Pomiar rozkładu wielkości cząstek w mętnych roztworach za pomocą mikroskopii dynamicznego rozpraszania światła

Podsumowanie

Przedstawiono protokół bezpośredniego pomiaru rozkładu wielkości cząstek w stężonych roztworach za pomocą dynamicznej mikroskopii rozpraszania światła.

Streszczenie

Opisano protokół pomiaru polidyspersyjności skoncentrowanych roztworów polimerowych za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Dynamiczne rozpraszanie światła to technika stosowana do pomiaru rozkładu wielkości roztworów polimerowych lub cząstek koloidalnych. Chociaż technika ta jest szeroko stosowana do oceny roztworów polimerowych, trudno jest zmierzyć wielkość cząstek w stężonych roztworach ze względu na efekt wielokrotnego rozpraszania lub silną absorpcję światła. Dlatego stężone roztwory należy rozcieńczyć przed pomiarem. Zastosowanie konfokalnego komponentu optycznego w mikroskopie dynamicznego rozpraszania światła¹ pomaga przezwyciężyć tę barierę. Korzystając z takiego mikroskopijnego systemu, zarówno przezroczyste, jak i mętne systemy mogą być analizowane w tym samym układzie eksperymentalnym bez rozcieńczania. Jako reprezentatywny przykład przeprowadzono pomiar rozkładu wielkości roztworu polimerowego reagującego na temperaturę. Rozmiary łańcuchów polimerowych w roztworze wodnym wynosiły kilkadziesiąt nanometrów w temperaturze poniżej dolnej temperatury roztworu krytycznego (LCST). W przeciwieństwie do tego, rozmiary wzrosły do ponad 1,0 μm, gdy były powyżej LCST. Wynik ten jest zgodny z obserwacją, że roztwór stał się mętny powyżej LCST.

Wprowadzenie

Wielkość cząstek jest jedną z najbardziej podstawowych właściwości roztworów koloidalnych i polimerowych. Do pomiaru wielkości cząstek stosuje się wiele technik. Cząstki o wielkości 1,0 μm lub większej można mierzyć bezpośrednio za pomocą mikroskopu optycznego. W przypadku mniejszych cząstek stosuje się techniki alternatywne, takie jak dyfrakcja laserowa, mikroskopia elektronowa lub mikroskopia sił atomowych^2,3. Dynamiczne rozpraszanie światła jest powszechnie stosowaną techniką pomiaru rozkładu wielkości cząstek w roztworach⁴. Wyniki uzyskane przy użyciu tej techniki nie pochodzą z obrazów cząstek, ale z charakterystycznego czasu fluktuacji natężenia światła rozproszonego. Fluktuacje te wywodzą się z ruchu Browna, który charakteryzuje się stałą dyfuzji. Rozkład wielkości uzyskuje się z rozkładu stałych dyfuzji za pomocą równania Einsteina-Stokesa. Ze względu na swoją prostotę, dynamiczne rozpraszanie światła jest szeroko stosowane do rutynowej oceny roztworów, takich jak farby i koloidy spożywcze.

Wstępna obróbka jest wymagana dla większości technik używanych do pomiaru wielkości cząstek w próbkach roztworu. W przypadku mikroskopii elektronowej i mikroskopii sił atomowych próbka musi być analizowana w warunkach próżni. W związku z tym trudno jest obserwować próbki w ich rodzimych formach. Ponadto w przypadku dyfrakcji laserowej i dynamicznego rozpraszania światła można mierzyć tylko rozcieńczone próbki, które są wolne od wielokrotnego rozpraszania i absorpcji światła. Aby przezwyciężyć tę trudność, zaproponowano kilka nowych technik pomiaru dynamicznego rozpraszania światła z nierozcieńczonych, skoncentrowanych roztworów, takich jak spektroskopia korelacji krzyżowej^5,6, dynamiczne rozpraszanie światła o niskiej koherencji^7,8, spektroskopia fal dyfuzyjnych^9,10 i różnicowa mikroskopia dynamiczna^11,12.

Opracowaliśmy nowe urządzenie zwane dynamicznym mikroskopem rozpraszania światła¹. Aparatura ta umożliwia pomiar mętnych próbek bez rozcieńczania za pomocą konfokalnego układu optycznego, w którym wielokrotne rozpraszanie jest eliminowane za pomocą otworu otworkowego. Jednak procedura pomiaru i analiza danych są nieco bardziej skomplikowane niż w przypadku przyrządów dostępnych na rynku. Ten film wyjaśnia szczegółowo procedurę pomiaru i analizę danych na przykładzie analizy reagującego na temperaturę polimeru, poli(N-izopropyloakrylamidu).

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Oczyszczanie monomerów reagujących na temperaturę
   1. Rozpuścić 20 g N-izopropyloakrylamidu (NIPA) w 100 ml toluenu.
   2. Przefiltruj roztwór pod odsysaniem, aby wyeliminować kurz.
   3. Wymieszać filtrat z 500 ml eteru naftowego.
   4. Umieścić naczynie reakcyjne w łaźni lodowato-wodnej.
   5. Mieszać roztwór, aż monomery się wytrącą (zwykle 30 min).
   6. Przefiltrować roztwór pod zasysaniem, aby uzyskać wytrącone monomery.
   7. Suszyć monomery pod zmniejszonym ciśnieniem (100 Pa) przez noc.
2. Przygotowanie roztworu polimeru reagującego na temperaturę
   1. Odgazuj 20 ml wody dejonizowanej przez 1,0 min za pomocą pompy membranowej.
   2. Rozpuścić 780,8 mg oczyszczonego NIPA w 9,5 ml odgazowanej i zdejonizowanej wody.
   3. Umieścić naczynie reakcyjne w łaźni lodowato-wodnej.
   4. Chroń reakcję przed światłem, przykrywając aparat folią aluminiową.
   5. Delikatnie mieszać roztwór przez 10 minut, delikatnie wprowadzając umiarkowany przepływ gazu Ar za pomocą końcówki pipety przymocowanej do butli z gazem za pomocą rurki.
   6. Dodać 11,9 μl N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy do roztworu za pomocą mikropipety.
   7. Mieszać roztwór przez 1,0 minuty, wprowadzając gaz Ar, jak wspomniano w kroku 1.2.5.
   8. Mieszając próbkę, rozpuścić 4,0 mg nadsiarczanu amonu w 0,5 ml odgazowanej i zdejonizowanej wody.
   9. Zmieszać roztwór próbki (z etapu 1.2.7) i roztwór nadsiarczanu amonu (z etapu 1.2.8).
   10. Mieszać roztwór przez 30 sekund, wprowadzając gaz Ar, jak wspomniano w kroku 1.2.5.
   11. Przykryj roztwór folią aluminiową i przechowuj go w lodówce (4 °C) przez noc.
3. Przygotowanie próbnych mocowań
   1. Umieścić 60 μl roztworu próbki (z etapu 1.2.11) w szkiełku do wnęki.
   2. Przykryj roztwór okrągłym szkłem nakrywkowym. Uważaj, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza.
   3. Usunąć nadmiar roztworu za pomocą mikropipety i chusteczek laboratoryjnych.
   4. Uszczelnij próbkę klejem. Pozostaw klej do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (zwykle 6 godzin).
   5. Przygotować kolejne szkiełko wypełnione zawiesiną lateksu polistyrenowego o stężeniu 0,1% wag. (średnica cząstek 100 nm), wykonując czynności 1.3.1-1.3.4. Ta prowadnica jest używana jako standard.

2. Pomiar wielkości cząstek za pomocą dynamicznego mikroskopu rozpraszania światła

1. Optymalizacja instrumentu
   1. Umieść polistyrenowy lateksowy szkiełko do zawieszania (od kroku 1.3.5) na stoliku mikroskopu odwróconego. Strona ze szkłem nakrywkowym powinna być skierowana w dół.
   2. Umieść tłumik wiązki przed detektorem (fotodioda lawinowa i autokorelator).
   3. Przyłożyć wiązkę laserową (laser na ciele stałym, λ = 488 nm, 30 mW, fala ciągła) do próbki przez soczewkę obiektywu (10×). Część odbitego światła przechodzi przez zwierciadło startowe mikroskopu i jest obserwowana przez kamerę CCD zamontowaną w bocznym porcie mikroskopu (ryc. 1).
   4. Dostosuj wysokość soczewki obiektywu, aby ustawić ogniskową na zawieszeniu próbki, przesuwając wysokość soczewki obiektywu z pozycji niskiej do wysokiej. Podczas tej procedury odbity obraz jest ogniskowany trzykrotnie: na powierzchni szkła nakrywkowego, na granicy faz między szkłem nakrywkowym a próbką oraz na granicy faz między próbką a szkłem z otworem. Ustaw punkt centralny między drugim a trzecim punktem.
   5. Osłabij natężenie rozproszonego światła, zmieniając moc lasera.
   6. Wprowadź rozproszone światło do detektora, zdejmując tłumik wiązki znajdujący się przed detektorem. To urządzenie mierzy korelację czasową natężenia światła.
   7. Ustaw otwór otworkowy (φ = 50 μm) między mikroskopem a detektorem, aby uzyskać efekt konfokalny. Dostosuj położenie otworka, aby zmaksymalizować natężenie światła na detektorze.
   8. Zmierz funkcję korelacji czasowej natężenia światła rozproszonego przez 30 s, inicjując działanie korelatora za pomocą komputera. Zmierzona funkcja korelacji jest często wyrażana jako g⁽²⁾ (t) - 1, gdzie t jest czasem korelacji⁴ i . Tutaj I(t) jest natężeniem światła rozproszonego w czasie t, a (•••)_T jest uśrednieniem czasu. Czas zaniku wyniesie około 0,1 ms.
   9. Dostosuj ogniskową, aby uzyskać szeroki zakres początkowej amplitudy funkcji korelacji czasu (g⁽²⁾ (t = 0) - 1).
      UWAGA: Na początkową amplitudę duży wpływ ma ilość odbitego światła. Przesuwając ogniskową w kierunku granicy faz między szkłem nakrywkowym a próbką, zwiększa się ilość odbitego światła. W przypadku silnych rozpraszaczy światła, takich jak lateks polistyrenowy, początkową amplitudę można zmienić z 0 na 1. Jednak trudno jest ustawić początkową amplitudę blisko 1 dla bardziej powszechnych roztworów polimerowych, ponieważ intensywność światła odbitego jest znacznie wyższa niż światła rozproszonego.
   10. Zastosuj odwrotną transformację Laplace'a (przy użyciu programu do regularyzacji z ograniczeniami CONTIN^13,14) do uzyskanej funkcji korelacji czasowej, aby uzyskać funkcję rozkładu wielkości. W przypadkach, gdy amplituda początkowa jest ustawiona na mniej niż 0,2, funkcja rozkładu promienia hydrodynamicznego pokaże ostry pik około 100 nm, co stanowi dwukrotność rzeczywistego promienia (szczegóły w dyskusji).
2. Pomiar próbki
   1. Ustaw stage temperatura na 25 °C.
   2. Umieścić szkiełko przygotowane z roztworem poli-NIPA (PNIPA) (krok 1.3.4) na stoliku mikroskopu.
   3. Zmierz funkcję korelacji czasowej natężenia światła rozproszonego, wykonując czynności 2.1.4-2.1.8. Jeśli amplituda początkowa jest większa niż 0,2, wyreguluj ogniskową tak, aby początkowa amplituda funkcji korelacji czasowej była mniejsza niż 0,2, wykonując krok 2.1.9. Mała amplituda początkowa upraszcza analizę.
   4. Ustaw temperaturę stage na 35 °C i poczekaj, aż roztwór stanie się mętny. Dolna temperatura krytyczna roztworu (LCST) roztworu PNIPA wynosi 32 °C¹⁵.
   5. Zmierz funkcję korelacji czasu, wykonując kroki 2.1.4-2.1.8. Jeśli to możliwe, dostosuj położenie ogniska tak, aby początkowa amplituda funkcji korelacji czasu była mniejsza niż 0,2. W przypadku mętnych roztworów ich początkowe amplitudy mają tendencję do zwiększania, ponieważ intensywność rozproszonego światła wzrasta, podczas gdy intensywność światła odbitego pozostaje stała.
   6. Zastosuj odwrotną transformację Laplace'a do uzyskanych funkcji korelacji czasowej, aby uzyskać funkcje rozkładu rozmiaru. Należy pamiętać, że rzeczywisty rozmiar jest połową uzyskanej wartości w przypadkach, gdy amplituda początkowa jest mniejsza niż 0,2.

Wyniki

Funkcje korelacji czasowej natężenia rozproszonego światła dla zawiesiny lateksowej polistyrenu (promień cząstek: 50 nm) zostały zmierzone w różnych punktach ogniskowych, jak pokazano na rysunku 2(a). Te funkcje korelacji zostały przekształcone w funkcje rozkładu promienia hydrodynamicznego przez odwrotną transformację Laplace'a (patrz rysunek 2(b) i (c)). Stosując tę samą procedurę, uzyskano funkcje korelacji czasowej i funkcje rozkładu promienia hydrodynamicznego roztworu PNIPA odpowiednio w temperaturze 25 °C i 35 °C. Rysunki 3 a) i b) pokazują funkcje korelacji czasowej natężenia światła rozproszonego i odpowiadające im funkcje rozkładu wielkości roztworu PNIPA poniżej (25 °C) i powyżej (35 °C) LCST. Funkcje rozkładu wielkości uzyskano za pomocą odwrotnej transformacji Laplace'a, po której nastąpiła poprawka częściowej heterodyny. Średni promień hydrodynamiczny poniżej LCST wynosi kilkadziesiąt nanometrów, co jest typowe dla roztworów polimerowych. Natomiast promień hydrodynamiczny powyżej LCST wynosi około 1,0 μm. Wynik ten jest zgodny z faktem, że roztwór jest mętny powyżej LCST. Czerwone i niebieskie linie na rysunku 3 reprezentują rozkład wielkości roztworów PNIPA otrzymanych odpowiednio bezpośrednio po i 20 minut po zmętnieniu roztworu. Rysunek 3 lit. b) wyraźnie wskazuje na wzrost agregacji.

Rysunek 1. Schemat mikroskopu dynamicznego rozpraszania światła. Światłowód otworkowy (PH), rozdzielacz wiązki (BS), polaryzator (Pol) i fotodioda lawinowa (APD). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki dla zawiesiny polistyrenowo-lateksowej. a) Funkcje korelacji czasowej natężenia światła rozproszonego dla zawiesiny lateksowej polistyrenu. Promień nominalny wynosi 50 nm, a stężenie 0,1% wag. Uzyskano dwa zestawy danych z różnych punktów rozpraszania. b), c) odpowiednie funkcje rozkładu wielkości zawiesiny lateksu polistyrenowego otrzymanej przez odwrotną transformację Laplace'a (a). Czerwona linia odpowiada funkcji korelacji czasowej, której amplituda początkowa wynosi około 1,0, a niebieska linia odpowiada tej o amplitudzie początkowej wynoszącej około 0,2. Oś poziomą obliczono bez (b) i z (c) z uwzględnieniem wpływu częściowej heterodyny (PHD), gdy A << 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki dla roztworu PNIPA. a) Funkcje korelacji czasowej natężenia światła rozproszonego dla roztworu PNIPA. (b) Odpowiednie funkcje rozkładu wielkości dla roztworu PNIPA otrzymanego przez odwrotną transformację Laplace'a (a). Oś pozioma została obliczona z uwzględnieniem wpływu częściowej heterodyny dla każdego zbioru danych. linia przedstawia dane uzyskane w temperaturze 25 °C. Czerwona linia reprezentuje dane uzyskane tuż po tym, jak roztwór stał się mętny (35 °C). Niebieska linia reprezentuje dane uzyskane po 20-minutowym pomiarze czerwonej linii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Początkowa amplituda funkcji korelacji czasowej w dużym stopniu zależy od punktu ogniskowego, jak pokazano na rysunku 2(a). Wydaje się to przeczyć faktowi, że rozwiązanie jest jednorodne (z wyjątkiem cienkiej warstwy na styku)⁸. Ta zmiana początkowej amplitudy jest przypisywana zmianie ilości odbitego światła. Teoria częściowej heterodyny¹⁶ przewiduje, że początkowa amplituda A, natężenie światła rozproszonego I_s i natężenie światła odbitego I_r spełniają następujące równanie¹

Równanie to pokazuje, że im większy staje się I_r, tym mniejsze staje się A. W związku z tym A jest zmniejszane przez ustawienie pozycji ogniskowej blisko interfejsu. Stałą dyfuzji _{pozornej D A} można uzyskać przez dopasowanie funkcji korelacji czasowej w przypadku roztworów monodyspersyjnych:

gdzie: . Tutaj n jest współczynnikiem załamania rozpuszczalnika (woda, 1,33), θ jest kątem rozproszenia (180°), a λ jest długością fali światła (514,5 nm). Ponieważ zastosowaliśmy geometrię rozpraszania wstecznego, wartość q jest stała. Jednak ten punkt można rozwiązać za pomocą różnych długości fal światła. Należy pamiętać, że do budowy mikroskopu DLS dostępne jest każde źródło lasera o fali ciągłej. Ze względu na małą objętość napromieniowanego współczynnika koherencji¹⁷ szacuje się na ponad 0,99 i jest on pomijalny. W przypadku roztworów polidyspersyjnych funkcję rozkładu _{D A} uzyskuje się przez odwrotną transformację Laplace'a. Teoria częściowej heterodyny przewiduje również, że _{D A} nie jest tym samym, co rzeczywista stała dyfuzji D. Te dwie stałe dyfuzji spełniają następujące równanie:

Stała dyfuzji D jest przekształcana na promień hydrodynamiczny R_h za pomocą równania Einsteina-Stokesa⁴. Gdy A = 1, ta zależność staje się _{D A} = D. W tym przypadku proces konwersji danych jest taki sam, jak w przypadku powszechnego dynamicznego rozpraszania światła. Czerwona linia pokazana na rysunku 2(b) odpowiada temu przypadkowi. Natomiast zależność ta staje się _{D A} = 0,5D na granicy A → 0. W związku z tym szacuje się, że rozmiar jest dwa razy większy niż rzeczywisty rozmiar, gdy A jest mały (praktycznie mniej niż 0,2), jak pokazano na niebieskiej linii na rysunku 2(b). Jeśli wiemy, że A jest znacznie mała, oś pozioma może zostać przesunięta, jak pokazano na rysunku 2(c). W zasadzie możemy przekonwertować _{D A} na D dla dowolnej wartości A. W praktyce jednak lepiej jest ustawić amplitudę początkową mniejszą niż 0,2, ponieważ sprawdza się proste przybliżenie D_A ∼ 0,5D.

Wyróżniające się cechy techniki mikroskopu dynamicznego rozpraszania światła zademonstrowano przy użyciu roztworu PNIPA. Konformacja PNIPA poniżej i powyżej LCST była szeroko badana przy użyciu rozpraszania neutronów pod małymi kątami^15,18. W przeciwieństwie do tego, dynamiczne rozpraszanie światła nie zostało wykorzystane do analizy PNIPA powyżej LCST ze względu na jego zmętnienie¹⁹. Problem ten rozwiązuje mikroskop dynamicznego rozpraszania światła, jak pokazano na rysunkach 3(a) i (b). Wielkość tych agregatów wynosi kilka μm, czego nie można uzyskać ani za pomocą rozpraszania promieniowania rentgenowskiego/neutronów pod małymi kątami, ani konwencjonalnych technik rozpraszania światła. Pomiary czasowo-rozdzielcze za pomocą tego systemu dostarczają informacji na temat procesu agregacji podczas zmiany temperatury.

Wadę mikroskopu dynamicznego rozpraszania światła zilustrowano również na rysunku 3. W przypadku wyniku poniżej LCST, na funkcję korelacji czasowej duży wpływ ma bardzo mała ilość obecnego pyłu (czarne linie na rysunku 3). Na przykład funkcja korelacji czasowej nie zanika całkowicie, nawet przy czasach korelacji rzędu 1,0 s. Dzieje się tak dlatego, że objętość napromieniowana tym aparatem (około 1,0 μm) jest znacznie mniejsza niż napromieniowana zwykłym aparatem do dynamicznego rozpraszania światła (około 100 μm). W przypadkach, gdy natężenie rozproszonego światła jest słabe, sygnał jest przesłonięty przez szum, taki jak ten spowodowany niewielkimi ilościami pyłu w roztworze. W związku z tym trzy piki pokazane na rysunku 3(b) mogą nie mieć znaczenia ilościowego, chociaż ogólny porządek wielkości jest znaczący. Zauważ, że taki słaby rozpraszacz może być zmierzony przez konwencjonalny aparat do dynamicznego rozpraszania światła.

Wykazaliśmy, że mikroskop dynamicznego rozpraszania światła umożliwia nam pomiar zarówno przezroczystych, jak i mętnych próbek przy użyciu tej samej konfiguracji. Ponieważ długość ścieżki optycznej w próbkach jest krótka, technikę tę można zastosować do silnych próbek pochłaniających światło, takich jak zawiesiny nanorurek węglowych²⁰. Ponadto, ze względu na wysoką rozdzielczość przestrzenną, technika ta może być stosowana do komórek biologicznych. Ze względu na zastosowanie w biologii, metoda ta może być również łączona z innymi technikami obrazowania, takimi jak obrazowanie fluorescencyjne i ramanowskie. Dlatego uważamy, że mikroskop dynamicznego rozpraszania światła jest potężnym narzędziem w szerokim zakresie dziedzin badawczych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
N-izopropylokrylakamid, 98%	Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.	I0401
toluen, 99%	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	201-01876
Eter naftowy, temperatura destylacji 30 ~ 60 ° C	Wako Pure Chemical Industries, Sp. z o.o.	169-22565
N,N,N',N',-tetrametyloetylenodiamina, 99%	Sigma	T9281
nadsiarczan amonu, 98%	Sigma	248614
zawiesina lateksowa polistyrenu, 1 wt%	Scientific Corporation	3500A
argon	Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.		czystość > 99,999 % obj.
szkiełko wnękowe	Matsunami Glass Ind., Ltd.	83-0336
odwrócony	Nikon Instech Co., Ltd.	ECLIPSE Ti-U
Thermo Plate	Tokai Hit CO., Ltd	TP-108R-C
Laser półprzewodnikowy	Koherentny	OBIS 488LX
fotodioda lawinowa	ALV-GmbH	ALV-High Q.E. Lawinowy
	ALV-GmbH	ALV-5000/EPP