Wykorzystanie liniowych kanałów agarozowych do badania pełzania larw Drosophila

Podsumowanie

Larwa Drosophila to potężny system modelowy do badania neuronalnej kontroli zachowania. Publikacja ta opisuje zastosowanie liniowych kanałów agarozowych do wywoływania długotrwałych napadów liniowego pełzania oraz metody ilościowego określania dynamiki struktur larwalnych podczas powtarzających się zachowań pełzania.

Streszczenie

Pełzanie larw Drosophila staje się potężnym modelem do badania neuronalnej kontroli zachowań sensomotorycznych. Jednak pełzanie larw po płaskich, otwartych powierzchniach jest złożone, obejmujące: zatrzymywanie się, skręcanie i meandrowanie. Ta złożoność repertuaru ruchu utrudnia szczegółową analizę zdarzeń zachodzących podczas pojedynczego cyklu kroku kraulowego. Aby pokonać tę przeszkodę, stworzono liniowe kanały agarozowe, które ograniczają zachowanie larw do prostego, ciągłego, rytmicznego pełzania. Zasadniczo, ponieważ zarówno kanały agarozowe, jak i ciało larwalne Drosophila są optycznie czyste, ruch struktur larwalnych znakowanych przez genetycznie kodowane sondy fluorescencyjne może być monitorowany w nienaruszonych, swobodnie poruszających się larwach. W przeszłości larwy umieszczano w kanałach liniowych i analizowano pełzanie na poziomie całego organizmu, segmentu i mięśni¹. W przyszłości larwy pełzające w kanałach mogą być wykorzystywane do obrazowania wapnia w celu monitorowania aktywności neuronalnej. Co więcej, metody te mogą być stosowane w przypadku larw o dowolnym genotypie i w dowolnym kanale zaprojektowanym przez badaczy. W związku z tym przedstawiony poniżej protokół ma szerokie zastosowanie w badaniach z wykorzystaniem larwy Drosophila jako modelu do zrozumienia kontroli motorycznej.

Wprowadzenie

Ogólnym celem tej metody jest szczegółowe zbadanie pełzania larw Drosophila. Eksperymenty nad lokomocją, odegrały ważną rolę w opracowywaniu i testowaniu teorii kontroli motorycznej². Tradycyjnie lokomocja była badana u zwierząt wodnych (np. pijawki, minoga, kijanki)³. Powtarzalność lokomocji u tych zwierząt pozwoliła na badanie rytmogenezy, analizę zdarzeń biofizycznych napędzających lokomocję oraz monitorowanie wzorców odpalania neuronów, które towarzyszą lokomocji.

Wykorzystanie larw Drosophila do badań lokomocji prezentuje unikalną kombinację zalet w porównaniu z innymi systemami modelowymi: łatwa genetyka, dobrze scharakteryzowany rozwój, ciało, które jest optycznie czyste w pierwszym i drugim stadium rozwoju, oraz trwająca transmisyjna mikroskopijna mikroskopowa rekonstrukcja całego układu nerwowego^4-6. Jednak poruszanie się larw Drosophila na płaskich, otwartych powierzchniach jest nieco złożone, obejmuje przerwy, skręty i meandrujące pełzanie⁷. W niniejszej publikacji przedstawiono metodę wykorzystania liniowych kanałów agarozowych do kierowania zachowaniami lokomotorycznymi larw Drosophila w taki sposób, aby larwy wykonywały trwałe, proste, rytmiczne pełzanie.

Badanie zachowania larw Drosophila w kanałach agarozowych, zamiast zachowania na płaskich, otwartych powierzchniach, ma kilka zalet. Po pierwsze, pozwala naukowcom na konkretny wybór zachowań pełzających spośród wielu ruchów, które są częścią repertuaru zachowań larw. Po drugie, dostosowując szerokość kanału w stosunku do wielkości ciała larwy, można dostosować prędkość pełzania. Po trzecie, kanały pozwalają na oglądanie larwy od strony grzbietowej, brzusznej lub bocznej, w zależności od tego, jak larwa jest załadowana i zorientowana w kanale. Ta wszechstronność w orientacji larw pozwala na to, aby każda struktura będąca przedmiotem zainteresowania była stale widoczna podczas pełzania. Po czwarte, kanały można stosować z szeroką gamą mikroskopów i obiektywów. Na przykład kanały liniowe mogą być używane do obrazowania o niskiej rozdzielczości na stereoskopach jasnego pola i/lub do obrazowania o wysokiej rozdzielczości w mikroskopach konfokalnych z wirującym dyskiem¹. Po piąte, metoda ta może być stosowana w połączeniu z optogenetycznymi/termogenetycznymi manipulacjami neuronalnymi w dowolnym tle genetycznym. Wreszcie, ponieważ zarówno ciało larwalne (w pierwszym i drugim stadium rozwoju), jak i kanały agarozowe są optycznie czyste, kanały mogą być wykorzystywane do badania ruchów dynamicznych lub zmian intensywności fluorescencji struktur larwalnych znakowanych przez genetycznie kodowane sondy fluorescencyjne.

Opisana metoda jest odpowiednia do szczegółowych badań kinematycznych zachowania larw Drosophila w pierwszym i drugim stadium rozwojowym. W niniejszej publikacji przeanalizowano dynamiczne zmiany intensywności fluorescencji OUN podczas pełzania larw do przodu, aby zademonstrować wykorzystanie kanałów i jako prekursora neuronalnego obrazowania wapnia.

Protokół

1. Przygotowanie larw

1. Na tydzień przed nagraniem zachowania ustaw krzyżówkę (minimum 25 dziewic i 5 samców). Utrzymywać wszystkie krzyżówki i potomstwo w temperaturze 25 °C.
   UWAGA: Temperatura warunków hodowli może ulec zmianie, ale opisana poniżej linia czasowa musiałaby zostać dostosowana, aby uwzględnić zmiany w szybkości rozwoju.
2. 5 dni przed nagraniem, z samego rana, umieść krzyż w klatce zbiorczej z nakrętką na agar/sok i odrobiną (0,5-1 ml) pasty drożdżowej na środku nasadki agarowej/soku.
   1. Aby zrobić klatkę zbiorczą, wbij otwory w kwadratową butelkę Drosophila o pojemności 6 uncji
   polietylenu.
   2. Aby zrobić nakrętki agarowe/sokowe, wymieszaj 18 g agaru z 600 ml wody w kolbie stożkowej. W osobnej kolbie wymieszać 20 g sacharozy z 200 ml soku jabłkowego. Kuchenka mikrofalowa aż do rozpuszczenia ciał stałych. Połączyć i wymieszać, pozwalając mieszaninie ostygnąć do temperatury 60 °C. Dodać 20 ml 10% p-hydroksybenzoesanu metylu w 95% etanolu i wymieszać. Dodać ~7 ml do dolnej połowy okrągłej szalki Petriego o wymiarach 35 x 10 mm. Pozostawić agar/sok do zestalenia się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   3. Aby zrobić pastę drożdżową, dodaj równe części objętości suchych drożdży i wody. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Sprawdź stan zdrowia kolekcji larwalnych.
   1. Rano, 4 i 3 dni przed nagraniem, zdejmij nakrętkę i umieść nową nakrętkę na klatce. Zmieniaj czapki o tej samej porze każdego dnia, aby uzyskać 24-godzinną kolekcję jaj i nowo wyklutych larw.
   2. Po zdjęciu każdej nasadki zbadaj ją, aby zobaczyć, ile jaj składa krzyżówka. Spodziewaj się od 500 do 2,000 jaj. W razie potrzeby dostosuj liczbę osób dorosłych.
      UWAGA: Z kilku jaj powinny wykluć się larwy, a nowo wyklute larwy zostaną znalezione z dala od pasty drożdżowej.
   3. Starzej każdą czapkę przez 24 godziny. Ponownie zbadaj kapelusz, aby ustalić, czy larwy są zdrowe.
      UWAGA: Z większości jaj powinny wykluć się larwy, a larwy powinny wpełznąć do pasty drożdżowej. Oznaki złego stanu zdrowia obejmują dużą liczbę niewyklutych jaj, martwe ciała larwalne z dala od pasty drożdżowej oraz larwy ze znacznymi ciemnymi plamami w jamie brzusznej, wskazujące na reakcję immunologiczną. Jeśli larwy są niezdrowe, zmień klatkę, przygotuj świeże nakrętki/pastę drożdżową i sprawdź genotyp.
   4. Wyrzuć stare nakrętki.
4. Zbieraj larwy do nagrań behawioralnych.
   1. Zarówno na 2, jak i 1 dzień przed nagraniem zdejmij nasadkę i zastąp ją nową.
   2. Oznaczyć każdą zdjętą nakrętkę i przechowywać w temperaturze 25 °C. W ten sposób powstanie zainscenizowana seria larw do nagrań behawioralnych. W kanałach można stosować larwy od nowo wyklutych (0-4 godziny po wykluciu) do drugiego stadium rozwojowego (24-48 godzin po wykluciu). Zachowaj wersaliki dla nagrań w kolejnych dniach.
   3. Wyrzuć wszystkie nakrętki po 48 godzinach.
   4. W razie potrzeby powtórz kroki 1.4.1-1.4.3 dla maksymalnie 5 dodatkowych d. Po tym czasie produkowanych jest mniej zapłodnionych jaj.

2. Przygotowanie kanałów

1. Przygotować formę odlewniczą PDMS (polidimetylosiloksan, elastomer silikonowy) z kanałem liniowym (rysunek 1A). Formy odlewnicze PDMS są dostępne w laboratorium Heckscher na życzenie.
   1. Oczyść formę odlewaną alkoholem izopropylowym. Wysuszyć na powietrzu, osuszyć chusteczkami laboratoryjnymi lub użyć powietrza z puszki.
   2. Umieść formę odlewniczą w pokrywie na szalkę Petriego o średnicy 10 cm lub innym pojemniku.
2. Przygotuj i wlej roztwór agarozy.
   1. Przygotuj 3% roztwór agarozy w wodzie (3 g w 100 ml), podgrzewając w kuchence mikrofalowej, aż do całkowitego rozpuszczenia.
   2. Schłodzić do temperatury 55 °C, pozwalając pęcherzykom wypłynąć na powierzchnię.
   3. Wlej mieszaninę agarozy na szalkę Petriego zawierającą formę odlewniczą, tak aby forma była po prostu przykryta. Niech agaroza zastygnie, aż stężeje.
3. Usuń kanały agarozy z formy odlewniczej. Przytnij krawędzie krążka agarozy żyletką.
   1. Umieść kanały na 10-centymetrowej szalce Petriego zanurzonej w wodzie. Można je przechowywać w temperaturze 4 °C przez 7 dni.

3. Wczytywanie larwy do kanału w celu zarejestrowania zachowania

UWAGA: Jeśli przechowujesz kanały w temperaturze 4 °C, pozwól kanałom przejść do RT przed użyciem do nagrywania behawioralnego.

1. Użyj czystej żyletki, aby wyciąć pojedynczy kanał z tych przygotowanych w kroku 2 (Rysunek 2A).
2. Użyj kleszczy, aby umieścić kanał rowkowaną stroną do góry na szklanym szkiełku nakrywkowym (Rysunek 2B). Rozmiar i grubość szkiełka nakrywkowego zależy od konkretnego zakresu używanego do obrazowania.
3. Za pomocą cienkich kleszczyków wybierz larwę z nasadki agarowej/soku przygotowanej w kroku 1 i umieść ją w wyciętym kanale (ryc. 2C).
   1. Nie ściskaj larwy. Podnieś go delikatnie końcówką zęba kleszcza. Możliwe jest również manipulowanie larwami za pomocą pędzla z drobnym czubkiem.
      UWAGA: Jest to ważne, ponieważ larwy są bardzo wrażliwe na dotyk. Jeśli nie obchodzi się z nimi ostrożnie, reakcje nocyceptywne mogą zdominować ich zachowanie w ciągu pierwszych kilku sekund eksperymentu.
   2. Umyj larwy, zanurzając je na krótko w wodzie.
   3. Po umieszczeniu larwy w przeciętym kanale, użyj końcówki zęba kleszcza, aby delikatnie wciągnąć larwę do zagajnika kanałowego.
      UWAGA: W przypadku większości zastosowań szerokość larwy i szerokość kanału powinny się zgadzać. Średnia szerokość larw na różnych etapach rozwoju jest następująca: 0 godzin po wylęgu - 140 μm, 24 godziny po wylęgu - 180 μm, 48 godzin po wylęgu - 320 μm, 72 godziny po wylęgu - 500 μm, 96 godzin po wylęgu - 750 μm⁸. Kanały występują w następujących szerokościach: 100, 150, 200, 250 i 300 μm, a wszystkie kanały mają głębokość 150 μm.
   4. Użyj końcówki zęba kleszcza lub pędzla, aby wyregulować pozycję larwy w kanale. Może być zorientowany w dowolnym kierunku: brzusznie do góry, brzusznie w dół, brzusznie w jedną stronę, w zależności od tego, jaka struktura ma być zobrazowana.
4. Za pomocą kleszczy delikatnie odwróć kanał tak, aby larwa znalazła się teraz na szkle nakrywkowym. Umieść jedną lub dwie krople wody na końcach kanału, tak aby wypełnił się wodą (Rysunek 2D).
   1. Delikatnie podnieś boki kanału, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
   2. Dostosuj orientację larwy. Aby to zrobić, delikatnie popchnij kanał, ale nie szkło nakrywkowe, aby zwinąć larwę. Jeśli to nie zmieni orientacji, zdejmij szklankę nakrywkową i wyreguluj pozycję larw. Larwa jest gotowa do zobrazowania.
   3. Zobrazuj kanał/szkiełko nakrywkowe pod mikroskopem odwróconym. W przypadku obrazowania pod mikroskopem pionowym wystarczy odwrócić kanał/szkiełko nakrywkowe.

4. Cecha pomiaru zainteresowania w rejestrowaniu zachowań

1. W przypadku interesującej nas struktury (np. ogona, ośrodkowego układu nerwowego) należy zmierzyć cechę będącą przedmiotem zainteresowania (np. intensywność fluorescencji, lokalizację) w czasie.
   UWAGA: Struktury, takie jak głowa i ogon, mogą być opisywane ręcznie. Na przykład głowę można zidentyfikować jako zawierającą ciemne haczyki ustne w kształcie litery H, a ogon można zidentyfikować jako zawierający tylne kolce tchawicy. W artykule skupiono się na rdzeniu nerwowym. Użyj neuronalnej linii GAL4 elav-GAL4 do napędzania transgenu UAS-myr-GFP (elav>GFP)^9,10 w celu fluorescencyjnego znakowania ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Ośrodkowy układ nerwowy zawiera dwa przednie płaty mózgowe połączone ze sznurem nerwowym, który rozciąga się do tylnego (ryc. 3).
2. Zmierz intensywność pikseli rdzenia nerwowego (f_(NC)) w każdym punkcie czasowym (t). Poniżej opisano podejście do ręcznej adnotacji, ale ten krok można zautomatyzować.
   1. Na Fidżi (lub podobnym oprogramowaniu) w menu "Analizuj" użyj opcji "Ustaw pomiary... ", aby podać średnią wartość szarości i pozycję przekroju.
   2. Ręcznie narysuj ramkę na środku sznura nerwowego w pierwszej klatce filmu (Rysunek 3). Ten krok można również zautomatyzować za pomocą algorytmów segmentacji i rejestracji obrazów.
   3. Użyj polecenia "Zmierz" w menu "Analizuj", aby zgłosić średnią intensywność pikseli w obszarze zainteresowania w ramce. Spowoduje to wygenerowanie okna "Wyniki".
   4. W następnej klatce ręcznie zmień położenie pola bez zmiany rozmiaru za pomocą strzałek. Użyj ponownie polecenia "Zmierz". Zaktualizowane wyniki zostaną wyświetlone w oknie "Wyniki". Powtórz ten krok dla każdej interesującej Cię klatki.
   5. Zapisz "Wyniki" za pomocą opcji "Zapisz jako... ' z menu Plik. Wyniki zostaną wyeksportowane jako plik .xls.

5. Analizuj pomiary

1. Znormalizuj każdą wartość f_(NC) do wartości z zakresu od 0 do 1 (z_(t)).
   1. W arkuszu kalkulacyjnym (lub innym programie) otwórz plik Results.xls. Ten plik będzie zawierał dwie kolumny reprezentujące numer klatki i średnią intensywność fluorescencji.
   2. Utwórz nową kolumnę i użyj wzoru z_(t) = f_(NC[t])-min_(f[NC])/max_(f[NC])-min_(f[NC]), aby wygenerować znormalizowaną wartość fluorescencji odpowiadającą każdemu punktowi czasowemu.
2. Określ okres kroku dla każdego kroku w nagraniu.
   UWAGA: Cykl kroku to jednostka powtarzających się ruchów całego ciała podczas czołgania się do przodu (i do tyłu). Zgodnie z konwencją krok do przodu zaczyna się (i kończy) ruchem do przodu ogona, głowy i innych narządów wewnętrznych, takich jak jelito lub OUN¹.
   1. Ręcznie sprawdź zapis behawioralny i zapisz czasy inicjacji (i) każdego kroku (i_{(Cykl kroku[n])}).
      UWAGA: W poniższym przykładzie wykorzystano ruch OUN do przodu jako inicjację cyklu kroku (ryc. 3).
   2. Dla każdego kroku oblicz okres: Δt_{(Cykl kroku) =} i_{(Cykl kroku [n+1])}-i_{(Cykl kroku [n])}.
3. Oblicz procent cyklu kroku, który upłynął dla każdego punktu czasowego nagrania.
   1. Utwórz dodatkową kolumnę w pliku arkusza kalkulacyjnego reprezentującą czas, jaki upłynął od rozpoczęcia cyklu kroku (c). Ustaw czas od inicjacji kroku na zero na początku każdego kroku (c_{(Cykl kroku[n])} = 0). Dostosuj odpowiednio czasy po zainicjowaniu.
   2. Utwórz dodatkową kolumnę w pliku arkusza kalkulacyjnego reprezentującą procent ukończonego cyklu kroku (% cyklu kroku). Podziel skorygowane czasy przez okres kroku i pomnóż przez 100, aby przeliczyć na procent upływającego cyklu kroku: % cyklu kroku = (c_{(Cykl kroku [n])})/ (Δt _{(Cykl kroku)} * 100).

6. Generuj wykresy współrzędnych biegunowych, aby przedstawić dynamikę interesujących struktur w cyklu pełzania

1. W MATLAB użyj okna dialogowego "Importuj dane" na karcie Strona główna, aby zaimportować zaktualizowane Results.xls.
2. Utwórz nową tablicę "Theta" zawierającą procentowe wartości cyklu kroku (% cyklu kroku). ("Theta = Var1", gdzie Var1 reprezentuje % cyklu kroku).
3. Spraw, aby nowa tablica "Rho" zawierała znormalizowane wartości fluorescencji (z_(t)). ("Rho = Var2", gdzie Var2 reprezentuje z_(t)).
4. Użyj polecenia 'polarplot', aby utworzyć wykresy współrzędnych biegunowych z procentowym cyklem kroku jako kątem i fluorescencją jako promieniem ("polarplot(Theta, Rho)").

Wyniki

Ten artykuł opisuje metodę kierowania zachowaniem larw Drosophila za pomocą kanałów agarozowych oraz pomiaru dynamiki struktur larwalnych w cyklu pełzania. Larwy w kanałach liniowych wykonują ciągłe napady rytmicznego pełzania (ryc. 3). Ponieważ zarówno larwy, jak i kanały są optycznie przezroczyste, kanały mogą być używane z larwami wyrażającymi sondy fluorescencyjne wyrażone w dowolnej strukturze będącej przedmiotem zainteresowania. Zarejestrowaliśmy larwy wyka...

Dyskusja

Zbudowano urządzenie mikroprzepływowe do tworzenia liniowych kanałów agarozowych, które mogą pomieścić larwy Drosophila (ryc. 1). Kiedy larwy Drosophila są umieszczane w tych liniowych kanałach agarozowych, ich repertuar behawioralny ogranicza się do pełzania, co pozwala na szczegółową obserwację dynamiki struktur larwalnych w cyklu pełzania.

Udane nagranie ma miejsce, gdy larwa wykonuje serię rytmicznych kroków (ryc. 3). Jeśli tak się nie st...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
6 uncji kwadratowa butelka Drosophila	Scimart	DR-103
agar	sigma	A1296
sacharoza	sigma	S9378
sok			nie z koncentratu
Tegosept	Fisher	T2300	p-hydroksybenzoesan metylu
35 x 10 mm okrągła szalka Petriego	Fisher	351008
Drożdże
PDMS forma odlewnicza	FlowJem		można zamówić u autorów
Alkohol izopropylowy	Chusteczki	A417-1
	Fisher	06-666-11
powietrze w puszce	Fisher	18-431
Szalka Petriego 10 cm	BioPioneer	GS82-1473-001
agaroza	Fisher	50-444-176
żyletka	Fisher	12-640
kleszcze	FST	11241-40
22 x 40 szkło osłonowe, #1.5	Fisher	50-365-605
Fidżi (wersja 1.51d)	NIH		fiji.sc
Excel 2016	Microsoft		www.microsoftstore.com
MATLAB R2016	Mathworks		www.mathworks.com