Zmodyfikowana witryfikacja MicroSecure: bezpieczna, prosta i wysoce skuteczna procedura kriokonserwacji ludzkich blastocyst

Summary

MicroSecure Vitrification został opracowany jako niekomercyjny, aseptyczny system zamkniętych urządzeń do witryfikacji, który jest zgodny z dobrymi praktykami FDA w zakresie produkcji i obchodzenia się z tkankami. Ze względu na wycofanie z przemysłu hydrofobowych słomek zarodkowych, procedura witryfikacji została zmodyfikowana tak, aby obejmowała wewnętrzną uszczelkę przed standardową wewnętrzną zatyczką bawełnianą.

Abstract

Kliniczna witryfikacja zarodków ewoluowała wraz z rozwojem unikalnych urządzeń do witryfikacji w XXI^{wieku i} z błędnym przekonaniem, że ultraszybkie chłodzenie w systemie "otwartym" (tj. bezpośredni kontakt z LN₂) było koniecznością dla optymalizacji sukcesu witryfikacji. Dogmat otaczający znaczenie szybkości chłodzenia doprowadził do niebezpiecznych praktyk podlegających zmianom technicznym oraz do stworzenia urządzeń do witryfikacji, które ignorowały ważne czynniki kontroli jakości (np. łatwość użycia, powtarzalność, niezawodność, bezpieczeństwo etykietowania i bezpieczeństwo przechowywania). Zrozumienie wad kontroli jakości innych urządzeń pozwoliło na opracowanie bezpiecznej, pewnej, powtarzalnej i niezawodnej metody μS-VTF, której celem było zminimalizowanie różnic między technikami i technikami. Co równie ważne, połączono dostępność dwóch istniejących urządzeń zgodnych z FDA: 1) słomki zarodkowej z żywicy jonomerowej o pojemności 0,3 ml z internalizowanym, dwukolorowym, odpornym na manipulacje oznakowaniem z powtarzalnym potencjałem zgrzewania; oraz 2) skrócone, powszechnie używane, sterylne flexipettes o średnicy wewnętrznej 300 μm do bezpośredniego ładowania zarodka (zarodków) w celu stworzenia wysoce skutecznego globalnego urządzenia do witryfikacji. Podobnie jak inne aseptyczne, zamknięte systemy witryfikacji (np. High Security Vitrification (HSV), Rapid-i i VitriSafe) skutecznie stosowane w medycynie reprodukcyjnej, microSecure Vitrification (μS-VTF) udowodnił, że może osiągnąć wysoką przeżywalność po ociepleniu i wyniki ciąży dzięki dbałości o prostotę i zmniejszoną zmienność techniczną. Chociaż słomka zarodkowa o pojemności 0,3 ml zawierająca wewnętrzną czop hydrofobowy została komercyjnie zastąpiona standardową słomką nasienia zawierającą zatyczki bawełniano-poliwinylopirolidonowe (PVP), zachowała ona swój skład żywicy jonomerowej, aby zapewnić uszczelnienie spoin. Jednak bawełniane zatyczki mogą w kontakcie odprowadzać płynną zawartość zarodków z flexipettes. Zmodyfikowana metoda μS-VTF została dostosowana w taki sposób, aby zawierała dodatkowe wewnętrzne uszczelnienie spawalnicze przed zaślepką po stronie obciążenia urządzenia. Dodatkowy etap techniczny procedury μS-VTF nie wpłynął na jej pomyślne zastosowanie, ponieważ wysokie wskaźniki przeżywalności (> 95%) i ciąż utrzymują się do dziś.

Introduction

Witryfikacja jest najbardziej wpływową technologią wspomaganego rozrodu w branży zapłodnienia in vitro (IVF) od czasu rozwoju docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Obecnie blastocysty są kriokonserwowane bez utraty żywotności zarodka, która wcześniej była związana z konwencjonalnymi metodami powolnego zamrażania¹. Dzięki niezawodnej przeżywalności zarodków po ociepleniu, przemysł niepłodności przekształca się w preferowane cykle kriokonserwowanego transferu zarodków, które dają podobne lub wyższe wyniki ciąży niż tradycyjny transfer świeżych zarodków. W połączeniu z biopsją blastocysty i preimplantacyjnymi genetycznymi badaniami przesiewowymi (PGS), witryfikacja stała się istotnym narzędziem klinicznym do optymalizacji zdrowych wyników żywych porodów poprzez euploidalny transfer pojedynczego zarodka^2,3.

Witryfikacja zarodków mysich została opracowana w połowie lat 80. XX wieku^4,5 i dostosowana do hodowli zwierząt przez 1990⁶. Opierając się na założeniu, że roztwory witryfikacyjne tworzą metastabilny stan szklisty, wolny od szkodliwego tworzenia się kryształków lodu, udowodniono, że skuteczniej zachowują pełną integralność komórkową zarodków. Co ciekawe, obiecująca akceptacja witryfikacji w embriologii człowieka zaczęła być realizowana dopiero w XXI^wieku. Wczesne publikacje promujące stosowanie witryfikacji zbiegły się w czasie z rozwojem unikalnych urządzeń systemu "otwartego"^7,8,9. Jednak przyjęcie witryfikacji do praktyki klinicznej było powolne, ponieważ nastąpiło w czasie, gdy następowała również poprawa w powolnym zamrażaniu blastocyst. Udane konwencjonalne zamrażanie w powolnym tempie, oprócz witryfikacji, zostało dostosowane do ulepszeń w systemach hodowli zarodków, a także do włączenia metod zapadania się blastocoele, co zwiększyło zarówno całkowite przeżycie trofektodermy, jak i następnie implantację¹⁰.

W ostatniej dekadzie technologia witryfikacji szybko wyparła konwencjonalne praktyki zamrażania. W dużej mierze wynikało to z opracowania specjalistycznych urządzeń do witryfikacji. Niektóre z tych urządzeń ograniczyły ogólne bezpieczeństwo, wydajność i skuteczność witryfikacji klinicznej, wprowadzając nieodłączne wady konstrukcyjne do urządzeń stosowanych w branży IVF¹¹. Rzeczywiście, niuanse różnych urządzeń wprowadzają znaczne różnice techniczne między programami, powszechnie określane jako "sygnatury techniczne"¹². W związku z tym czasopisma naukowe, takie jak Journal of Visualized Experiments (JoVE), mogą służyć jako cenne źródło informacji o szczegółach technicznych, które pomogą zmniejszyć zmienność wyników. Innym nieustającym problemem jest to, że niektórzy embriolodzy nadal są dezinformowani, nawet dzisiaj, w oparciu o twierdzenia, że "ultraszybkie chłodzenie zarodków lub oocytów w »otwartym systemie witryfikacji« (tj. bezpośredni kontakt zarodka z ciekłym azotem (LN₂)) jest warunkiem wstępnym optymalizacji wskaźników sukcesu". Oczywiście, to przekonanie jest błędne, oparte na udowodnionym sukcesie aseptycznych systemów zamkniętych^{13, 14,15}.

Na podstawie kriobiologicznych zasad witryfikacji, skuteczność witryfikacji jest bardziej zależna od tempa ocieplenia niż od tempa chłodzenia^16,17,18. Ogólnie rzecz biorąc, niezależnie od zastosowanego urządzenia do witryfikacji, szybkość nagrzewania musi przekraczać szybkość chłodzenia, aby zapewnić wysokie wskaźniki przeżycia. Wysokie tempo ocieplania minimalizuje możliwość wzrostu lodu (tj. rekrystalizacji zanieczyszczeń jądrzastych w krioroztworach) podczas fazy dewitryfikacji ocieplenia. To prawda, że stabilność roztworu witryfikacyjnego (tj. rodzaj i stężenie użytych środków krioprotekcyjnych) może mieć mylący efekt, ale jest to omówione w osobnej publikacji¹¹. Biorąc pod uwagę problemy z szybkością chłodzenia i nagrzewania, MicroSecure Vitrification (μS-VTF) została opracowana w 2008 roku jako niedroga, niekomercyjna, zgodna z FDA metoda, która zoptymalizowała aspekty kontroli jakości witryfikacji. Jego wyjątkowość polegała na tym, że oferował odporne na manipulacje, zinternalizowane, dwukolorowe etykietowanie. Ponadto, dzięki ładowaniu i przechowywaniu zarodków bezpośrednio w sterylnym flexipette używanym do pipetowania (tj. bez pipetowania do powierzchni urządzenia wtórnego) oraz dzięki zastosowaniu słomek z żywicy jonomerycznej, które całkowicie zgrzewają za pomocą automatycznego zgrzewarki, różnice techniczne zostały skutecznie wyeliminowane.

Przy ocenie kompletności urządzeń do witryfikacji pod kątem potencjalnego użytku, powinno być wziętych pod uwagę kilka czynników kontroli jakości, w tym: 1) Potencjał etykietowania - Czy etykiety mogą być bezpiecznie przestrzegane? Czy są odporne na manipulacje? Czy oferują one potencjał identyfikacji dwukolorowej? Czy wymaga to dodatkowej etykiety i czy etykietę można łatwo usunąć w celach dokumentacyjnych (tj. weryfikacji pacjenta) po ociepleniu? 2) Łatwość techniczna — czy zarodki można łatwo załadować do urządzenia / na nie w odpowiednim czasie i łatwo zidentyfikować i śledzić po podgrzaniu? 3) Prostota proceduralna/powtarzalność — Czy metoda witryfikacji oferuje prostotę i niezawodność, które łatwo pozwalają na powtarzalność, co minimalizuje różnice między technikami (wewnętrznymi) i programami (zewnętrznymi)? 4) Pojemność pamięci LN₂ — czy urządzenia można łatwo i bezpiecznie obsługiwać i identyfikować? Czy ich potencjał magazynowy jest efektywny przestrzennie? Czy urządzenie zapewnia bezpieczeństwo i ochronę przed uszkodzeniami fizycznymi lub możliwymi zanieczyszczeniami jako aseptyczny system zamknięty? 5) Potencjał rekonwalescencji / Przeżywalność - Czy konstrukcja urządzenia jest podatna na potencjalne problemy z gwarantowanym odzyskiwaniem zarodków i czy niezawodnie witryfikują i utrzymują pełną integralność komórkową po ociepleniu? Ten ostatni konkretny problem związany z jakością, czyli wskaźnik odzysku, został w rzeczywistości zaskakująco zminimalizowany w opublikowanych raportach; Odbywa się to poprzez ukrywanie niekorzystnego wyniku (tj. utraconego zarodka lub komórki jajowej) w typowo dobrych wskaźnikach przeżycia. Każde urządzenie podatne na niespójne odzyskiwanie (<99%) jest poważnie wadliwe i stanowi odpowiedzialność proceduralną.

Nasza asepyczna, zamknięta metoda μS-VTF została strategicznie opracowana, aby uwzględnić każdy środek kontroli jakości. Jednak po 5 latach doskonałych sukcesów klinicznych i walidacji¹⁴, procedura musiała zostać zmodyfikowana. Oryginalne słomki zarodkowe o pojemności 0,3 ml (posiadające korek hydrofobowy) zostały usunięte z przemysłu IVF i zastąpione słomką nasienia o pojemności 0,3 ml posiadającą standardową zatyczkę bawełnianą/PVP (tj. przemianowaną na słomkę nasienia/zarodka). W tym dokumencie proceduralnym przedstawiono konkretne kroki i strategie potrzebne do bezpiecznego, prostego i skutecznego wdrożenia μS-VTF. Ponadto zwracamy uwagę na modyfikacje niezbędne do niezawodnego uwzględnienia ograniczeń w dostawach, do czasu, gdy alternatywny idealny pojemnik na słomę zostanie ponownie wprowadzony z powrotem do laboratorium klinicznego.

Protocol

Opracowanie procedury μS-VTF zostało przeprowadzone w ramach zatwierdzonego badania Institutional Review Board (IRB) w latach 2008-2009 (Aspire IRB, Santee, CA) na temat kriokonserwacji ludzkich oocytów i zarodków. Od tego czasu procedura ta jest rutynowo stosowana w leczeniu klinicznym pacjentów z niepłodnością, którzy podpisali formularze świadomej zgody.

1. Uwagi dotyczące kontroli jakości

1. Używaj różnych kolorów (np. długopisów, etykiet lub prętów identyfikacyjnych (ID) lub zatyczek), aby odróżnić pacjentów, którzy kriokonserwują więcej niż jedną grupę zarodków w ciągu dnia.
2. Dla każdego pacjenta należy używać różnych naczyń i pipet. Zminimalizuj objętość pożywki przenoszonej podczas przenoszenia blastocyst z jednego roztworu do drugiego.
3. Kriokonserwować jedną blastocystę na słomkę lub urządzenie. Utrzymuj aseptyczne/sterylne techniki i przestrzegaj wszystkich środków ostrożności.
4. Przed rozpoczęciem zabiegów potwierdź formularz skierowania od lekarza i podpisaną zgodę pacjenta. Sprawdzić rozmieszczenie zarodków (zarodków) pacjentów znajdujących się w inwentarzu.
5. Skorzystaj ze "Zwolnienia z odpowiedzialności i zgody na transport", jeśli blastocysty mają zostać przeniesione do innego obiektu. Upewnij się, że wszystkie podpisy są poświadczone na miejscu lub poświadczone notarialnie.
6. Potwierdzić właściwe środki kontroli jakości pożywki i odżywek białkowych, w stosownych przypadkach, w tym testy biologiczne, oznaczanie endotoksyn oraz weryfikację i śledzenie daty ważności/numeru partii.
7. Ustal limity krytyczne (tj. niski poziom obaw) dla klinicznego monitorowania i oceny wyników kriokonserwacji, takie jak wskaźniki wyzdrowienia: < 95%, wskaźniki przeżycia: < 80% oraz wskaźniki ciąż klinicznych przy użyciu pojedynczych blastocyst euploidalnych: < 50%.

2. Procedura kriokonserwacji

1. preparat
   1. Wypełnij odpowiednie dokumenty, w tym wprowadź dane do arkuszy roboczych i bazy danych kriokonserwacji oraz dzienników inwentaryzacji.
   2. Przygotuj świeże roztwory do krioprezerwacji lub użyj źródła komercyjnego (przestrzegając zalecanych przez producenta warunków przechowywania i trwałości).
   3. Przygotowanie słomy.
      1. Otwórz stronę z etykietami zindywidualizowanych sterylnych opakowań. Odłącz dyszę napełniającą znajdującą się na tradycyjnej słomce zarodkowej o pojemności 0,3 ml, chwytając ją za opakowanie i częściowo podnosząc i wyciągając słomkę; Spowoduje to, że końcówka etykiety będzie wystawiona na działanie warunków otoczenia, podczas gdy słomka będzie spoczywać aseptycznie wewnątrz plastikowego opakowania.
         1. (Modyfikacja) W przypadku słomek nasienia/zarodków o pojemności 0,3 ml wciśnij zatyczkę w dół o 0,5 cm. Nałóż wewnętrzną uszczelkę przed zatyczką z bawełny PVP za pomocą podstawowego zgrzewarki impulsowej na stole.
         2. Umieść słomkę na teflonowej powierzchni elektrody, tuż przed korkiem. Naciśnij uchwyt, aby aktywować ogrzewanie. Zwolnij uchwyt, gdy pojawi się czerwone światło. Aby zapewnić pełne uszczelnienie spoiny, podgrzej ją w temperaturze, która wystarczająco spłaszczy przeciwległe powierzchnie, a następnie obróć ją o 180° i ponownie uszczelnij przeciwległą powierzchnię¹⁹ w razie potrzeby.
   4. Za pomocą kriomarkera oznacz każdą słomkę/urządzenie i kriogobiert imieniem i nazwiskiem pacjenta, unikalnym numerem identyfikacyjnym (np. SSN, DOB lub numerem identyfikacyjnym pacjenta) oraz datą zamrożenia. Umieść również unikalny numer na każdej słomce/urządzeniu (np. 1, 2, 3 itp.).
      1. Przymocuj etykietę (najlepiej kolorową) do kolorowego pręta identyfikacyjnego, który zostanie włożony i zapieczętowany w słomce do zarodków o pojemności 0,3 ml. Słomkę należy umieścić z powrotem w indywidualnym sterylnym opakowaniu do czasu użycia.
         nuta: Jeśli dostępne są tylko pręty ID o średnicy 30 mm ważone kolorem, konieczne jest dodatkowe włożenie dwóch łożysk kulkowych, przylegających do każdej strony pręta ID.
   5. Zidentyfikuj każdą trzcinę za pomocą unikalnego wpisanego numeru identyfikacyjnego. Zidentyfikuj numer zbiornika magazynowego LN₂ i numer kanistra, w którym próbka (próbki) każdego pacjenta może być przechowywana przez długi czas.
   6. Przygotuj świeże naczynia kriogeniczne (100 mm), oznaczając dolną powierzchnię imieniem i nazwiskiem pacjenta, identyfikatorem roztworu i identyfikatorem zarodka/kropli trzymającej (ryc. 1A). W szczególności ustaw 4 rzędy kropel: izotoniczne podłoże buforowane hepesem (na górze), V1 (roztwór równoważący (ES)), V2 (roztwór pośredni (IS)), V3 (roztwór do witryfikacji (VS); na dole). Napisz identyfikator zarodka w prawym górnym rogu z oznaczonymi kolumnami.
      nuta: Stosuje się serię kropelek płuczących o objętości od 25 do 50 μl (n = 3) w celu zapewnienia, że każda pojedyncza końcowa kropla/roztwór o wielkości od 10 do 15 μl (tj. V1, V2 lub V3) jest czysta i nierozcieńczona. Dzięki takiemu podejściu można poddać witryfikacji do pięciu pojedynczych zarodków przy użyciu jednego naczynia. Trzymaj każde naczynie pod przykryciem, gdy nie jest używane, aby uniknąć parowania/odwodnienia kropelek w temperaturze pokojowej.
   7. Przygotuj sterylne flexipettes, odcinając 3 cm od ich podstawy (zwane "końcówkami VTF"). Włóż je do pojedynczych pipet (o pojemności 3 μl) i ustaw końcówki pipet-VTF pionowo w styropianowym stojaku na probówki (Rysunek 1B).
2. Selekcja zarodków
   1. Potwierdź identyfikację pacjenta/próbki.
   2. Używając mikroskopu odwróconego (powiększenie 200 - 400X), oceń i sklasyfikuj blastocysty zgodnie z systemem klasyfikacji Gardnera²⁰, używając klasyfikacji numerycznej od 1 do 6 odpowiednio dla blastocyst wcześnie i wykluwających się oraz stopnia A, B lub C przypisanego do wewnętrznej masy komórkowej (ICM) i trofektodermy (TE).
      nuta: W ramach przygotowań do biopsji blastocysty i analizy euploidii, osłonka przejrzysta jest wstępnie wykluwana przez ablację laserową w dniu 3 w celu promowania wczesnej przepukliny TE, a zatem wymaga zmodyfikowanej klasyfikacji klasyfikacji². Krótko mówiąc, pełne blastocysty stopnia 3 wykazują do 10% przepukliny TE, rozszerzone blastocysty stopnia 4 są wylęgnięte w 10 - 50%, a blastocysty wylęgowe stopnia 5 mają > 50% ekstruzji TE (ryc. 2A-C).
      >nuta: Preferujemy kriokonserwację blastocyst stopnia 3 lub wyższego o jakości ≥BB w dniu 5 lub 6. Jednak zeszklone blastocysty o niższej jakości (C) i zarodki po zagęszczeniu we wcześniejszych stadiach (w tym blastocysty późnej moruli do stopnia 1 lub 2) z pewnością mogą przetrwać ocieplenie w stanie całkowicie nienaruszonym i dać zdolne do życia zarodki zdolne do osiągnięcia żywych urodzeń.
   3. Zapadnij blastocoele każdej blastocysty przed rozpoczęciem procesu kriodilucji poprzez mikronakłucie połączenia trofektodermy lub wykonanie laserowej ablacji impulsowej komórki trofektodermalnej²¹ w przypadku stosowania roztworów witryfikacji o niskiej molowości (< 6,5 M lub 40% v/v).
      nuta: Konieczność zapadnięcia się blastocyst nie jest zależna od urządzenia. W naszym własnym wczesnym rozwoju μS-VTF (2008) początkowo z powodzeniem stosowaliśmy roztwory glikolu etylenowego (EG)/DMSO z oocytami (1 na 1 ciążę donoszoną (1 na 1), ale nieoptymalne (< 80%) przeżycie/rozwój mysich blastocyst ¹⁶ było doświadczane przez innych²¹. Ponieważ roztwory na bazie glicerolu o wysokiej molowości (przekraczającej 7,9 M) są stosowane w naszym obecnym systemie VTF (od 2009 roku), fizyczny zapad blastocoele nie jest konieczny. Jednak ogólnie zaleca się selektywne wylęganie wyklutych blastocyst.
3. Kriodilucja i ładowanie blastocyst
   1. Wyjąć naczynie do hodowli pacjenta z inkubatora i potwierdzić identyfikację pacjenta/próbki z inną osobą (tj. świadkiem ze źródła wtórnego) przed usunięciem zarodka (zarodków), który ma zostać poddany witryfikacji.
   2. Potwierdzić rozwój blastocysty zgodnie z krokiem 2.2.2, zaktualizować kartę danych kriogenicznej i, pod mikroskopem stereoskopowym, odpipetować blastocysty (blastocysty) z szalki hodowlanej do izotonicznej kropli zatrzymującej się w naczyniu kriogenicznym.
   3. Przenieś każdą blastocystę do pojedynczych kropelek za pomocą flexipette do witryfikacji (tj. końcówki VTF).
   4. Przenieś każdą blastocystę do roztworu V1 (ES).
      1. Napełnij flexipette roztworem V1 (3 μl) i umieść połowę zawartości na zarodku.
      2. Zassać zarodek i przenieść do pierwszej z trzech kropelek do płukania V1 (wymienionych w kroku 2.1.6), odpipetować zarodek 2-3 razy dookoła obwodu i usunąć zawartość pipety z kropli (unikając tworzenia się pęcherzyków) lub na zewnątrz na powierzchni naczynia.
   5. Napełnij końcówkę VTF następną kroplą do płukania V1 i powtórz aspirację zarodka (zarodków). Powtórz po raz trzeci i przenieś blastocystę (blastocysty) do pojedynczej kropli podtrzymującej V1. Etapy rozcieńczania/mycia powinny trwać od 30 do 45 sekund. Wstępnie załaduj każdą końcówkę VTF następnym roztworem (np. V2), włóż pipetę do stojaka i użyj następnej pipety (zgodnie z konfiguracją w kroku 2.1.7) (Rysunek 1B).
      nuta: Ponieważ całkowity czas ekspozycji w roztworach niedimetylosulfotlenku (DMSO) zawierającego V1 i V2 wynosi po 5 minut, pipetowanie poszczególnych blastocyst powinno być równomiernie rozłożone w tym przedziale, biorąc pod uwagę, że końcowy etap V3 będzie wymagał co najmniej 1 minuty na blastocystę. Na przykład, jeśli w grupie witryfikacji znajdują się 4 blastocysty, pipetuj blastocysty #1-2-3-4 w odstępach 75 sekund.
      nuta: Opisany powyżej protokół rozcieńczania Innovative Cryo Enterprises (ICE) wyraźnie różni się od większości innych komercyjnych procedur witryfikacji, które zazwyczaj obejmują roztwory zawierające DMSO. Protokoły te osiągają te same stopniowe rozcieńczenia poprzez stopniowe, ale mniej kontrolowane łączenie roztworu płuczącego (tj. pożywki izotonicznej), ES i VS.
   6. Powtórz kroki 2.3.4 i 2.3.5 przy użyciu roztworów V2 (IS).
   7. Powtórz kroki 2.3.4 i 2.3.5 przy użyciu rozwiązań V3 (VS).
   8. Po umieszczeniu każdej blastocysty w kropli utrzymującej V3, usuń pozostały roztwór i pęcherzyki z końcówki VTF (na zewnątrz kropli), a następnie całkowicie wypełnij końcówkę czystym V3 wokół zarodka. Wydalić około jednej trzeciej objętości (1 μl) i całkowicie odpipetować blastocystę (cysty) oraz pozostałą V3 do końcówki VTF.
   9. Wyjmij końcówkę VTF z pipety, wytrzyj końcówkę do sucha z resztek V3 na zewnętrznej powierzchni za pomocą sterylnego gazika i włóż końcówkę do przodu w otwarty koniec wstępnie oznakowanej słomki. "Sucha końcówka" ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania ewentualnemu wewnętrznemu przyleganiu słomy.
   10. Odwróć słomkę (etykietą skierowaną w dół), obserwuj końcówkę na wewnętrznej zatyczce lub uszczelce i bezpiecznie uszczelnij otwarty koniec 1 cm przestrzeni powietrznej. Zaleca się użycie automatycznego urządzenia uszczelniającego (np. Syms I) w celu wyeliminowania zmian technicznych.
       nuta: Zaletą stosowania słomek wykonanych z tworzywa sztucznego z żywicy jonomerowej (np. HSV lub μS-VTF) jest to, że użycie dowolnego prawidłowo działającego urządzenia do zgrzewania tworzy niezawodne uszczelnienie "spawalnicze", jak wspomniano w kroku 2.1.3.1.
   11. Po zamknięciu zanurz zamkniętą słomkę bezpośrednio w LN₂ w kolbie Dewara ze stali nierdzewnej i umieść słomkę (słomki) w otwartym kielichu przymocowanym do laski pacjenta w celu przechowywania.
       nuta: Ponieważ słomki μS-VTF wykorzystują 40-milimetrowe pręty identyfikacyjne w celu zrównoważenia wyporności słomki wypełnionej powietrzem, użycie odwróconych kielichów lub pustych kriowiali do przykrycia próbki (próbek) nie jest wymagane, chyba że w grę wchodzi transport.
4. Ocieplanie i wymłukiwanie/rozcieńczanie w roztworze krioroztworowym
   1. Potwierdź formularz skierowania od lekarza dotyczący daty transferu zarodków zeszklonych, planowanego czasu i szczegółów zarodka (liczba do rozmrożenia/transferu, konkretny numer zarodka, jeśli testowano PGS itp.).
   2. Przygotuj świeże roztwory rozgrzewające (1,0 M roztwór podstawowy sacharozy) i/lub użyj źródła komercyjnego (zalecane 1 tydzień-1 miesiąc trwałości po użyciu, przechowywanie w 4 °C).
      1. Podwielokrotność 17,1 g sacharozy rozlać do sterylnych kolb o pojemności 50 ml przy pierwszym otwarciu (np. źródło cotygodniowego zaopatrzenia) ze względu na ryzyko akumulacji endotoksyn w granulkach sacharozy przy powtarzającym się narażeniu otoczenia.
      2. Zmieszać wstępnie zważoną sacharozę granulowaną z roztworem (1,0 M zapasu = 3,42 g/10 ml płynu z jajowodów ludzkich buforowanych hepes [H-HTF]) i ogrzać roztwór do temperatury 37 °C w celu zwiększenia rozpuszczalności granulek. Kilkakrotnie odwracaj pojemnik, aby przyspieszyć i zakończyć końcowe mieszanie.
         nuta: Filtracja (filtr 0,22 μm) wykonywana za pomocą urządzeń do filtracji nadciśnieniowej jest zalecana w przypadku lepkich roztworów (> 0,5 M sacharozy) lub dużych objętości. Ręczne pompy ciśnieniowe są wystarczające i niedrogie, podczas gdy pompa elektryczna jest głośna, powoduje wibracje i po prostu nie jest wymagana.
   3. Ciepła (37 °C) po jednej probówce po 10 ml zawierającej 1,0 M roztwór sacharozy i pożywkę H-HTF na pacjenta do stosowania w kąpieli rozgrzewającej μS-VTF.
   4. Przygotuj świeże naczynia do rozmrażania (płytka 6-dołkowa), oznaczając powierzchnię pokrywy imieniem i nazwiskiem pacjenta oraz identyfikatorami roztworu.
      nuta: W tym przypadku użyliśmy: (1) płukania T1 (200 μL bez nakładki olejowej, (2) T1 (100 μL) z 1 ml oleju, (3) T2 (100 μL) z olejem, (4) T3 (100 μL) z olejem, (5) T4 (100 μL) z olejem oraz (6) T5/200 μL izotonicznego buforu HEPES z 10% albuminą surowicy ludzkiej (HSA) lub 20% substytutem surowicy bez nakładki olejowej. Zastosuj uniwersalny protokół obniżania poziomu roztworu sacharozy - T1 = 1,0 M, T2 = 0,5 M, T3 = 0,25 M i T4 = 0,125 M - jeśli ICE lub inne źródło komercyjne nie jest dostępne, zgodnie z propozycją dla wolno mrożonych zarodków22. Ponadto należy zauważyć, że początkowe płukanie T1 i końcowe równowagi T5 można przeprowadzić na 30-milimetrowych szalkach Petriego i na 4-dołkowej szalce używanej do etapów 2-5 powyżej, obejmującej nakładkę olejową.
   5. Rozmrażaj tylko zarodek (zarodki) jednej pacjentki na raz.
      1. Sprawdź Formularz Skierowania Lekarza i potwierdź cykl przed podgrzaniem wskazanej liczby (tj. 1 lub 2 blastocysty); oceń przeżycie/prawdopodobną żywotność, obserwując zmiany osmotyczne (tj. kurczenie się i ponowne uwodnienie) oraz nienaruszone błony, a w razie wątpliwości skontaktuj się z lekarzem i/lub pacjentem przed ociepleniem kolejnej blastocysty.
   6. Potwierdź identyfikację pacjenta/próbki ze współpracownikiem (tj. świadkiem ze źródła wtórnego).
   7. Umieścić trzcinę pacjenta w kolbie Dewara wypełnionej LN₂ i wyizolować, zidentyfikować słomkę, która ma zostać podgrzana.
   8. Doprowadzić 6-dołkowe naczynie do rozcieńczania do środka stereomikroskopu stage. Umieszczając 60-milimetrową szalkę Petriego z boku (tj. w zależności od preferencji technika po lewej lub prawej stronie), dodaj podgrzaną sacharozę (1,0 M) i roztwory H-HTF, aby utworzyć 0,5 M kąpiel rozgrzewającą sacharozę (odkrytą).
      nuta: Końcówki VTF są podgrzewane tylko w 0,5 M roztworach sacharozy jako zabezpieczenie kontroli jakości, aby zapewnić zachowanie żywotności zarodka w rzadkim przypadku, gdy zarodek zostanie wydalony po szybkim ociepleniu²².
   9. Przytrzymaj górną uszczelkę słomki powyżej poziomu cieczy, aby potwierdzić tożsamość, a następnie chwyć i zabezpiecz słomkę poniżej wewnętrznej zatyczki za pomocą nożyczek Mayo (końcówka VTF powinna być nadal zanurzona w LN₂).
      1. Mocno postukaj nożyczkami w kolbę Dewara (kilka razy), aby wyjąć końcówkę VTF z wewnętrznej ściany bocznej słomki jako środek ostrożności w zakresie kontroli jakości; jeśli końcówka VTF przylega, gwintowanie zapewnia, że podstawa końcówki opadnie na uszczelniony koniec naprzeciwko oznaczonego końca, zapewniając w ten sposób przestrzeń powietrzną w pobliżu końca korka.
   10. Podnieś słomkę nożyczkami do powietrza otoczenia w pozycji poziomej (obok lub poniżej powierzchni stereoskopu) i chwyć nieoznakowany koniec (etykieta po prawej stronie). Przetnij słomkę przy wewnętrznej zatyczce lub uszczelce i podnieś ją nad naczynie do kąpieli rozgrzewającej. Wlać końcówkę VTF do ciepłej kąpieli sacharozowej pod kątem 60°, aż zostanie całkowicie wytłoczona i szybko podgrzana (> 6 000 °C/min); Podstawa flexipette będzie spoczywać nad ścianą boczną naczynia.
       1. Pozwól, aby końcówka VTF swobodnie wpadła do wanny. Delikatnie postukaj w górną powierzchnię słomki, jeśli końcówka nie wynurzy się natychmiast. Jeśli pojawia się tylko częściowo, pomóż w wytłaczaniu, chwytając trzon flexipette nożyczkami lub cienkimi kleszkami.
   11. Po 5 - 10 s chwyć podstawę pipety i włóż ją do jednorazowego urządzenia do pipetowania; otwór w bańce działa w celu zmniejszenia ciśnienia po włożeniu. Zakryj otwór bańki palcem wskazującym i delikatnie ściśnij bańkę, aby uwolnić zeszkloną blastocystę do płukania T1 (#1) podczas oglądania pod mikroskopem stereoskopowym. Po potwierdzeniu usuń pozostały roztwór V3 (VS) i pęcherzyki za pomocą nadciśnienia, usuwając zawartość do środka, niewykorzystanego dobrze wyrzuć. Uruchom 5-minutowy timer.
       nuta: Wszystkie etapy rozcieńczania sacharozy przeprowadza się w temperaturze pokojowej (21 ± 2 °C).
   12. Zdejmij końcówkę VTF i umieść ją na pipecie. Kontynuuj, przenosząc zarodek do T1 #2 pod olejem na pozostały czas (około 3 - 4 minuty).
       1. Jeśli do przeniesienia potrzebna jest druga blastocysta, należy natychmiast ogrzać drugą słomkę i końcówkę VTF (powtarzając kroki 2.4.9 - 2.4.11) od pacjenta przed rozpoczęciem kroku 2.4.12. Przesunąć obie blastocysty razem, aby uzyskać minimalną elucję w T1 (1,0 M sacharozy) przez co najmniej 3 minuty.
   13. Wstępnie napełnij flexipette następnym roztworem, a następnie przesuwaj i rozcieńczaj blastocysty (blastocysty) w T2, T3 i T4 w odstępach 3-minutowych. Jeśli osłonka przejrzysta nie została wcześniej poddana ablacji laserowej (tj. wykluła), należy to zrobić w T4. Umieść szalkę na stoliku odwróconego mikroskopu i zobrazuj zarodek na monitorze komputera. Ustaw strefę w wyznaczonym czerwonym okręgu i aktywuj 2 lub 3 impulsy lasera diodowego (zaczynając od krawędzi przestrzeni perywitelnej i przesuwając się na zewnątrz), aby utworzyć otwór^2,19.
   14. Równoważyć blastocysty w T5 (tj. podłożu izotonicznym) przez 5 minut na ciepłej powierzchni (37 °C).
   15. Oceń początkowe przeżycie zarodka na podstawie dominującej obecności nienaruszonych błon komórkowych z równymi, półprzezroczystymi cytoplazmami pozbawionymi piknotycznego ciemnienia. Umieścić zarodek (zarodki) w hodowli na 2 - 6 godzin przed transferem zarodka, po którym to czasie rozwój/przeżycie zarodka powinno zostać ponownie ocenione i udokumentowane.
       nuta: Jeśli w momencie transferu istnieje więcej niż 1 żywotna blastocysta, a pacjent zdecyduje się na leczenie tylko 1 blastocystą, dodatkowa blastocysta może być następnie pomyślnie ponownie zeszklona (rVTF), powtarzając kroki 2.3.3 - 2.3.11. Mamy kilka potwierdzonych żywych urodzeń po pojedynczych zdarzeniach rVTF.
       Uwaga: rVTF przeprowadzono eksperymentalnie do 5 razy bez znaczącego wpływu na przeżycie/żywotność ludzkich blastocyst z aneuploidią zeszklonych w metastabilnym roztworze na bazie glicerolu.

Results

1 341 zeszklonych blastocyst zostało podgrzanych między 2012 a czerwcem 2014 roku, 1 341 zarodków odzyskano (100%), a 1 316 przeżyło (98,1%). Blastocysty poddane biopsji doświadczyły ponad 99,5% przeżycia. Po transferze głównie pojedynczych, przebadanych genetycznie euploidalnych, zeszklonych zarodków, byliśmy w stanie osiągnąć jedne z najwyższych wskaźników implantacji i żywych urodzeń w USA, niezależnie od wieku (Ryc. 3)²⁰, zgodnie z najnowszymi statystykami krajowymi zgłoszonymi przez Centrum Kontroli Chorób i Towarzystwo Technologii Wspomaganego Rozrodu (Tabele 1 i 2). Oceniając populację pacjentów o dobrym rokowaniu (w wieku poniżej 35 lat) dla samych cykli kriokonserwacji (Tabela 1), nasze laboratorium osiągnęło lepsze wyniki niż średnia krajowa zarówno pod względem wskaźników implantacji (tj. skuteczności zarodka w celu zajścia w ciążę), jak i ostatecznie wskaźników żywych urodzeń o ponad 30%. Dodatkowo, wstępna walidacja/weryfikacja naszych zmodyfikowanych słomek do przechowywania w połowie 2014 r. przy użyciu 70 zatwierdzonych przez badania, ponownie zeszklonych aneuploidalnych blastocyst zaowocowała 100% wyzdrowieniem i 100% przeżyciem.

Rysunek 1. Konfiguracja MicroSecure VTF. Naczynie VTF (A) składa się z 3 odrębnych rzędów roztworów witryfikacyjnych, które wykorzystują 3 kropelki płukania przed umieszczeniem w odrębnych, ponumerowanych kropelkach do przechowywania. Ponadto poszczególne pipety ze skróconymi końcówkami VTF (tj. flexipettes o średnicy wewnętrznej 300 μm) są zabezpieczone i zorganizowane w styropianowym stojaku na rurki (B), który można obracać w celu uporządkowanego użytkowania. Należy pamiętać, że reprezentatywny zestaw do pipetowania jednorazowych gruszek do mikropipet spoczywa na styropianowym stojaku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Zmodyfikowany system klasyfikacji blastocyst. Nasz zmodyfikowany system klasyfikacji blastocyst Gardnera uwzględnia indukowaną przepuklinę komórek TE, aby ułatwić biopsję blastocysty. Modyfikacja uwzględnia przedwczesne wylęganie się pełnych blastocyst (A: stopień 3 = mniej niż 10% przepukliny) i rozszerzonych blastocyst (B: stopień 4 = do 50% przepukliny), podczas gdy wylęgająca się blastocysta (C) ma więcej niż 50% przepukliny¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Porównawcze wyniki ciąży. W skumulowanym przedziale 1,5 roku porównano dane dotyczące ciąży w celu oceny skutków transferu blastocyst euploidalnych ogrzanych szklistością (n = 172 cykle/144 transfery) w porównaniu z cyklami innymi niż PGS (n = 160 cykli/153 transfery) obejmujących głównie świeże transfery¹⁸. Dla naszych celów eksperymentalnych dane te wyraźnie pokazują, że biopsyjne blastocysty zeszklone procedurą μS-VTF zachowują swoją żywotność. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział TGL

Źródło danych	# Cykle	Średnia # przeniesionych zarodków	Wskaźniki implantacji (%)	Wskaźnik urodzeń żywych (%)
Laboratorium NB *	144	Rozdział 1.2	74,00%	74,50%
Średnia krajowa	20 423	Pytanie 1.7	39,60%	44,10%
* Dane zostały uśrednione na podstawie wyników z 2014 roku klinik Orange County Fertility, Southern California Fertility Center i Southern California Center for Reproductive Medicine przy użyciu obecnego laboratorium Ovation Fertility (NB Lab), które stworzyło procedurę witryfikacji microSecure w 2008 roku.

Tabela 1. Statystyki CDC dotyczące wspomaganego rozrodu z 2014 roku. Dane dotyczące ciąży po transferze zamrożonych zarodków kobiet poniżej 35 roku życia z trzech raportujących klinik lekarskich korzystających z naszego laboratorium NB w porównaniu ze średnią krajową z 2013 r. wynoszącą ponad 450 raportujących klinik.

. . . .

SART Średnie krajowe
Klinika - Stan	kobieta	kobieta	kobieta	kobieta
	< 35 lat	35-37 lat	38-40 lat	41-42 lata
SCCRM-CA *	63,1%	58,3%	40,6 proc.	32,3 proc
CCRM-CO *	64,7%	61,5%	40,4 proc.	32,2%
RMA-NJ *	63,2 proc	59,7%	34,6%	18,7%
Średnia krajowa	48,6 proc	38,3%	24,3%	12,3 proc
SCCRM — Centrum Medycyny Reprodukcyjnej Południowej Kalifornii; CCRM — Centrum Medycyny Rozrodu w Kolorado; oraz RMA — Reproductive Medicine Associates (Współpracownicy Medycyny Rozrodu)
* Wszystkie te wiodące kliniki wprowadziły głównie cykle transferu zarodków z zarodkami, w połączeniu z preimplantacyjnymi testami genetycznymi, do swojej standardowej praktyki opieki nad pacjentem, aby zoptymalizować sukces żywego urodzenia na przeszczepiony zarodek.

Tabela 2. Skumulowane wskaźniki żywych urodzeń, zgłoszone przez Society for Assisted Reproductive Technologies (SART), dla Kliniki SCCRM korzystającej z naszego Laboratorium Płodności Ovation w Newport Beach w Kalifornii, kontrastowały z kilkoma innymi szanowanymi programami, a także ze średnimi krajowymi SART.

Discussion

Obecnie oczekuje się, że uda się osiągnąć całkowite przeżycie blastocysty (> 95%) i osiągnąć sukces implantacyjny podobny do tego, jaki ma miejsce w przypadku świeżych zarodków. Niektóre grupy sugerują, że wskaźniki żywych urodzeń w cyklach transferu zarodków zeszklonych są być może nawet wyższe niż w przypadku świeżych blastocyst, gdy nienaruszony kriokonserwowany zarodek jest przeszczepiany do zdrowej, niestymulowanej hormonalnie macicy. Nasze dane jednoznacznie wskazują, że witryfikacja skutecznie i niezawodnie utrzymuje żywotność świeżego zarodka. Ponadto udowodniliśmy, że nasza aseptyczna, zamknięta metoda, zwana MicroSecure Vitrification (μS-VTF), może osiągnąć optymalny wynik porównywalny lub wyższy niż standardy komercyjne (tj. otwarte systemy urządzeń) stosowane w branży IVF.

Zmienność jest związana z techniczną powtarzalnością i niezawodnością między osobami korzystającymi z wielu urządzeń/metod witryfikacji. To z kolei spowodowało niespójności między programami stosującymi witryfikację. Dlatego nie jest zaskakujące, że znajomość urządzenia jest ważnym czynnikiem wpływającym na biegłość laboratoryjną i pomyślne wyniki. To właśnie koncepcja "podpisu technicznego"¹¹ wyjaśnia, dlaczego powtarzalność między programami może być problematyczna. Opracowanie kilkunastu komercyjnych urządzeń nie tylko skomplikowało to zjawisko, ale także stworzyło problemy związane z kontrolą jakości. Na szczęście zamknięte systemy witryfikacji, takie jak μS-VTF, Rapid-I i VitriSafe, okazują się obecnie równie skuteczne w przypadku otwartych systemów urządzeń 12,13,14.

MicroSecure VTF to nowatorska, asepyczna technika witryfikacji opracowana z myślą o technicznej łatwości, niezawodności i kriobezpieczeństwie. Dzięki połączeniu dwóch wcześniej zatwierdzonych urządzeń zgodnych z FDA, jest to niekomercyjny system witryfikacji z wyraźną zaletą polegającą na ustalonym niskim koszcie, w przeciwieństwie do specjalistycznych urządzeń. Ponadto unikalny, odporny na manipulacje i zinternalizowany dwukolorowy system etykietowania, a także wiele innych zalet związanych z kontrolą jakości, sprawiły, że μS-VTF jest atrakcyjną globalną opcją¹¹. Jednak jako niekomercyjne urządzenie VTF, jego szerokie zastosowanie w przemyśle powoli ewoluuje. Tylko dzięki ciągłemu publikowaniu informacji o jego bezpieczeństwie i skuteczności klinicznej μS-VTF zyska coraz większe zastosowanie.

W sierpniu 2014 r., w obliczu braku możliwości pozyskania oryginalnej słomki zarodkowej o pojemności 0,3 ml wyprodukowanej z wewnętrzną, nieodprowadzającą wilgoci czopem hydrofobowym, byliśmy w stanie niezawodnie zmodyfikować metodę μS-VTF. Krótko mówiąc, nowe słomki do nasienia/zarodków o pojemności 0,3 ml z bawełnianymi zatyczkami PVP zostały skutecznie dostosowane. Osiągnięto to po prostu poprzez stworzenie wewnętrznego uszczelnienia przed bawełnianą zatyczką, zapobiegając w ten sposób kontaktowi i odprowadzaniu płynu z otwartą końcówką VTF (tj. flexipette zawierającą zarodek lub jaja). Ponadto, jeśli pręty o średnicy wewnętrznej 40 mm nie są dostępne, problem z wypornością związany z lżejszymi prętami 30 mm można zrównoważyć za pomocą dwóch łożysk kulkowych.

Te dodatkowe kroki sprawiły, że technika ta jest nieco mniej prosta, ale nadal bardzo skuteczna. Obecnie ekonomia i skuteczność stają się coraz ważniejszymi problemami, ponieważ blastocysty poddane biopsji są zazwyczaj zeszklone indywidualnie, dopóki ich status euploidalności nie zostanie potwierdzony w raporcie genetycznym. Blastocysty z potwierdzonym statusem aneuploidii nieżywotnej są zazwyczaj odrzucane, za zgodą pacjenta, w ciągu kilku tygodni. W związku z tym większość (> 50%) urządzeń VTF jest wyrzucana po krótkotrwałym przechowywaniu, co powoduje rosnące roczne koszty w przypadku korzystania z urządzeń komercyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, μS-VTF jest wysoce skuteczną, niezawodną i powtarzalną procedurą kriokonserwacji ludzkich blastocyst. Doskonała konstrukcja kontroli jakości bezpiecznie etykietuje i bezpiecznie przechowuje zarodki/oocyty, jednocześnie eliminując niepowodzenia w odzyskiwaniu i optymalizując przeżywalność i żywotność po ociepleniu, co uzasadnia stosowanie systemu jako uniwersalnego podejścia do witryfikacji zarodków.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trzcina aluminiowa		IVM XC055
Łożyska kulkowe, 3/32"	VXB.com	KIT15977	stal nierdzewna
CBS słomka nasienia/zarodka, 0,3 ml	CryoBioSystems	25292	indywidualny sterylny
kolor, pręty identyfikacyjne, 30 mm	CryoBioSystems	019021-26	ważone
probówki hodowlane, 15 ml	Falcon	352099	stożkowe
Probówki hodowlane, 10 ml	Falcon	352057	Snap-cap
Cryosleeves	Filtr Nalgene	5016-001
, 250 ml	Fisher Sci.	09-740-2A	0,22 μ m
Kolby, Kultura tkankowa 50 ml	Falcon	353014
Flexipettes, 300 μ m ID	Cook Med.	K-FPIP-1300-10BS-5	Sterylny, 20
kleszczyka, duży	Miltex	6-30TC
, drzazga - drobna	Miltex	17-305
Kielich	IVM	PA003
Zgrzewarka, SYMS 1	CryoBioSystems	16399	110 V lub 220 V z adapterem
Nośniki buforowane Hepes	Life Global lub	LGGH-100; 100  ml lub	przechowywane w temperaturze 2 - 8 º C
	Irvine Scientific	H-HTF; 90126; 100 ml	z nieistotnymi etykietami AA
, Cryo	GA International	CL-23T1	Różne kolory
Zbiornik ciekłego azotu, 40  L	MVE lub Taylor Warton	różne	płyny do przechowywania
LN2; Kolba Dewara, 0,5  L	Hampton Research	HR4-695	Szalki
Custera ze stali nierdzewnej 6-dołkowe	Biogenics	015/020	tworzywa sztuczne w etui
Żarówka do pipet, Micro Cap	Drummond	Fisher#13681451	Otwór na wierzchołku żarówki
Szalki Petriego, 35 mm		Szalki
, 58 mm	150288		Nunc
100 mm	Końcówki	351029
, ART długie	Fisher Sci.	02-707-80	10 - 100 μ L
Pipet Aid	Drummond lub Falcon	różne	ładowalne
urządzenia do pipetowania, pipety chirurgiczne	Stripper Cooper	MXL3-STR
, serologiczne 1  mL	Falcon	357521
, serologiczne 2  mL	Falcon	357507
pipety, serologiczne 5  mL	Falcon	357543
, serologiczne 10  mL	Nożyczki Falcon	357551
, Surgical	Mayo Miltex	5-SC-16
Stereomikroskop	Nikon, Olympus, Leica	różne
sterylne gaziki, 4 "x 4"	Kendall Healthcare	6939
Syntetyczne serum	Life Global lub	LGPS-20; 20 ml lub	przechowywane w temperaturze 2 - 8 º C
	Irvine Scientific	SS-99193; 12 x 10 ml	zakup partii o niskiej zawartości endotoksyn
Sacharoza	Sigma Chemical Co.	#S9378	Porcja na 50  kolby ml, 1 rok; 17,1 g/kolbę + podłoże do 50 ml; wytwarza roztwór 1 M; Filtr z 0,22 i mikro; m jednostka
Timer	Nalgene	5016-001
Rozwiązanie do rozmrażania	Innowacyjne przedsiębiorstwa kriogeniczne	BL-TS (≤ 1,0 mln sacharozy)	T1, T2, T3, T4; rozdarty w 2 - 8 º C jak ≤ 1 miesiąc po otwarciu
Roztworu do Witryfikacji*,**	Innowacyjne Przedsiębiorstwa Kriogeniczne	BL-VS (≥ 7,9 M [Glycerol/EG])	V1, V2, V3; przechowywane w temperaturze 2 - 8 º C jak ≤ 1 miesiąc po otwarciu
* Nieprzepuszczalne dodatki krioprotekcyjne mogą obejmować: sacharozę, fikol i hialuronian sodu
** Inne preparaty komercyjne to zazwyczaj glikol etylenowy (EG)/dimetylosulfotlenek (DMSO; 30% v/v; 4,8 M), ale może to być EG/glikol propylenowy (32% v/v; 5,2 M). Roztwory mieszane są zwykle stosowane w celu zmniejszenia obaw związanych z kriotoksycznością roztworu o wysokiej zawartości molowej. Rozwiązania komercyjne zazwyczaj obejmują rozwiązanie ES i VS. Formułowanie preparatu komercyjnego jest zazwyczaj własnością własnościową.