To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.
Artykuł metodologiczny
Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Test mikroneutralizacji (MN) jest standardową techniką pomiaru zakaźności wirusa grypy i hamowania replikacji wirusa. W tym badaniu przedstawiamy protokół testu MN opartego na obrazowaniu w celu ilościowego określenia prawdziwych relacji antygenowych między wirusami. W przeciwieństwie do typowych testów redukcji blaszek miażdżycowych, które opierają się na widocznych blaszkach, ten test określa ilościowo całą populację zakażonych komórek w każdym dołku. Protokół dopasowuje typ lub podtyp wirusa do wyboru linii komórkowych w celu osiągnięcia maksymalnej zakaźności, co zwiększa kontrast próbki podczas obrazowania i przetwarzania obrazu. Wprowadzenie miareczkowania ilościowego określa ilość wirusów wejściowych do neutralizacji i umożliwia porównywanie wyników różnych eksperymentów. Konfiguracja obrazowania z płaskim skanerem i bezpłatnym oprogramowaniem do pobrania sprawia, że podejście to jest wydajne, opłacalne, przyjazne dla użytkownika i łatwe do wdrożenia w większości laboratoriów. Nasze badanie pokazuje, że ulepszony test MN działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B, bez znaczącego wpływu podstawień aminokwasów w neuraminidazie (NA) wirusów A(H3N2). Jest to szczególnie przydatne do charakteryzowania wirusów, które albo rosną do niskiego miana kwasu hialuronowego, albo przechodzą nieudaną infekcję powodującą niezdolność do tworzenia blaszek w hodowanych komórkach.
Wprowadzenie
Testy mikroneutralizacji (MN) są używane w wirusologii do ilościowego oznaczania przeciwciał neutralizujących i aktywności przeciwwirusowej. Jako alternatywa dla testów hamowania hemaglutynacji (HI), testy MN mogą przezwyciężyć efekty nieantygenowe, na które wpływają zmiany powinowactwa wiązania receptorów w wirusach grypy, co może komplikować interpretację wyników HI1,2,3. Do niedawna większość testów MN opierała się na efektach cytopatycznych (CPE) lub testach immunoenzymatycznych (ELISA)4,5. W 1990 r. opracowano testy MN oparte na koncentracji i redukcji blaszki miażdżycowej6,7,8. Testy redukcji płytki nazębnej polegają na zliczaniu widocznych blaszek w celu ilościowego określenia zakaźności. Jednak zliczenia wizualne obejmują tylko duże blaszki, które są rozpoznawane przez ludzkie oczy, mimo że większość blaszek jest mała i niewidoczna dla wielu obecnie krążących wirusów. To niepełne pokrycie może powodować znaczne różnice między egzaminatorami i między eksperymentami, prowadząc do nieporównywalnych wyników. Niemożliwe jest również zastosowanie tej metody, gdy niektóre wirusy wykazują nieudaną infekcję pojedynczych komórek lub bardzo małe blaszki.
Słaba rozdzielczość zliczania może być poprawiona przez wprowadzenie protokołu opartego na obrazowaniu. Dzięki postępowi technologicznemu, mikroskopia optyczna i wysokowydajne czytniki płytek studziennych mogą zapewnić dokładne metody liczenia zainfekowanych komórek9. Pod mikroskopem z prześwietlanym światłem zakażone komórki oznaczone pewnymi markerami mogą być wizualizowane przez ich absorpcję lub kontrast fluorescencyjny w rozdzielczości subkomórkowej. Próbka może być następnie analizowana na ekranie komputera.
Niestety, ze względu na ograniczenie pola widzenia, do pokrycia jednej studni potrzeba więcej niż stu obrazów wyłożonych kafelkami. Analiza płytki z 96 dołkami wymagałaby zobrazowania i przetworzenia około dziesięciu tysięcy obrazów. Tak pracochłonny proces jest czasochłonny i kosztowny, a uzyskana rozdzielczość jest na ogół zbędna do rutynowej charakterystyki infekcji wirusowych. Laboratoria dysponujące ograniczonym budżetem mogą uznać, że podejście oparte na skanerze płaskim stanowi opłacalną alternatywę o wysokiej przepustowości.
W tym artykule opisujemy ulepszony test MN do redukcji płytki nazębnej, który jest odpowiedni do charakterystyki antygenowej dużej liczby wirusów oraz do ilościowego pomiaru aktywności przeciwwirusowej i przeciwciał neutralizujących. Test ma kilka zalet: po pierwsze, jest to test oparty na obrazowaniu, który jest w stanie zmierzyć infekcje wirusowe na poziomie komórkowym, niezależnie od wielkości płytki nazębnej. Zliczenie całkowitej populacji zakażonych komórek (ICP) w studzience znacznie zwiększa czułość wykrywania, umożliwiając scharakteryzowanie wirusów o niskiej zakaźności. Po drugie, przed neutralizacją wprowadza się dokładniejsze miareczkowanie ilościowe w celu określenia ilości wirusa wejściowego. Ilościowy wirus wejściowy znacznie zmniejsza różnice między różnymi eksperymentami i sprawia, że wyniki są bardziej porównywalne między laboratoriami. Po trzecie, miana neutralizacji można określić bezpośrednio poprzez analizę obrazów, dzięki czemu kwantyfikacja jest szybka i przyjazna dla użytkownika. Wreszcie, protokół zapewnia opłacalną i wysokowydajną alternatywę o wymaganej rozdzielczości i dokładności. Kwantyfikacja opiera się na skanerze płaskim i bezpłatnym oprogramowaniu do przetwarzania danych. Cała konfiguracja zajmuje niewiele miejsca i można ją wdrożyć w większości laboratoriów.
Protokół przedstawiony w tym artykule składa się z czterech głównych etapów, w tym miareczkowania wirusa, miareczkowania, neutralizacji wirusa i kwantyfikacji neutralizacji. Miareczkowanie wirusów to eksperyment przygotowawczy, który określa ilość wirusów wejściowych, które mają być użyte do neutralizacji. Podczas miareczkowania do monowarstw komórek w 96-dołkowej płytce nakłada się szereg stężeń wirusa. Zainfekowane komórki są następnie oznaczane ilościowo w sekcji 2. Rozcieńczenie wirusa, które wytwarza 20%-85% ICP, jest z kolei stosowane jako wirusy wejściowe do odpowiedniej neutralizacji w sekcji 3. Miana w protokole neutralizacji określa się ilościowo za pomocą sekcji 4. Eksperymenty, które przeprowadzono zgodnie z powyższymi protokołami, przedstawiono w Reprezentatywnych Wynikach. Test został dokładnie przetestowany w ciągu ostatnich dwóch lat z większością obecnie krążących wirusów grypy, takich jak wirusy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B. Wyniki charakterystyki wirusa grypy zostały zawarte w raportach na spotkanie konsultacyjne WHO, w których wydano zalecenia dotyczące szczepionek przeciw grypie do stosowania na półkuli południowej w 2016 r. i na półkuli północnej w latach 2016-2017.
Protokół
UWAGA: Poziom bezpieczeństwa biologicznego (BSL) dla poniższego protokołu to BSL 2 dla wirusów grypy sezonowej i BSL 3+ dla potencjalnych wirusów grypy pandemicznej. Miareczkowanie wirusa jest wymagane przed eksperymentem neutralizacji, aby zdecydować o stężeniu wirusa w kontroli wirusa (VC).
1. Miareczkowanie wirusa
UWAGA: W zależności od liczby wirusów i liczby duplikatów, można ustawić płytkę studzienkową z następującymi elastycznościami: (1) Rozcieńczenie wirusa może być ułożone wzdłuż rzędów lub kolumn (Rysunek 1). Każdy wirus powinien zajmować osobny wiersz/kolumnę. (2) Przyrost rozcieńczenia wirusa jest elastyczny, ale powinien zaczynać się od najwyższego stężenia wirusa w lewym górnym rogu. (3) Nie ma ograniczeń co do liczby duplikatów.
UWAGA: Komórki nerki psa Madin Darby (MDCK) i MDCK-SIAT1 (SIAT) zostały uprzejmie dostarczone przez Dr. M. Matrosovich, Marburg, Niemcy10. Komórki SIAT to komórki MDCK stabilnie transfekowane ludzkim genem CMP-N-acetyloneuraminianu: β-galaktozydu α-2,6-sialylotransferazy w celu zwiększenia ekspresji oligosacharydów zakończonych kwasem sjalowym (SA) α2-6Gal
.- Podzielić wystarczającą ilość komórek MDCK lub komórek MDCK-SIATz 8 na płytki 96-dołkowe (200 μl/dołek). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 lub 3 dni, aby osiągnąć konfluencję. Rozmnażaj komórki w DMEM uzupełnione 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą (FCS) i antybiotykami (100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Inkubować komórki SIAT w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 1 mg/ml siarczanu G418.
UWAGA: Współczynnik rozcieńczenia zależy od doświadczenia i użytej linii komórkowej. Monowarstwa komórkowa musi być zlewająca się (tj. bez ściany komórkowej lub widocznego konturu dla komórek MDCK i ciasno upakowany układ dla komórek MDCK-SIAT1) w momencie inokulacji wirusa. Przykłady rozcieńczeń opartych na subkulturze zlewających się kolb komórek MDCK lub MDCK-SIAT1 podano w Tabeli 1. - Przemyć komórki 3 razy 200 μl pożywki wzrostowej wirusa (VGM) na dołek. Sterylizuj wielościenną podkładkę płytkową z 70% EtOH przez 30 minut, a następnie wypłucz ją w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub VGM przed myciem.
- Zassać VGM i natychmiast dodać 50 μl VGM do każdej studzienki.
- Dodaj 900 μl VGM do każdej z 6 sterylnych probówek (lub mniej, w zależności od liczby testowanych wirusów i duplikatów). Odpipetować 100 μl wirusa do pierwszej probówki, dobrze wymieszać i seryjnie rozcieńczyć, zmieniając końcówki między każdym rozcieńczeniem. Powtórz te czynności dla każdego wirusa, który ma być stopniowo miareczkowany.
UWAGA: Spowoduje to rozcieńczenie wirusa od 10-1 do 10-6. - Dodać 50 μl każdego rozcieńczenia wirusa, zaczynając od najwyższego rozcieńczenia (1 x 10-5 na rysunku 1), do zduplikowanych studzienek (kolumny 9 i 10 na rysunku 1) płytki 96-dołkowej.
- Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C na 2-3 godziny, aby wirus mógł zainfekować komórki.
UWAGA: Konieczna jest inkubacja trwająca od 2 do 3 godzin, aby zapewnić, że wirusy w inokulum mają wystarczająco dużo czasu, aby dotrzeć do monowarstwy. - Przygotować nakładkę (10 ml/płytkę)
UWAGA: Nakładka składa się z 5 ml 2x DMEM, trypsyny (2 μg/ml stężenie końcowe), 20 μl bulionu 1 mg/ml i 5 ml lintersów bawełnianych z celulozy (patrz Lista Materiałów). - Usunąć inokulum.
- Dodaj nakładkę (200 μl do każdego dołka). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, BEZ ZAKŁÓCEŃ.
UWAGA: Pączkowanie wirusa następuje po około 4 godzinach, dlatego ważne jest, aby po tym czasie nie naruszyć płytki. - Zassać nakładkę ze studzienek.
- Dodaj lodowaty 4% paraformaldehyd do PBS A (200 μl/dołek). Umieść je w temperaturze 4 °C na 30 minut lub w temperaturze pokojowej na 20 minut.
UWAGA: PBS A to sól fizjologiczna buforowana fosforanami o naturalnym pH z 10 g NaCl, 0,25 g KCl, 1,437 g Na2HPO4, 0,25 g KH2PO4 i 1 l wody destylowanej (patrz Lista materiałów).
UWAGA: Paraformaldehyd jest szkodliwy w przypadku wdychania i może spowodować oparzenia w przypadku połknięcia. Istnieją również ograniczone dowody na działanie rakotwórcze i może powodować uczulenie po kontakcie ze skórą. - Odessać paraformaldehyd i dwukrotnie przemyć płytki PBS A (200 μl/dołek).
- Przechowywać płytki w PBS A w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości lub kontynuować następujące czynności.
- Dodać bufor permeabilizacyjny (100 μl/basenik). Pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.
- Umyć płytkę dwukrotnie PBS A (200 μl/basenik).
- Dodać 50 μl pierwszego przeciwciała, mysiego MAb przeciwko grypie typu A (1:1000 w buforze ELISA), na basenie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (lub 4 °C przez noc), wstrząsając.
- Przemyj go 3 razy w 100 μl buforu do płukania (0,05% Tween 80 w PBS A, v/v) na studzienkę. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut między praniami. Alternatywnie umyj go 3 razy bez inkubacji, używając 300 μl na studzienkę.
- Dodać 50 μl drugiego przeciwciała, koniugatu koziego anty-mysiego IgG (H + L) HRP (1:1,000 w buforze ELISA) na studzienkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, wstrząsając.
- Umyj go 3 razy, jak opisano w kroku 1.17.
- Dodać substrat (50 μl/studzienkę). Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub do momentu, gdy wyraźnie widoczny będzie rozwój niebieskiego koloru.
- Aby zatrzymać reakcję, umyć płytkę dwukrotnie 200 μl wody destylowanej na studzienkę, inkubując w temperaturze pokojowej przez 2 -3 minuty między płukaniami.
- Wysuszyć płytkę na powietrzu i przechowywać ją w ciemnym miejscu (np. zawinąć w folię aluminiową).
2. Miareczkowanie
- Umieść płytkę studzienkową w obszarze skanowania skanera płaskiego, jak pokazano na rysunku 2a. Użyj limitu pozycji w kształcie litery L, aby zapewnić optymalną i powtarzalną lokalizację obrazowania.
UWAGA: Możliwe jest zobrazowanie dwóch płytek dołkowych podczas jednego skanowania. - Zeskanuj obraz.
UWAGA: Ustawienia są pokazane w Tabeli 2. - Uruchom oprogramowanie "Wellplate Reader", aby obliczyć wymagane stężenie wirusa (Rysunek 3).
- Kliknij przycisk "Załaduj obraz", aby załadować obraz. Przesuń czerwony pasek na histogramie zakładki "Próg globalny", aby dostosować próg próbkowania. Kliknij przycisk "Aktualizuj", aby sprawdzić wpływ na obraz.
- Zaznacz pole "Oblicz neutralizację/miareczkowanie". Kliknij przycisk "Pobieranie próbek", aby określić ilościowo ICP. Kliknij przycisk "Zapisz", aby zapisać wyniki próbkowania, gdy zostaniesz o to poproszony.
UWAGA: Po zakończeniu procesu pobierania próbek, jeśli zaznaczone jest pole "Oblicz neutralizację/miareczkowanie", automatycznie pojawia się nowe okno o nazwie "Obliczanie neutralizacji i miareczkowania". - Załaduj lub wprowadź mapę definicji płyty studzienki. Wskaż próg (np. 30%) w polu "Miareczkowanie: optymalna populacja wirusa (%)". Wybierz zakładkę "Proces miareczkowania", aby obliczyć wyniki miareczkowania. Sprawdź wyniki miareczkowania. Kliknij przycisk "Zapisz i zamknij", aby zapisać wyniki miareczkowania.
UWAGA: Zapoznaj się z Uzupełnieniem S1, aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące oprogramowania. Kopia oprogramowania na zamówienie jest dostępna na życzenie.
UWAGA: Zazwyczaj najlepsze rozcieńczenie wirusa do testu redukcji blaszek miażdżycowych daje około 50% (20-85%) ICP wszystkich komórek w każdym dołku11.
3. Neutralizacja wirusa
UWAGA: Oblicz liczbę płytek wymaganych do przeprowadzenia testu neutralizacji. Każda płytka może pomieścić jednego wirusa i kilka surowic odpornościowych.
UWAGA: W zależności od liczby surowic odpornościowych i liczby duplikatów, można ustawić płytkę studzienkową o następujących elastycznościach: (1) Rozcieńczenie surowicy może być ułożone wzdłuż rzędu lub kolumny (Rysunek 4). Każda surowica powinna zajmować osobny wiersz lub kolumnę. (2) Przyrost rozcieńczenia surowicy jest elastyczny, ale powinien zaczynać się od najwyższego stężenia surowicy w lewym górnym rogu płytki. (3) Liczba duplikatów równoważy liczbę surowic odpornościowych. Więcej duplikatów może pomóc w wygładzeniu eksperymentalnych wariantów. (4) Liczba VC i liczba duplikatów kontrolnych komórek (CC) są elastyczne, ale powinny być również umieszczone w oddzielnych wierszach lub kolumnach. Oczekuje się, że liczba duplikatów VC jest znacznie większa niż w przypadku surowic odpornościowych.
- Przygotuj monowarstwę komórki, jak w krokach 1.1-1.3, 2 lub 3 dni wcześniej.
- Dodaj 50 μl VGM do każdego dołka płytki.
- Użyj kolumn 11 i 12 odpowiednio dla VC i CC. Dodać 50 μl podwielokrotności surowicy traktowanej enzymem niszczącym receptory (RDE) w stosunku 1:20 do pierwszego rzędu (A) kolumn 1-10,
UWAGA: Dla każdej kombinacji wirusa i surowicy test przeprowadza się dwukrotnie, więc jedna płytka może, na przykład, zawierać jednego wirusa testowanego przeciwko pięciu surowicom odpornościowym. - Przeprowadzić 2-krotne rozcieńczenia seryjne, przenosząc 50 μl z rzędu A do rzędu H (kolumny 1-10 na rysunku 4) i odrzucając 50 μl z rzędu H.
- Dodać 50 μl rozcieńczalnika do każdego dołka kolumny CC (kolumna 12 na rysunku 4).
- Dodać 50 μl wirusa do każdego dołka płytki, z wyjątkiem kolumny CC (kolumny 1-11, wiersze A-H na rysunku 4).
- Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny. Usunąć inokulum. Dodaj nakładkę (200 μl) do każdego dołka. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, W STANIE NIEZAKŁÓCONYM. Zamocuj i wybarwić płytki jak w przypadku miareczkowania wirusa (kroki 1.11-1.22).
4. Kwantyfikacja neutralizacji
- Umieść płytkę studzienkową w obszarze skanowania skanera płaskiego, jak pokazano na rysunku 2a. Użyj limitu pozycji w kształcie litery L, aby zapewnić optymalną i powtarzalną lokalizację obrazowania.
UWAGA: Możliwe jest zobrazowanie dwóch płytek dołkowych podczas jednego skanowania. - Zeskanuj płytkę zgodnie z opisem w kroku 2.2.
- Uruchom oprogramowanie "Wellplate Reader", aby obliczyć wymagane miana wirusa (Rysunek 3, krok 2.3).
- Kliknij przycisk "Załaduj obraz", aby załadować obraz. Przesuń czerwony pasek w polu "Próg globalny", aby dostosować próg próbkowania. Kliknij przycisk "Aktualizuj", aby sprawdzić efekt.
- Zaznacz pole "Oblicz neutralizację/miareczkowanie". Kliknij przycisk "Pobieranie próbek", aby określić ilościowo ICP. Kliknij przycisk "Zapisz", aby zapisać wyniki próbkowania, gdy zostaniesz o to poproszony.
UWAGA: Po zakończeniu procesu pobierania próbek, jeśli zaznaczone jest pole "Oblicz neutralizację/miareczkowanie", automatycznie pojawia się nowe okno o nazwie "Obliczanie neutralizacji i miareczkowania". - Załaduj lub wprowadź mapę płyty wiertniczej. Wskaż próg (np. 50%) w polu "Neutralizacja: Odliczenie infekcji (%)".
- Wybierz "Proces neutralizacji", aby obliczyć miana. Sprawdź miana i kliknij przycisk "Zapisz i zamknij", aby zapisać wyniki neutralizacji.
UWAGA: Neutralizację podaje się jako odwrotność największego rozcieńczenia surowicy z predefiniowaną redukcją ICP (taką jak 50% lub 80%) w stosunku do VC (średnia z kolumny 11 na rysunku 4). W reprezentatywnych wynikach zastosowano 50% redukcję ICP.
Wyniki
Zgodnie z powyższymi procedurami przedstawiamy wyniki z ostatnich eksperymentów dotyczących charakterystyki antygenowej. Układ miareczkowania został zaprojektowany w celu zbadania ośmiu wirusów wejściowych, z podwójnymi powtórzeniami dla każdego rozcieńczenia. Rozcieńczenia wirusów testowano w zakresie od 1.0 x 10-1 do 1.0 x 1.0-6, aby objąć różnice między wirusami. Badane wirusy należały do podtypu H3N2 i obejmowały: A/Cameroon/15V-3538/2015, A/Vladivostok/36/2015, A/Moscow/103/2015, A/Tomsk/5/2015/, A/Moscow/101/2015, A/Moscow/100/2015, A/Moscow/133/2015 oraz A/Bratislava/437/2015. Wyniki miareczkowania przedstawiono na Rysunku 5. Rysunek 5d obrazuje spadek ICP wraz ze wzrostem rozcieńczenia wirusa. Krzywe znormalizowano względem ICP tych samych wirusów, które wywołały infekcje we wszystkich komórkach w studni12 (zdefiniowano jako saturację ICP). Jeśli przy najwyższym stężeniu wirusa nie osiągnięto saturacji ICP, zamiast tego wykorzystano średnią ICP z odpowiadających im powtórzeń (A/Moscow/103/2015 na Rysunku 5d). Rozcieńczenia wirusów, które spowodowały 30% saturacji ICP, wybrano jako rozcieńczenie wirusa wejściowego do neutralizacji (Tabela 3).
Neutralizacja została zaplanowana tak, aby jeden wariant wirusa wejściowego był testowany przeciwko pięciu antyserom, z podwójnymi powtórzeniami na każdej płytce. Przedstawionym wirusem referencyjnym jest H3N2 A/Stockholm/63/2015. Pięć antyser to A/HK 4801/14 Egg F12/15, A/HK 7295/14 MDCK F02/15, A/South Africa R2665/15 SIAT F50/15, A/Swiss 9715923/13 SIAT NIBF F18/15 oraz A/Dutch 525/14 SIAT f23/15. Wyniki neutralizacji zilustrowano na Rysunku 6. Rysunek 6d przedstawia postęp infekcji wraz ze wzrostem rozcieńczenia surowicy. Znormalizowana populacja pozytywna na osi pionowej reprezentuje stosunek ICP z odpowiedzi odpowiedniego antiserum do średniego ICP wirusa referencyjnego12. Podczas normalizacji odjęto ICP w tle z kontrolnych komórek niezakażonych. Miana neutralizacji określono jako odwrotności rozcieńczeń antiserum odpowiadające 50% redukcji ICP (Tabela 4). Do oszacowania mian przypadających pomiędzy dwoma sąsiednimi rozcieńczeniami surowicy zastosowano interpolację liniową.
Rycina 1: Przykład układu płytek w eksperymencie miareczkowania wirusa. Badane wirusy są przypisane do oddzielnych rzędów (od A do H). Kolumny są przeznaczone dla różnych rozcieńczeń wirusa (od 1 do 12). Dwie kolumny zostały wykorzystane jako powtórzenia dla każdego rozcieńczenia wirusa. Pasek skali = 10 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Schematy systemu skanowania próbek. (a) Płytka 96-dołkowa w pozycji obrazowania skanera płaskiego (ponownie opublikowano z referencji11 za zgodą Elsevier B.V.) oraz (b) wymiary ogranicznika pozycji w kształcie litery L pokazanego na (a). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.
Rycina 3: Schemat ekranu oprogramowania do kwantyfikacji „Wellplate Reader”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Przykład ustawienia płytki do testów w eksperymencie neutralizacji. Każdemu antyserum przypisano dwie kolumny z powtórzeniami (1 do 10). Wiersze są przeznaczone dla różnych rozcieńczeń surowicy (A do H). Kontrola wirusa znajduje się w kolumnie 11, z ośmioma powtórzeniami (A11 do H11). Kontrola komórek znajduje się w kolumnie 12, z ośmioma powtórzeniami (A12 do H12). Pasek skali = 10 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Wyniki eksperymentu miareczkowania. (a) Ustawienie płytki do mikrotitracji, (b) obraz zeskanowanej płytki, (c) ilustracja zakodowanej kolorystycznie, skwantyfikowanej populacji komórek zainfekowanych wirusem oraz (d) znormalizowane populacje komórek zainfekowanych wirusem w zależności od rozcieńczeń wirusa. Jako próg przyjęto 30% ICP. Słupki błędu na (d) przedstawiają odchylenia standardowe (SD) z powtórzeń próbek (± 1 SD). Paski skali na (b) i (c) = 10 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6: Wyniki eksperymentu neutralizacji. (a) Układ płytki wielodołkowej, (b) obraz zeskanowanej płytki wielodołkowej, (c) ilustracja skwantyfikowanej populacji komórek zainfekowanych wirusem oraz (d) znormalizowana populacja komórek zainfekowanych wirusem w funkcji rozcieńczenia surowicy. Jako wirus wejściowy (VC) zastosowano szczep A/Stockholm/63/2015. Do obliczenia mian wykorzystano 50% ICP. Słupki błędów na wykresie (d) przedstawiają odchylenia standardowe (SD) z powtórzeń próbek (± 1 SD). Paski skali na (b) i (c) = 10 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Uzupełnienie S1: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
| Typowe rozcieńczenie | ||
| komórki MDCK | komórki MDCK-SIAT1 | |
| 2 dni | 1:5 (1 + 4) | 1:10 (1 + 9) |
| 3 dni | 1:10 (1 + 9) | 1:20 (1 + 19) |
| Typowa liczba komórek na ml | ||
| komórki MDCK | komórki MDCK-SIAT1 | |
| 2 dni | 2 x 105 | 1 x 105 |
| 3 dni | 1 x 105 | 5 x 104 |
Tabela 1: Typowe rozcieńczenia przy subkulturze konfluentnych kolb komórek MDCK lub MDCK-SIAT1.
| Tryb | Tryb profesjonalny |
| Typ dokumentu | Film (z przewodnikiem po obszarze filmu) |
| Typ automatycznej ekspozycji | Zdjęcie |
| Typ obrazu | kolor 24-bitowy |
| Rozdzielczość | 1200 dpi |
| Format zapisanego obrazu | TIFF |
Tabela 2: Typowa konfiguracja skanera płaskiego.
| Rząd | Wirus | Zalecane rozcieńczenie |
| A | A/Cameron/15V-3538/2016 | 1.0 x 10-2 |
| B | A/Vladivostok/36/2015 | 1.0 x 10-3 |
| C | A/Moscow/103/2015 | 1.1 x 10-1 |
| D | A/Tomsk/5/2015 | 5.9 x 10-1 |
| E | A/Moscow/101/2015 | 8.3 x 10-1 |
| F | A/Moscow/100/2015 | 1.4 x 10-2 |
| G | A/Moscow/133/2015 | 1.3 x 10-2 |
| H | A/Bratislava/437/2015 | 1.3 x 10-4 |
Tabela 3: Rozcieńczenia wirusa obliczone dla populacji z 30% ICP.
| Kolumna | Antysera | Zalecane miano |
| 1 - 2 | A/HK4801/2014 | 110 |
| 3 - 4 | A/HK7295/2014 | 213.3 |
| 5 - 6 | A/South Africa/R2665/2015 | 2155.8 |
| 7 - 8 | A/Szwajcaria/9715293/2013 | 89.4 |
| 9 - 10 | A/Netherlands/525/2014 | 78.6 |
Tabela 4: Miana przy 50% ICP A/Stockholm/63/2015 przeciwko antyserom.
Dyskusja
W tym badaniu opisaliśmy test MN oparty na obrazowaniu w celu ilościowego określenia prawdziwych relacji antygenowych między wirusami. W porównaniu z innymi testami redukcji blaszki miażdżycowej, metoda ta kładzie nacisk na pomiar ICP całej studni, zapewniając pełne pokrycie populacji zakaźnej. Jego niezależność od tworzenia blaszek miażdżycowych rozszerza również zastosowanie testu do wirusów, które mogą tworzyć głównie niewidoczne małe blaszki lub które mogą zarządzać infekcją tylko jednokomórkową. W związku z tym test jest w stanie zbadać więcej wirusów i działanie szerszego zakresu przeciwciał niż HI, a także pomaga bardziej kompleksowo odzwierciedlić podobieństwa lub różnice antygenowe między wirusami12. Na przykład, gdy włączy się karboksylan oseltamiwiru, test MN jest mniej podatny na wiązanie zależne od NA, co dokładniej odzwierciedla różnice antygenowe. Podczas opracowywania testu włożono wiele wysiłku w zwiększenie spójności, szybkości i czułości eksperymentu, w tym poprzez kontrolowanie wirusów wejściowych za pomocą miareczkowania ilościowego, obrazowanie z wysoką przepustowością za pomocą skanera płaskiego oraz wdrożenie przyjaznej dla użytkownika platformy przetwarzania danych. Wyniki były na ogół zgodne z wynikami HI i je potwierdziły. Warto zauważyć, że wyniki ujawniły również różnice antygenowe między wariantami dryfu antygenowego niedawnych wirusów szczepionkowych typu A i B, a także zmiany antygenowe spowodowane selekcją kultur lub sporadycznymi zmianami, takimi jak substytucja G155E w HA1 niektórych wirusów A(H1N1)pdm0912.
Protokół dopasował typ lub podtyp wirusa do wyboru linii komórkowych, które dały najsilniejszą infekcję, co znacznie wzmocniło sygnał obrazowania. Zmienność eksperymentalna została wygładzona dzięki zaprojektowaniu duplikatów, które równoważyły się z liczbą badanych surowic odpornościowych. Niepewności mogą również wynikać z jakości obrazu, na którą wpływ ma głównie urządzenie do obrazowania. Porządny kolorowy skaner płaski może znacznie poprawić kontrast obrazu i zredukować szumy. Ilość wirusa wejściowego do neutralizacji musi być ilościowo określona z wyprzedzeniem na podstawie odpowiedniego miareczkowania, podczas gdy wirusy nadal utrzymują podobny status. Podczas neutralizacji odpowiedź surowicy odpornościowej na zakażenie jest normalizowana w stosunku do różnicy między wirusem referencyjnym (VC) a poziomem tła (CC). Dokładne pomiary VC i CC są niezbędne w eksperymencie neutralizacji. Zaleca się stosowanie większej liczby duplikatów (w reprezentatywnych wynikach wykorzystano osiem duplikatów). Wreszcie, zrozumienie oprogramowania ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Oprogramowanie było testowane pod kątem rutynowej charakterystyki wirusa w Centrum Grypy WHO w Wielkiej Brytanii przez ponad dwa lata. Szczegółowe instrukcje dotyczące postępowania w różnych sytuacjach znajdują się w Dodatku S1.
Ten test MN nadaje się do zastosowań, w których próbki obejmują bardzo duże pole widzenia, ale wymagają jedynie umiarkowanej rozdzielczości obrazowania. Niski koszt i prosta konfiguracja sprawiają, że system jest łatwo dostępny dla większości laboratoriów wirusologicznych. Różnica w pomiarach tej samej próbki była mniejsza niż 3%, co z grubsza określa niepewność wprowadzoną podczas skanowania11. Taka powtarzalność jest wystarczająca w wielu badaniach wirusologicznych i może być dodatkowo zmniejszona poprzez uśrednianie obrazów z wielu skanów.
Podsumowując, badanie to demonstruje solidny test MN, który może być rutynowo stosowany w badaniach antygenowych i jako wsparcie danych HI w szczegółowych analizach obecnie krążących wirusów grypy, w szczególności w przypadku dwuletniej selekcji wirusów do włączenia do szczepionek przeciwko grypie ludzkiej.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Dr. M. Matrosovichowi za dostarczenie macierzystych linii komórkowych MDCK i MDCK-SIAT1 oraz firmie Roche Pharmaceuticals za dostarczenie karboksylanu oseltamiwiru. Dziękujemy również dr Anne Weston za cenne sugestie dotyczące manuskryptu. Badanie to było uzależnione od cennej współpracy Krajowych Centrów ds. Grypy WHO i CC WHO w ramach GISRS WHO, którzy dostarczyli wykorzystane wirusy grypy. Prace te zostały sfinansowane przez Radę ds. Badań Medycznych w ramach Programu U117512723.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS Nature | pH Sól fizjologiczna buforowana fosforanami: NaCl 10 g, KCl 0,25 g, Na2HPO4 1,437 g, KH2PO4 0,25 g i Dist. Woda 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2,4 g w 100 ml wody destylowanej rozpuszczonej przez mieszanie na mieszadle magnetycznym przez 1 godzinę. Sterylizować w autoklawie. |
| 2x DMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsyna | Sigma | T1426 | |
| Nakładka (10 ml/płytka): | 5 ml 2x DMEM, Trypsyna 2 μ g/ml stężenie końcowe, Avicell 5 ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Bufor permeabilizacyjny: 0,2% w PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Bufor do płukania: 0,05% Tween 80 w PBS A (v/v) |
| Surowica końska | PAA Labs Ltd | B15-021 | Bufor ELISA: 10% w PBS A (v/v) + 0,1% Tween 80 |
| Mysz MAb przeciwko grypie typu A | Biorad | MCA 400 | 1st Przeciwciało: 1:1,000 w ELISA Bufor |
| Koza anty-mysia IgG (H+L) HRP koniugat | Biorad | 172-1011 | 2nd Przeciwciało: 1:1,000 w buforze ELISA |
| Prawdziwy substrat peroksydazy Blu | KPL | 50-78-02 | Podłoże: True Blue +0,03% H2O2g (1:1,000 z 30% roztworu) |
| 96-dołkowe płaskie płytki do mikromiareczkowania | Costar | 3596 | |
| 8-kanałowa podkładka i rozdzielacz wielościenna | Sigma | M2656 | |
| Skaner płyt doskonałości | Epson | V750 Pro | Oprogramowanie do obrazowania można pobrać bezpłatnie ze strony http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134& infoType=Pliki do pobrania. |
| Środowisko operacyjne oprogramowania: LabVIEW | National Instruments | Corporation Window oparte na konstruktorze NI Vision | Wersja: LabVIEW2012 lub nowsza |
Bibliografia
- Walker, D. L., Horsfall, F. L. Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses. J Exp Med. 91, 65-86 (1950).
- Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes. Virology. 289, 74-85 (2001).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment. J Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection. J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).
- Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).
- Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system. J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).
- Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro. J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3, 63-70 (2006).
- Comley, J. High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis. Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).
- Lin, Y. P., et al. Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).
Przedruki i uprawnienia
