Barwienie immunologiczne skrawków wypełnionych i przetworzonych biocytyną pod kątem markerów neurochemicznych

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę morfologicznego odzyskiwania neuronów załatanych podczas zapisów elektrofizjologicznych za pomocą wypełnienia biocytyną i późniejszego immunohistochemicznego przetwarzania końcowego. Pokazujemy, że grube skrawki wypełnione biocytyną, które zostały wybarwione i przykryte, mogą być ponownie wybarwione drugim pierwotnym przeciwciałem kilka dni lub miesięcy później.

Streszczenie

Elektrofizjologiczne zapisy komórek za pomocą techniki patch clamp pozwoliły na identyfikację różnych typów neuronów na podstawie wzorców zapłonu. Włączenie biocytyny/neurobiotyny do elektrody rejestrującej pozwala na odzyskanie szczegółów morfologicznych post hoc, które są niezbędne do określenia arboryzacji dendrytycznej i regionów, do których dążą aksony zarejestrowanych neuronów. Jednak biorąc pod uwagę obecność morfologicznie podobnych neuronów o odrębnych tożsamościach i funkcjach neurochemicznych, barwienie immunohistochemiczne białek specyficznych dla typu komórki jest niezbędne do ostatecznej identyfikacji neuronów. Aby utrzymać łączność sieciową, wycinki mózgu do zapisów fizjologicznych są przygotowywane o grubości 300 μm lub większej. Jednak ta grubość często utrudnia immunohistologiczną obróbkę końcową ze względu na problemy z penetracją przeciwciał, co wymaga resekcji tkanki. Resekcja wycinków jest trudną sztuką, często prowadzącą do utraty tkanki i morfologii komórek, z których uzyskano dane elektrofizjologiczne, co sprawia, że dane stają się bezużyteczne. Ponieważ odzyskanie morfologii ograniczyłoby utratę danych i pomogłoby w selekcji markerów neuronalnych, przyjęliśmy strategię polegającą najpierw na odzyskaniu morfologii komórki, a następnie na wtórnym barwieniu immunologicznym. Wprowadzamy praktyczne podejście do wypełniania biocytyną podczas zapisów fizjologicznych i późniejszego seryjnego barwienia immunologicznego w celu odzyskania morfologii, a następnie ponownego barwienia skrawków w celu określenia tożsamości neurochemicznej. Donosimy, że sekcje, które zostały wypełnione biocytyną, utrwalone paraformaldehydem (PFA), wybarwione i przykryte, mogą zostać usunięte i ponownie wybarwione drugim pierwotnym przeciwciałem kilka dni później. To ponowne barwienie polega na usunięciu szkiełka nakrywkowego, umyciu skrawków w roztworze buforowym oraz inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych w celu ujawnienia tożsamości neurochemicznej. Metoda ta jest korzystna w eliminowaniu utraty danych z powodu niemożności odzyskania morfologii oraz w zawężaniu markerów neurochemicznych, które mają być badane na podstawie morfologii.

Wprowadzenie

Mózg jest znany z różnorodności strukturalnych i funkcjonalnych cech swoich poszczególnych elementów neuronalnych. Zrozumienie roli różnych typów neuronów w funkcjonowaniu i patologii mózgu wymaga charakterystyki i jednoznacznej identyfikacji neuronów. Strukturalnie cechy morfologiczne zdefiniowane przez lokalizację somato-dendrytyczną określają potencjalne dane wejściowe, które otrzymuje dany neuron, podczas gdy wzorzec arboryzacji aksonalnej identyfikuje potencjalne cele postsynaptyczne. Różnorodność strukturalna neuronów jest doceniana od czasów przełomowych badań histologicznych Ramóna y Cajala¹. Pojawienie się technik rejestracji pojedynczej komórki ujawniło, że strukturalnie odrębne neurony wykazują również różnice we wzorcach zapłonu i cechach synaptycznych. Różnorodność w budowie i fizjologii jest szczególnie widoczna w neuronach hamujących GABA-ergiczne^2,3. Ponadto staje się coraz bardziej oczywiste, że strukturalnie podobne neurony mogą wyrażać różne markery neurochemiczne i wykazywać odpowiadające im różnice funkcjonalne⁴. Podobnie, neurony z tymi samymi markerami neurochemicznymi mogą mieć odrębne struktury i funkcje^5-10. Tak więc w praktyce analiza cech funkcjonalnych neuronów i ich roli w sieci pociąga za sobą zdefiniowanie zarówno tożsamości morfologicznej, jak i neurochemicznej. Nawet wraz z pojawieniem się linii myszy reporterowych ukierunkowanych na określone markery neurochemiczne, często konieczne jest określenie morfologii i tożsamości podtypu na podstawie immunohistologii¹¹.

Standardowa metoda używana do charakteryzowania komórek zarejestrowanych w ostrych wycinkach mózgu polega na wypełnieniu ich biocytyną lub neurobiotyną podczas zapisu, utrwaleniu skrawków w paraformaldehydzie (PFA) po nagraniach i użyciu immunohistochemii do ujawnienia morfologii i neurochemii. Ponieważ grubość skrawków dla fizjologii plastrów wynosi zwykle 300 μm lub więcej, a większość przeciwciał nie przenika przez całą tę głębokość, plastry muszą zostać ponownie pocięte do 60 μm lub mniej, aby umożliwić jednoczesne barwienie immunologiczne biocytyny i markerów neurochemicznych^12-14. Niestety, resekcja jest pracochłonna; ryzyko utraty tkanki podczas cięcia; i może prowadzić do zróżnicowanego kurczenia się tkanek, komplikując rekonstrukcje morfologiczne. Ponadto wcześniejsza wiedza na temat morfologii może pomóc w zawężeniu potencjalnych markerów, które prawdopodobnie będą wyrażane przez komórki. Zmodyfikowaliśmy standardowe protokoły immunohistologiczne biocytyny, aby umożliwić seryjne przetwarzanie skrawków najpierw w celu odzyskania morfologii, a następnie identyfikacji potencjalnych markerów neurochemicznych.

Immunohistochemia to nauka o dystrybucji antygenu w tkankach lub komórkach i może być wizualizowana za pomocą enzymu, etykiet fluorescencyjnych, pierwiastków radioaktywnych lub cząstek koloidu złota¹⁵. Procedura polega na użyciu przeciwciał pierwszorzędowych do specyficznego znakowania i amplifikacji jednego lub więcej specyficznych antygenów, a następnie użyciu fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych skierowanych na przeciwciało pierwszorzędowe w celu wizualizacji. Ze względu na konieczność rozróżnienia widm fluorescencyjnych każdego przeciwciała drugorzędowego bez nakładania się, tylko ograniczona liczba antygenów może być badana jednocześnie. W związku z tym wcześniejsza wiedza na temat morfologii może być przydatna w wyborze potencjalnych markerów neurochemicznych do klasyfikacji komórek. Koncepcyjnie, uzasadnienie dla seryjnego przetwarzania już wybarwionych skrawków opiera się na założeniu, że znakowanie immunologiczne dla jednego białka lub peptydu nie powinno kolidować z antygenowością, a następnie znakowanie immunologiczne dla strukturalnie niezależnego peptydu¹⁶. Ten brak interferencji wynika z wiązania przeciwciał ze specyficznym epitopem białkowym na antygenie, a zatem pozwala na jednoczesne barwienie wielu antygenów w tej samej tkance. Liczba antygenów ujawnionych w procesie barwienia immunologicznego jest ograniczona przez konieczność nienakładania się widm fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych oraz przez konieczność celowania w poszczególne antygeny przeciwciałami wyhodowanymi u różnych gatunków w celu wyeliminowania reaktywności krzyżowej^17,18. Chociaż jest to powód stojący za szeregowym, a nie jednoczesnym znakowaniem dwoma odrębnymi przeciwciałami, które mogą wchodzić w interakcje, o ile nam wiadomo, barwienie immunologiczne dla drugiego antygenu nie zostało zgłoszone po zakończeniu znakowania immunologicznego dla jednego lub więcej antygenów na zamontowanych odcinkach. W tym miejscu opisujemy metodę seryjnego barwienia immunologicznego wcześniej wybarwionych i zamontowanych odcinków. Chociaż szczegółowo opisujemy ten proces dla procedury seryjnego znakowania immunologicznego w celu odzyskania morfologii, a następnie barwienia markerów białkowych / peptydowych w grubych sekcjach, te same procedury można również zastosować w standardowych, cienkich skrawkach histologicznych. Ponadto opisujemy praktyczne podejście do wypełniania zarejestrowanych neuronów biocytyną oraz proces usuwania elektrody z komórki po zakończeniu nagrań w celu optymalizacji wypełnienia aksonalnych i dendrytycznych trzpieni neuronów, jak przedstawiono w naszej ostatniej pracy^6,8.

Najważniejszą zaletą opisanej tutaj procedury jest to, że morfologia zarejestrowanej komórki może być w pełni odzyskana i zobrazowana przed próbą resekcji lub immunologicznego barwienia wycinków. Chociaż problemy z penetracją niektórych przeciwciał mogą spowodować konieczność resekcji wycinków w celu wtórnego barwienia immunologicznego, opisane tutaj procedury wyeliminowałyby potrzebę rekonstrukcji złożonych neuronów z wielu sekcji i pozwoliłyby uniknąć problemów spowodowanych utratą tkanek i zróżnicowanym skurczem, co może zagrozić rekonstrukcji po resekcji. Dodatkową zaletą jest to, że proces ten zmniejszy koszty, czas, wysiłek i drogie przeciwciała poprzez ograniczenie barwienia immunologicznego i resekcji do wycinków, w których odzyskiwane są neurony wypełnione biocytyną. Najbardziej praktycznym aspektem jest dodatkowe barwienie immunologiczne, które można wykonać na odcinkach barwionych na kilka miesięcy przed zastosowaniem wyżej wymienionej techniki. W szczególności przywrócenie morfologii znacznie zmniejszyłoby prawdopodobieństwo, że dane fizjologiczne z komórek zostaną odrzucone z powodu niemożności uzyskania podstawowej charakterystyki morfologicznej typu komórki.

Protokół

1. Wypełnianie biocytyną podczas elektrofizjologii

UWAGA: Czytelnicy mogą skorzystać z alternatywnych źródeł w celu zapoznania się z podstawowymi technikami i oprzyrządowaniem do rejestracji metodą patch-clamp^19-22, które nie zostały tutaj szczegółowo omówione. Kroki opisane w niniejszym opracowaniu zakładają, że sprzęt i procedury do rejestracji patch-clamp zostały już ustanowione, a opis zostanie ograniczony do szczegółów związanych z wypełnianiem biocytyną i późniejszym barwieniem immunocytochemicznym. Wszystkie eksperymenty opisane w niniejszym manuskrypcie zostały przeprowadzone na szczurach.

1. Za pomocą wibratomu przygotować żywe skrawki mózgu z pożądanego obszaru o grubości 300 - 350 µm²³.
2. Przygotować roztwór wewnętrzny zawierający 0,2% biocytyny, dodając 2 mg biocytyny do 1 mL roztworu wewnętrznego⁶. Aby uzyskać najlepsze wyniki, poddać roztwór wewnętrzny sonikacji przez 10 - 15 min, aż biocytyna całkowicie się rozpuści. Następnie wprowadzić roztwór wewnętrzny do strzykawki o pojemności 1 mL wyposażonej w polipropylenowy filtr o rozmiarze porów 0,2 µm, przymocowany do mikroloadera. Przechowywać strzykawkę z roztworem w chłodni, aby zachować stabilność Mg-ATP i Na-GTP w roztworze wewnętrznym.
   UWAGA: Roztwór wewnętrzny zawierający glukonian potasu (126 mM K-gluconate, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP oraz 10 mM fosfokreatyny) jest optymalny dla odzyskiwania niektórych markerów neurochemicznych, w tym parwalbuminy, podczas immunoznakowania. W naszym doświadczeniu stosowanie roztworów wewnętrznych opartych na cezie i chlorkach zmniejsza możliwość uzyskania immunostainingu dla niektórych markerów neurochemicznych. Jako alternatywę dla biocytyny można zastosować neurobiotynę lub nieprzenikający do komórki, utrwalany, polarny znacznik łączący fluorofor Alexa Fluor z biocytyną.
3. W podczerwieni, przy zastosowaniu kontrastu interferencyjnego (DIC), zlokalizować odpowiednią komórkę do rejestracji. Aby zminimalizować uszkodzenia aksonu, zbliżyć się do ciała komórki, opuszczając pipetę wzdłuż jej osi za pomocą funkcji „approach” dostępnej w większości mikromanipulatorów. Wykonać rejestrację whole-cell w podczerwieni przy zastosowaniu kontrastu interferencyjnego, korzystając z protokołów fizjologii patch-clamp^19-22.
   UWAGA: Należy unikać zbliżania się do komórki od strony domniemanego aksonu, ponieważ spowoduje to jego przerwanie, co objawia się obecnością pęcherzyka na przeciętym końcu (zielona strzałka na Rysunku 1). Należy również unikać stosowania wysokiego dodatniego ciśnienia w pipecie rejestrującej podczas zbliżania się do komórki, aby zminimalizować wyciek biocytyny, co skutkowałoby wysokim tłem barwienia.

Rycina 1. Sugerowana płaszczyzna podejścia do komórek w celu wypełnienia biocytyną.Na obrazie przedstawiono wypełnienie komórki ziarnistej (GC) biocytyną podczas rejestracji, po obróbce w celu uwidocznienia biocytyny (na czerwono przy użyciu streptawidyny sprzężonej z 594). Dendryty komórki GC są zorientowane w płaszczyźnie XY. Zauważalne jest przerwanie aksonu komórki ziarnistej (zielona strzałka) w wyniku ruchu pipety w płaszczyźnie XY. Należy zwrócić uwagę, że idealnym rozwiązaniem jest podejście do tego neuronu w płaszczyźnie XZ. Pasek skali: 50 µm.

4. W konfiguracji clampingu napięcia wyznacz pojemność całej komórki oraz rezystancję szeregową w odpowiedzi na niewielkie (5 mV), krótkie (30 ms) skoki napięcia, korzystając z funkcji testu błony w trybie kąpieli w oprogramowaniu do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych. Pozwoli to upewnić się, że ustanowiono warunki rejestracji z całej komórki, umożliwiające wypełnienie biocytyną.
5. Przeprowadź rejestracje fizjologiczne w trybie clampingu prądu lub napięcia, w zależności od potrzeb. Idealny minimalny czas rejestracji to >10 min w temperaturze 34 °C.
   UWAGA: W przypadku badań przeprowadzanych w temperaturze pokojowej może być wymagany dłuższy czas rejestracji.
6. Po zakończeniu rejestracji fizjologicznych ponownie ustanów konfigurację patch-clamp, powoli przesuwając pipetę rejestrującą w małych krokach, naprzemiennie w górę (wzdłuż osi Z) i na zewnątrz (wzdłuż osi X) w trybie clampingu napięcia.
7. Jednocześnie monitoruj pojemność i rezystancję wejściową za pomocą funkcji „testu błony”, aby zaobserwować zanik stanów nieustalonych pojemności oraz spłaszczenie odpowiedzi prądowych do linii prostej, co wskazuje na ponowne uszczelnienie komórki i utworzenie patcha typu outside-out na końcówce pipety. Utrzymanie komórki przy potencjale zdepolaryzowanym (-40 mV) ułatwi proces ponownego uszczelnienia.
   UWAGA: Ta procedura usuwania komórki zazwyczaj zapewnia całkowite odzyskanie somy i dendrytów. Nie przykładaj dodatniego ciśnienia do pipety rejestrującej podczas tej procedury ani podczas odłączania komórki od pipety. Wizualizacja somy rejestrowanej komórki w skrawku świadczy o pomyślnym rozłączeniu. Obecność szczątków komórkowych lub fragmentu błony na końcu odłączonej końcówki zazwyczaj wskazuje na przemieszczenie somy i nie pozwoli na uzyskanie pełnej morfologii komórki.
8. Po odłączeniu pipety od komórki pozostaw skrawki w komorze rejestracyjnej przez 3 - 5 min, aby zapewnić transport barwnika do dystalnych wypustek dendrytycznych i aksonalnych.
9. Przenieś skrawki do płytki 24-dołkowej zawierającej 4% PFA w celu fiksacji.
   OSTRZEŻENIE: PFA jest substancją rakotwórczą; należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice i maseczkę, aby uniknąć podrażnień skóry i inhalacji. PFA jest łatwopalne i musi być przechowywane z dala od źródeł ognia. PFA nigdy nie wolno wylewać do odpływu; należy je gromadzić jako odpady chemiczne. Fiksacja w PFA musi być odizolowana od obszarów wykorzystywanych do przygotowywania żywych skrawków, aby uniknąć zanieczyszczenia zestawu fizjologicznego, w tym pipet transferowych.
10. Od 24 do 48 h po fiksacji w PFA przenieś skrawki do 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w celu przechowywania przed immunobarwieniem.
    UWAGA: Odzyskiwanie biocytyny i immunobarwienie przebiegają najlepiej, gdy są wykonywane wkrótce po fiksacji, choć barwienie przeprowadzone w ciągu 7 d od fiksacji daje dobre wyniki. Skrawki można przechowywać w PBS z 0,02 - 0,05% azotku sodu w przypadku barwienia wykonywanego do 90 dni i dłużej po fiksacji. Chociaż fiksacja w PFA przez noc sprawdza się w przypadku większości przeciwciał, możliwe jest, że niektóre z nich działają najlepiej przy krótszym czasie inkubacji w utrwalaczu. Fiksacja w PFA przez ponad 48 h zmniejsza dostępność antygenów i obniża szanse na udane wtórne immunobarwienie markerów neurochemicznych.
    OSTRZEŻENIE: Azotek sodu jest substancją niezwykle niebezpieczną i drażniącą w przypadku kontaktu ze skórą, oczami, połknięcia lub inhalacji. Silna ekspozycja może prowadzić do śmierci. Rakotwórczość i mutagenność tego związku nie są znane. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice, gogle ochronne, fartuch laboratoryjny i respirator przeciwpyłowy. Azotku sodu nigdy nie wolno wylewać do odpływu; należy go gromadzić jako odpady chemiczne.

2. Barwienie pierwszym przeciwciałem pierwszorzędowym i biocytyną

(Dzień 1)
UWAGA: Poniższa procedura immunobarwienia dotyczy skrawków wolnopływających i wymaga ciągłego wstrząsania z niską prędkością (2 obr./min, rpm) na wytrząsarce podczas wszystkich etapów inkubacji.

1. Przemyć tkankę 3x po 10 min każdorazowo w 0,1 M PBS (pH = 7,4).
   UWAGA: 0,1 M PBS można nabyć komercyjnie lub przygotować w laboratorium w następujący sposób (na 1 L): 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ oraz 0,24 g KH₂PO₄ w 1 L dH₂0.
   UWAGA: Jeśli znany jest pożądany marker neurochemiczny, barwienie na białko/peptyd można przeprowadzić jednocześnie z barwieniem na biocytynę (kroki 2.2 - 2.4). W przypadku barwienia wyłącznie na biocytynę, należy przejść do kroku 2.5.
2. OPCJONALNIE: Zablokować za pomocą 10% serum blokującego (BS; normalne surowica kozia (NGS) rozcieńczona w 0,3% Triton X-100 w PBS przez 1 h w RT).
   UWAGA: Każda studzienka powinna otrzymać taką samą objętość roztworu; zalecana objętość wynosi od 250 do 500 µL/studzienkę. Wybór serum blokującego opiera się na gatunku, w którym opracowano przeciwciała wtórne (np. NGS jest stosowane dla znakowanych barwnikiem przeciwciał przeciw- (odpowiedni gatunek przeciwciała pierwszorzędowego) pochodzenia koziego). Jeśli pojawi się potrzeba użycia przeciwciał wtórnych opracowanych u różnych gatunków do immunobarwienia skrawków, w kroku blokowania (2) należy uwzględnić 10% każdej normalnej surowicy, a w krokach inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi i wtórnymi 3% każdej normalnej surowicy.
3. (OPCJONALNIE) Inkubować skrawki w przeciwciałach pierwszorzędowych, CB₁R (poliklonalne, świnka morska) z 0,3% Triton X-100 oraz 3% BS w 0,1 M PBS w RT przez noc (O/N). CB₁R jest stosowane do identyfikacji ekspresji receptora kannabinoidowego typu 1.
   UWAGA: Krok ten jest opcjonalny i nie jest wymagany do uwidocznienia wypełnienia biocytyną. Rysunek 2 przedstawia skrawek znakowany na biocytynę i CB₁R podczas pierwszego procesu barwienia. Inkubacja O/N w RT jest wystarczająca dla większości przeciwciał pierwszorzędowych; jednak niektóre przeciwciała pierwszorzędowe, w tym CB₁R, wymagają inkubacji przez 3 - 5 d. Jeśli inkubacja musi trwać dłużej niż 1 d, zaleca się inkubację w 4 °C, ponieważ Triton X-100 może permeabilizować skrawki i prowadzić do dezintegracji tkanki podczas przedłużonej inkubacji w temperaturze pokojowej. W co najmniej jednym skrawku dla każdej serii eksperymentów należy uwzględnić kontrolę negatywną pozbawioną przeciwciał pierwszorzędowych jako kontrolę specyficzności przeciwciał wtórnych. W przypadku kontroli negatywnych pomija się przeciwciało pierwszorzędowe, ale dodaje 0,3% Triton X-100 w 0,1 M PBS oraz BS.

Rycina 2. Pomyślne barwienie na CCK tydzień po odzyskaniu barwienia biocytyną i znakowaniu receptora kannabinoidowego typu 1 (CB₁R)-zależnego. (A - C) Obrazy konfokalne przy 60X przedstawiające neuron wypełniony biocytyną (A) oraz immunoreaktywność CB₁R (B), wskazaną grotem strzałki. Ten sam przekrój został poddany immunobarwieniu na CCK po 1 tygodniu (C). Nałożenie obrazów pokazano w D. Immunoreaktywność CCK wykazano przy użyciu barwnika dalekiej czerwieni i została ona pseudo-pokolorowana na cyjan. (E) Rekonstrukcja morfologiczna komórki wypełnionej biocytyną z panelu A. Należy zauważyć, że barwienia na biocytynę i CB₁R są widoczne nawet po drugim immunobarwieniu na CCK. Zwróćmy również uwagę na oczekiwany rozkład wzorców immunobarwienia CB₁R i CCK. (F - H) Powiększony obraz aksonu z komórki, jak w A, pokazuje bliską kolokalizację biocytyny i CB₁R w aksonach (groty strzałek). Pasek skali: 50 µm (A - D), 100 µm (E) i 10 µm (F - H). Obrazy zostały powielone z Yu et al. 2015⁹. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

(Dzień 2)

4. Przemyć skrawki mózgu 3 razy po 10 min w 0,1 M PBS (pH = 7,4).
5. Inkubować skrawki w koniugacie streptawidyny z czerwonym barwnikiem (stężenie: 1:1 000; wzbudzenie: 594 nm z emisją w widzialnym spektrum czerwonym) z 0,3% Triton X-100 i 3% BS w 0,1 M PBS w temperaturze 4 °C przez noc (O/N) w ciemności (owinięte w folię aluminiową), aby uwidocznić biocytynę. OPCJONALNIE: Do powyższej inkubacji dodać przeciwciało wtórne, kozie anty-świnka morska (stężenie: 1:500; wzbudzenie: 488 nm i emisja w kolorze zielonym), jeśli przeprowadzono opcjonalną inkubację z przeciwciałem pierwotnym w kroku 2.3.
   UWAGA: Przeciwciało wtórne będzie potrzebne tylko w przypadku przeprowadzenia opcjonalnego barwienia przeciwciałem pierwotnym (krok 2.3). Do wizualizacji biocytyny zaleca się stosowanie koniugatu streptawidyny z fluoroforem o spektrum emisji w kolorze czerwonym, ponieważ ułatwia to szczegółową wizualizację cieńszych aksonów z lepszym kontrastem (Ryciny 1 - 3). Podczas podwójnego lub potrójnego barwienia immunocytochemicznego, aby uniknąć reaktywności krzyżowej przeciwciał wtórnych, należy dodawać je sekwencyjnie (wystarczający jest 2-godzinny  odstęp między kolejnymi dodaniami przeciwciał). Rycina 3A przedstawia wypełnioną biocytyną komórkę przetworzoną bez opcjonalnego barwienia przeciwciałem pierwotnym i obrazowaną przed ponownym skrawaniem.

Rycina 3. Udane drugie immunobarwienie po odzyskaniu morfologii biocytyny i ponownym cięciu. (A1) Obraz konfokalny skrawka o grubości 300 µm pokazujący odzyskanie morfologii dendrytycznej komórki wypełnionej biocytyną. (A2) Ślady napięcia błonowego neuronu w odpowiedzi na wstrzyknięcia prądu +500 i -100 pA. (B) Odzyskanie wypełnionego biocytyną somy w skrawku o grubości 50 µm uzyskanym po ponownym cięciu skrawka 300 µm (na A1) po zamontowaniu i obrazowaniu. (B2) Następne immunobarwienie cienkiego skrawka wykazało kolokalizację wypełnionego biocytyną somy (panel prawy) z CCK (panel środkowy). Obraz scalony przedstawiono na panelu prawym. Pasek skali: 50 µm. Panel A2 został powielony za zgodą Yu et al., w druku²⁵. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

(Dzień 3)

6. Przemyć skrawki mózgu 3x po 10 min każdy w 0,1 M PBS (pH = 7,4).
7. Aby chronić fluorescencję i ułatwić ponowne barwienie w przyszłości, zamontować skrawki w wodnym medium montażowym i zabezpieczyć krawędzie szkiełka podstawowego bezbarwnym lakierem do paznokci.
   UWAGA: Najlepiej przeprowadzić ponowne barwienie skrawków jak najszybciej, aby uniknąć trudności z usuwaniem lakieru ze szkiełka, zakażenia pleśnią oraz odwodnienia tkanki na skutek wycieku medium montażowego z preparatu.
   OSTROŻNIE: Azotek sodu jest silnie toksyczny i łatwopalny w kontakcie z wodą. Należy stosować się do standardowych procedur operacyjnych dotyczących obchodzenia się z chemikaliami niebezpiecznymi i ich utylizacji.
   (Dni 4 - 7)
8. Wykonać obrazowanie konfokalne z wzbudzeniem przy 594 i 488 nm oraz powiększeniem 20X lub 40X, aby uwidocznić neurony wypełnione biocytyną w kolorze czerwonym oraz markery neurochemiczne (CB₁R) w kolorze zielonym. Ocenić kolokalizację (Rysunek 2).
9. Ustawić czas ekspozycji kamery na mniej niż 100 ms, aby uniknąć fotoblaknięcia, i uzyskać konfokalne stosy obrazów drzew aksonalnych i dendrytycznych całego neuronu. Wykorzystać konfokalne stosy obrazów oraz pakiety oprogramowania do śledzenia neuronów w celu rekonstrukcji morfologii neuronalnej.

3. Barwienie drugim przeciwciałem pierwszorzędowym

UWAGA: Chociaż drugi etap immunobarwienia można przeprowadzić 90 d po pierwszym barwieniu, optymalne wyniki uzyskuje się, jeśli drugie barwienie przeciwciałami pierwszorzędowymi zostanie wykonane w ciągu 7 - 10 d.

(Po 7 - 90 d)

1. Nanieś aceton na patyczek higieniczny i usuń lakier do paznokci z szkiełka przedmiotowego.
2. Ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami i nanieś kilka kropli 0.1 M PBS na skrawki.
3. Ostrożnie zdejmij skrawki ze szkiełka za pomocą cienkiego pędzla malarskiego i płucz je w 0.1 M PBS przez 24 - 48 h na wytrząsarce, przykrytych folią aluminiową, w słabym świetle w temperaturze 4 ^oC.
   UWAGA: Kluczowe jest przykrycie skrawków folią aluminiową, aby uniknąć fotoblaknięcia.
4. Aby zapewnić całkowite usunięcie medium montażowego, następnego dnia wypłucz skrawki 1 - 2x w 0.1 M PBS przez 10 min każde płukanie.
5. Przystąp do inkubacji z drugim przeciwciałem pierwszorzędowym (np. cholecystokiną, neuropeptydem występującym w niektórych interneuronach GABAergicznych (CCK; stężenie: 1:1,000; mysie przeciwciało monoklonalne)) przez 1 d (Rysunek 2).
   UWAGA: Procedura ta jest podobna do kroku 2.3, ale wykorzystuje inne przeciwciało. Dodatkowo, podczas ponownego barwienia pomija się etap blokowania.
6. Wypłucz skrawki mózgu trzy razy przez 10 min każdy w 0.1 M PBS (pH = 7.4).
7. Koloruj za pomocą koniugowanego z fluorophorem przeciwciała wtórnego koziego anty-mysiego (stężenie: 1:500; długość fali wzbudzenia: 647 nm), upewniając się, że widma wzbudzenia i emisji przeciwciała wtórnego nie nakładają się na widma streptawidyny (stężenie: 1:1,000; długość fali wzbudzenia: 594 nm) oraz wcześniejszych barwień immunofluorescencyjnych.
8. Zamontuj skrawki w wodnym medium montażowym i zaklej krawędzie szkiełka nakrywkiego bezbarwnym lakierem do paznokci.
   UWAGA: Przechowuj skrawki w temperaturze 4 °C w nieprzezroczystym pudełku do przechowywania, aby chronić fluorescencję.

Wyniki

Po pomyślnym zakończeniu procedury przekroje zachowują wypełnienie biocytyną oraz immunoznakowanie wykonane w kroku 2 i mogą być obrazowane przy użyciu mikroskopii konfokalnej lub epifluorescencyjnej. Ponadto w przetworzonych przekrojach będzie widoczne barwienie immunocytochemiczne dla antygenu znakowanego podczas następnego etapu przetwarzania w kroku 3. Na przekroju przedstawionym w Rysunek 2, morfologia neuronu wypełnionego biocytyną w grubym skrawku (300 µm...

Dyskusja

Kluczowe kroki w ramach protokołu

Wypełnienie załatanej komórki biocytyną jest najważniejszym krokiem do zapewnienia pełnego odzyskania morfologii. Aby w pełni odzyskać komórkę, konieczne jest wybranie optymalnej orientacji plastrów, aby zminimalizować przerwanie procesów podczas krojenia. Ta orientacja może się różnić w zależności od badanego obwodu i typu ogniwa. Następnie ważne jest, aby zapewnić odpowiednią ilość czasu na dyfuzję biocytyny do dendrytów i aksonów. Niektóre...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl	Sigma	S7653	Barwienie immunologiczne
KCl	Fluka	60129	Barwienie immunologiczne
Na2HPO4	Sigma	S7907	Barwienie immunologiczne
KH2PO4	Sigma	229806	Barwienie immunologiczne
Triton X-100	Sigma	T8787	Immunostaining
świnka morska anty CB1	Sigma	Af530-1	Immunostaining
Mysz anti CCK	CURE, UCLA	dzięki uprzejmości G. Ohning	Immunostaining
Rabbit anty Parvalbumin	Swant	PV27	Immunostaining
Streptawidyna, Alexa Fluor sprzęgany	Sondy molekularne	S11227	Barwienie immunologiczne
Normalna surowica kozia (NGS)	Sigma	G9023	Barwienie immunologiczne
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Barwienie immunologiczne
Przeciwciała wtórne	Invitogen Sondy molekularne	Alexa Fluor Barwienie	immunologiczne
Wytrząsarka niskoobrotowa Labnet orbit	Bioexpress	S-2030-LS	Kleszczyki do barwienia immunologicznego
	Dumont	11231-30	Markery immunologiczne
	EMS	71520	Barwienie immunologiczne
Vibratome VT 1200 S	Leica	14048142066	Elektrofizjologia
Multiclamp 700B	wzmacniacz Urządzenia molekularne	Multiclamp 700B	Elektrofizjologia
pCLAMP 10 Oprogramowanie	Urządzenia molekularne	pCLAMP 10	Elektrofizjologia
Digitizer	Urządzenia molekularne	Digidata 1440 digitizer	Elektrofizjologia
Końcówki filtrów	Nalgene	171-0020	Elektrofizjologia
Sonikator	Fisher Scientific	15-335-100	Elektrofizjologia
Mikroładowarki	Eppendorf	930001007	Elektrofizjologia
Biocytin	Sigma	B4261	Elektrofizjologia