Barwienie immunologiczne skrawków wypełnionych i przetworzonych biocytyną pod kątem markerów neurochemicznych

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę morfologicznego odzyskiwania neuronów załatanych podczas zapisów elektrofizjologicznych za pomocą wypełnienia biocytyną i późniejszego immunohistochemicznego przetwarzania końcowego. Pokazujemy, że grube skrawki wypełnione biocytyną, które zostały wybarwione i przykryte, mogą być ponownie wybarwione drugim pierwotnym przeciwciałem kilka dni lub miesięcy później.

Streszczenie

Elektrofizjologiczne zapisy komórek za pomocą techniki patch clamp pozwoliły na identyfikację różnych typów neuronów na podstawie wzorców zapłonu. Włączenie biocytyny/neurobiotyny do elektrody rejestrującej pozwala na odzyskanie szczegółów morfologicznych post hoc, które są niezbędne do określenia arboryzacji dendrytycznej i regionów, do których dążą aksony zarejestrowanych neuronów. Jednak biorąc pod uwagę obecność morfologicznie podobnych neuronów o odrębnych tożsamościach i funkcjach neurochemicznych, barwienie immunohistochemiczne białek specyficznych dla typu komórki jest niezbędne do ostatecznej identyfikacji neuronów. Aby utrzymać łączność sieciową, wycinki mózgu do zapisów fizjologicznych są przygotowywane o grubości 300 μm lub większej. Jednak ta grubość często utrudnia immunohistologiczną obróbkę końcową ze względu na problemy z penetracją przeciwciał, co wymaga resekcji tkanki. Resekcja wycinków jest trudną sztuką, często prowadzącą do utraty tkanki i morfologii komórek, z których uzyskano dane elektrofizjologiczne, co sprawia, że dane stają się bezużyteczne. Ponieważ odzyskanie morfologii ograniczyłoby utratę danych i pomogłoby w selekcji markerów neuronalnych, przyjęliśmy strategię polegającą najpierw na odzyskaniu morfologii komórki, a następnie na wtórnym barwieniu immunologicznym. Wprowadzamy praktyczne podejście do wypełniania biocytyną podczas zapisów fizjologicznych i późniejszego seryjnego barwienia immunologicznego w celu odzyskania morfologii, a następnie ponownego barwienia skrawków w celu określenia tożsamości neurochemicznej. Donosimy, że sekcje, które zostały wypełnione biocytyną, utrwalone paraformaldehydem (PFA), wybarwione i przykryte, mogą zostać usunięte i ponownie wybarwione drugim pierwotnym przeciwciałem kilka dni później. To ponowne barwienie polega na usunięciu szkiełka nakrywkowego, umyciu skrawków w roztworze buforowym oraz inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych w celu ujawnienia tożsamości neurochemicznej. Metoda ta jest korzystna w eliminowaniu utraty danych z powodu niemożności odzyskania morfologii oraz w zawężaniu markerów neurochemicznych, które mają być badane na podstawie morfologii.

Wprowadzenie

Mózg jest znany z różnorodności strukturalnych i funkcjonalnych cech swoich poszczególnych elementów neuronalnych. Zrozumienie roli różnych typów neuronów w funkcjonowaniu i patologii mózgu wymaga charakterystyki i jednoznacznej identyfikacji neuronów. Strukturalnie cechy morfologiczne zdefiniowane przez lokalizację somato-dendrytyczną określają potencjalne dane wejściowe, które otrzymuje dany neuron, podczas gdy wzorzec arboryzacji aksonalnej identyfikuje potencjalne cele postsynaptyczne. Różnorodność strukturalna neuronów jest doceniana od czasów przełomowych badań histologicznych Ramóna y Cajala¹. Pojawienie się technik rejestracji pojedynczej komórki ujawniło, że strukturalnie odrębne neurony wykazują również różnice we wzorcach zapłonu i cechach synaptycznych. Różnorodność w budowie i fizjologii jest szczególnie widoczna w neuronach hamujących GABA-ergiczne^2,3. Ponadto staje się coraz bardziej oczywiste, że strukturalnie podobne neurony mogą wyrażać różne markery neurochemiczne i wykazywać odpowiadające im różnice funkcjonalne⁴. Podobnie, neurony z tymi samymi markerami neurochemicznymi mogą mieć odrębne struktury i funkcje^5-10. Tak więc w praktyce analiza cech funkcjonalnych neuronów i ich roli w sieci pociąga za sobą zdefiniowanie zarówno tożsamości morfologicznej, jak i neurochemicznej. Nawet wraz z pojawieniem się linii myszy reporterowych ukierunkowanych na określone markery neurochemiczne, często konieczne jest określenie morfologii i tożsamości podtypu na podstawie immunohistologii¹¹.

Standardowa metoda używana do charakteryzowania komórek zarejestrowanych w ostrych wycinkach mózgu polega na wypełnieniu ich biocytyną lub neurobiotyną podczas zapisu, utrwaleniu skrawków w paraformaldehydzie (PFA) po nagraniach i użyciu immunohistochemii do ujawnienia morfologii i neurochemii. Ponieważ grubość skrawków dla fizjologii plastrów wynosi zwykle 300 μm lub więcej, a większość przeciwciał nie przenika przez całą tę głębokość, plastry muszą zostać ponownie pocięte do 60 μm lub mniej, aby umożliwić jednoczesne barwienie immunologiczne biocytyny i markerów neurochemicznych^12-14. Niestety, resekcja jest pracochłonna; ryzyko utraty tkanki podczas cięcia; i może prowadzić do zróżnicowanego kurczenia się tkanek, komplikując rekonstrukcje morfologiczne. Ponadto wcześniejsza wiedza na temat morfologii może pomóc w zawężeniu potencjalnych markerów, które prawdopodobnie będą wyrażane przez komórki. Zmodyfikowaliśmy standardowe protokoły immunohistologiczne biocytyny, aby umożliwić seryjne przetwarzanie skrawków najpierw w celu odzyskania morfologii, a następnie identyfikacji potencjalnych markerów neurochemicznych.

Immunohistochemia to nauka o dystrybucji antygenu w tkankach lub komórkach i może być wizualizowana za pomocą enzymu, etykiet fluorescencyjnych, pierwiastków radioaktywnych lub cząstek koloidu złota¹⁵. Procedura polega na użyciu przeciwciał pierwszorzędowych do specyficznego znakowania i amplifikacji jednego lub więcej specyficznych antygenów, a następnie użyciu fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych skierowanych na przeciwciało pierwszorzędowe w celu wizualizacji. Ze względu na konieczność rozróżnienia widm fluorescencyjnych każdego przeciwciała drugorzędowego bez nakładania się, tylko ograniczona liczba antygenów może być badana jednocześnie. W związku z tym wcześniejsza wiedza na temat morfologii może być przydatna w wyborze potencjalnych markerów neurochemicznych do klasyfikacji komórek. Koncepcyjnie, uzasadnienie dla seryjnego przetwarzania już wybarwionych skrawków opiera się na założeniu, że znakowanie immunologiczne dla jednego białka lub peptydu nie powinno kolidować z antygenowością, a następnie znakowanie immunologiczne dla strukturalnie niezależnego peptydu¹⁶. Ten brak interferencji wynika z wiązania przeciwciał ze specyficznym epitopem białkowym na antygenie, a zatem pozwala na jednoczesne barwienie wielu antygenów w tej samej tkance. Liczba antygenów ujawnionych w procesie barwienia immunologicznego jest ograniczona przez konieczność nienakładania się widm fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych oraz przez konieczność celowania w poszczególne antygeny przeciwciałami wyhodowanymi u różnych gatunków w celu wyeliminowania reaktywności krzyżowej^17,18. Chociaż jest to powód stojący za szeregowym, a nie jednoczesnym znakowaniem dwoma odrębnymi przeciwciałami, które mogą wchodzić w interakcje, o ile nam wiadomo, barwienie immunologiczne dla drugiego antygenu nie zostało zgłoszone po zakończeniu znakowania immunologicznego dla jednego lub więcej antygenów na zamontowanych odcinkach. W tym miejscu opisujemy metodę seryjnego barwienia immunologicznego wcześniej wybarwionych i zamontowanych odcinków. Chociaż szczegółowo opisujemy ten proces dla procedury seryjnego znakowania immunologicznego w celu odzyskania morfologii, a następnie barwienia markerów białkowych / peptydowych w grubych sekcjach, te same procedury można również zastosować w standardowych, cienkich skrawkach histologicznych. Ponadto opisujemy praktyczne podejście do wypełniania zarejestrowanych neuronów biocytyną oraz proces usuwania elektrody z komórki po zakończeniu nagrań w celu optymalizacji wypełnienia aksonalnych i dendrytycznych trzpieni neuronów, jak przedstawiono w naszej ostatniej pracy^6,8.

Najważniejszą zaletą opisanej tutaj procedury jest to, że morfologia zarejestrowanej komórki może być w pełni odzyskana i zobrazowana przed próbą resekcji lub immunologicznego barwienia wycinków. Chociaż problemy z penetracją niektórych przeciwciał mogą spowodować konieczność resekcji wycinków w celu wtórnego barwienia immunologicznego, opisane tutaj procedury wyeliminowałyby potrzebę rekonstrukcji złożonych neuronów z wielu sekcji i pozwoliłyby uniknąć problemów spowodowanych utratą tkanek i zróżnicowanym skurczem, co może zagrozić rekonstrukcji po resekcji. Dodatkową zaletą jest to, że proces ten zmniejszy koszty, czas, wysiłek i drogie przeciwciała poprzez ograniczenie barwienia immunologicznego i resekcji do wycinków, w których odzyskiwane są neurony wypełnione biocytyną. Najbardziej praktycznym aspektem jest dodatkowe barwienie immunologiczne, które można wykonać na odcinkach barwionych na kilka miesięcy przed zastosowaniem wyżej wymienionej techniki. W szczególności przywrócenie morfologii znacznie zmniejszyłoby prawdopodobieństwo, że dane fizjologiczne z komórek zostaną odrzucone z powodu niemożności uzyskania podstawowej charakterystyki morfologicznej typu komórki.

Protokół

1. Napełnianie biocytyną podczas elektrofizjologii

UWAGA: Czytelnicy mogą odwołać się do alternatywnych źródeł podstawowych technik nagrywania i instrumentacji^19-22, które nie są tutaj rozwijane. Opisane tutaj kroki zakładają, że sprzęt i procedury zapisów patch-clamp są już ustalone, a opis będzie ograniczony do szczegółów związanych z wypełnianiem biocytyną i barwieniem immunologicznym post hoc. Wszystkie eksperymenty opisane w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone na szczurach.

1. Za pomocą wibratomu przygotuj żywe wycinki mózgu w żądanym obszarze o grubości 300 - 350 μm²³.
2. Przygotować roztwór wewnętrzny zawierający 0,2% biocytyny, dodając 2 mg biocytyny do 1 ml roztworu wewnętrznego⁶. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy sonikować roztwór wewnętrzny przez 10 - 15 minut, aż biocytyna całkowicie się rozpuści. Następnie załaduj roztwór wewnętrzny do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w polipropylenową końcówkę filtra o wielkości porów 0,2 μm przymocowaną do mikroładowarki. Przechowywać tę strzykawkę ładującą na zimnym opakowaniu, aby utrzymać stabilność Mg-ATP i Na-GTP w roztworze wewnętrznym.
   UWAGA: Wewnętrzny roztwór zawierający glukonian potasu (126 mM K-glukonianu, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP i 10 mM fosfokreatyny) jest optymalny do odzyskiwania niektórych markerów neurochemicznych, w tym parwalbuminy, podczas znakowania immunologicznego. Z naszego doświadczenia wynika, że stosowanie roztworów wewnętrznych na bazie cezu i chlorku zmniejsza zdolność do odzyskania barwienia immunologicznego dla niektórych markerów neurochemicznych. Jako alternatywę dla biocytyny można zastosować neurobiotynę lub nieprzepuszczalny dla komórek, utrwalany znacznik polarny łączący fluorofor Alexa z biocytyną.
3. W kontraście różnicowym zakłóceń w podczerwieni zwizualizuj odpowiednią komórkę do nagrywania. Aby zminimalizować jakiekolwiek zakłócenia aksonu, zbliż się do korpusu komórki, opuszczając pipetę wzdłuż jej osi, korzystając z funkcji "zbliżenia" dostępnej w większości mikromanipulatorów. Ustanów zapisy całych komórek w kontraście różnicowym w podczerwieni przy użyciu protokołów fizjologii patch-clamp^19-22.
   UWAGA: Unikaj zbliżania się do komórki od strony domniemanego aksonu, ponieważ spowoduje to przecięcie aksonu, co jest wizualizowane jako pęcherzyk na odciętym końcu (zielona strzałka na rysunku 1). Należy również unikać wywierania wysokiego nadciśnienia na pipetę rejestrującą podczas zbliżania się do komórki, aby zminimalizować rozlanie biocytyny, co spowoduje silne zabarwienie tła.

Rysunek 1. Sugerowana płaszczyzna zbliżania się do komórek w celu wypełnienia biocytyną. Obraz ilustruje wypełnienie komórek ziarnistych (GC) biocytyną podczas nagrywania, które zostało przetworzone w celu ujawnienia biocytyny (na czerwono przy użyciu streptawidyny sprzężonej z 594). GC ma swoje dendryty zorientowane w płaszczyźnie XY. Zwróć uwagę na odcięty akson komórki granulki (zielona strzałka) spowodowany ruchem pipety wzdłuż płaszczyzny XY. Zauważ, że idealnie jest zbliżyć się do tego neuronu wzdłuż płaszczyzny XZ. Podziałka: 50 μm.

4. W konfiguracji cęgów napięciowych należy określić pojemność całego ogniwa i rezystancję szeregową w odpowiedzi na małe (5 mV), krótkie (30 ms) kroki napięcia za pomocą funkcji testu membranowego w trybie kąpieli w oprogramowaniu do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych. Zapewni to stworzenie warunków zapisu całej komórki, które umożliwią wypełnienie biocytyną.
5. W razie potrzeby przeprowadzaj zapisy fizjologiczne w trybie cęgów prądowych lub napięciowych. Minimalny czas nagrywania wynoszący >10 min w temperaturze 34 °C jest idealny.
   UWAGA: W przypadku badań wykonywanych w temperaturze pokojowej może być konieczne wydłużenie czasu nagrywania.
6. Po zakończeniu zapisów fizjologicznych należy przywrócić konfigurację patch-clamp, powoli przesuwając pipetę rejestrującą małymi krokami, na przemian w górę (wzdłuż osi Z) i na zewnątrz (wzdłuż osi X) w trybie zacisku napięciowego.
7. Jednocześnie monitoruj pojemność i rezystancję wejściową za pomocą funkcji "testu membranowego" w celu wizualizacji utraty pojemnościowych stanów nieustalonych i załamania się reakcji prądowych na linię prostą, co wskazuje na ponowne uszczelnienie ogniwa i ustanowienie zewnętrznej łaty na końcówce pipety. Utrzymywanie ogniwa na poziomie potencjału zdepolaryzowanego (-40 mV) ułatwi proces ponownego uszczelnienia.
   UWAGA: Ta procedura usuwania komórki zazwyczaj zapewnia całkowite odzyskanie somy i dendrytów. Nie należy wywierać nadciśnienia na pipetę rejestrującą podczas tej procedury lub podczas odłączania kuwety od pipety. Wizualizacja somy zarejestrowanej komórki w wycinku wskazuje na pomyślne odłączenie. Obecność resztek komórkowych lub plamy błony na końcu oderwanej końcówki zazwyczaj wskazuje na przemieszczenie somy i nie daje pełnej morfologii komórkowej.
8. Po odłączeniu pipety od celi należy utrzymać plasterek w komorze zapisu przez 3 - 5 minut, aby zapewnić transport barwnika do dystalnych wyrostków dendrytycznych i aksonalnych.
9. Przenieś plastry na 24-dołkową płytkę zawierającą 4% PFA w celu utrwalenia.
   ostrożność: PFA jest rakotwórcze i należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice i maskę na twarz, aby uniknąć podrażnienia skóry i wdychania. PFA jest łatwopalny i należy go przechowywać w miejscu niedostępnym dla ognia. PFA nigdy nie jest wyrzucany do kanalizacji i musi być zbierany jako odpady chemiczne. Utrwalanie PFA musi być odizolowane od obszarów wykorzystywanych do przygotowania żywych plastrów, aby uniknąć zanieczyszczenia zestawu fizjologicznego, w tym pipet transferowych.
10. 24 - 48 godzin po utrwaleniu PFA, przenieść plastry do 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu przechowywania przed barwieniem immunologicznym.
    UWAGA: Idealnie, odzyskiwanie biocytyny i barwienie immunologiczne są najlepsze, gdy są wykonywane wkrótce po utrwaleniu, chociaż barwienie wykonane w ciągu 7 dni od utrwalenia daje dobre wyniki. Plastry można utrzymywać w PBS z 0,02 - 0,05% azydkiem sodu do barwienia wykonywanego do i ponad 90 dni po utrwaleniu. Chociaż wiązanie przez noc w PFA działa dobrze w przypadku większości przeciwciał, możliwe jest, że niektóre przeciwciała działają najlepiej, gdy czas inkubacji w utrwalaczu jest skrócony. Wiązanie w PFA przez ponad 48 godzin zmniejsza dostępność antygenów i zmniejsza szanse na skuteczne wtórne barwienie immunologiczne markerów neurochemicznych.
    ostrożność: Azydek sodu jest niezwykle niebezpieczny i działa drażniąco w przypadku kontaktu ze skórą lub oczami, lub po spożyciu lub wdychaniu . Poważne nadmierne narażenie może spowodować śmierć. Rakotwórczość i mutagenność tego związku nie są znane. Używaj odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, w tym rękawic, okularów przeciwbryzgowych, fartucha laboratoryjnego i respiratora przeciwpyłowego. Azydek sodu nigdy nie jest wyrzucany do kanalizacji i musi być zbierany jako odpad chemiczny.

2. Barwienie pierwszego przeciwciała pierwotnego i biocytyny

(Dzień 1)
UWAGA: Poniższa procedura barwienia immunologicznego dotyczy sekcji swobodnie pływających i wymaga ciągłego wytrząsania z niską prędkością (2 obroty/min, obr./min) na wytrząsarce dla wszystkich etapów inkubacji.

1. Płukać chusteczkę 3x po 10 minut w 0,1 M PBS (pH = 7,4).
   UWAGA: 0,1 M PBS można kupić komercyjnie lub wyprodukować w laboratorium w następujący sposób (składniki na 1 l): 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ i 0,24 g KH₂PO₄ w 1 L dH₂0,
   UWAGA: Jeśli znany jest pożądany marker neurochemiczny, barwienie białka/peptydu można przeprowadzić jednocześnie z barwieniem biocytyną (kroki 2.2 - 2.4). W przypadku barwienia tylko na biocytynę przejdź do kroku 2.5.
2. OPCJONALNIE: Blok z 10% surowicą blokującą (BS; normalna surowica kozia (NGS) rozcieńczona w 0,3% Triton X-100 w PBS przez 1 godzinę przy RT).
   UWAGA: Każda studzienka powinna otrzymać taką samą objętość roztworu; zalecana objętość wynosi od 250 do 500 μL/studzienkę. Wybór surowicy blokującej opiera się na gatunkach, w których wytwarzane są przeciwciała drugorzędowe (np. NGS stosuje się do anty-koziego anty-koniugowanego barwnikiem (odpowiednie gatunki przeciwciał pierwszorzędowych)). Jeśli zajdzie potrzeba użycia przeciwciał drugorzędowych wyhodowanych u różnych gatunków do odcinków barwienia immunologicznego, należy włączyć 10% każdej normalnej surowicy do etapu blokowania (2) i 3% każdej normalnej surowicy do etapów inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.
3. (OPCJONALNIE) Inkubować skrawki w przeciwciałie pierwszorzędowym, CB₁R (poliklonalnym, świnka morska) z 0,3% Triton X-100 i 3% BS w 0,1 M PBS w RT O / N. CB₁R służy do identyfikacji ekspresji receptora kannabinoidowego typu 1.
   UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i nie jest wymagany do odsłonięcia wypełnienia biocytyną. Rycina 2 ilustruje sekcję oznaczoną dla biocytyny i CB₁R podczas pierwszego procesu barwienia. Inkubacja O/N w RT jest wystarczająca dla większości przeciwciał pierwszorzędowych; jednak niektóre przeciwciała pierwszorzędowe, w tym CB₁R, wymagają 3 - 5 dni inkubacji. Jeżeli inkubacja musi być dłuższa niż 1 dzień, zaleca się inkubację w temperaturze 4 °C, ponieważ Triton X-100 może przenikać przez plastry i może prowadzić do rozpadu tkanki podczas długotrwałej inkubacji w temperaturze pokojowej. Włączyć kontrolę ujemną pozbawioną przeciwciała pierwszorzędowego w co najmniej jednej sekcji dla każdej serii doświadczeń jako kontrolę swoistości przeciwciała drugorzędowego. W przypadku kontroli ujemnych pomija się przeciwciało pierwszorzędowe, ale dodaje się 0,3% Triton X-100 w 0,1 M PBS i BS.

Rysunek 2. Udane barwienie CCK 1 tydzień po odzyskaniu barwienia biocytyną i znakowaniu receptora annabinoidowego C typu 1 (CB₁R). (A - C) Obrazy konfokalne przy 60X pokazujące neuron wypełniony biocytyną (A) i immunoreaktywność CB₁R (B), wskazywaną przez grot strzałki. Ten sam wycinek poddano obróbce pod kątem barwienia immunologicznego CCK po 1 tygodniu (C). Nakładanie obrazów jest pokazane w D. Immunoreaktywność CCK została ujawniona przy użyciu dalekiej czerwieni i była pseudo-zabarwiona w kolorze cyjanu. (E) Rekonstrukcja morfologiczna komórki wypełnionej biocytyną w A. Należy zauważyć, że barwienie biocytyną i CB₁R jest widoczne nawet po drugim barwieniu immunologicznym CCK. Należy również zwrócić uwagę na oczekiwany rozkład wzorców barwienia immunologicznego CB₁, R i CCK. (F - H) Powiększony obraz aksonu z komórki, jak w A, pokazuje ścisłą kolokalizację biocytyny i CB₁R w aksonach (groty strzałek). Podziałka: 50 μm (A - D), 100 μm (E) i 10 μm (F - H). Obrazy są reprodukowane z Yu et al. 2015⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

(Dzień 2)

4. Przemyć skrawki mózgu 3x po 10 minut w 0,1 M PBS (pH = 7,4).
5. Inkubować skrawki w sprzężonym czerwonym barwniku streptawidyny (stężenie: 1:1,000; wzbudzenie: 594 nm z emisją w widzialnym widmie czerwonym) z 0,3% Triton X-100 i 3% BS w 0,1 M PBS w temperaturze 4 °C O/N w ciemności (owinięte w folię aluminiową), aby odsłonić biocytynę. OPCJONALNIE: Dołączyć przeciwciało drugorzędowe, kozie przeciwciało przeciwko śwince morskiej (stężenie: 1:500; wzbudzenie: 488 nm i emisja na zielono), z powyższą inkubacją, jeśli następuje po fakultatywnej inkubacji pierwotnej w kroku 2.3.
   UWAGA: Przeciwciało drugorzędowe będzie potrzebne tylko wtedy, gdy zostanie przeprowadzone opcjonalne barwienie przeciwciałami pierwszorzędowymi (krok 2.3). Aby uwidocznić biocytynę, zaleca się koniugat streptawidyna-fluorofor z widmem emisyjnym w kolorze czerwonym, ponieważ pomaga to w szczegółowej wizualizacji drobniejszych aksonów i z lepszym kontrastem (ryc. 1 - 3). Podczas podwójnego lub potrójnego barwienia immunologicznego, w celu uniknięcia reaktywności krzyżowej przeciwciał drugorzędowych względem siebie, należy dodawać przeciwciała drugorzędowe jedno po drugim w sposób szeregowy (wystarczający jest 2-godzinny odstęp między seryjnymi dodatkami przeciwciał). Rycina 3A ilustruje komórkę wypełnioną biocytyną przetworzoną bez opcjonalnego barwienia przeciwciałami pierwotnymi i zobrazowaną przed resekcją.

Rysunek 3. Udane drugie barwienie immunologiczne po odzyskaniu morfologii biocytyny i resekcji. (A1) Obraz konfokalny wycinka o grubości 300 μm pokazujący odzyskiwanie morfologii dendrytycznej komórki wypełnionej biocytyną. (A2) Ślady napięcia błonowego neuronu w odpowiedzi na wstrzyknięcia prądu +500 i -100 pA. (B) Odzysk somy wypełnionej biocytyną w przekroju 50 μm uzyskanym po resekcji sekcji 300 μm (w A1) po zamontowaniu i zobrazowaniu. (B2) Późniejsze barwienie immunologiczne cienkiego odcinka ujawniło kolokalizację somy wypełnionej biocytyną (prawy panel) z CCK (panel środkowy). Scalony obraz jest zilustrowany w prawym panelu. Podziałka: 50 μm. Panel A2 jest reprodukowany za zgodą Yu et al., w druku²⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

(Dzień 3)

6. Przemyć skrawki mózgu 3x po 10 minut w 0,1 M PBS (pH = 7,4).
7. Aby chronić fluorescencję i ułatwić ponowne barwienie w przyszłości, zamontuj sekcje w wodnym podłożu montażowym i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci.
   UWAGA: Najlepiej jest odciąć sekcje tak wcześnie, jak to możliwe, aby uniknąć trudności z usunięciem lakieru do paznokci ze szkiełka, zarażenia pleśnią i odwodnienia tkanki z powodu wycieku medium montażowego ze szkiełka. Zanieczyszczeniu mikrobiologicznemu można zapobiec, stosując 0,02% azydku sodu w PBS.
   ostrożność: Azydek sodu jest wysoce toksyczny i łatwopalny w kontakcie z wodą. Proszę zapoznać się ze standardowymi procedurami operacyjnymi dotyczącymi obchodzenia się z niebezpiecznymi chemikaliami i ich usuwania.
   (dni 4 - 7)
8. Wykonaj obrazowanie konfokalne ze wzbudzeniem przy 594 i 488 nm oraz przy powiększeniu 20X lub 40X, aby ujawnić neurony wypełnione biocytyną na czerwono i markery neurochemiczne (CB_1R) na zielono. Oceń wspólne etykietowanie (rysunek 2).
9. Ustaw ekspozycję aparatu na mniej niż 100 ms, aby uniknąć fotowybielania i uzyskać konfokalne stosy obrazów aksonalnych i dendrytycznych altan całego neuronu. Użyj konfokalnych stosów obrazów i pakietów oprogramowania do śledzenia neuronów, aby zrekonstruować morfologię neuronów.

3. Barwienie drugiego przeciwciała pierwotnego

UWAGA: Podczas gdy drugi etap barwienia immunologicznego można wykonać 90 dni po pierwszym barwieniu, optymalne barwienie osiąga się, jeśli drugie podstawowe barwienie przeciwciał zostanie wykonane w ciągu 7 - 10 dni.

(Po 7 - 90 d)

1. Nałóż aceton na bawełniany wacik i usuń lakier do paznokci ze szkiełka.
2. Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczyków z cienką końcówką i umieść kilka kropel 0,1 M PBS na sekcjach.
3. Ostrożnie usunąć skrawki ze szkiełka za pomocą drobnego pędzla i umyć je w 0,1 M PBS przez 24 - 48 godzin na wytrząsarce pokrytej folią aluminiową w słabym świetle w temperaturze 4 ^oC.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby przykryć sekcje folią aluminiową, aby uniknąć fotowybielania.
4. Aby zapewnić całkowite usunięcie podłoża montażowego, należy przemyć sekcje 1 - 2x następnego dnia w 0,1 M PBS przez 10 minut każda.
5. Kontynuuj inkubację w drugim pierwotnym przeciwciałie (np. Cholecystokininie, neuropeptydzie znajdującym się w niektórych interneuronach GABA-ergicznych (CCK; stężenie: 1:1,000; mysie przeciwciało monoklonalne)) przez 1 d (Figura 2).
   UWAGA: Ta procedura jest podobna do kroku 2.3, ale wykorzystuje inne przeciwciało. Dodatkowo etap blokowania jest pomijany podczas ponownego barwienia.
6. Umyć skrawki mózgu trzy razy po 10 minut w 0,1 M PBS (pH = 7,4).
7. Wybarwić sprzężonym z fluoroforem drugorzędowym przeciwciałem kozim anty-myszem (stężenie: 1:500; długość fali wzbudzenia: 647 nm), upewniając się, że widma wzbudzenia-emisji przeciwciała drugorzędowego nie pokrywają się ze streptawidyną (stężenie: 1:1,000; długość fali wzbudzenia: 594 nm) i wcześniejszymi barwieniami immunofluorescencyjnymi.
8. Zamontuj sekcje w wodnym medium montażowym i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego bezbarwnym lakierem do paznokci.
   UWAGA: Przechowuj sekcje w temperaturze 4 °C w nieprzezroczystym pudełku do przechowywania, aby chronić fluorescencję.

Wyniki

Po pomyślnym zakończeniu, sekcje zachowują wypełnienie biocytyną i immunoznakowanie wykonane w kroku 2 i mogą być obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej lub epifluorescencyjnej. Ponadto przetworzone skrawki będą również wykazywać barwienie immunologiczne antygenu znakowanego podczas późniejszego przetwarzania w kroku 3. W sekcji zilustrowanej na rycinie 2 morfologia neuronu wypełnionego biocytyną w grubym przekroju (300 μm) została ujawniona przy użyciu streptawidyn...

Dyskusja

Kluczowe kroki w ramach protokołu

Wypełnienie załatanej komórki biocytyną jest najważniejszym krokiem do zapewnienia pełnego odzyskania morfologii. Aby w pełni odzyskać komórkę, konieczne jest wybranie optymalnej orientacji plastrów, aby zminimalizować przerwanie procesów podczas krojenia. Ta orientacja może się różnić w zależności od badanego obwodu i typu ogniwa. Następnie ważne jest, aby zapewnić odpowiednią ilość czasu na dyfuzję biocytyny do dendrytów i aksonów. Niektóre...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl	Sigma	S7653	Barwienie immunologiczne
KCl	Fluka	60129	Barwienie immunologiczne
Na2HPO4	Sigma	S7907	Barwienie immunologiczne
KH2PO4	Sigma	229806	Barwienie immunologiczne
Triton X-100	Sigma	T8787	Immunostaining
świnka morska anty CB1	Sigma	Af530-1	Immunostaining
Mysz anti CCK	CURE, UCLA	dzięki uprzejmości G. Ohning	Immunostaining
Rabbit anty Parvalbumin	Swant	PV27	Immunostaining
Streptawidyna, Alexa Fluor sprzęgany	Sondy molekularne	S11227	Barwienie immunologiczne
Normalna surowica kozia (NGS)	Sigma	G9023	Barwienie immunologiczne
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Barwienie immunologiczne
Przeciwciała wtórne	Invitogen Sondy molekularne	Alexa Fluor Barwienie	immunologiczne
Wytrząsarka niskoobrotowa Labnet orbit	Bioexpress	S-2030-LS	Kleszczyki do barwienia immunologicznego
	Dumont	11231-30	Markery immunologiczne
	EMS	71520	Barwienie immunologiczne
Vibratome VT 1200 S	Leica	14048142066	Elektrofizjologia
Multiclamp 700B	wzmacniacz Urządzenia molekularne	Multiclamp 700B	Elektrofizjologia
pCLAMP 10 Oprogramowanie	Urządzenia molekularne	pCLAMP 10	Elektrofizjologia
Digitizer	Urządzenia molekularne	Digidata 1440 digitizer	Elektrofizjologia
Końcówki filtrów	Nalgene	171-0020	Elektrofizjologia
Sonikator	Fisher Scientific	15-335-100	Elektrofizjologia
Mikroładowarki	Eppendorf	930001007	Elektrofizjologia
Biocytin	Sigma	B4261	Elektrofizjologia