Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Barwienie immunologiczne skrawków wypełnionych i przetworzonych biocytyną pod kątem markerów neurochemicznych

22.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54880

⸱

31 grudnia 2016

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rutgers New Jersey Medical School, 2Department of Pharmacology, Physiology and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę morfologicznego odzyskiwania neuronów załatanych podczas zapisów elektrofizjologicznych za pomocą wypełnienia biocytyną i późniejszego immunohistochemicznego przetwarzania końcowego. Pokazujemy, że grube skrawki wypełnione biocytyną, które zostały wybarwione i przykryte, mogą być ponownie wybarwione drugim pierwotnym przeciwciałem kilka dni lub miesięcy później.

Streszczenie

Elektrofizjologiczne zapisy komórek za pomocą techniki patch clamp pozwoliły na identyfikację różnych typów neuronów na podstawie wzorców zapłonu. Włączenie biocytyny/neurobiotyny do elektrody rejestrującej pozwala na odzyskanie szczegółów morfologicznych post hoc, które są niezbędne do określenia arboryzacji dendrytycznej i regionów, do których dążą aksony zarejestrowanych neuronów. Jednak biorąc pod uwagę obecność morfologicznie podobnych neuronów o odrębnych tożsamościach i funkcjach neurochemicznych, barwienie immunohistochemiczne białek specyficznych dla typu komórki jest niezbędne do ostatecznej identyfikacji neuronów. Aby utrzymać łączność sieciową, wycinki mózgu do zapisów fizjologicznych są przygotowywane o grubości 300 μm lub większej. Jednak ta grubość często utrudnia immunohistologiczną obróbkę końcową ze względu na problemy z penetracją przeciwciał, co wymaga resekcji tkanki. Resekcja wycinków jest trudną sztuką, często prowadzącą do utraty tkanki i morfologii komórek, z których uzyskano dane elektrofizjologiczne, co sprawia, że dane stają się bezużyteczne. Ponieważ odzyskanie morfologii ograniczyłoby utratę danych i pomogłoby w selekcji markerów neuronalnych, przyjęliśmy strategię polegającą najpierw na odzyskaniu morfologii komórki, a następnie na wtórnym barwieniu immunologicznym. Wprowadzamy praktyczne podejście do wypełniania biocytyną podczas zapisów fizjologicznych i późniejszego seryjnego barwienia immunologicznego w celu odzyskania morfologii, a następnie ponownego barwienia skrawków w celu określenia tożsamości neurochemicznej. Donosimy, że sekcje, które zostały wypełnione biocytyną, utrwalone paraformaldehydem (PFA), wybarwione i przykryte, mogą zostać usunięte i ponownie wybarwione drugim pierwotnym przeciwciałem kilka dni później. To ponowne barwienie polega na usunięciu szkiełka nakrywkowego, umyciu skrawków w roztworze buforowym oraz inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych w celu ujawnienia tożsamości neurochemicznej. Metoda ta jest korzystna w eliminowaniu utraty danych z powodu niemożności odzyskania morfologii oraz w zawężaniu markerów neurochemicznych, które mają być badane na podstawie morfologii.

Wprowadzenie

Mózg jest znany z różnorodności strukturalnych i funkcjonalnych cech swoich poszczególnych elementów neuronalnych. Zrozumienie roli różnych typów neuronów w funkcjonowaniu i patologii mózgu wymaga charakterystyki i jednoznacznej identyfikacji neuronów. Strukturalnie cechy morfologiczne zdefiniowane przez lokalizację somato-dendrytyczną określają potencjalne dane wejściowe, które otrzymuje dany neuron, podczas gdy wzorzec arboryzacji aksonalnej identyfikuje potencjalne cele postsynaptyczne. Różnorodność strukturalna neuronów jest doceniana od czasów przełomowych badań histologicznych Ramóna y Cajala1. Pojawienie się technik rejestracji pojedynczej komórki ujawniło, że strukturalnie odrębne neurony wykazują również różnice we wzorcach zapłonu i cechach synaptycznych. Różnorodność w budowie i fizjologii jest szczególnie widoczna w neuronach hamujących GABA-ergiczne2,3. Ponadto staje się coraz bardziej oczywiste, że strukturalnie podobne neurony mogą wyrażać różne markery neurochemiczne i wykazywać odpowiadające im różnice funkcjonalne4. Podobnie, neurony z tymi samymi markerami neurochemicznymi mogą mieć odrębne struktury i funkcje5-10. Tak więc w praktyce analiza cech funkcjonalnych neuronów i ich roli w sieci pociąga za sobą zdefiniowanie zarówno tożsamości morfologicznej, jak i neurochemicznej. Nawet wraz z pojawieniem się linii myszy reporterowych ukierunkowanych na określone markery neurochemiczne, często konieczne jest określenie morfologii i tożsamości podtypu na podstawie immunohistologii11.

Standardowa metoda używana do charakteryzowania komórek zarejestrowanych w ostrych wycinkach mózgu polega na wypełnieniu ich biocytyną lub neurobiotyną podczas zapisu, utrwaleniu skrawków w paraformaldehydzie (PFA) po nagraniach i użyciu immunohistochemii do ujawnienia morfologii i neurochemii. Ponieważ grubość skrawków dla fizjologii plastrów wynosi zwykle 300 μm lub więcej, a większość przeciwciał nie przenika przez całą tę głębokość, plastry muszą zostać ponownie pocięte do 60 μm lub mniej, aby umożliwić jednoczesne barwienie immunologiczne biocytyny i markerów neurochemicznych12-14. Niestety, resekcja jest pracochłonna; ryzyko utraty tkanki podczas cięcia; i może prowadzić do zróżnicowanego kurczenia się tkanek, komplikując rekonstrukcje morfologiczne. Ponadto wcześniejsza wiedza na temat morfologii może pomóc w zawężeniu potencjalnych markerów, które prawdopodobnie będą wyrażane przez komórki. Zmodyfikowaliśmy standardowe protokoły immunohistologiczne biocytyny, aby umożliwić seryjne przetwarzanie skrawków najpierw w celu odzyskania morfologii, a następnie identyfikacji potencjalnych markerów neurochemicznych.

Immunohistochemia to nauka o dystrybucji antygenu w tkankach lub komórkach i może być wizualizowana za pomocą enzymu, etykiet fluorescencyjnych, pierwiastków radioaktywnych lub cząstek koloidu złota15. Procedura polega na użyciu przeciwciał pierwszorzędowych do specyficznego znakowania i amplifikacji jednego lub więcej specyficznych antygenów, a następnie użyciu fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych skierowanych na przeciwciało pierwszorzędowe w celu wizualizacji. Ze względu na konieczność rozróżnienia widm fluorescencyjnych każdego przeciwciała drugorzędowego bez nakładania się, tylko ograniczona liczba antygenów może być badana jednocześnie. W związku z tym wcześniejsza wiedza na temat morfologii może być przydatna w wyborze potencjalnych markerów neurochemicznych do klasyfikacji komórek. Koncepcyjnie, uzasadnienie dla seryjnego przetwarzania już wybarwionych skrawków opiera się na założeniu, że znakowanie immunologiczne dla jednego białka lub peptydu nie powinno kolidować z antygenowością, a następnie znakowanie immunologiczne dla strukturalnie niezależnego peptydu16. Ten brak interferencji wynika z wiązania przeciwciał ze specyficznym epitopem białkowym na antygenie, a zatem pozwala na jednoczesne barwienie wielu antygenów w tej samej tkance. Liczba antygenów ujawnionych w procesie barwienia immunologicznego jest ograniczona przez konieczność nienakładania się widm fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych oraz przez konieczność celowania w poszczególne antygeny przeciwciałami wyhodowanymi u różnych gatunków w celu wyeliminowania reaktywności krzyżowej17,18. Chociaż jest to powód stojący za szeregowym, a nie jednoczesnym znakowaniem dwoma odrębnymi przeciwciałami, które mogą wchodzić w interakcje, o ile nam wiadomo, barwienie immunologiczne dla drugiego antygenu nie zostało zgłoszone po zakończeniu znakowania immunologicznego dla jednego lub więcej antygenów na zamontowanych odcinkach. W tym miejscu opisujemy metodę seryjnego barwienia immunologicznego wcześniej wybarwionych i zamontowanych odcinków. Chociaż szczegółowo opisujemy ten proces dla procedury seryjnego znakowania immunologicznego w celu odzyskania morfologii, a następnie barwienia markerów białkowych / peptydowych w grubych sekcjach, te same procedury można również zastosować w standardowych, cienkich skrawkach histologicznych. Ponadto opisujemy praktyczne podejście do wypełniania zarejestrowanych neuronów biocytyną oraz proces usuwania elektrody z komórki po zakończeniu nagrań w celu optymalizacji wypełnienia aksonalnych i dendrytycznych trzpieni neuronów, jak przedstawiono w naszej ostatniej pracy6,8.

Najważniejszą zaletą opisanej tutaj procedury jest to, że morfologia zarejestrowanej komórki może być w pełni odzyskana i zobrazowana przed próbą resekcji lub immunologicznego barwienia wycinków. Chociaż problemy z penetracją niektórych przeciwciał mogą spowodować konieczność resekcji wycinków w celu wtórnego barwienia immunologicznego, opisane tutaj procedury wyeliminowałyby potrzebę rekonstrukcji złożonych neuronów z wielu sekcji i pozwoliłyby uniknąć problemów spowodowanych utratą tkanek i zróżnicowanym skurczem, co może zagrozić rekonstrukcji po resekcji. Dodatkową zaletą jest to, że proces ten zmniejszy koszty, czas, wysiłek i drogie przeciwciała poprzez ograniczenie barwienia immunologicznego i resekcji do wycinków, w których odzyskiwane są neurony wypełnione biocytyną. Najbardziej praktycznym aspektem jest dodatkowe barwienie immunologiczne, które można wykonać na odcinkach barwionych na kilka miesięcy przed zastosowaniem wyżej wymienionej techniki. W szczególności przywrócenie morfologii znacznie zmniejszyłoby prawdopodobieństwo, że dane fizjologiczne z komórek zostaną odrzucone z powodu niemożności uzyskania podstawowej charakterystyki morfologicznej typu komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wypełnianie biocytiną podczas elektrofizjologii

UWAGA: Czytelnicy mogą zapoznać się z alternatywnymi źródłami dotyczącymi podstawowych technik rejestracji metodą patch-clamp oraz aparatury19-2, które nie zostały tutaj szczegółowo omówione. Kroki opisane w niniejszym materiale zakładają, że sprzęt i procedury do rejestracji patch-clamp zostały już przygotowane, a opis ograniczy się do szczegółów związanych z wypełnianiem biocytyną i późniejszym immunobarwieniem. Wszystkie eksperymenty opisane w niniejszym opracowaniu zostały przeprowadzone na szczurach.

  1. Używając wibratomu, przygotuj żywe przekroje mózgu z pożądanego obszaru o grubości 30 - 350 µm23.
  2. Przygotuj roztwór wewnętrzny zawierający 0,2% biocytyny, dodając 2 mg biocytyny do 1 mL roztworu wewnętrznego6. Dla uzyskania najlepszych wyników poddaj roztwór wewnętrzny sonikacji przez 10 - 15 min, aż biocytyna całkowicie się rozpuści. Następnie wprowadź roztwór wewnętrzny do strzykawki o objętości 1 mL wyposażonej w polipropylenowy filtr o rozmiarze porów 0,2 µm przymocowany do mikroładownika. Przechowuj tę strzykawkę wkładzie chłodzącym, aby zachować stabilność Mg-ATP i Na-GTP w roztworze wewnętrznym.
    UWAGA: Roztwór wewnętrzny zawierający glukonian potasu (126 mM K-gluconate, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP oraz 10 mM fosfokreatyny) jest optymalny dla odzyskania niektórych markerów neurochemicznych, w tym parwalbuminy, podczas znakowania immunologicznego. W naszym doświadczeniu stosowanie roztworów wewnętrznych opartych na cezie i chlorkach zmniejsza zdolność do odzyskania immunostainingu dla niektórych markerów neurochemicznych. Jako alternatywa dla biocytyny można zastosować neurobiotynę lub nieprzenikający do komórki, utrwalany, polarny marker łączący fluorofor Alexa Fluor z biocytyną.
  3. W podczerwonym kontraście interferencyjnym (DIC) zlokalizuj odpowiednią komórkę do rejestracji. Aby zminimalizować uszkodzenie aksonu, zbliż się do ciała komórki, opuszczając pipetę wzdłuż jego osi, korzystając z funkcji „approach” dostępnej w większości mikromanipulatorów. Przeprowadź rejestrację w konfiguracji whole-cell w podczerwonym kontraście interferencyjnym, stosując protokoły fizjologii patch-clamp19-2.
    UWAGA: Unikaj zbliżania się do komórki z kierunku domniemanego aksonu, ponieważ spowoduje to jego przerwanie, co będzie widoczne jako pęcherzyk na przeciętym końcu (zielona strzałka na Rysunku 1). Ponadto unikaj stosowania wysokiego dodatniego ciśnienia w pipecie rejestrującej podczas zbliżania się do komórki, aby zminimalizować wyciek biocytyny, co skutkowałoby wysokim tłem barwienia.

Obrazowanie neuronów z labelingiem biocytyną, trójwymiarowy układ współrzędnych, wynik mikroskopowy, skala 50 μm.
Rysunek 1. Sugerowana płaszczyzna podejścia do komórek w celu wypełnienia biocytyną. Obraz przedstawia wypełnienie komórki ziarnistej (GC) biocytyną podczas rejestracji, przetworzone w celu uwidocznienia biocytyny (na czerwono, przy użyciu streptawidyny sprzężonej z barwnikiem 594). Dendryty komórki ziarnistej są zorientowane w płaszczyźnie XY. Zwróć uwagę na przerwany akson komórki ziarnistej (zielona strzałka), spowodowany ruchem pipety w płaszczyźnie XY. Należy zauważyć, że optymalne jest podchodzenie do tego neuronu w płaszczyźnie XZ. Pasek skali: 50 µm.

  1. W konfiguracji clampy napięciowej (voltage clamp), wyznacz pojemność całej komórki oraz oporność szeregową w odpowiedzi na krótkie (30 ms) skoki napięcia o niewielkiej amplitudzie (5 mV), korzystając z funkcji testu błony w trybie kąpieli (bath mode) w oprogramowaniu do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych. Pozwoli to upewnić się, że ustanowiono warunki rejestracji whole-cell, umożliwiające wypełnienie komórki biocytyną.
  2. Przeprowadź rejestracje fizjologiczne w trybie clampy prądowej (current-clamp) lub napięciowej (voltage-clamp), zależnie od potrzeb. Optymalny minimalny czas rejestracji wynosi >10 min w temperaturze 34 °C.
    UWAGA: W przypadku badań prowadzonych w temperaturze pokojowej może być wymagany dłuższy czas rejestracji.
  3. Po zakończeniu rejestracji fizjologicznych przywróć konfigurację patch-clamp, powoli przesuwając pipetę rejestrującą małymi krokami, naprzemiennie w górę (wzdłuż osi Z) i na zewnątrz (wzdłuż osi X), w trybie clampy napięciowej.
  4. Jednocześnie monitoruj pojemność i oporność wejściową za pomocą funkcji „testu błony”, aby zaobserwować zanik przejściowych prądów pojemnościowych i spłaszczenie odpowiedzi prądowych do linii prostej, co wskazuje na ponowne zamknięcie komórki i utworzenie patcha typu outside-out na końcówce pipety. Utrzymywanie komórki przy potencjale zdepolaryzowanym (-40 mV) ułatwi proces ponownego zamknięcia.
    UWAGA: Ta procedura usuwania komórki zazwyczaj zapewnia pełną regenerację somy i dendrytów. Nie przykładaj dodatniego ciśnienia do pipety rejestrującej podczas tej procedury ani podczas odłączania komórki od pipety. Wizualizacja somy rejestrowanej komórki w skrawku świadczy o pomyślnym rozłączeniu. Obecność szczątków komórkowych lub fragmentu błony na końcu odłączonej pipety zazwyczaj wskazuje na przemieszczenie somy i nie pozwoli na uzyskanie pełnej morfologii komórkowej.
  5. Po odłączeniu pipety od komórki, pozostaw skrawki w komorze rejestracyjnej na 3 - 5 min, aby zapewnić transport barwnika do dystalnych wypustek dendrytycznych i aksonalnych.
  6. Przenieś skrawki do płytki 24-dołkowej zawierającej 4% PFA w celu utrwalenia.
    OSTRZEŻENIE: PFA jest rakotwórcze; należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice i maseczkę ochronną, aby uniknąć podrażnienia skóry i inhalacji. PFA jest łatwopalne i musi być przechowywane z dala od źródeł ognia. PFA nigdy nie wolno wylewać do odpływu; musi być ono zbierane jako odpad chemiczny. Utrwalanie w PFA musi odbywać się w obszarze oddzielonym od miejsc przygotowywania żywych skrawków, aby uniknąć zanieczyszczenia aparatury fizjologicznej, w tym pipet transferowych.
  7. Od 24 do 48 h po utrwaleniu w PFA przenieś skrawki do 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) do przechowywania przed immunostainingiem.
    UWAGA: Odzyskiwanie biocytyny i immunostaining przebiegają najlepiej, gdy są wykonywane wkrótce po utrwaleniu, choć barwienie przeprowadzone w ciągu 7 d od utrwalenia daje dobre wyniki. Skrawki mogą być przechowywane w PBS z dodatkiem 0,02 - 0,05% azotku sodu w przypadku barwienia wykonywanego do 90 dni i później po utrwaleniu. Chociaż nocne utrwalanie w PFA sprawdza się w przypadku większości przeciwciał, niektóre z nich mogą działać najlepiej przy skróconym czasie inkubacji w utrwalaczu. Utrwalanie w PFA przez ponad 48 h zmniejsza dostępność antygenów i obniża szanse na udany wtórny immunostaining markerów neurochemicznych.
    OSTRZEŻENIE: Azotek sodu jest niezwykle niebezpieczny i działa drażniąco w kontakcie ze skórą, oczami, po połknięciu lub inhalacji. Silna ekspozycja może prowadzić do śmierci. Rakotwórczość i mutagenność tego związku nie są znane. Stosuj odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice, okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i respirator przeciwpyłowy. Azotku sodu nigdy nie wolno wylewać do odpływu; musi być on zbierany jako odpad chemiczny.

2. Barwienie pierwszym przeciwciałem pierwotnym i biocytyną

(Dzień 1)
UWAGA: Poniższa procedura immunobarwienia dotyczy przekrojów swobodnie pływających i wymaga ciągłego wstrząsania z niską prędkością (2 obroty/min, rpm) na wytrząsarce podczas wszystkich etapów inkubacji.

  1. Przemyć tkankę 3x przez 10 min każdorazowo w 0.1 M PBS (pH = 7.4).
    UWAGA: 0.1 M PBS można zakupić komercyjnie lub przygotować w laboratorium w następujący sposób (na 1 L): 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.4 g Na2HPO4 oraz 0.24 g KH2PO4 w 1 L dH20.
    UWAGA: Jeśli znany jest pożądany marker neurochemiczny, barwienie na białko/peptyd można przeprowadzić jednocześnie z barwieniem na biocytynę (kroki 2.2 - 2.4). W przypadku barwienia wyłącznie na biocytynę, przejść do kroku 2.5.
  2. OPCJONALNIE: Zablokować, używając 10% Serum Blokującego (BS; normalne serum kozie (NGS) rozcieńczone w 0.3% Triton X-10 w PBS) przez 1 h w RT.
    UWAGA: Do każdego dołka należy wlać taką samą objętość roztworu; zalecana objętość wynosi od 250 do 50 µL/dołek. Wybór serum blokującego zależy od gatunku, w którym wytworzono przeciwciała wtórne (np. NGS jest stosowane dla koniugatów barwnikowych kozich przeciwciał anty-(odpowiedni gatunek przeciwciała pierwotnego)). Jeśli pojawi się potrzeba użycia przeciwciał wtórnych wytworzonych w różnych gatunkach do immunobarwienia sekcji, należy dodać 10% każdego normalnego serum w kroku blokowania (2) oraz 3% każdego normalnego serum do etapów inkubacji z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi.
  3. (OPCJONALNIE) Inkubować sekcje w przeciwciałach pierwotnych, CB1R (poliklonalne, świnka morska) z 0.3% Triton X-10 oraz 3% BS w 0.1 M PBS w RT przez noc (O/N). CB1R jest stosowane do identyfikacji ekspresji kannabinoidowego receptora typu 1.
    UWAGA: Krok ten jest opcjonalny i nie jest wymagany do wykazania wypełnienia biocytyną. Rycina 2 przedstawia sekcję znakowaną na biocytynę i CB1R podczas pierwszego procesu barwienia. Inkubacja przez noc w RT jest wystarczająca dla większości przeciwciał pierwotnych; jednak niektóre przeciwciała pierwotne, w tym CB1R, wymagają inkubacji przez 3 - 5 d. Jeśli inkubacja musi trwać dłużej niż 1 d, zaleca się inkubację w 4 °C, ponieważ Triton X-10 może permeabilizować skrawki i prowadzić do dezintegracji tkanki podczas przedłużonej inkubacji w temperaturze pokojowej. W co najmniej jednej sekcji dla każdej serii eksperymentów należy uwzględnić kontrolę negatywną bez przeciwciał pierwotnych w celu weryfikacji swoistości przeciwciał wtórnych. W przypadku kontroli negatywnych pomija się dodanie przeciwciał pierwotnych, ale dodaje się 0.3% Triton X-10 w 0.1 M PBS oraz BS.

Markowanie neuronów biocytyną, CB1, CCK; obrazy mikroskopowe; analiza mapowania dendrytycznego i aksonalnego.
Rysunek 2. Pomyślne barwienie CCK tydzień po odzyskaniu barwienia biocytyną i Creceptor kannabinoidowy typu 1 (CB1)1(R)-znakowanie (A - C) obrazy konfokalne przy 60X przedstawiające wypełniony biocytyną neuron (A) oraz CB1immunoreaktywność R (B), wskazane przez grot strzałki. Ten sam przekrój poddano barwieniu immunohistochemicznemu na CCK po 1 tygodniu (C). Nałożenie obrazów przedstawiono w DImmunoreaktywność CCK wykazano przy użyciu barwnika dalekiej czerwieni, a następnie nadano jej pseudokolor cyjan.E) Rekonstrukcja morfologiczna komórki wypełnionej biocytyną na rys. A. Należy zwrócić uwagę, że biocytyna i CB1Barwienie R jest widoczne nawet po drugim immunostainingu CCK. Należy również zwrócić uwagę na oczekiwany rozkład CB.1Wzorce barwienia immunocytochemicznego dla R i CCK. (F - H) Powiększony obraz aksonu komórki, jak w Awykazują ścisłą ko-lokalizację biocytyny i CB1R w aksonach (groty strzałek). Pasek skali: 50 µm (A - D), 100 µm (E), i 10 µm (F - H). Obrazy zostały powielone z Yu i wsp. 20159. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

(Dzień 2)

  1. Przemyć skrawki mózgu 3x przez 10 min każdy w 0,1 M PBS (pH = 7,4).
  2. Inkubować skrawki z koniugatem streptawidyny z czerwonym barwnikiem (stężenie: 1:1 0; wzbudzenie: 594 nm z emisją w czerwonej części widma widzialnego) z dodatkiem 0,3% Triton X-10 i 3% BS w 0,1 M PBS w temperaturze 4 °C przez noc (O/N) w ciemności (zawinięte w folię aluminiową), aby uwidocznić biocytynę. OPCJONALNIE: W przypadku przeprowadzenia opcjonalnej inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym w kroku 2.3, do powyższej inkubacji należy dołączyć przeciwciało drugorzędowe, kozie anty-świnka morska (stężenie: 1:50; wzbudzenie: 48 nm i emisja w kolorze zielonym).
    UWAGA: Przeciwciało drugorzędowe będzie potrzebne tylko wtedy, gdy wykonano opcjonalne barwienie przeciwciałem pierwszorzędowym (krok 2.3). Do wizualizacji biocytyny zaleca się stosowanie koniugatu streptawidyna-fluorofor z widmem emisji w kolorze czerwonym, ponieważ ułatwia to szczegółową wizualizację cieńszych aksonów z lepszym kontrastem (Rysunki 1 - 3). Podczas podwójnego lub potrójnego barwienia immunohistorochemicznego, aby uniknąć reaktywności krzyżowej przeciwciał drugorzędowych, należy dodawać przeciwciała drugorzędowe sekwencyjnie (wystarczający jest odstęp 2 h między kolejnymi aplikacjami przeciwciał). Rysunek 3A przedstawia wypełnioną biocytyną komórkę przetworzoną bez opcjonalnego barwienia przeciwciałem pierwszorzędowym i zobrazowaną przed ponownym cięciem.

Obrazowanie neuronów, wykres elektrofizjologiczny, analiza konektywności; znakowanie dendrytów; aktywność synaptyczna.
Rycina 3. Pomyślne drugie immunostaining po odzyskaniu morfologii biocytyny i ponownym cięciu. (A1) Obraz konfokalny a 300 µm przekrój przedstawiający odzyskanie morfologii dendrytycznej komórki wypełnionej biocytyną. (A2) Przebiegi napięcia błonowego neuronu w odpowiedzi na wstrzyknięcia prądu o wartości +50 i -10 pA. (B) Odzyskanie wypełnionego biocytyną somy w 50 µm przekrój uzyskany po wycięciu 300 µm sekcja (w A1) po zamontowaniu i obrazowaniu. (B2Następne barwienie immunocytochemiczne cienkiego przekroju wykazało kolokalizację wypełnionego biocytyną somy (panel środkowy) z CCK (panel środkowy). Obraz z nałożonymi kanałami przedstawiono na panelu prawym. Pasek skali: 50 µmPanel A2 został powielony za zgodą Yu i wsp., w druku25. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

(Dzień 3)

  1. Przemyć skrawki mózgu 3 razy po 10 min każdy w 0,1 M PBS (pH = 7,4).
  2. Aby chronić fluorescencję i ułatwić ponowne barwienie w przyszłości, zamontować skrawki w wodnym medium montażowym i zabezpieczyć krawędzie szkiełka nakrywkowego bezbarwnym lakierem do paznokci.
    UWAGA: Najlepiej jest przeprowadzić ponowne barwienie skrawków tak wcześnie, jak to możliwe, aby uniknąć trudności z usuwaniem lakieru ze szkiełka, infekcji pleśnią oraz odwodnienia tkanki na skutek wycieku medium montażowego z preparatu.
    OSTRZEŻENIE: Azydk sodu jest silnie toksyczny i łatwopalny w kontakcie z wodą. Należy stosować standardowe procedury operacyjne dotyczące obchodzenia się z substancjami niebezpiecznymi i ich utylizacji.
    (Dni 4 - 7)
  3. Przeprowadzić obrazowanie konfokalne z wzbudzeniem przy 594 i 488 nm oraz przy powiększeniu 20X lub 40X, aby uwidocznić wypełnione biocytyną neurony w kolorze czerwonym oraz markery neurochemiczne (CB1R) w kolorze zielonym. Ocenić kolokalizację (Rysunek 2).
  4. Ustawić czas ekspozycji kamery na mniej niż 10 ms, aby uniknąć fotowybielania, i uzyskać stosy obrazów konfokalnych drzewk wewnątrz i zewnętrznych całej struktury neuronu. Wykorzystać stosy obrazów konfokalnych oraz oprogramowanie do śledzenia neuronów w celu rekonstrukcji morfologii neuronalnej.

3. Barwienie drugim przeciwciałem pierwszorzędowym

UWAGA: Chociaż drugi etap immunobarwienia można przeprowadzić 90 d po pierwszym barwieniu, optymalne wyniki uzyskuje się, jeśli drugie barwienie przeciwciałami pierwotnymi zostanie wykonane w ciągu 7 - 10 d.

(Po 7 – 90 d)

  1. Nanieś aceton na patyczek higieniczny i usuń lakier do paznokci z szkiełka przedmiotowego.
  2. Ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkę za pomocą pęsety z cienkimi końcami i nanieś kilka kropel 0,1 M PBS na skrawki.
  3. Ostrożnie zdejmij skrawki ze szkiełka za pomocą cienkiego pędzla i płucz je w 0,1 M PBS przez 24 - 48 h na wytrząsarce, przykrywając je folią aluminiową, w słabym świetle w temperaturze 4 oC.
    UWAGA: Przykrycie skrawków folią aluminiową jest kluczowe, aby uniknąć fotoblaknięcia.
  4. Aby zapewnić całkowite usunięcie medium montażowego, następnego dnia płucz skrawki 1 - 2x w 0,1 M PBS przez 10 min każde płukanie.
  5. Przejdź do inkubacji z drugim przeciwciałem pierwszorzędowym (np. cholecystokininą, neuropeptydem występującym w niektórych interneuronach GABAergicznych (CCK; stężenie: 1:1 0; mysie przeciwciało monoklonalne)) przez 1 d (Rysunek 2).
    UWAGA: Procedura ta jest podobna do kroku 2.3, ale wykorzystuje inne przeciwciało. Dodatkowo, podczas ponownego barwienia pomija się etap blokowania.
  6. Płucz skrawki mózgu trzy razy po 10 min każdy w 0,1 M PBS (pH = 7,4).
  7. Barwi za pomocą koniugowanego z fluoroforem przeciwciała wtórnego koziego anty-mysiego (stężenie: 1:50; długość fali wzbudzenia: 647 nm), upewniając się, że widma wzbudzenia i emisji przeciwciała wtórnego nie nakładają się na widma streptawidyny (stężenie: 1:1 0; długość fali wzbudzenia: 594 nm) oraz wcześniejszych barwień immunofluorescencyjnych.
  8. Zamontuj skrawki w wodnym medium montażowym i zabezpiecz krawędzie szkiełka nakrywki bezbarwnym lakierem do paznokci.
    UWAGA: Przechowuj skrawki w temperaturze 4 °C w nieprzepuszczającym światła pudełku, aby chronić fluorescencję.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po pomyślnym zakończeniu sekcje zachowują wypełnienie biocytyną oraz immunoznakowanie wykonane w kroku 2 i mogą być obrazowane przy użyciu mikroskopii konfokalnej lub epifluorescencyjnej. Dodatkowo, przetworzone sekcje wykażą również immunobarwienie przeciwko antygenowi znakowanemu podczas późniejszej procedury w kroku 3. Na przekroju przedstawionym na Rysunku 2 morfologia neuronu wypełnionego biocytyną w grubym przekroju (300 µm) została ujawniona przy użyciu streptawidy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe kroki w ramach protokołu

Wypełnienie załatanej komórki biocytyną jest najważniejszym krokiem do zapewnienia pełnego odzyskania morfologii. Aby w pełni odzyskać komórkę, konieczne jest wybranie optymalnej orientacji plastrów, aby zminimalizować przerwanie procesów podczas krojenia. Ta orientacja może się różnić w zależności od badanego obwodu i typu ogniwa. Następnie ważne jest, aby zapewnić odpowiednią ilość czasu na dyfuzję biocytyny do dendrytów i aksonów. Niektóre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie ze strony NIH/NINDS R01 NS069861 i NJCBIR CBIR14IRG024 dla VS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NaClSigmaS7653Barwienie immunologiczne
KClFluka60129Barwienie immunologiczne
Na2HPO4 SigmaS7907Barwienie immunologiczne
KH2PO4 Sigma229806Barwienie immunologiczne
Triton X-100SigmaT8787Immunostaining
świnka morska anty CB1 SigmaAf530-1Immunostaining
Mysz anti CCKCURE, UCLAdzięki uprzejmości G. OhningImmunostaining
Rabbit anty ParvalbuminSwantPV27Immunostaining
Streptawidyna, Alexa Fluor sprzęganySondy molekularneS11227Barwienie immunologiczne
Normalna surowica kozia (NGS)SigmaG9023Barwienie immunologiczne
Vectashield Vector LabsH-1000Barwienie immunologiczne
Przeciwciała wtórneInvitogen Sondy molekularneAlexa Fluor Barwienieimmunologiczne
Wytrząsarka niskoobrotowa Labnet orbitBioexpressS-2030-LSKleszczyki do barwienia immunologicznego
Dumont11231-30Markery immunologiczne
EMS71520Barwienie immunologiczne
Vibratome VT 1200 SLeica14048142066Elektrofizjologia
Multiclamp 700Bwzmacniacz Urządzenia molekularneMulticlamp 700BElektrofizjologia
pCLAMP 10 OprogramowanieUrządzenia molekularnepCLAMP 10 Elektrofizjologia
DigitizerUrządzenia molekularneDigidata 1440 digitizerElektrofizjologia
Końcówki filtrówNalgene171-0020Elektrofizjologia
SonikatorFisher Scientific15-335-100Elektrofizjologia
MikroładowarkiEppendorf930001007Elektrofizjologia
BiocytinSigmaB4261Elektrofizjologia

Bibliografia

  1. Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9(2010).
  2. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  3. Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  4. Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
  5. Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553(2013).
  6. Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
  7. Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
  8. Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
  9. Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
  10. Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
  11. Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109(2015).
  12. Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
  13. Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
  14. Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17(2011).
  15. Chen, X., Cho, D. -B., Yang, P. -C. Double staining immunohistochemistry. N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).
  16. Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
  17. Fuccillo, D. A., Sever, J. L. Concepts in Viral Pathogenesis II. , Springer. 324-330 (1986).
  18. Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358(2015).
  20. Walz, W. Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , Humana Press. (2007).
  21. Molnar, P. Patch-clamp methods and protocols. 403, Springer Science & Business Media. (2007).
  22. Martina, M., Taverna, S. Patch-clamp methods and protocols. , Humana Press. (2014).
  23. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706(2014).
  24. Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
  25. Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
  26. Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109(2013).
  27. Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
  28. Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wypełnianie biocytynąbarwienie immunohistochemiczneodzyskiwanie morfologiirejestracja patch-clampseryjne barwienie immunologiczneprzygotowanie przekrojów mózgupenetracja przeciwciałobrazowanie konfokalnemorfologia komórek
Barwienie immunologiczne skrawków wypełnionych i przetworzonych biocytyną pod kątem markerów neurochemicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.