Larwa Drosophila to potężny system modelowy do badania neuronalnej kontroli zachowania. Publikacja ta opisuje zastosowanie liniowych kanałów agarozowych do wywoływania długotrwałych napadów liniowego pełzania oraz metody ilościowego określania dynamiki struktur larwalnych podczas powtarzających się zachowań pełzania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie liniowych kanałów agarozowych do badania pełzania larw Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pełzanie larw Drosophila staje się potężnym modelem do badania neuronalnej kontroli zachowań sensomotorycznych. Jednak pełzanie larw po płaskich, otwartych powierzchniach jest złożone, obejmujące: zatrzymywanie się, skręcanie i meandrowanie. Ta złożoność repertuaru ruchu utrudnia szczegółową analizę zdarzeń zachodzących podczas pojedynczego cyklu kroku kraulowego. Aby pokonać tę przeszkodę, stworzono liniowe kanały agarozowe, które ograniczają zachowanie larw do prostego, ciągłego, rytmicznego pełzania. Zasadniczo, ponieważ zarówno kanały agarozowe, jak i ciało larwalne Drosophila są optycznie czyste, ruch struktur larwalnych znakowanych przez genetycznie kodowane sondy fluorescencyjne może być monitorowany w nienaruszonych, swobodnie poruszających się larwach. W przeszłości larwy umieszczano w kanałach liniowych i analizowano pełzanie na poziomie całego organizmu, segmentu i mięśni1. W przyszłości larwy pełzające w kanałach mogą być wykorzystywane do obrazowania wapnia w celu monitorowania aktywności neuronalnej. Co więcej, metody te mogą być stosowane w przypadku larw o dowolnym genotypie i w dowolnym kanale zaprojektowanym przez badaczy. W związku z tym przedstawiony poniżej protokół ma szerokie zastosowanie w badaniach z wykorzystaniem larwy Drosophila jako modelu do zrozumienia kontroli motorycznej.
Wprowadzenie
Ogólnym celem tej metody jest szczegółowe zbadanie pełzania larw Drosophila. Eksperymenty nad lokomocją, odegrały ważną rolę w opracowywaniu i testowaniu teorii kontroli motorycznej2. Tradycyjnie lokomocja była badana u zwierząt wodnych (np. pijawki, minoga, kijanki)3. Powtarzalność lokomocji u tych zwierząt pozwoliła na badanie rytmogenezy, analizę zdarzeń biofizycznych napędzających lokomocję oraz monitorowanie wzorców odpalania neuronów, które towarzyszą lokomocji.
Wykorzystanie larw Drosophila do badań lokomocji prezentuje unikalną kombinację zalet w porównaniu z innymi systemami modelowy....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie larw
- Na tydzień przed nagraniem zachowania ustaw krzyżówkę (minimum 25 dziewic i 5 samców). Utrzymywać wszystkie krzyżówki i potomstwo w temperaturze 25 °C.
UWAGA: Temperatura warunków hodowli może ulec zmianie, ale opisana poniżej linia czasowa musiałaby zostać dostosowana, aby uwzględnić zmiany w szybkości rozwoju. - 5 dni przed nagraniem, z samego rana, umieść krzyż w klatce zbiorczej z nakrętką na agar/sok i odrobiną (0,5-1 ml) pasty drożdżowej na środku nasadki agarowej/soku.
- Aby zrobić klatkę zbiorczą, wbij otwory w kwadratową butelkę Drosophila o pojemności 6 uncji polietylenu.
- Aby zrob....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy artykuł opisuje metodę sterowania zachowaniem larw Drosophila za pomocą kanałów agarozowych oraz pomiaru dynamiki struktur larwalnych w trakcie cyklu pełzania. Larwy w kanałach liniowych wykazują przedłużone serie rytmicznego pełzania (Rysunek 3). Ponieważ zarówno larwy, jak i kanały są optycznie przejrzyste, kanały te można wykorzystać z larwami wykazującymi ekspresję sond fluorescencyjnych w dowolnej interesującej strukturze. Rejestrowaliśmy larwy z e.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zbudowano urządzenie mikroprzepływowe do tworzenia liniowych kanałów agarozowych, które mogą pomieścić larwy Drosophila (ryc. 1). Kiedy larwy Drosophila są umieszczane w tych liniowych kanałach agarozowych, ich repertuar behawioralny ogranicza się do pełzania, co pozwala na szczegółową obserwację dynamiki struktur larwalnych w cyklu pełzania.
Udane nagranie ma miejsce, gdy larwa wykonuje serię rytmicznych kroków (ryc. 3). Jeśli tak się nie st.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Chrisowi Wredenowi i Michelle Bland za komentarze do manuskryptu i za pomoc techniczną.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 6 uncji kwadratowa butelka Drosophila | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sacharoza | sigma | S9378 | |
| sok | nie z koncentratu | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | p-hydroksybenzoesan metylu |
| 35 x 10 mm okrągła szalka Petriego | Fisher | 351008 | |
| Drożdże | |||
| PDMS forma odlewnicza | FlowJem | można zamówić u autorów | |
| Alkohol izopropylowy | Chusteczki | A417-1 | |
| Fisher | 06-666-11 | ||
| powietrze w puszce | Fisher | 18-431 | |
| Szalka Petriego 10 cm | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agaroza | Fisher | 50-444-176 | |
| żyletka | Fisher | 12-640 | |
| kleszcze | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 szkło osłonowe, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fidżi (wersja 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
Bibliografia
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Marder, E., Calabrese, R. L. Principles of rhythmic....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
