Method Article

Modyfikacja i funkcjonalizacja grupy guanidyny przez prekursory dostosowane do potrzeb klienta

DOI:

10.3791/54873

⸱

April 27th, 2017

 ,  , 
1Department of Chemistry, Technische Universität München

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół syntezy guanidyn modyfikowanych alkilem oparty na użyciu odpowiednich prekursorów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grupa guanidyny jest jedną z najważniejszych grup farmakoforycznych w chemii medycznej. Jedynym aminokwasem przenoszącym grupę guanidyny jest arginina. W artykule przedstawiono prostą metodę modyfikacji grupy guanidynowej w ligandach peptydowych na przykładzie ligandów integrynowych wiążących RGD. Niedawno wykazano, że wyraźna modyfikacja grupy guanidynowej w tych ligandach pozwala na selektywną modulację podtypu (np. między podtypami αv i α5). Ponadto zademonstrowano nieznaną wcześniej strategię funkcjonalizacji za pomocą grupy guanidyny, a podejście syntetyczne zostało omówione w niniejszym dokumencie. Opisane tutaj modyfikacje obejmują terminalnie (N, ω) alkilowane i acetylowane grupy guanidynowe. Do syntezy syntetyzowane są specjalnie przygotowane cząsteczki prekursorowe, które są następnie poddawane reakcji z ortogonalnie odzabezpieczoną aminą w celu przeniesienia wstępnie zmodyfikowanej grupy guanidyny. Do syntezy alkilowanych guanidyn do syntezy acylowanych związków stosuje się prekursory na bazie N,N′-Di-Boc-1H-pirazolo-1-karboksyamidyny, przy czym prekursorem z wyboru jest odpowiednio acylowana pochodna N-Boc-S-metyloizotiomocznika, którą można otrzymać w reakcjach jedno- i dwuetapowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wśród najliczniejszych grup farmakoforycznych w naturalnych ligandach jest grupa guanidyny, która bierze udział w wielu interakcjach1,2. Na przykład służy jako potencjalny czterokrotny donor wodoru w oddziaływaniach wiązań wodorowych i bierze udział w oddziaływaniach elektrostatycznych, takich jak mostki solne lub oddziaływania kation-π. W chemii medycznej grupa ta jest często spotykana w lekach i kandydatach na leki4, chociaż bardzo często jako mimetyki guanidyny5,6. Powodem rozwoju mimetyki guanidyny jest usunięcie wszechobecnej, dodatnio naładowanej grupy guanidyny, a także dostosowanie lipofilowości ligandu. W ligandach peptydowych jedynym aminokwasem zawierającym grupę guanidynową jest arginina, która dlatego często znajduje się w bioaktywnym regionie ligandów peptydowych.

Bardzo ważnym przykładem dla rodziny ligandów zawierających argininę jest podrodzina integryn wiążących RGD. Ogólnie rzecz biorąc, integryny są klasą receptorów adhezyjnych komórek, które przejmują ważne funkcje we wszystkich organizmach wyższych. Niektóre z tych funkcji obejmują adhezję komórek, migrację i przeżycie komórek. W związku z tym biorą również udział we wskazaniach patologicznych, takich jak rak i zwłóknienie. Integryny to transbłonowe białka heterodimeryczne składające się z podjednostki α i β, które tworzą 24 obecnie znane podtypy integryn; 8 z nich rozpoznaje sekwencję tripeptydową Arg-Gly-Asp (=RGD) w swoich ligandach7. Region wiązania znajduje się na granicy tych dwóch podtypów w części zewnątrzkomórkowej, tzw. grupie głównej integryny8. RGD rozpoznaje się na podstawie dwóch typowych oddziaływań: regionu miejsca adhezji zależnego od jonów metalu (MIDAS), który znajduje się w podjednostce beta i który wiąże kwas karboksylowy w ligandach (łańcuch boczny Asp); i grupa guanidyny w ligandach, która znajduje się w podjednostce alfa. Większość podtypów integryn jest rozwiązła i ma przynajmniej część swoich naturalnych ligandów macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)9. W związku z tym, przy opracowywaniu sztucznych ligandów integrynowych, główny nacisk kładziony jest, oprócz wysokiego powinowactwa wiązania, selektywność podtypów. Niedawno udało nam się ujawnić kluczowy element dla generacji ligandów selektywnych dla podtypów: grupę guanidyny. Dzięki odrębnym modyfikacjom, dwuselektywne ligandy dla podtypów integryn zawierających αv- i α5 mogą zostać przekształcone w selektywne związki poprzez proste modyfikacje grupy guanidyny, które mogą następnie rozróżnić różne podjednostki α10.

W kieszeni αv, grupa guanidyny oddziałuje bocznie poprzez dwuzębny mostek solny z Asp21811,12. Oddziaływanie to można również zaobserwować w α5β1 (tutaj z Asp227 w α5), ale dodatkowo obserwuje się tam oddziaływanie end-on grupy guanidynowej z resztą Gln (Gln221) 13. W ten sposób zmodyfikowaliśmy grupę guanidyny na dwa przeciwstawne sposoby: w jednym przypadku poprzez blokowanie oddziaływania bocznego z metylacją δ N grupy guanidyny, aw drugim przypadku z metylacją guanidyny Nω, blokując oddziaływanie end-on. Co zaskakujące, ta niewielka modyfikacja doprowadziła do całkowitej zmiany selektywności ligandów. Oprócz alkilowania w niniejszej publikacji wprowadzono nową metodę funkcjonalizacji. Klasyczna metoda funkcjonalizacji tego typu liganda pentapeptydowego polega na koniugacji łańcucha bocznego aminokwasu niebiorącego udziału w wiązaniu (np. K w c(RGDfK))14,15. Tutaj pokazujemy, że funkcjonalizacja jest również możliwa poprzez modyfikację guanidyny - która ma kluczowe znaczenie dla wiązania - za pomocą acylowego lub alkilowanego łącznika. Ładunek dodatni, który jest niezbędny do wiązania, jest zachowywany, a modele sugerują, że długi łańcuch wychodzi z kieszeni wiążącej, zapewniając w ten sposób idealną możliwość dołączenia dalszych łączników i jednostek znakujących (np. znacznika fluorescencyjnego lub chelatora do obrazowania molekularnego).

W tej pracy koncentrujemy się na etapach przygotowawczych do modyfikacji grupy guanidyny w ligandach zawierających argininę. Obejmuje to syntezę N-ω-metylowanych gatunków, a także guanidyn z dłuższymi jednostkami łączącymi. Różne modyfikacje obejmują grupy acylowe i alkilowe.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Wszystkie odczynniki i rozpuszczalniki zostały uzyskane od komercyjnych dostawców i były używane bez dalszego oczyszczania.

Uwaga: Przed użyciem należy zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS). Podczas wykonywania syntez chemicznych należy używać całego odpowiedniego sprzętu ochronnego (np. dygestoria, okularów ochronnych, rękawic, fartucha laboratoryjnego, spodni o pełnej długości i butów z zakrytymi palcami).

1. Synteza prekursorów guanidynylu

  1. Gatunki alkilowane
    1. Gatunki metylowane
      1. Rozpuścić 1,0 g N,N′-di-Boc-1 H-pirazolo-1-karboksyamidyny N,N′-di-Boc-1 (3,2 mmol, 1 ort.) i 1,0 g trifenylofosfiny (PPh3,8 mmol, 1,2 eq) w 10 ml suchego tetrahydrofuranu (THF) w 50-mililitrowej kolbie okrągłodennej w atmosferze obojętnej, stosując przegrodę gumową w temperaturze pokojowej (RT). Dodać 194 μl suchego metanolu za pomocą strzykawki (4,8 mmol, 1,5 eq) i pozostawić do wymieszania w temperaturze pokojowej.
      2. Oddzielnie przygotować roztwór z 747 μl azodikarboksylanu diizopropylu (DIAD, 3,8 mmol, 1,2 eq.) w 2 ml suchego THF w małej szklanej fiolce. Mieszając, dodawać roztwór DIAD w THF kroplami do roztworu N,N′-di-Boc-1 H-pirazolo-1-karboksyamidyny, PPh3 i metanolu za pomocą strzykawki (przez 15 min). Pozwól roztworowi mieszać przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
      3. Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej i rozpuścić surowy produkt w 1 ml dichlorometanu (DCM). Załaduj kolumnę błyskową (2,5 cm x 20 cm) 100 g krzemionki w 10% octanie etylu (EtOAc) w roztworze pentanu. Załadować rozpuszczony produkt surowy na kolumnę i dodać rozpuszczalnik pod ciśnieniem (1,5 bara).
      4. Zebrać frakcje (układ rozpuszczalników: izokratyczny 10% EtOAc w pentanie), zidentyfikować żądaną plamkę związku za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i zebrać ją (Rf = 0,4, EtOAc/pentan 1:9, UV). Połącz pożądane frakcje i odparuj rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać 0,85 g tytułowego związku w postaci żółtego, lepkiego oleju (2,6 mmol, wydajność 81%). Uzyskany związek należy przechowywać w temperaturze pokojowej do dalszego wykorzystania.
    2. Gatunki modyfikowane heksyloaminą
      1. Rozpuścić 1,0 g N,N′-Di-boc-1 H-pirazolo-1-karboksyamidyny N,N′-Di-boc-1 pirazolo-1-karboksyamidyny (3,2 mmol, 1,0 eq.), 0,9 g Dde-6-aminoheksanolu (3,8 mmol, 1,2 eq.) i 1,0 g PPh3 (3,8 mmol, 1,2 eq.) w 10 ml suchego THF w 50-mililitrowej kolbie okrągłodennej w atmosferze obojętnej, używając gumowej przegrody w temperaturze pokojowej.
      2. Oddzielnie przygotować roztwór z 747 μl DIAD (3,8 mmol, 1,2 eq) w 2 ml suchego THF w małej szklanej fiolce. Mieszając, dodawać kroplami roztwór DIAD w THF do roztworu N,N′-di-Boc-1 H-pirazole-1-karboksyamidyny, PPh3 i Dde-6-aminoheksanolu za pomocą strzykawki (przez 15 min). Pozwól roztworowi mieszać przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
      3. Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej i zebrać surowy produkt do 1 ml DCM. Załadować kolumnę błyskową (2,5 cm x 20 cm) 100 g krzemionki w roztworze pentanu/EtOAc (2:1). Rozpuszczony produkt surowy nanieść na kolumnę i dodać rozpuszczalnik pod ciśnieniem (1,5 bara).
      4. Zbierz frakcje (układ rozpuszczalnikowy: izokratyczny 2:1 pentan/EtOAc), zidentyfikuj żądane frakcje za pomocą TLC i zbierz je (Rf = 0,66, 2:1 pentan/EtOAc, UV). Połącz pożądane frakcje i odparuj rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać 1,6 g tytułowego związku w postaci żółtego, lepkiego oleju (2,8 mmol, wydajność 88%). Uzyskany związek należy przechowywać w temperaturze pokojowej do dalszego wykorzystania.
  2. Gatunki acylowane (2 etapy reakcji)
    1. Rozpuścić 1,4 g hemissiarczanu S-metyloizotiuroniowego (10 mmol, 1,0 eq) i 2,2 g diwęglanu di(tert-butylu) (10 mmol, 1,0 eq.) w energicznie mieszającym dwufazowym roztworze DCM/ sat. NaHCO3 i mieszaj przez 24 godziny w temperaturze RT.
    2. Rozdzielić warstwy w rozdzielaczu separacyjnym i trzykrotnie ekstrahować fazę wodną za pomocą DCM. Połączyć fazy organiczne, wysuszyć je za pomocą Na2SO4 i usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej. Weź surowy produkt w 1 ml heksanu.
    3. Załadować kolumnę błyskową (2,5 cm x 20 cm) 100 g krzemionki w roztworze heksanu w proporcji 4:1/EtOAc. Załadować rozpuszczony produkt surowy na kolumnę. Dodaj rozpuszczalnik pod ciśnieniem. Zidentyfikuj pożądane frakcje za pomocą TLC (układ rozpuszczalników: 4:1 izokratyczny heksan/EtOAc (detekcja UV: 254 nm) i zbierz je (Rf = 0,30).
    4. Połącz pożądane frakcje i odparuj rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać 1,1 g tytułowego związku w postaci żółtego, lepkiego oleju (5,8 mmol, 58% wydajności). Odczynnik N-(tert-butoksykarbonylo)-S-metyloizotiomocznik należy przechowywać w temperaturze pokojowej do dalszego użycia.
    5. Rozpuścić 250 mg N-(tert-butoksykarbonylo)-S-metyloizotiomocznika (1,3 mmol, 1,0 eq.) w 10 ml suchego N,N-dimetyloformamidu (DMF) w 50-mililitrowej kolbie okrągłodennej w atmosferze obojętnej w temperaturze pokojowej. Dodać 440 μl N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) (2,6 mmol, 2 eq.) za pomocą strzykawki. Mieszając, dodaj kroplami 245 μl Ac2O (5,2 mmol, 4,0 eq) za pomocą strzykawki i mieszaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    6. Dodać nadmiar metanolu (2 ml) do mieszaniny za pomocą strzykawki i pozostawić na mieszanie przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej. Umieścić surowy produkt w 1 ml DCM.
    7. Załadować kolumnę błyskową (2,5 cm x 20 cm) 60 g krzemionki w roztworze heksanu 3:1/EtOAc 3:1. Nanieść rozpuszczony produkt surowy na kolumnę. Dodać rozpuszczalnik (heksan 3:1/EtOAc) i ciśnienie (1,5 bara). Zidentyfikuj żądane frakcje za pomocą TLC (heksan 3:1/EtOAc, UV: 220 nm) i zbierz je (Rf = 0,62).
    8. Połącz pożądane frakcje i odparuj rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać 210 mg tytułowego związku w postaci białego ciała stałego (0,9 mmol, 70% wydajności). Przechowuj związek w temperaturze pokojowej do dalszego wykorzystania.

2. Synteza cyklicznych prekursorów peptydów

  1. Ładowanie i zamykanie żywicy TCP
    1. Dodać 1,00 g żywicy chlorku 2-chlortriylu (CTC) (0,9 mmol/g) i 320 mg Fmoc-Gly-OH (1,2 eq) do plastikowej strzykawki o pojemności 20 ml z frytą. Przygotować roztwór 313 μl DIPEA (2 egw.) w 5 ml suchego DCM i dodać go do strzykawki. Pozwól mu obracać się przez 1 godzinę przy suchej temperaturze za pomocą jednostki obrotowej.
    2. W międzyczasie przygotuj 2 ml roztworu metanolu/DIPEA w proporcji 5:1 (v/v; roztwór zamykający). Dodaj roztwór zamykający do strzykawki i pozwól mu obracać się przez kolejne 15 minut. Umyj żywicę za pomocą DCM (5x) i DMF (3x).
  2. Deprotekcja Fmoc na żywicy
    1. Pokryć związany żywicą Fmoc-Gly 20% piperydyną w DMF przez 10 minut, a następnie przez 5 minut. Przemyć żywicę DMF (3x).
  3. Sprzężenie na żywicy Fmoc-Orn(Dde)-OH
    1. Dodać 934 mg Fmoc-l-Orn(Dde)-OH (2 eq.), 684 mg 1-[bis(dimetyloamino)metyleno]-1 H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pirydyno-3-tlenku heksafluorofosforanu (HATU) (2 równanie) i 245 mg 1-hydroksy-7-azabenzotriazolu (HOAt) (2 eq.) do małej szklanej fiolki i rozpuścić w 5 ml DMF. Dodać 814 μl leku DIPEA.
    2. Dodaj ten roztwór do odzabezpieczonego, umytego i związanego żywicą Gly i pozwól mu obracać się przez 1 godzinę. Umyj żywicę za pomocą DMF (3x).
  4. Deprotekcja Fmoc na żywicy
    1. Związany z żywicą Fmoc-Orn(Dde)-Gly należy traktować 20% piperydyną w DMF przez 10 minut, a następnie przez 5 minut. Umyć żywicę DMF (3x).
  5. Złącze na żywicy Fmoc-Val-OH
    1. Dodać 610 mg Fmoc-Val-OH (2 eq), 684 mg HATU (2 eq.) i 245 mg HOAt (2 eq.) do małej szklanej fiolki i rozpuścić w 5 ml DMF. Dodać 814 μl leku DIPEA.
    2. Dodaj ten roztwór do odzabezpieczonego, umytego i związanego żywicą Orn(Dde)-Gly i pozwól mu obracać się przez 1 godzinę.
  6. Deprotekcja Fmoc na żywicy
    1. Związany z żywicą Fmoc-Val-Orn(Dde)-Gly należy traktować 20% piperydyną w DMF przez 10 minut, a następnie przez 5 minut. Umyć żywicę DMF (3x).
  7. Metylacja N-żywicy
    1. Umyj żywicę za pomocą DCM (3x). Rozpuścić 887 mg chlorku 2-nitrobenzenosulfonylu (o-NBS-Cl, 4 eq.) w DCM i dodać 1,2 ml 2,4,6-kolidyny (10 eq.).
    2. Dodaj roztwór do peptydu związanego z żywicą i pozwól mu inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj żywicę za pomocą CH2Cl2 (3x) i THF (5x). Przygotować roztwór z 1,18 g PPh3 (5 eq) i 365 μl metanolu w THF. Dodać ten roztwór do strzykawki.
    4. Przygotować roztwór zawierający 883 μl DIAD w 2 ml THF i dodać go do strzykawki. Pozostaw do inkubacji na 15 minut. Umyj żywicę za pomocą THF (5x) i DMF (5x).
  8. o -Ns deochrona
    1. Przygotować roztwór z 570 μl merkaptoetanolu (10,0 eq) i 672 μl diazabicykloddecenu (DBU) w 2 ml DMF. Dodaj ten roztwór do strzykawki i pozwól mu inkubować przez 5 minut.
    2. Powtórz krok deochrony, a następnie umyj żywicę DMF (5x).
  9. Złącze na żywicy Fmoc-d-Phe-OH
    1. Dodać 697 mg Fmoc-D-Phe-OH (2 eq.), 684 mg HATU (2 eq.) i 245 mg HOAt (2 eq.) do małej szklanej fiolki i rozpuścić w 5 ml DMF. Dodać 814 μl leku DIPEA.
    2. Dodaj ten roztwór do odzabezpieczonego, umytego i związanego żywicą peptydu Fmoc i pozwól mu obracać się przez 1 godzinę.
  10. Deprotekcja Fmoc na żywicy
    1. Traktować peptyd związany z żywicą 20% piperydyną w DMF przez 10 minut, a następnie przez 5 minut. Przemyć żywicę DMF (3x).
  11. Złącze na żywicy Fmoc-Asp(OtBu)-OH
    1. Dodać 741 mg Fmoc-Asp(OtBu)-OH (2 eq), 684 mg HATU (2 eq.) i 245 mg HOAt (2 eq.) do małej szklanej fiolki i rozpuścić w 5 ml DMF. Dodać 814 μl leku DIPEA.
    2. Dodaj ten roztwór do odzabezpieczonego, umytego i związanego żywicą peptydu Fmoc i pozwól mu obracać się przez 1 godzinę.
  12. Rozszczepienie peptydu liniowego z żywicy
    1. Przemyć żywicę DCM (3x), a następnie przygotować 10 ml roztworu heksafluoroizopropanolu (HFIP) w DCM (1:4; v/v).
    2. Dodaj roztwór do żywicy i pozwól mu obracać się przez 15 minut. Zebrać roztwór do kolby okrągłodennej. Powtórzyć rozszczepienie i odparować rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej.
  13. Cyklizacja peptydu liniowego
    1. Rozpuścić 384 mg NaHCO3 (5,0 eq) i 582 μl azydku difenylofosforylu (DPPA) (3,0 eq) w 50 ml DMF i dodać do produktu surowego. Pozostaw na wymieszanie przez noc lub do momentu, gdy nie zaobserwuje się liniowego peptydu za pomocą ESI-MS (10 h)17.
    2. Pod zmniejszonym ciśnieniem zredukuj rozpuszczalnik do małej objętości za pomocą wyparki obrotowej. Przygotować nasycony roztwór wodny NaCl (solanka). Za pomocą pipety Pasteura dodać cyklizowany peptyd kroplami do 40 ml nasyconego wodnego roztworu NaCl w probówce wirówkowej.
    3. Odwirować zawiesinę (5 000 x g, 5 min) i przepłukać osad wodą o wysokiej jakości HPLC (2x). Liofilizuj produkt.

3. Guanidyniloacja i deprotekcja w roztworze

  1. Guanidynylacja z prekursorami dostosowanymi do potrzeb klienta
    1. Rozpuścić niewielką ilość (np. 25 mg) ortogonalnie odzabezpieczonego cyklicznego peptydu w małej objętości DMF (np. 2 ml). Dodać 2 eq prekursora guanidydylu i 2 eq DIPEA do roztworu i pozostawić na mieszanie przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    2. Monitorować postęp reakcji za pomocą HPLC-MS. Po zakończeniu reakcji należy usunąć rozpuszczalnik, ponownie rozpuścić guanidynylowany cykliczny peptyd w acetonitrylu i przeprowadzić semipreparatywne oczyszczanie metodą HPLC16.
  2. Usunięcie kwasoodpornych, labilnych grup ochronnych łańcucha bocznego
    1. Przygotować 2 ml roztworu zawierającego kwas trifluorooctowy (TFA), wodę i triizopropylosilan (TIPS) (95/2,5/2,5; v/v/v). Dodać ten roztwór do oczyszczonego produktu w małej szklanej fiolce i mieszać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę. Obserwuj całkowitą deochronę za pomocą ESI-MS17.
    2. Odparować rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem do małej objętości. Przygotuj lodowaty eter i dodaj 10 ml do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Wytrącić odchroniony peptyd w lodowatym eterze za pomocą pipety Pasteura, dodając go kroplami. Odwirować zawiesinę (5 000 x g, 5 min) w celu uzyskania osadu.
    3. Przemyć osad lodowatym eterem i odwirować go (5 000 x g, 5 min, 2 razy). Rozpuścić produkt w 2 ml wody klasy HPLC i oczyścić go za pomocą półpreparatywnego HPLC16.

4. Dane analityczne i parametry do oczyszczania

  1. Analityczna HPLC-ESI-MS
    1. Przeprowadzić analityczne HPLC-ESI-MS za pomocą spektrometru mas LCQ przy użyciu kolumny C18 (wielkość porów 12 nm, wielkość cząstek 3 μm, 125 mm × 2,1 mm) lub kolumny C8 (wielkość porów 20 nm, wielkość cząstek 5 μm, 250 mm × 2,1 mm), zH2O(0,1% v/v kwas mrówkowy)/acetonitryl (0,1% v/v kwas mrówkowy) jako eluentami.
  2. Półpreparatywna HPLC
    1. Wykonać półpreparatywną HPLC przy użyciu preparatywnego przyrządu HPLC z kolumną ODS-A (20 x 250 mm, 5 μm), natężeniem przepływu 8 ml/min i liniowymi gradientamiH2O(0,1% v/v TFA) i acetonitrylu (0,1% v/v TFA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prekursor cyklicznego peptydu został zsyntetyzowany jako peptyd liniowy, cyklizowany i ortogonalnie dechroniony przez Dde. Po wytrąceniu czystość związku analizowano za pomocą HPLC-MS (ryc. 1). W celu monitorowania postępu reakcji przeprowadzono analizę HPLC po 2-godzinnym czasie reakcji (ryc. 2).

Dla większych pozostałości w grupie guanidyny, czas reakcji wynoszący 2 godziny jest często niewyst...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prekursorem guanidynylu jest ortogonalnie odchroniony cykliczny pochodna peptydu (c(OrnD(OtBu)Gf(NMe)V)), który jest syntetyzowany przez standardowy protokół Fmoc syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS). Ornityna została użyta jako ortogonalnie chroniona pochodna (Fmoc-Orn(Dde)-OH), która może być odbezpieczona hydrazyną w DMF po cyklizacji rusztowania peptydowego. Prekursor peptydu jest oczyszczany przez wytrącanie związku, a następnie liofilizację.

Alkilowane prekur...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T.G.K. dziękuje Międzynarodowej Wyższej Szkole Nauki i Inżynierii (IGGSE) Technische Universität München za wsparcie finansowe. H.K. dziękuje Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) za ich wsparcie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
N,N′ -Di-Boc-1H-pirazol-1-karboksyamidyna, 98% Sigma Aldrich434167  ALDRICH
Trifenylofosfina, 99%Sigma AldrichT84409  SIGMA-ALDRICH
Tetrahydrofuran, >99.5%Carl Roth4745
Tetrahydrofuran bezwodny, 99.8%Carl Roth5182
Metanol bezwodny, 99.8%Sigma Aldrich322415  SIGMA-ALDRICH
Diizopropylo-azodikarboksylan diizopropylu, 98%Sigma Aldrich225541  ALDRICH
Dichlormetan, do syntezy, 99,5%Carl Roth8424
Żel krzemionkowy do chromtaografii błyskowejSigma Aldrich60738  SIGMA-ALDRICH
n-Pentan, 99%Carl Roth8720
n-heksan, 99%Carl RothCP47
Octan etylu, 99,5%Carl Roth7338
Aminoheksanol, 95%Sigma AldrichA56353  ALDRICH
em>S-Methylisothioiciocea hemisulfate, 98%Sigma AldrichM84445 ALDRICH
Di-tert-butylu diwęglan, 99%Sigma Aldrich205249  ALDRICH
em>N,N-dimetyloformamid, 99,8%Carl RothA529
N,N,N-Diizopropyloetyloamina, 99,5%Carl Roth2474
Bezwodnik octowy, 99%Carl Roth4483
Karbolucjażywicy chlortrytylowejCC11006
Fmoc-Gly-OH, 98%Karbolucja
Piperydyna, 99%Sigma Aldrich104094  SIGMA-ALDRICH
Fmoc-Orn(Dde)-OHIris-BiotechFAA1502
HATU, 99%KarbolucjaCC01011
HOAt, 99%KarbolucjaCC01004
Fmoc-Val-OHKarbolucjaCC05028
Chlorek 2-nitrobenzenosulfonylu, 97%Sigma AldrichN11507  ALDRICH
2,4,6-Kolidyna, 99%Sigma Aldrich27690  SIGMA-ALDRICH
Merkaptoetanol, 99% Sigma AldrichM6250  ALDRICH
Diazabicycloundecen, 98%Sigma Aldrich139009  ALDRICH
Fmoc-D-Phe-OH, 98%Sigma Aldrich47378  ALDRICH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98%KarbolucjaCC05008
HeksafluoroizopropanolKarbolucjaCC03056
Azydek difenylofosforylu, 97%Sigma Aldrich178756  ALDRICH
TFA, 99.9%Carl RothP088
Triizopropylosilan, 98%Sigma Aldrich233781  ALDRICH
Acetonitryl, klasa HPLCCarl RothHN44
<<CC05014

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds. Exp. Opin. Ther. Patents. 19 (10), 1417-1448 (2009).
  2. Saczewski, F., Balewski, L. Biological activities of guanidine compounds, 2008-2012 update. Exp. Opin. Ther. Patents. 23 (8), 965-995 (2013).
  3. Wirth, T. H., Davidson, N. Mercury (II) Comlexes of Guanidine and Ammonia, and a general discussion of the Complexing of Mercury (II) by Nitrogen Bases. J. Am. Chem. Soc. 86 (20), 4325-4329 (1964).
  4. Berlinck, R. G., Burtoloso, A. C., Kossuga, M. H. The chemistry and biology of organic guanidine derivatives. Nat. Prod. Rep. 25, 919-954 (2008).
  5. Peterlin-Mašič, L., Kikelj, D. Arginine mimetics. Tetrahedron. 57 (33), 7073-7105 (2001).
  6. Peterlin-Mašič, L. Arginine mimetic structures in biologically active antagonists and inhibitors. Curr. Med. Chem. 13 (30), 3627-3648 (2006).
  7. Hynes, R. O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  8. Liddington, R. C. Structural aspects of integrins. Adv. Exp. Med. Biol. 819, 111-126 (2014).
  9. Plow, E. F., Haas, T. A., Zhang, L., Loftusi, J., Smith, J. W. Ligand binding to integrins. J. Biol. Chem. 275 (29), 21785-21788 (2000).
  10. Kapp, T. G., Fottner, M., Maltsev, O. V., Kessler, H. Small cause, great impact - modification of guanidine group in RGD controls subtype selectivity. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 1540-1543 (2016).
  11. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3. Science. 294, 339-345 (2001).
  12. Xiong, J. P., et al. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand. Science. 296 (5565), 151-155 (2002).
  13. Nagae, M., et al. Crystal structure of α5β1 integrin ectodomain: atomic details of the fibronectin receptor. J. Cell Biol. 197 (1), 131-140 (2012).
  14. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
  15. Auernheimer, J., Dahmen, C., Hersel, U., Bausch, A., Kessler, H. Photoswitched Cell Adhesion on Surfaces with RGD Peptides. J. Am. Chem. Soc. 127 (46), 16107-16110 (2005).
  16. Corradini, D., Eksteen, E., Eksteen, R., Schoenmakers, P., Miller, N. Handbook of HPLC. , CRC Press. (2011).
  17. de Hoffmann, E., Stroobant, V. Mass Spectrometry: Principles and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  18. Frank, A. O., et al. Conformational Control of Integrin-Subtype Selectivity in isoDGR Peptide Motifs: A Biological Switch. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (48), 9278-9281 (2010).
  19. Rossiter, S., et al. Selective substrate-based inhibitors of mammalian dimethylarginine dimethylaminohydrolase. J. Med. Chem. 48 (14), 4670-4678 (2005).
  20. Weiss, S., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., König, B. N(G)-Acyl-argininamides as NPY Y(1) receptor antagonists: Influence of structurally diverse acyl substituents on stability and affinity. Bioorg. Med. Chem. 18 (17), 6292-6304 (2010).
  21. Hammerschmidt, F., Kvaternik, H., Schweifer, A., Mereiter, K., Aigner, R. M. Improved Synthesis of No-Carrier-Added [*I]MIBG and Its Precursor. Synthesis. 44 (21), 3387-3391 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Guanidine ModificationPeptide FunctionalizationTailor made PrecursorsSPPS CompatibilityRGD binding LigandsIntegrin Subtype SelectivityGuanidinylation PrecursorsFlash ChromatographySemi preparative HPLCESIMS Analysis

Related Articles