Artykuł metodologiczny

Ilościowe modelowanie 3D in silico (q3DISM) mózgowej fagocytozy beta-amyloidowej w modelach gryzoni choroby Alzheimera

DOI:

10.3791/54868

⸱

26 grudnia 2016

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California (USC)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy metodologię ilościowego modelowania 3D in silico (q3DISM) amyloid-β (Aβ) fagocytoza przez jednojądrzaste fagocyty w modelach gryzoni choroby Alzheimera. Metodę tę można uogólnić w celu ilościowego określenia praktycznie każdego zdarzenia fagocytarnego in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapalenie układu nerwowego jest teraz uznawane za główny czynnik etiologiczny w chorobach neurodegeneracyjnych. Fagocyty jednojądrzaste to wrodzone komórki odpornościowe odpowiedzialne za fagocytozę i usuwanie gruzu i detrytusu. Komórki te obejmują makrofagi rezydujące w OUN, znane jako mikroglej, oraz fagocyty jednojądrzaste infiltrujące z peryferii. Mikroskopia świetlna jest zwykle stosowana do wizualizacji fagocytozy w próbkach mózgu gryzoni lub ludzi. Jednak metody jakościowe nie dostarczyły ostatecznych dowodów na fagocytozę in vivo. W tym miejscu opisujemy ilościowe modelowanie 3D in silico (q3DISM), solidną metodę pozwalającą na prawdziwą kwantyfikację 3D fagocytozy β amyloidu (Aβ) przez fagocyty jednojądrzaste w modelach choroby Alzheimera (AD) gryzoni. Metoda polega na fluorescencyjnej wizualizacji Aβ zamkniętego w fagolizosomach w wycinkach mózgu gryzoni. Duże zestawy danych konfokalnych w wymiarze z są następnie rekonstruowane w 3D w celu ilościowego określenia Aβ przestrzennie kolokalizowanego w fagolizosomie. Wykazujemy udane zastosowanie q3DISM do mózgów myszy i szczurów, ale metodologia ta może być rozszerzona na praktycznie każde zdarzenie fagocytarne w dowolnej tkance.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Alzheimera (AD), najczęstsza demencja związana z wiekiem1, charakteryzuje się akumulacją amyloid β u w mózgu (Aβ) w postaci "starczych" blaszek β-amyloidowych, przewlekłego zapalenia nerwów o niskim poziomie, tauopatii, utraty neuronów i zaburzeń poznawczych2. W mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera zapalenie nerwów jest sygnalizowane przez reaktywne astrocyty i fagocyty jednojądrzaste (określane jako mikroglej, chociaż ich centralne i obwodowe pochodzenie pozostaje niejasne) otaczające złogi Aβ3. Jako wrodzeni strażnicy immunologiczni OUN, mikroglej jest centralnie umieszczony w celu oczyszczenia mózgu Aβ. Jednak rekrutacji mikrogleju do blaszek Aβ towarzyszy bardzo mało, jeśli w ogóle, fagocytozy Aβ4,5. Jedna z hipotez głosi, że mikroglej jest początkowo neuroprotekcyjny poprzez fagocytozowanie małych zespołów Aβ. Jednak w końcu komórki te stają się neurotoksyczne, ponieważ przytłaczające obciążenie Aβ i/lub związany z wiekiem spadek funkcjonalny prowokuje mikroglej do dysfunkcyjnego fenotypu prozapalnego, przyczyniając się do neurotoksyczności i pogorszenia funkcji poznawczych6.

Ostatnie badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) zidentyfikowały grupę alleli ryzyka AD należących do podstawowych wrodzonych szlaków immunologicznych7, które modulują fagocytozę8-11. W związku z tym odpowiedź immunologiczna na odkładanie się amyloidu w mózgu stała się głównym obszarem zainteresowania, zarówno pod względem zrozumienia etiologii choroby Alzheimera, jak i opracowania nowych podejść terapeutycznych12-14. Istnieje jednak pilna potrzeba opracowania metodologii oceny fagocytozy Aβ in vivo. Aby zaspokoić tę niezaspokojoną potrzebę, opracowaliśmy ilościowe modelowanie 3D in silico (q3DISM), aby umożliwić prawdziwą kwantyfikację 3D mózgowej fagocytozy Aβ za pomocą fagocytów jednojądrzastych w modelach choroby podobnej do choroby Alzheimera u gryzoni.

Ograniczone jedynie przez zakres, w jakim rekapitulują chorobę, modele zwierzęce okazały się nieocenione dla zrozumienia patoetiologii AD i oceny eksperymentalnych metod terapeutycznych. Ze względu na fakt, że mutacje w genach preseniliny (PS) i białka prekursorowego amyloidu (APP) niezależnie powodują autosomalną dominującą chorobę Alzheimera, te zmutowane transgeny są szeroko wykorzystywane do generowania transgenicznych modeli gryzoni. Transgeniczne myszy APP / PS1 jednocześnie koeksprymujące "szwedzką" zmutowaną ludzką APP (APPswe) i zmutowaną ludzką presenilinę 1 eksonu 9 Δ (PS1ΔE9) z przyspieszoną amyloidozą mózgową i zapaleniem nerwów15,16. Ponadto wygenerowaliśmy bi-transgeniczne szczury, którym wstrzyknięto jednocześnie konstrukty APPswe i PS1ΔE9 (linia TgF344-AD, na tle Fischera 344). W przeciwieństwie do transgenicznych mysich modeli amyloidozy mózgowej, szczury TgF344-AD rozwijają amyloid mózgowy, który poprzedza tauopatię, apoptozę neuronów i upośledzenie zachowania17.

W tym raporcie opisujemy protokół immunologicznego barwienia mikrogleju, fagolizosomów i złogów Aβ w sekcjach mózgu myszy APP/PS1 i szczurów TgF344-AD oraz pozyskiwania dużych obrazów konfokalnych w wymiarze z. Szczegółowo opisujemy generowanie i analizę prawdziwych rekonstrukcji 3D na podstawie konfokalnych zestawów danych umożliwiających ilościowe określenie wychwytu Aβ przez fagolizososomy mikrogleju. W szerszym ujęciu, metodologia, którą tutaj szczegółowo opisujemy, może być wykorzystana do ilościowego określenia praktycznie każdej formy fagocytozy in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie o etyce badawczej: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach wyszczególnione w niniejszym dokumencie zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Południowej Kalifornii (IACUC) i przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi i zaleceniami National Institutes of Health oraz zaleceniami Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.

1. Izolacja mózgu gryzoni i przygotowanie do barwienia immunologicznego

DZIEŃ 1:

  1. Umieść sędziwe szczury TgF344-AD (14-miesięczne) lub myszy APP/PS1 (12-miesięczne) pod ciągłym głębokim znieczuleniem izofluranem (4%). Oceń głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi i brak odruchu wycofania.
  2. Przetnij obie strony klatki piersiowej i podnieś, aby odsłonić serce. Wbić igłę 23 G do lewej komory serca i wykonać małe nacięcie w prawym przedsionku. Przystąpić do wykrwawiania przez perfuzję przezsercową lodowato buforowaną fosforanem soli fizjologicznej (PBS) za pomocą pompy perystaltycznej (30 ml dla myszy; 150 - 200 ml dla szczurów).
  3. Wykonaj ogonowe nacięcie linii środkowej w skórze i odsuń skórę i mięśnie na bok. Przeciąć górną część czaszki wzdłuż linii środkowej i między oczami. Usuń płytki kostne i odizoluj cały mózg od czaszki.
  4. Umieść mózg w koronalnej matrycy mózgu gryzonia i pokrój go na ćwiartki. Inkubować tylne ćwiartki O/N (16 h) w utrwalaczu paraformaldehydu (4% PFA w PBS) w temperaturze 4 °C. Przemyć 3x w PBS, a następnie przenieść do 70% etanolu. Ostrzeżenie: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim pod kapturem chemicznym przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.

DZIEŃ 2:

  1. Umieść ćwiartki mózgu w kasetach osadzających i stopniowo odwadniaj tkankę w kolejno bardziej skoncentrowanych 1-godzinnych kąpielach etanolowych (70%, 80%, 95% i 100% x3).
  2. Usuń etanol z tkanki za pomocą trzech kolejnych kąpieli 100% ksylenu (1 h każda). Uwaga: Ksylen jest toksyczny i należy obchodzić się z nim pod kapturem chemicznym przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.
  3. Zanurzyć tkankę w blokach parafinowych po dwóch kąpielach w stopionym wosku parafinowym (56 - 58 °C, 90 min każda).

DZIEŃ 3:

  1. Wytnij odcinki mózgów o grubości 10 μm zatopionych w parafinie za pomocą mikrotomu. Zanurz skrawki w łaźni wodnej (50 °C na 1 min) i nałóż na szkiełka mikroskopowe. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia, upewniając się, że szkiełko przylega do szkiełka.

2. Barwienie immunologiczne

Uwaga: Do opisanej poniżej procedury barwienia można wykorzystać różne kombinacje przeciwciał. Koktajle przeciwciał kompatybilne z tkanką mózgową szczurów i myszy są wymienione w Tabeli 1.

DZIEŃ 4:

  1. Deparafinizacja skrawków mózgu za pomocą 2x kąpieli 100% ksylenu (12 min każda).
  2. Nawadniaj sekcje mózgu w kolejnych kąpielach etanolowych – 100% przez 10 min, 95% przez 5 min, 80% przez 10 min i wreszcie 70% przez 15 min – a następnie 3x płukanie PBS [5 min w temperaturze pokojowej, z lekkim mieszaniem]. W międzyczasie podgrzej roztwór do pobierania antygenu do 95 - 97 °C na płycie grzejnej z mieszaniem pręta magnetycznego.
  3. Inkubować skrawki mózgu w roztworze do pobierania antygenu w temperaturze 95-97 °C przez 30 minut. Następnie umyć 3x w PBS (5 min w temperaturze pokojowej, z lekkim mieszaniem).
  4. Szybko wysusz szkiełka za pomocą delikatnych wycieraczek zadaniowych, aby uniknąć wysuszenia tkanek, i narysuj hydrofobową barierę wokół obszaru tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego. Wypełnij otoczony obszar tkanki buforem blokującym [PBS zawierający 0,3% Triton X-100 i 10% normalnej surowicy osła (NDS)] i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w wilgotnej komorze.
  5. Zastąp bufor blokujący pierwszorzędowym przeciwciałem Iba1 (rozcieńczonym w buforze blokującym) w celu znakowania fagocytów jednojądrzastych i inkubuj O/N w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze. W przypadku żywicieli opartych na przeciwciałach i rozcieńczeń roboczych zob. Tabela 1 i Tabela materiałów.

DZIEŃ 5:

  1. Przepłukać przeciwciało pierwotne 3 kąpielami PBS (5 minut w temperaturze pokojowej z lekkim mieszaniem). Inkubować z fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym (sprzężonym z fluoroforem emisyjnym o długości fali 594 nm) przez 1 godzinę (w buforze blokującym w temperaturze pokojowej w ciemności), a następnie 3 razy w kąpieli PBS (5 minut w temperaturze pokojowej z lekkim mieszaniem). W tym czasie utrzymuj sekcje w ciemności, aby uniknąć blaknięcia sygnału fluorescencyjnego.

DZIEŃ 6 - 7:

  1. Powtórz kroki 2.5 i 2.6 z przeciwciałami CD68 (mózgi szczurów) lub LAMP1 (tkanka myszy) i odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (sprzężonymi z fluoroforem emisyjnym 488 nm), aby oznaczyć fagolizososomy.

DZIEŃ 7 - 8:

  1. Powtórz kroki 2.5 i 2.6 z przeciwciałami OC (tkanka szczura) lub 4G8 (mózgi myszy) i odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (sprzężonymi z fluoroforem 647 nm), aby oznaczyć depozyty Aβ.
    UWAGA: Alternatywnie, przeciwciało 6E10 może być z powodzeniem stosowane zarówno na tkankach myszy, jak i szczurów. Odpowiednie kombinacje przeciwciał znajdują się w Tabeli materiałów.
  2. Pozwól sekcjom całkowicie wyschnąć przy RT w ciemności. Następnie przykryj próbki szkiełkiem nakrywkowym uszczelnionym fluorescencyjnym nośnikiem montażowym zawierającym DAPI.

3. Akwizycja dużych zestawów danych konfokalnych Z-stack

Uwaga: Ten protokół wymaga w pełni zautomatyzowanego skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 60X i lasery 405 nm, 488 nm, 594 nm i 647 nm. Wszystkie urządzenia są sterowane komputerowo za pomocą oprogramowania do obrazowania i sterowania laserem. Przed rozpoczęciem protokołu obrazowania włącz komputer, lampę epifluorescencyjną, mikroskop, lasery i kamerę.

DZIEŃ 9:

  1. Wybierz obiektyw mikroskopu 60X. Dodaj olejek immersyjny do soczewki i umieść próbkę na uchwycie szkiełka mikroskopowego. Podnieś obiektyw, aż olej zetknie się z prowadnicą. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby zlokalizować blaszki amyloidowe w hipokampie lub korze mózgowej za pomocą epifluorescencyjnego oświetlenia przez okulary.
  2. Uzyskaj obrazy konfokalne aktywowanych fagocytów jednojądrzastych otaczających złogi amyloidu w hipokampie lub korze gryzoni za pomocą mikroskopii konfokalnej (60-krotne powiększenie, kroki z-stack: 0,25 μm < z < 0,40 μm, liczba kroków 25 < n < 35).

4. q3DISM

Uwaga: Aby uzyskać znaczące wyniki, sugerujemy przeanalizowanie co najmniej 3 obrazów na zwierzę/region zainteresowania. Dla każdego obrazu obfitość komórek do analizy może się różnić w zależności od paradygmatów eksperymentalnych. W reprezentatywnych wynikach przedstawionych w tym raporcie przeanalizowaliśmy 3 komórki / stan (np. fagocyty jednojądrzaste odległe od blaszek lub związane z blaszkami; patrz ryc. 1C - D i 2C - D).

DZIEŃ 10:

  1. Analizuj zestawy danych konfokalnych za pomocą naukowego modułu kolokalizacji oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów 3D (coloc) pod kątem przestrzennej bliskości barwienia Iba1/CD68 (tkanka szczura) lub Iba1/LAMP1 (tkanka myszy) we wszystkich płaszczyznach Z jednocześnie. Utwórz kanały kolokalizacyjne Iba+/CD68+ lub Iba+/LAMP1+, które odpowiadają fagolizosomom w aktywowanych fagocytach jednojądrzastych.
    1. Wybierz TRITC dla kanału A (odpowiadającego barwieniu Iba1 sprzężonemu z fluoroforem 594 nm) i FITC dla kanału B (odpowiadającego barwieniu CD68 lub LAMP1 sprzężonemu z fluoroforem 488 nm). Po prawej stronie okna oprogramowania dla "Sprawdzanie trybu" wybierz "próg", a dla "Intensywności coloc" wybierz "Kanały źródłowe".
    2. Kliknij "Edytuj", aby wybrać "kolor coloc" po prawej stronie okna oprogramowania.
    3. Dla każdego kanału niezależnie dostosuj progi, aby uwzględnić określone barwienie i wykluczyć sygnały tła/niespecyficzne. Po dostosowaniu nie zmieniaj progów między obrazami, aby zapewnić bezstronną analizę. Kolokalizowane woksele (piksele ze wszystkich stosów z) pojawią się w kolorze wybranym w kroku 4.1.2 we wszystkich stosach z jednocześnie.
    4. Kliknij "zbuduj kanał coloc". Utworzony kanał kolokalizacji pojawi się w oknie regulacji wyświetlania.
    5. Kliknij na kanał coloc, aby otworzyć statystyki kanału. "% objętości/materiału A powyżej progu kolokalizowanego" oznacza % sygnału Iba1 (woksele odpowiadające fluoroforowi 594 nm) kolokalizowanego z sygnałem LAMP1 lub CD68 (woksele odpowiadające fluoroforowi 488 nm). Mówiąc prościej, jest to objętość monocytów zajmowana przez fagolizosomy (patrz ryc. 1C i 2C).
      UWAGA: "% objętości/materiału B powyżej progu kolokalizowanego" odpowiada % sygnału LAMP1 lub CD68 kolokalizowanego z Iba1. Powinno to być bliskie 100%, ponieważ fagolizosomy są strukturami wewnątrzkomórkowymi. Wartości są oparte na stosunku sygnału ze wszystkich stosów z powyżej progu kolokalizowanego.
  2. Korzystając z modułu coloc, przeanalizuj kanał coloc utworzony w kroku 4.1 pod kątem bliskości przestrzennej z sygnałami OC (tkanka szczura) lub 4G8 (tkanka myszy) Aβ. Pozwala to na ilościowe określenie Aβ zamkniętego w fagolizosomach.
    1. Wybierz zestaw danych coloc kanału A (odpowiadający kanałowi coloc Iba1/CD68 lub Iba1/LAMP1 utworzonemu w kroku 4.1) i Cy5 dla kanału B (odpowiadającego barwieniu OC lub 4G8 sprzężonemu z fluoroforem 647 nm).
    2. Zbuduj kanał coloc zgodnie z opisem w krokach od 4.1.2 do 4.1.5.
    3. Kliknij na kanał coloc, aby otworzyć statystyki kanału. "% objętości/materiału A powyżej progu kolokalizowanego" oznacza % Iba1/LAMP1 lub Iba1/CD68 (wokseli odpowiadających kanałowi coloc zbudowanemu w kroku 4.1.5) kolokalizowanych z sygnałem OC lub 4G8 (woksele odpowiadające fluoroforowi o długości fali 647 nm). Jest to objętość fagolizosomalna zajmowana przez Aβ (patrz rysunki 1D i 2D).
      UWAGA: "% objętości/materiału B powyżej progu kolokalizowanego" odpowiada % całkowitego sygnału Aβ kolokalizowanego z fagolizosomami. Można to wykorzystać do oceny frakcji całkowitych depozytów Aβ zamkniętych w fagolizosomach (niepokazanych w obecnych reprezentatywnych wynikach).
  3. Użyj modułu surpass, aby zrekonstruować stosy obrazów konfokalnych i wygenerować modele 3D Aβ zamknięte w fagolizosomach monocytów.
    1. W oknie "Regulacja wyświetlania" wybierz TRITC (aby wyświetlić tylko barwienie Iba1). W oknie "Właściwości objętości" kliknij "dodaj nową powierzchnię".
    2. W kroku "Algorytm 1/5", w "ustawieniach" wybierz "powierzchnia". Również w "kolorze" wybierz typ koloru w palecie lub RGB i dostosuj przezroczystość (kolor czerwony jest ustawiony na 60% przezroczystości na rysunkach 1B i 2B). Zaznacz pole wyboru "wybierz obszar zainteresowania". Kliknij Dalej.
    3. W kroku "2/5 obszar zainteresowania" narysuj okno wokół interesującej komórki, dostosowując współrzędne x, y i z (patrz białe pola na rysunkach 1A i 2A). Kliknij Dalej.
    4. W kroku "Kanał źródłowy 3/5" wybierz kanał źródłowy TRITC. Zaznacz pole "gładkie" i ustaw poziom szczegółowości powierzchni na 0,4 μm. W polu "thresholding" (określanie progów) wybierz intensywność bezwzględną. Kliknij Dalej.
    5. W kroku "Próg 4/5" dostosuj próg tak, aby utworzona głośność idealnie pokrywała się z sygnałem kanału TRITC. Kliknij Dalej.
    6. W kroku "5/5 Klasyfikacja powierzchni" w sekcji "Typ filtra" wybierz obiekty w zależności od ich rozmiaru, które mają zostać uwzględnione lub wykluczone z tworzonych objętości. Kliknij przycisk Zakończ, wykonaj wszystkie kroki tworzenia i zamknij kreatora.
    7. Powtórz kroki od 4.3.1 do 4.3.6, aby utworzyć powierzchnię 3D dla kanału FITC (fagolizososomy LAMP1+ lub CD68+).
    8. Powtórz kroki od 4.3.1 do 4.3.6, aby utworzyć powierzchnię 3D dla kanału Cy5 (osady OC+ lub 4G8+ Aβ).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z wieloetapowej metodologii q3DISM opisanej powyżej, jesteśmy w stanie określić ilościowo wychwyt Aβ przez fagolizosomy monocytów w mózgach myszy APP/PS1 (Rysunek 1) i szczurów TgF344-AD (Rysunek 2). W związku z tym metodologia q3DISM umożliwiła analizę fagocytów jednojądrzastych w mysich i szczurzych modelach AD. Co ciekawe, objętość zajmowana przez fagolizosomy CD68 + jest znacznie zwiększona w fagocytach jednojądrzastych Iba1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół, który opisujemy w tym raporcie, dotyczący prawdziwej kwantyfikacji 3D fagocytozy Aβ in vivo przez fagocyty jednojądrzaste, opiera się na specyficznym znakowaniu przedziałów komórkowych i subkomórkowych, a także złogów Aβ. W szczególności używamy Iba1 (cząsteczka 1 zjonizowanego adaptera wiążącego wapń), białka, które bierze udział w marszczeniu błony i fagocytozie po aktywacji komórek18,19, do barwienia jednojądrzastych fagocytów mózgowych. Chociaż komórki Iba1 +

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M-V. G-S. jest wspierany przez BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease Research Fellowship Award (A2015309F) oraz Alzheimer's Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. jest wspierany przez Fundację ARCS i Francuską Fundację Alzheimera im. Johna Douglasa Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. Praca ta była wspierana przez National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, do T.T.), Alzheimer's Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, do T.T.) oraz American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, do T.T.). Jesteśmy wdzięczni za fundusze na start z Instytutu Neurogenetycznego Zilkha, które pomogły w realizacji tej pracy.  

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IsofluraneAbbottNDC 0044-5260-05
Nożyczki preparacyjneVWR82027-582
Nożyczki preparacyjne końcówkaVWR82027-588
PęsetaVWR94024-408
Igła 23 GPompa
FH10Thermo Scientific72-310-010
PBS 10xBioland ScientificPBS01-02Sól fizjologiczna buforowana fosforanami; Stężenie robocze 1x
Matryca mózgu dorosłej myszy, plastry koronalne, stal nierdzewna 1 mm Kent ScientificRBMS-200C
Matryca mózgu dorosłego szczura, plastry koronalne, stal nierdzewna 1 mm Kent ScientificRBMS-305C 
32% wodny roztwór paraformaldehydu (PFA)EMS15714-SUwaga: Toksyczny. Stężenie robocze: 4% w PBS
EtanolVWR89125-188Różne stężenia, patrz protokół
Kasety Tissue-Tek Uni SakuraVWR25608-774
Parafina do zatapiania i infiltracjiVWR15147-839
Mikrotom Leica RM2125Leica Biosystems
 VWR25608-964
Kąpiel wodna Leica HI 1210Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plusVWR48311-703
XyleneSigma-Aldrich534056-4X4LUwaga: Toksyczny 
Roztwór do odzyskiwania celu 10xDAKOS1699Stężenie robocze 1x
KimWipesVWR21905-026
Hydrofobowy długopis PAPVWR95025-252
Triton X-100VWR97062-208
Normalna surowica osła (NDS)Jackson Immuno017-000-121
Szkiełka nakrywkoweVWR48393081
Odczynnik przeciwblaknięcia Prolong Gold z DAPILife TechnologiesP36935
Szklany stojak na slajdyVWR100492-942
Przeciwciało Iba1 (poliklonalne, królik)Wako019-19741 Stężenie robocze 1:200
Przeciwciało Iba1 (poliklonalne, kozie)LifeSpan BioscienceLS-B2645Stężenie robocze 1:200
szczur CD68 [KP1] przeciwciało (monoklonalne, mysz)Abcamab955Stężenie robocze 1:200
mysz CD68 [FA-11] przeciwciało (monoklonalne, szczur)Abcamab53444Stężenie robocze 1:200
mysz CD107a (LAMP1) przeciwciało (monoklonalne, szczur)Affymetrix14-1071Stężenie robocze 1:100
Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) przeciwciało (monoklonalne, mysie)CovanceSIG-39220Stężenie robocze 1:200
Beta-amyloid, 1 - 16 (6E10) przeciwciało (monoklonalne, mysie)CovanceSIG-39320Stężenie robocze 1:200
Przeciwciało OC (poliklonalne, królik)Podarowane przez D. H. Cribbs i C. G. Glabe (UC Irvine)Stężenie robocze 1:200
Przeciwciało wtórne myszy Alexa Fluor 488InvitrogenA-11001Stężenie robocze 1:1,000
Alexa Fluor 488 przeciwciało wtórne szczuraInvitrogenA-11006Stężenie robocze 1:1,000
Alexa Fluor 594 przeciwciało drugorzędowe królikaInvitrogenA-11037Stężenie robocze 1:1,000
Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało wtórneInvitrogenA-11080Stężenie robocze 1:1,000
Alexa Fluor 647 mysie przeciwciało wtórneInvitrogenA-21235Stężenie robocze 1:1,000
Alexa Fluor 647 przeciwciało wtórne królikaInvitrogenA-21443Stężenie robocze 1:1,000
Olejek immersyjnyNikon 
Mikroskop konfokalny A1Nikon 
Oprogramowanie NIS Elements Advanced ResearchNikon 
Imaris:Oprogramowanie Bitplane w wersji 7.6Bitplane"coloc" i "supass". Alternatywnie, darmowe oprogramowanie typu open source  ImageJ może być używany do kolokalizacji  Analiza zbiorów danych konfokalnych stosów Z.
perystaltyczna VWR BD305145 Jednorazowe ostrza do mikrotomów Używane są moduły

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. Innate immunity in Alzheimer's disease. Nat Immunol. 16 (3), 229-236 (2015).
  4. Mawuenyega,, et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease. Science. 330 (6012), 1774(2010).
  5. Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 28 (33), 8354-8360 (2008).
  6. Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease. Biochem Soc Trans. 39 (4), 886-890 (2011).
  7. Gjoneska, E., et al. Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease. Nature. 518 (7539), 365-369 (2015).
  8. Reitz, C., Mayeux, R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol. 88 (4), 640-651 (2014).
  9. Hazrati, L. -N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2949(2012).
  10. Griciuc, A., et al. Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta. Neuron. , 1-13 (2013).
  11. Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease. Scientific reports. 5, 12393(2015).
  12. Weitz, T. M., Town, T. Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context". Int J Alzheimers Dis. , 314185(2012).
  13. Guillot-Sestier, M. -V., Doty, K. R., Town, T. Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease. Trends Neurosci. 38 (11), 674-681 (2015).
  14. Guillot-Sestier, M. -V., Town, T. Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12 (5), 593-607 (2013).
  15. Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng. 17 (6), 157-165 (2001).
  16. Guillot-Sestier, M. -V., et al. Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology. Neuron. 85 (3), 534-548 (2015).
  17. Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. J Neurosci. 33 (15), 6245-6256 (2013).
  18. Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (3), 855-862 (1996).
  19. Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. J Neurochem. 88 (4), 844-856 (2004).
  20. Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (30), 11055-11060 (2014).
  21. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
  22. Connor, T., et al. Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis. Neuron. 60 (6), 988-1009 (2008).
  23. Cai, D., et al. Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1936-1940 (2006).
  24. Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (9), 1316-1325 (2016).
  25. Lefterov, I., et al. Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice. J Biol. Chem. 285 (47), 36945-36957 (2010).
  26. Blurton-Jones, M., et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13594-13599 (2009).
  27. Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. 3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid. Neurobiol Aging. 22 (3), 427-434 (2001).
  28. Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 33(2015).
  29. Liarski, V. M., et al. Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue. Sci Transl Med. 6 (230), 46(2014).
  30. Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).
  31. Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).
  32. Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease. J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).
  33. Novotny, R., et al. Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model. J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).
  34. Tartaro, K., et al. Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat. J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fagocyty jednoj drowemikroskopia konfokalnaanaliza kolokalizacjirekonstrukcja 3Dbarwienie fagolizosom wgryzoniowe modele choroby Alzheimerafluorescencyjne barwienie immunocytochemiczne

Powiązane artykuły