. Rozpraszanie promieni rentgenowskich przez roztwór zawierający makrocząsteczki o rozmiarach w zakresie nm rejestrowane jest pod bardzo małymi kątami. Ten zakres kątowy zawiera informacje o parametrach globalnych: promieniu bezwładności; największa odległość od wpustu; kształt cząstek; oraz stopień fałdowania, denaturacji lub nieporządku. Technika ta nie wymaga kryształów, a makrocząsteczka pozostaje w roztworze, a zatem może być przechowywana w warunkach naśladujących pewne ważne parametry komórki, takie jak siła jonowa, pH itp. Znajomość tych czynników może pomóc na przykład w określeniu fizjologicznie istotnego stanu oligomerycznego białka będącego przedmiotem zainteresowania lub w walidacji proponowanego modelu kompleksu. Charakterystyka oddziaływań białko-białko w różnych warunkach buforowych, tworzenie modeli brakujących domen, udoskonalanie modeli homologii oraz określanie dyskretnych stanów fałdowania i niesfałdowania może być przeprowadzone szybko iłatwo5.

Jak w przypadku każdej techniki, BioSAXS ma wewnętrzne słabości: zagregowane lub zdenaturowane próbki, mieszaniny cząstek, próbki niejednorodne, uszkodzenia spowodowane promieniowaniem i niedopasowania mogą skutkować niemożliwymi do zinterpretowania danymi. W przypadku wielu metod analizy zakłada się domyślnie, że próbka jest monodyspersyjna, co jest często wymogiem trudnym do uzyskania w praktyce. W wielu przypadkach degradacja próbki jest subtelna i nie można jej samodzielnie wykryć w danych, a każda próba interpretacji danych daje niedokładne lub nawet mylące wyniki. Aby przezwyciężyć te przeszkody, na wielu liniach badawczych zastosowano połączenie chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) i SAXS, aby zapewnić jakość danych i uczynić tę technikę bardziej dostępną dla coraz trudniejszych próbek6-11. Niedawno dodaliśmy nową metodę do repertuaru, opracowując SAXS12 sprzężoną z chromatografią jonowymienną (IEC) online. Obie techniki otwierają SAXS na szeroki zakres cząstek biologicznych, które wcześniej były niemożliwe do analizy. Wybór metody zależy od właściwości biofizycznych interesujących nas cząstek.

SEC rozdziela makrocząsteczki według ich wielkości, przy czym do separacji potrzebne jest co najmniej 10% różnicy w pozornej masie cząsteczkowej. Fizyczne ograniczenia kolumny i właściwości fizjologiczne próbek, takie jak powierzchnie hydrofobowe, elastyczność i brak stabilności, również komplikują gromadzenie, analizę i interpretację danych.

Chromatografia jonowymienna, która rozdziela cząsteczki na podstawie ich ładunku, a co za tym idzie, ich powinowactwa wiązania do kolumny IEC, może być stosowana zamiast lub oprócz SEC. Całkowitym ładunkiem można łatwo manipulować poprzez zmianę pH lub zmianę stężenia soli w buforze, zapewniając stosunkowo prostą metodę kontrolowanej elucji cząsteczek z kolumny IEC. Dzięki zastosowaniu ładunku, separacja podobnych typów i rozmiarów cząsteczek, które w przeciwnym razie byłyby trudne do rozdzielenia, może być wykonywana rutynowo za pomocą IEC. Dodatkowo IEC ma tę zaletę, że jest w stanie poradzić sobie z rozcieńczonymi próbkami, co pozwala uniknąć etapów koncentracji, które niosą ze sobą potencjalne ryzyko denaturacji białka. Niestety, ponieważ rozkład ładunku jest w dużym stopniu zależny od próbki, IEC wymaga optymalizacji pod względem pH i stężeń soli13,14.

Dla wielu białek, które są trudne do ekspresji, oczyszczenia, lub obu, dostępne są tylko niewielkie ilości próbek do zbadania. Ważne jest, aby być wydajnym i zminimalizować liczbę etapów oczyszczania, a tym samym straty. Z tego powodu ostatni etap oczyszczania odbywa się w trybie online bezpośrednio przed akwizycją danych SAXS, aby zwiększyć prawdopodobieństwo zebrania dobrego zestawu danych.

Tutaj prezentujemy i porównujemy online SEC-SAXS i IEC-SAXS. Obie techniki zostały wdrożone na linii badawczej BioSAXS BM29 w Europejskim Ośrodku Promieniowania Synchrotronowego (ESRF) w Grenoblewe Francji 15. Jako przypadek testowy wykorzystaliśmy domenę D5N i helikazę białka wirusa krowianki D5, które było dość trudne do strukturalnej analizy przy użyciu innych metod. Wirus krowianki należy do rodziny Poxviridae i jest w 98% identyczny z wirusem ospy wietrznej, przyczyną ospy prawdziwej. Korzystając z systemu krowianki, badamy maszynerię replikacji, skupiając się tutaj na niezbędnej helikazie-prymazie D5.

D5 to białko o masie 95 kDa z N-końcową domeną archeo-eukariotycznej prymazy (AEP)16, po której następuje region klastra cysteiny (res. 240-345)16. Dalej w kierunku C-końca znajduje się domena D5N (res. 340-460), która jest zawsze związana z helikazami typu D5, a na końcu domena helikazy nadrodziny 3 (SF3) (res. 460-785) 17 (Rysunek 1A). Domena helikazy D5 buduje heksameryczną strukturę pierścieniową, która jest potrzebna do ścisłego wiązania się z DNA. Dzięki niedawnym badaniom SAXS i EM znane są obecnie niskorozdzielcze struktury domen prymazy i helikazy18.

Tutaj pokazujemy, jak korzystać z zaimplementowanych technik chromatografii online na linii badawczej BioSAXS BM29 w ESRF, aby uzyskać wgląd w strukturę C-końcowego fragmentu (reszta 323-785) D5.

Protokół

1. Opis przygotowania offline i generowania próbki białka delecji D5

UWAGA: Konstrukt D5323-785 (Rysunek 1A) został sklonowany, wyrażony i oczyszczony zgodnie z opisem18.

  1. Sklonuj konstrukcję do wektora pProEx HTb
    1. Przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) na D5R przy użyciu starterów 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3' i 5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3' oraz mieszaniny reakcyjnej PCR z polimerazą, zgodnie z zaleceniami producenta.
    2. Oczyść fragmenty PCR za pomocą kolumn wirowych, postępując zgodnie z zaleceniami producenta.
    3. Fragmenty PCR i plazmid należy trawić enzymami restrykcyjnymi NcoI i HindIII, postępując zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi składu buforu i czasu inkubacji.
    4. Uruchom fragmenty na 1% żelu agarozowym w 0,5x buforze TAE (20 mM Tris, 10 mM kwasu octowego i 0,5 mM EDTA) i wybarwić żel barwnikiem DNA.
    5. Wystaw żel na działanie promieniowania UV.
      Uwaga: Nosić środki ochrony osobistej! Wyciąć prążki strawionych fragmentów PCR i strawionego plazmidu i oczyścić DNA za pomocą zestawu kolumny wirowej do oczyszczania żelu, postępując zgodnie z zaleceniami producenta.
    6. Oczyszczone fragmenty PCR należy związać z plazmidem za pomocą zestawu do szybkiej ligacji, postępując zgodnie z zaleceniami producenta.
    7. Przekształć poprzez szok termiczny produkt z reakcji ligacji w kompetentne bakterie zoptymalizowane pod kątem amplifikacji plazmidu.
      1. Dodać połowę produktu do podwiązania do fiolki z bakteriami.
      2. Inkubować probówkę reakcyjną na lodzie przez 20 minut.
      3. Inkubować probówkę w temperaturze 42 °C przez 30 s.
      4. Umieść probówkę na lodzie na 2 minuty.
      5. Dodać 1 ml bulionu Luria Bertani (LB) (Miller) bez antybiotyków i pozostawić komórki do odzysku w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
      6. Wiruj komórki w temperaturze 16 100 x g przez 3 sekundy w wirówce stołowej z mikroprobówkami i usuń większość pożywki.
      7. Rozprowadzić komórki na płytce agarowej LB z ampicyliną (50 μg/ml final) i pozwolić koloniom rosnąć w temperaturze 37 °C przez noc.
    8. Umieścić kolonię w 3 ml LB z ampicyliną (50 μg/ml final) i hodować kulturę w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 160 obr./min przez noc.
    9. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu miniprep, aby wyodrębnić plazmid.
    10. Wyślij próbkę plazmidu do sekwencjonowania i przeanalizuj sekwencję pod kątem braku mutacji i prawidłowej insercji.
    11. Przekształć konstrukt pProEx HTb D5323-785 w bakterie zoptymalizowane pod kątem ekspresji białek (użyj 1 μl i postępuj zgodnie z krokami w kroku 1.1.7). Rozprowadzić bakterie na płytce agarowej LB z ampicyliną (50 μg/ml final).
    12. Aby stworzyć kulturę wyjściową, umieść jedną kolonię w 300 ml LB z ampicyliną (50 μg/ml końcową) i hoduj bakterie w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 160 obr./min przez noc.
  2. Zaszczepić 12 x 1 l LB w obecności ampicyliny (50 μg/ml końcowy), każdy z 20 ml kultury starterowej bakterii pProEx HTb D5323-785 w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia OD600 = 0,3. Obniżyć temperaturę do 18 °C i wywołać ekspresję przy OD600 = 0,5 przy 1 mM IPTG. Inkubować kultury, wytrząsając je przez noc z prędkością 160 obr./min i w temperaturze 18 °C.
  3. Zebrać bakterie przez odwirowanie w temperaturze 50 000 x g i w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Zawiesić granulki bakteryjne w około 150 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mM β-merkaptoetanolu i 10% glicerolu) z 1x inhibitorem proteazy i 25 jednostkami (U)/10 ml DNazy. Liza bakterii poprzez sonikację na lodzie (sonda 1 cal, 50% mocy, impuls 0,5 s, przerwa 0,5 s, 3x 5 min).
  4. Załadować supernatant do kolumny o powinowactwie do niklu (kolumna Ni, objętość złoża 1,5 ml) i przepłukać go 10 objętościami kolumny (CV) buforu wiążącego (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-merkaptoetanolu i 10% glicerolu), 10 CV buforu płuczącego (50 mM Tris-HCl [pH 7], 1 M NaCl, 10 mM β-merkaptoetanolu, i 10% glicerolu) oraz 10 CV płukania imidazolem (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-merkaptoetanolu, 10% glicerolu i 30 mM imidazolu). Eluować D5323-785 (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-merkaptoenol, 10% glicerolu i 200 mM imidazolu).
  5. Sprawdź różne etapy oczyszczania za pomocą elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu (SDS) i poliakryloamidu (PAGE).
    1. Załaduj 2-20 μl każdego etapu oczyszczania zmieszanego z 1x barwnikiem ładującym (2x: 4% SDS, 20% glicerolu, 120% mM Tris-HCl [pH 6,8] i 0,02% wagowo-objętościowo błękitu bromofenolowego) na 10% żelu SDS i uruchom je przy 200 V w 1x buforze do pracy Laemmli (25 mM Tris, 0,192 M glicyny i 0,1% SDS).
    2. Żel zabarwić gotowym do użycia roztworem Coomassie blue.
  6. Wymienić bufor eluowanego białka z buforem wiążącym za pomocą kolumny odsalającej zgodnie z instrukcją producenta.
  7. Rozszczepić znacznik His, dodając endopeptydazę z inkluzją jądrową wirusa wytrawiania tytoniu (TEV, 1 mg/100 mg białka) do roztworu białkowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez noc.
  8. Sprawdź trawienie, wykonując SDS-PAGE (patrz krok 1.5)
  9. Zrównoważ kolumnę Ni w buforze wiązania. Pozwól, aby roztwór białkowy przeszedł przez kanał i przemyć kulki 2 CV buforu płuczącego imidazolu, jednocześnie zbierając przepływ.
  10. Zagęścić białko za pomocą koncentratora odśrodkowego do końcowej objętości 0,5 ml.
  11. Wstrzyknąć skoncentrowane białko do kolumny wykluczającej wielkość zrównoważonej żelowym buforem filtracyjnym (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10% glicerolu i 1 mM ditiotreitolu [DTT]).
  12. Zebrać przepływ we frakcjach o pojemności 0,5 ml.
  13. Sprawdzić obecność i czystość białka w próbkach pików, wykonując SDS-PAGE (patrz krok 1.5).
  14. Połącz frakcje eluowanego piku D5323-785. Rozcieńczyć próbkę do 25 mM NaCl i 5% glicerolu, utrzymując stałe stężenia Tris i DTT (dla 5 ml roztworu białka w 20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10% glicerolu i 1 mM DTT, najpierw dodać 5 ml 20 mM Tris-HCl [pH 7] i 1 mM DTT, a następnie dodać 20 ml 20 mM Tris-HCl [pH 7], 5% glicerolu i 1 mM DTT).
  15. Załadować próbkę do kolumny jonowymiennej. Użyj buforu A (20 mM Tris [pH 7], 25 mM NaCl, 5% glicerolu i 1 mM DTT) i buforu B (20 mM Tris [pH 7], 1 M NaCl, 5% glicerolu i 1 mM DTT), aby utworzyć gradient soli od 25 mM do 1 M.
  16. Zebrać eluowane białko we frakcjach o pojemności 1,5 ml.
  17. Sprawdź obecność i czystość białka w próbkach pików, wykonując SDS-PAGE (patrz krok 1.5 i rysunek 1B)
  18. Ponownie zagęścić roztwór białkowy w koncentratorze odśrodkowym do końcowej objętości 0,5 ml.
  19. Ponownie uruchomić skoncentrowane białko na kolumnie wykluczającej wielkość w żelowym buforze filtracyjnym (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 5% glicerolu i 1 mM DTT; patrz krok 1.11).

2. Gromadzenie danych

UWAGA: Poproś o czas promieniowania tak wcześnie, jak to możliwe. W przypadku ESRF wytyczne dotyczące dostępnych rodzajów dostępu oraz sposobu składania wniosków można znaleźć na stronie:
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. Po zaakceptowaniu propozycji i zaproszeniu do eksperymentu, wszyscy uczestnicy muszą odbyć szkolenie z zakresu bezpieczeństwa. Po walidacji szkolenia należy wypełnić "Formularz A" (za pośrednictwem portalu użytkownika ESRF), aby zadeklarować badaczy odwiedzających linię badawczą w celu przeprowadzenia eksperymentu, wraz z wymaganymi informacjami dotyczącymi bezpieczeństwa próbek. Skontaktuj się z lokalną osobą kontaktową, aby omówić eksperyment.

  1. Gromadzenie danych SEC-SAXS
    UWAGA: Do oczyszczania online należy użyć systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) zainstalowanego w BM29. System składa się z odgazowywacza liniowego, pompy dwuskładnikowej, zaworu do wyboru bufora i gradientów, automatycznego podajnika próbek, fotospektrometru UV-VIS i konduktometru. Jest on bezpośrednio podłączony do kapilary przepływowej jednostki ekspozycjiSAXS 19.
    1. Odłożyć 1 ml żelowego buforu filtracyjnego na bok. Podłącz butelkę buforową do systemu SEC (domyślnie jest to port A).
    2. Wybierz natężenie przepływu w zależności od używanej kolumny. Uwaga: W przypadku zastosowanej tutaj kolumny wykluczającej rozmiar natężenie przepływu wynosi 0,1 ml/min. Zdefiniuj maksymalne ciśnienie dla kolumny, zwróć uwagę na przeciwciśnienie i ustaw czas akwizycji na co najmniej 1,2 CV.
    3. Przepłukać pompy i rury wylotowe za pomocą funkcji "automatycznego oczyszczania".
    4. Poczekaj, aż system zostanie wypełniony buforem i podłącz kolumnę. Zrównoważyć kolumnę, przekazując co najmniej 1,5 CV.
    5. Zablokować klatkę i zmierzyć bufor odłożony na bok w kroku 2.1.1, używając podajnika próbek do kontroli zmian sygnału spowodowanych uszkodzeniem przez promieniowanie. Kontynuuj tylko wtedy, gdy nie ma uszkodzenia bufora przez promieniowanie.
    6. Przełącz układ sterowania linią w tryb HPLC. Wykonaj próbny przebieg bufora, zbierając 200 ramek po 1 s na klatkę. Zapisz liczbę zliczeń podanych przez detektor na wykresie zsumowanej intensywności.
      UWAGA: Sygnał powinien być zgodny z poprzednio zmierzonym buforem, a zsumowane natężenie w czasie powinno pozostać stałe. Jeśli sygnał nie pasuje lub nie jest stały, wymagana jest dłuższa równowaga systemu.
    7. Odwirować próbkę o wymiarach 13 000 x g w wirówce stołowej z mikroprobówkami przez co najmniej 10 minut.
    8. Napełnij próbkę szklaną fiolką kompatybilną z HPLC (w zestawie) i umieść ją w automatycznym wstrzykiwaczu. Zwróć uwagę na położenie studni.
    9. Zablokuj klatkę eksperymentalną za pomocą standardowej procedury, jak wyjaśniono w Szkoleniu dotyczącym bezpieczeństwa użytkownika.
    10. Zaloguj się i utwórz folder do przechowywania danych za pomocą oprogramowania sterującego linią badawczą.
    11. Zaprogramuj system HPLC za pomocą funkcji "szybkiego wsadu". Ustaw lokalizację przechowywania danych UV na folder utworzony w kroku 2.1.10. Upewnij się, że aktywowałeś automatyczną konwersję danych UV do ASCII, przechowując plik ASCII w tym samym folderze.
      1. Wybierz objętość wtrysku i pozycję studzienki. Dodaj pomiar do kolejki, naciskając przycisk "Start". Oprogramowanie poprosi o zapisanie partii. Przygotuj się do zapisu, ale nie naciskaj przycisku "Zapisz", ponieważ spowoduje to automatyczne rozpoczęcie pomiaru.
    12. Ustaw parametry zbierania danych w oprogramowaniu sterującym linią. Wybierz liczbę ramek tak, aby całkowity czas zbierania danych był nieznacznie dłuższy niż czas zbierania zdefiniowany w kroku 2.1.2.
    13. Otwórz przesłonę bezpieczeństwa i rozpocznij zbieranie danych SAXS za pomocą oprogramowania sterującego linią badawczą. Sprawdź, czy dane zostały poprawnie pobrane. Porównaj nowo zebrane dane z danymi zebranymi w kroku 2.1.6 i sprawdź, czy liczba zliczeń w zsumowanej intensywności pozostaje stała przez co najmniej 100 klatek i odpowiada wartości z kroku 2.1.6.
      1. Uruchom SEC, naciskając przycisk "Zapisz", jak przygotowano w kroku 2.1.11, i zanotuj numer klatki wyświetlany w oprogramowaniu camserver po zakończeniu wstrzykiwania i rozpoczęciu akwizycji danych UV.
    14. Po zebraniu danych otwórz bazę danych ISPyB20 w Otwórz zakładkę "akwizycja danych" i naciśnij przycisk "Przejdź", aby uzyskać dostęp do zestawu danych i wyników automatycznej analizy21.
  2. Gromadzenie danych IEC-SAXS
    UWAGA: Zamiast ciągłego gradientu liniowego powszechnie stosowanego w eksperymentach IEC, należy użyć gradientu krokowego, w którym ilość bufora B jest zwiększana w wstępnie ustawionych dyskretnych krokach.
    1. Utwórz program HPLC do uruchomienia bufora bez próbek. Zaprogramuj gradient krokowy, zaczynając od 0% bufora B i zwiększając o 5 punktów procentowych po dwóch CV, aż do osiągnięcia 100% bufora B.
    2. Odłóż część każdego bufora na bok. Podłącz butelkę z buforem o niskiej zawartości soli A do portu A, a butelkę z buforem o wysokiej zawartości soli B do portu B.
    3. Wybierz natężenie przepływu i pozostań poniżej limitu ciśnienia kolumny (w tym przykładzie 1 ml/min).
    4. Podobnie jak w kroku 2.1.3, przepłucz pompy i przewody rurowe za pomocą funkcji "automatycznego oczyszczania".
    5. Zrównoważyć układ w buforze A o niskiej zawartości soli (patrz krok 1.15) i podłączyć kolumnę jonowymienną. Poczekaj, aż kolumna zostanie całkowicie zrównoważona (co najmniej 1,5 CV).
    6. Użyj buforu odłożonego na bok w kroku 2.2.2, aby zbadać A i B pod kątem uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem za pomocą podajnika próbek, jak w kroku 2.1.5.
    7. Sprawdź bufor wychodzący z kolumny, jak w kroku 2.1.6. Porównaj sygnał z sygnałem bufora A zarejestrowanym w kroku 2.2.6. Ponownie zwróć uwagę na liczbę zliczeń na wykresie zsumowanej intensywności.
    8. Utwórz folder do przechowywania danych dla uruchomienia buforu.
    9. Skonfiguruj zbieranie danych w trybie systemu HPLC. Wybierz liczbę ramek tak, aby całkowity czas zbierania danych przekraczał całkowity czas przebiegu IEC (patrz krok 2.2.1).
    10. Otwórz migawkę bezpieczeństwa i rozpocznij zbieranie danych SAXS. Sprawdź, czy przebiega prawidłowo i dokładnie sprawdź, czy zsumowana intensywność pozostaje stała na poziomie wartości zanotowanej w kroku 2.2.7 przez co najmniej 100 klatek.
    11. Użyj funkcji "Pojedynczy przebieg" w oprogramowaniu HPLC i uruchom gradient krokowy zaprogramowany w kroku 2.2.1. W celu wstrzyknięcia należy ustawić numer fiolki na -1, aby na tym etapie nie wstrzykiwać żadnej próbki. Zapisz liczbę klatek uzyskanych podczas uruchamiania programu.
    12. Utwórz program HPLC dla przykładowego przebiegu. Zaprogramuj gradient krokowy, zaczynając od 0% bufora B. Oszacuj procent bufora B na każdym piku mierzonym w trybie offline w kroku 1.1.5 (Rysunek 1B). Ustaw co najmniej 3 stopnie dokładnie 1 punkt procentowy poniżej i 1,5 punktu powyżej szczytów zainteresowania, każdy dla 2,5 CV (Rysunek 1C). Dodaj ostatni krok przy 100% buforze B dla 2,5 CV.
    13. Odwirować próbkę o wymiarach 13 000 x g w wirówce stołowej z mikroprobówkami przez co najmniej 10 minut.
    14. Rozcieńczyć D5323-785 do stężenia soli buforu A (25 mM), mieszając go z 20 mM Tris-HCl [pH 7], 10% glicerolem i 1 mM DTT.
    15. Załaduj próbkę ręcznie do kolumny. Umieścić rurkę wejściową buforu A w rozcieńczonej próbce po wstrzymaniu pomp, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Odłącz kolumnę od detektorów, aby bezpośrednio zbierać przepływ z kolumny.
      1. Gdy pojemnik na próbkę jest prawie pusty, włóż rurkę wejściową z powrotem do buforu A (ponownie zatrzymując pompy podczas przesuwania rurki) i wznów pompowanie z buforem A, aby przenieść próbkę z rurki do kolumny. Po załadowaniu całej próbki przepuść 2 CV buforu A, a następnie ponownie podłącz kolumnę do detektorów.
    16. Dla przykładowego przebiegu utwórz folder do przechowywania danych.
    17. Otwórz migawkę bezpieczeństwa i rozpocznij zbieranie danych SAXS. Sprawdź, czy zbieranie danych przebiega prawidłowo i dokładnie sprawdź, czy zsumowana intensywność pozostaje stała na poziomie wartości zanotowanej w kroku 2.2.7 przez co najmniej 100 klatek.
    18. Użyj funkcji "Pojedynczy przebieg" w oprogramowaniu HPLC, aby rozpocząć gradient krokowy zaprogramowany w kroku 2.2.12. W celu wstrzyknięcia należy ustawić numer fiolki na -1, aby na tym etapie nie wstrzykiwać żadnej próbki. Zapisz liczbę klatek uzyskanych podczas uruchamiania programu.
    19. Otwórz "akwizycję danych" w ISPyB20 i naciśnij "Go", aby spojrzeć na zestaw danych i automatyczną analizę21.
    20. Eksportuj dane UV z systemu HPLC do formatu ASCII za pomocą oprogramowania "Postrun Analysis".

3. Redukcja i analiza danych SEC-SAXS

  1. Otwórz dane w akwizycji danych w ISPyB, naciskając przycisk "Go". Określ w przeglądzie, które ramki zbioru danych SAXS odpowiadają pikowi elucji. Sprawdzić, czy promień bezwładności jest stabilny na całym piku.
  2. Upewnij się, że automatyczna korekta bufora została wykonana poprawnie. Załaduj klatki z centralnej części piku do programu, który wykonuje manipulacje z eksperymentalnymi plikami danych SAXS22 i uśrednij je. Następnie załaduj automatycznie wygenerowany plik bufora i sprawdź, czy obszary o wysokim q uśrednionych ramek i ramek bufora są zgodne.
  3. Porównaj ilościowo ramki uzyskane podczas piku za pomocą testu CORMAP23.
    1. Wczytuje automatycznie utworzone odejmowania (pliki *_sub.dat) ramek pokrywających obszar zainteresowania.
    2. Przeskaluj je do siebie, naciskając przycisk "Skala".
    3. Porównaj je za pomocą funkcji "Porównanie danych". Przez cały szczyt nie powinno być systematycznych zmian między klatkami.
  4. Otwórz wszystkie interesujące Cię ramki *-_sub.dat, połącz je za pomocą przycisku "Scal" i zapisz scalony plik w .dat formacie.
  5. Określ promień bezwładności za pomocą narzędzia "Promień bezwładności" w programie, odnotowując pierwszy punkt danych w zakresie Guiniera w celu późniejszego przycięcia danych w niskiej rozdzielczości.
  6. Określ funkcję rozkładu odległości par za pomocą narzędzia "Rozkład odległości" w programie i zapisz wynikowy plik .out jako gnom.out.

4. Modelowanie ab initio

  1. Na komputerze z systemem Unix uruchom program do rekonstrukcji modelu 40 x ab initio bez ograniczeń symetrii. Utwórz nowy folder i skopiuj do niego plik gnom.out. Uruchom program w następujący sposób:
    dla (( i = 1; i <= 40; i++ )); do dammif gnom.out -m s -p dammifp1_$i; gotowy
  2. Analogicznie, uruchom program do rekonstrukcji modelu ab initio z ograniczeniami symetrii dla symetrii sześciokrotnej w drugim folderze:
    dla (( i = 1; i <= 40; i++ )); do dammif gnom.out -m s -s P6 -p dammifp6_$i; gotowy
  3. Wyrównaj wszystkie pliki wyjściowe programu do rekonstrukcji modelu ab initio (*-1.pdb). W dwóch folderach z kroków 4.1 i 4.2 uruchom polecenie damaver -a *-1.pdb.
  4. Otwórz unię wszystkich modeli (damaver.pdb), jak również model przefiltrowany do odpowiedniej objętości (damfilt.pdb) w odpowiednim oprogramowaniu do wizualizacji molekularnej26 i porównaj je.
  5. Otwórz plik damsel.log w edytorze tekstów. Model wymieniony jako "odniesienie" u dołu pliku jest najbardziej reprezentatywnym modelem.

5. Redukcja, analiza i modelowanie danych IEC-SAXS

  1. W programie, który wykonuje manipulację z eksperymentalnymi plikami danych SAXS22, załaduj około 50 ramek SAXS z każdego kroku mieszania przebiegu bufora, naciśnij przycisk "ŚREDNIA" i zapisz wyniki.
  2. Na podstawie wyników automatycznego przetwarzania dostępnych za pośrednictwem ISPyB określ, które ramki eksperymentu odpowiadają elucji białka i sprawdź, czy (wstępny) promień bezwładności jest stabilny w całym piku.
  3. Załaduj ramki do eksperymentalnego programu do manipulacji plikami danych SAXS22 i uśrednij je, tak jak to zrobiono dla ramek bufora (patrz krok 5.1). Następnie załaduj pliki buforowe wygenerowane w kroku 5.1 i porównaj obszary wysokiego q (powyżej 4,2 nm-1), aby znaleźć bufor pasujący do średniej z wartości szczytowej.
    UWAGA: Nie powinno być systematycznego przesunięcia między średnią z piku a buforem. Jeśli wydaje się, że krzywa próbki znajduje się między dwiema krzywymi buforowymi, należy interpolować ich krzywe, obliczając średnią.
  4. Odejmij bufor zidentyfikowany jako najlepiej dopasowany od średniej krzywej rozpraszania ułamka piku i zapisz wynikowy odjęty plik. Ponadto należy utworzyć odjęte krzywe, korzystając ze średnich krzywych buforowych z poprzedniego i następnego kroku mieszania, aby oszacować margines błędu odejmowania.
  5. Powtórz kroki 5.3 i 5.4 indywidualnie dla lewej i prawej połowy piku i porównaj wyniki z krokiem 5.4, aby sprawdzić stabilność sygnału w całym piku.
  6. Wykonaj kroki 3.5 i 3.6 dla wszystkich trzech odjętych krzywych z kroku 5.4.
  7. Porównaj wyniki dla wszystkich trzech odjętych krzywych.
    Uwaga: Można ufać tylko wynikom, które pozostają solidne w marginesie błędu odejmowania.
  8. Wykonaj modelowanie jak w krokach 4.1 i 4.2, aby uzyskać najlepsze odejmowanie określone w kroku 5.3.
  9. Wykonaj kroki od 4.3 do 4.5, aby wyrównać modele i zidentyfikować najbardziej reprezentatywny.

6. Porównanie wyników

  1. Uruchom program do nakładania struktur 3D12 na reprezentatywne modele danych SEC (krok 4.5) i IEC-SAXS (krok 5.9) z symetrią P6: supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb
  2. Zaimportuj pliki model_sec.pdb i model_iec-r.pdb do oprogramowania do wizualizacji molekularnej.
  3. Otwórz pliki .fir modelsec.pdb i modeliec-r.pdb w arkuszu kalkulacyjnym i utwórz wykres 2D z eksperymentalnymi i obliczonymi krzywymi rozpraszania.

Wyniki

Wyniki analizy niezmienniczej bezmodelowej przedstawiono w Tabeli 1. Analiza danych D5323-785 SEC-SAXS wykazała szacunkową masę cząsteczkową (z analizy Poroda) wynoszącą 345 kDa w porównaniu do 338 kDa zaobserwowanych przy użyciu IEC-SAXS. Obie wartości są zgodne z oczekiwaną masą 6 razy 53,5 kDa (321 kDa) dla heksameru. Modelowanie ab initio obu zestawów danych przeprowadzono bez narzuconej symetrii (SEC-SAXS: χ2 = 0,88, IEC-SAXS: χ2 = 3,1) oraz z zastosowaniem symetrii C6 (SEC-SAXS: χ2 = 1,0, IEC-SAXS: χ2 = 4). Ponieważ ogólne dopasowania do danych rozpraszania dla obu rekonstrukcji są w obu przypadkach porównywalne (Rysunek 1D oraz E), można przyjąć symetrię C6. Zatem model odpowiada strukturze w kształcie stożka sześciokątnego z centralnym kanałem, który wydaje się być częściowo zablokowany (SEC: Rysunek 1F; IEC: Rysunek 1G, nałożenie Rysunek 1H). Analiza poszczególnych modeli przed uśrednieniem wykazuje, że blokada ta jest prawdopodobnie artefaktem procesu uśredniania.

Schemat chromatografii; eksperymenty SEC/IEC; wykresy absorbancji względem intensywności; modele molekularne.
Rysunek 1: Analiza danych SAXS i porównanie D5323-785 (rysunek zaadaptowany z referencji 12 i 18). A) Schematyczna struktura domen białka D5 i D5323-785. B) Chromatogram wymiany jonowej offline z zaznaczeniem trzech pikiów. Krzywa pomarańczowa: absorbancja przy 280 nm (au), krzywa niebieska: procent buforu B. Wskazano wartości procentowe buforu B w pikiach. C) Chromatogram wymiany jonowej online. Legenda kolorów taka sama jak w B. Dodatkowo, zmierzona intensywność jest zaznaczona na zielono. Eksperymentalna krzywa rozpraszania i krzywa obliczona z modelu otrzymanego na podstawie analizy danych SEC-SAXS D) oraz IEC E) dla D5323-785. F) Model kulkowy (bead model) D5323-785 oparty na danych SEC i G) danych IEC. H) Nałożenie modeli SEC i IEC. Panele od F) do H) zostały stworzone przy użyciu oprogramowania do wizualizacji molekularnej24. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Parametry gromadzenia danych
Instrument:ESRF BM29
Długość fali (Å)0.99
Zakres q (Å-1)0.0032 – 0.49
Odległość próbka-detektor2.864 m
Czas ekspozycji (sec)1 na klatkę
Zakres stężeńn.d.
Temperatura (K)293
DetektorPilatus 1M (Dectris)
Strumień (photons/s)1 × 1012
Rozmiar wiązki (µm2)700 × 700
Parametry strukturalne dla D5323-785, SEC
I0 (cm-1) [z analizy Guiniera]0.0237
Rg (Å) [z analizy Guiniera]48
qminRg – qmaxRg użyte do analizy Guiniera0.77 - 1.24
Dmax (Å) [z p(r)]145
Zakres q użyty dla p(r) (Å-1)0.02 - 0.17
Objętość Poroda Vp (Å3) [z rozpraszania](570 ± 5) × 103
Masa cząsteczkowa Mr (kDa) [z Vp]345
Obliczona masa monomeru Mr z sekwencji (kDa)321
Parametry strukturalne dla D5323-785, IEC
I0 (cm-1) [z analizy Guiniera]0.386
Rg (Å) [z analizy Guiniera]46.5 ± 0.1
qminRg – qmaxRg użyte do analizy Guiniera0.44 - 1.29
Dmax (Å) [z p(r)]120
Zakres q użyty dla p(r) (Å-1)0.03 - 0.18
Objętość Poroda Vp (Å3) [z rozpraszania](577 ± 5) × 103
Masa cząsteczkowa Mr (kDa) [z Vp]339
Obliczona masa heksameru Mr z sekwencji (kDa)321

Tabela 1: Parametry danych SAXS. Tabela podsumowuje parametry akwizycji i analizy danych SAXS.

Dyskusja

W przypadku wielu makrocząsteczek przed zebraniem danych SAXS wymagany jest końcowy etap oczyszczania za pomocą chromatografii w celu uzyskania zestawu danych dobrej jakości. Jednak nie wszystkie próbki pozostają stabilne; Mogą być podatne na agregację lub rebalansację do mieszaniny stanów oligomeryzacji. W związku z tym wymagany jest końcowy etap oczyszczania online na linii badawczej, aby zminimalizować czas między oczyszczaniem a zbieraniem danych w celu uzyskania najlepszej jakości danych SAXS. W zależności od właściwości biofizycznych białka będącego przedmiotem zainteresowania, w celu uzyskania optymalnej jakości próbki można wybrać SEC-SAXS lub IEC-SAXS. Tutaj, na konstrukcie białkowym pochodzącym z helikazy/prymazy D5, obie techniki są wyjaśnione i omówione.

Akwizycja danych SEC-SAXS staje się coraz bardziej ustandaryzowana i jest dostępna na wielu liniach badawczych BioSAXS. Analiza danych, a zwłaszcza odejmowanie tła, jest stosunkowo prosta i łatwa. Niezbędny pozostaje jednak stabilny sygnał buforowy i wystarczająca separacja gatunków wielkocząsteczkowych. Dlatego tak ważne jest, aby zarezerwować wystarczająco dużo czasu, aby dokładnie wyrównać kolumnę. Niepowodzenie tej metody może być spowodowane trwałymi zanieczyszczeniami o wielkości podobnej do białka będącego przedmiotem zainteresowania, niskimi stężeniami i wrażliwymi na promieniowanie.

W praktyce, początkowo, SEC-SAXS będzie prawdopodobnie stosowana jako metoda z wyboru dla większości próbek makromolekularnych. Mimo to wiele protokołów oczyszczania wymaga wcześniejszego kroku IEC ze względu na obecność zanieczyszczeń lub agregację. Biorąc pod uwagę, że każdy etap koncentracji i chromatografii wiąże się ze stratami próbki (szacowanymi na 30-50%) i czasem, bezpośredni IEC-SAXS jest korzystny. W przypadku próbek, których nie można oczyścić metodą SEC, czy to ze względu na obecność "zanieczyszczeń" o podobnej wielkości, czy też dlatego, że poważnie agregują się w niezbędnych stężeniach, IEC-SAXS zawsze będzie lepszym podejściem. Ponadto wyższe natężenia przepływu obsługiwane przez wiele kolumn IEC mogą pomóc w skróceniu czasu przejścia między oczyszczaniem a pomiarem. W przedstawionym przykładzie zastosowano IEC z elucją krokową, która pozwala na oddzielenie bliskich pików D5323-785 od zanieczyszczeń poprzez staranny dobór stopni stężenia soli. Zasadniczo liczba kroków jest nieograniczona, ale w praktyce wymagany jest co najmniej 1 krok na szczyt i nie należy wybierać zbyt wiele. W przypadku opisanej powyżej metody odejmowania tła kluczowe jest zmierzenie stosunkowo dużej liczby różnych kompozycji buforowych w celu znalezienia pasującego.

Wspólną wadą obu technik jest brak precyzyjnych informacji o stężeniu białka. Z tego powodu precyzyjne określenie masy na podstawie rozpraszania do przodu nie jest możliwe. Dla białek globularnych, takich jak D5323-785, objętość Porod zapewnia alternatywne, choć mniej precyzyjne, oszacowanie masy, ale dla białek wysoce elastycznych lub nieuporządkowanych podejście to nie byłoby prawidłowe.

Odmianą przedstawionej tutaj metody gradientu krokowego IEC-SAXS jest zastosowanie gradientu liniowego. Podczas gdy możliwa jest praca z dowolną liczbą kroków w celu wyizolowania podpików za pomocą elucji krokowej, w podejściu gradientowym liniowym wymagana jest staranna optymalizacja warunków gradientu w celu całkowitego oddzielenia pików przed rozpoczęciem eksperymentu SAXS. Odejmowanie tła w tym podejściu mogłoby odbywać się klatkowo i mogłoby być weryfikowane przez porównanie poszczególnych ramek, ale wymaga to bardziej zaawansowanej obsługi danych, a dedykowane oprogramowanie jeszcze nie istnieje.

Wybór odpowiedniej kolumny ma kluczowe znaczenie dla obu technik, ponieważ decyduje o separacji gatunków makromolekularnych. Kolumny wykluczające wielkość różnią się nośnością, zakresem wielkości oddzielalnych makrocząsteczek i rozdzielczością, podczas gdy kolumny jonowymienne różnią się rodzajem i gęstością ich unieruchomionych ładunków.

Podczas gdy przedstawiony tutaj protokół jest specyficzny dla linii badawczej ESRF BM29, adaptacja do każdej innej linii badawczej SAXS jest w zasadzie prosta. Główne wymagania to wystarczająco wysoki strumień promieniowania rentgenowskiego i odpowiedni detektor (najlepiej zliczający pojedyncze fotony), aby uzyskać rozsądne dane dotyczące stosunku sygnału do szumu w ciągu kilku sekund lub krócej, a także system chromatografii cieczowej online zdolny do tworzenia gradientów. Dokładna implementacja będzie oczywiście zależała od lokalnego środowiska linii badawczej.

Wyniki uzyskane na D5323-785 przy użyciu tych dwóch metod różnią się nieznacznie. Promień bezwładności jest nieco mniejszy dla danych IEC niż dla danych SEC, a lokalne minima krzywej rozpraszania są przesunięte do nieco większych wektorów rozpraszania. Oznacza to, że D5323-785 mierzony za pomocą IEC-SAXS jest nieco bardziej kompaktowy niż D5323-785 mierzony za pomocą SEC-SAXS. Może to być spowodowane różnicami w przygotowaniu próbki, czasem między oczyszczaniem a pomiarem (IEC jest szybszy) lub, co mniej prawdopodobne, zanieczyszczeniem w próbce oczyszczonej metodą SEC. Modele ściegów uzyskane całkowicie niezależnie za pomocą obu metod są porównywalne (rysunek 1H). D5323-785 pokazuje oczekiwaną pustą, heksameryczną strukturę18.

Podsumowując, wymiana jonowa online i chromatografia wykluczania wielkości online są ważnymi metodami oczyszczania biochemicznego, które można bezpośrednio sprzęgnąć z SAXS6,7,9-12,25,26. Odejmowanie tła danych IEC-SAXS jest nieco trudniejsze i bardziej niejednoznaczne niż w przypadku SEC-SAXS, ale mimo to jest możliwe. W zależności od właściwości biofizycznych białka będącego przedmiotem zainteresowania, zarówno SEC, jak i IEC-SAXS pozwalają na optymalizację separacji gatunków z nieodłącznymi korzyściami. Pod warunkiem, że kroki walidacji (zgodnie z opisem) są prawidłowo przestrzegane, uzyskane dane mogą być analizowane z pewnością, a modele mogą być określane przy użyciu standardowych narzędzi dostępnych w społeczności. Obie techniki umożliwiają separację online dla szerokiego zakresu makrocząsteczek biologicznych, uzyskując dane niedostępne za pomocą standardowych pomiarów statycznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy za wsparcie finansowe dla projektu z francuskiego grantu REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 oraz z grantów badawczych od Service de Santé des Armées i Délégation Générale pour l'Armement. Jesteśmy wdzięczni ESRF za czas poświęcony na wiązkę SAXS. Dziękujemy Andrew McCarthy'emu, Gordonowi Leonardowi, Wimowi Burmeisterowi i Guyowi Schoehnowi za wsparcie finansowe i naukowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,4-ditiotreitol [DTT]EuromedexEU0006-B
10% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żel białkowyBiorad4561033
2x Phusion Flash PCR Master MixThermoFisher scientificF 548
kwas octowy lodowatyVWR Chemicals (BDH Prolabo)20104.298
Agaroza D-5EuromedexLF45130653
Amicon Ultra -15 Filtry odśrodkowe Ultracel -30KMillipore LtdUFC903024
Sól sodowa ampicylinyEuromedexEU0400-D
BenzonazaNovagene70750-3
błękit bromofenolowy MERCK8122
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy Roche11231400
Econo-Pac 10 DG Kolumna odsalającaBio-rad732-2010
EDTASigmaE-5134
GlicerolVWR Chemicals (BDH Prolabo)24388.295
GlicynaEuromedex26-128-6405-C
HindIIIRoche656313
HisSelect HF Powinowactwo do niklu ŻelSigmaH0537
Kwas solny (HCl)VWR Chemicals (BDH Prolabo)20252.295
ImidazolAppliChem PanreacA1073,0500
InstantBlueExpedeonISB1L
LB bulion MillerFluka AnalyticalL3152
MgCl2ICN Biomedicals Inc.
NaClVWR Chemicals (BDH Prolabo)27808.297
NcoIFermentasER0571
One Shot BL21 Star (DE3) Wektor wektorowy ThermoFisher scientificC6010-03
pProEx HTb Addgene10711018
Primer  Eurofins mwg operon
QIAprep Spin Zestaw miniprepQIAGEN27106
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQIAGEN28706
QIAquick PCR oczyszczanie kidQIAGEN28106
SDS Sigma75746
Superose 6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNAInvitrogen life technologyS33102
Ligaza T4ThermoFisher scientificEL0011
TEVdomowej roboty
TOP 10technologii Invitrogen lifeC404003 
Podstawa TrisEuromedex26-128-3094-B
Kolumna Uno Q 1R Bio-rad720 0011
β-merkaptoetanolMPBiomedicals, LLC194834
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Softwares
Oprogramowanie BsXCuBEESRFPernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664rozwój lokalny
Oprogramowanie CamserverOprogramowanie Dectrisn.a.detectoroprogramowanie sterujące
DAMAVERATSAS 2.6.0http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.htmlprogram do wyrównywania modeli ab initio 
DAMMIFATSAS 2.6.0http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.htmlab initio program do rekonstrukcji modelu
HPLC Biologic Duo FlowBio-rad
HPLC program LabSolutionsShimadzun.a.ISPyB
ESRFDe Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.Rozwój lokalny
PRIMUSATSAS 2.6.0http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.htmlprogram, który wykonuje manipulację eksperymentalnym SAXS
PyMOLDeLano Scientific LLChttps://www.pymol.org/oprogramowanie do wizualizacji
SUPCOMBATSAS 2.6.0http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.htmlprogram do nakładania struktur 3D
NameFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
BioLogic Duo FlowBiorad
BioLogic Biofrac Kolektor frakcjiBiorad
HPLC systemShimadzu
Labsonic PSartorius Stedim biotechBBI8535108
191421 program

Bibliografia

  1. Graewert, M. A., Svergun, D. I. Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS). Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).
  2. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Sci. 19, 642-657 (2010).
  3. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).
  4. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
  5. Vestergaard, B. Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue. Arch. Biochem. Biophys. , (2016).
  6. David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).
  7. Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Sci. Rep. 5, (2015).
  8. Lambright, D., et al. Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS. ACA Trans. , 1-12 (2013).
  9. Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins. J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).
  10. Round, A., et al. Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).
  11. Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).
  12. Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering. Acta Cryst. , (2016).
  13. Selkirk, C. Ion-exchange chromatography. Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).
  14. Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates. Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).
  15. Pernot, P., et al. Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution. J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).
  16. Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members. Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).
  17. Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases. Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).
  18. Hutin, S., et al. Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5. J. Virol. , 4604-4613 (2016).
  19. Round, A., et al. BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).
  20. De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).
  21. Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).
  22. Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis. J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).
  23. Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra. Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).
  24. Schrodinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).
  25. Jensen, M. H., et al. Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange. J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).
  26. Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes. J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

chromatografia wykluczaniachromatografia on lineanaliza BioSAXSoczyszczanie bia ekredukcja danychodejmowanie t aelucja gradientowabiologia strukturalna
Wykluczenie według wielkości i chromatografia jonowymienna online na linii badawczej SAXS
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.