Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

24.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54899

⸱

10 grudnia 2016

 , 
1Lund University Diabetes Centre, Lund University, 2INSERM UMR-1060, CarMeN Laboratory, Lyon 1 University, INRA U1235, INSA of Lyon, Rockefeller and Charles Merieux Lyon-Sud Medical Universities

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.

Streszczenie

Strukturalne interakcje między endoplazmatycznym siatkowatym (ER) a błonami mitochondrialnymi, w domenach znanych jako błony związane z mitochondriami (MAM), są kluczowymi węzłami dla sygnalizacji komórkowej i losu komórki. W szczególności te miejsca kontaktu między organellami umożliwiają przenoszenie wapnia z ER do mitochondriów przez zależny od napięcia kanał anionowy (VDAC) / regulowane glukozą białko 75 (GRP75) / receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP3R) kompleks kanałowy wapnia. Chociaż ten subkomórkowy przedział jest intensywnie badany zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych, nie istnieje prosta i czuła metoda ilościowego określania endogennej ilości kontaktu ER-mitochondriów w komórkach. Podobnie, MAM są wysoce dynamicznymi strukturami i nie ma odpowiedniego podejścia do śledzenia modyfikacji interakcji ER-mitochondria bez nadekspresji białka. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół oparty na zastosowaniu testu ligacji zbliżeniowej in situ do wizualizacji i ilościowego określenia endogennych interakcji ER-mitochondriów w stałych komórkach przy użyciu bliskiej odległości między białkami zewnętrznej błony mitochondrialnej (VDAC1) i błony ER (IP3R1) na granicy MAM. Podobne eksperymenty z ligacją zbliżeniową in situ można również przeprowadzić z parami przeciwciał GRP75/IP3R1 i cyklofiliny D/IP3R1. Ten test ma kilka zalet w porównaniu z innymi procedurami obrazowania, ponieważ jest wysoce specyficzny, czuły i nadaje się do testów wielowarunkowych. Dlatego zastosowanie tego testu ligacji zbliżeniowej in situ powinno być pomocne w lepszym zrozumieniu fizjologicznych regulacji interakcji ER-mitochondria, a także ich roli w kontekstach patologicznych.

Wprowadzenie

Mitochondria i retikulum endoplazmatyczne (ER) nie są niezależnymi organellami w komórce, lecz oddziałują ze sobą strukturalnie i funkcjonalnie w miejscach kontaktu definiowanych jako błony retikulum endoplazmatycznego stowarzyszone z mitochondriami (MAM). W rzeczywistości MAM odpowiadają regionom, w których błony ER i mitochondriów ściśle do siebie przylegają, co umożliwia oddziaływania między białkami z obu stron. Niemniej jednak błony tych organelli nie łączą się w tych regionach, dzięki czemu zachowują one swoją odrębność. MAM odgrywają kluczową rolę w transporcie wapnia (Ca2+) i fosfolipidów z ER do mitochondriów, wpływając na metabolizm energetyczny i przeżywalność komórek1-3.

Powiązania między siateczką śródplazmatyczną (ER) a mitochondriami zostały po raz pierwszy zobrazowane w latach 70. XX wieku za pomocą mikroskopii elektronowej. Od tego czasu klasycznie stosowano transmisyjną mikroskopię elektronową4,5, tomografię elektronową6,7 lub immunolokalizację fluoroforów/białek fluorescencyjnych specyficznych dla ER i mitochondriów8 w celu badania oddziaływań ER-mitochondria. Innym użytecznym narzędziem do analizy MAM jest frakcjonowanie subkomórkowe. Pozwala ono na izolację frakcji MAM poprzez różnicowe ultrawirowanie w połączeniu z gradientem Percoll9. Jednakże produkt końcowy zawiera wzbogacone frakcje MAM, a nie frakcje czyste. Łącznie strategie te nie są szczególnie czułe i/lub ilościowe oraz nie nadają się do łatwego prowadzenia szerokich badań przesiewowych. Alternatywnie pojawiły się podejścia genetyczne z wykorzystaniem indukowanych lekiem fluorescencyjnych łączników międzyorganellowych, lecz nie pozwalają one na analizę oddziaływań organelli przy endogennych poziomach ekspresji białek10.

W oparciu o odkrycie kompleksu IP3R/GRP75/VDAC w obszarze MAM11 dokonane przez Szabadkai, opracowaliśmy ilościową metodę analizy oddziaływań między siateczką śródplazmatyczną (ER) a mitochondriami. Wykorzystaliśmy test ligacji bliskości in situ (proximity ligation assay), aby wykryć i określić ilość oddziaływań pomiędzy VDAC1 a IP3R1, dwoma białkami powierzchni organelli uczestniczącymi w kompleksie kanałów Ca2+ na styku MAM w utrwalonych komórkach12. W skrócie, badaliśmy VDAC1 w zewnętrznej błonie mitochondrialnej (mysi przeciwciało pierwszorzędowe anty-VDAC1) oraz IP3R1 w błonie ER (królicze przeciwciało pierwszorzędowe anty-IP3R1) (Rysunek 1, panel a). Następnie, zgodnie z procedurą testu, dodaliśmy zarówno przeciwciała IgG anty-mysie, jak i anty-królicze (sondy do testu ligacji bliskości dla myszy i królika), które są sprzężone z komplementarnymi rozszerzeniami oligonukleotydowymi. Jeśli dwa docelowe białka znajdują się w odległości mniejszej niż 40 nm, oligonukleotydy mogą zhybrydyzować z dodanymi później oligonukleotydami łącznikowymi, co umożliwia utworzenie kolistego szablonu DNA (Rysunek 1, panel b). Ta kolista cząsteczka DNA jest ligowana i amplifikowana, tworząc jednoniciowy produkt DNA kowalencyjnie przyłączony do jednej z sond bliskości (Rysunek 1, panel c). Ponieważ odległość między ER a mitochondriami na styku MAM wynosi od 10 nm do 25 nm6, możliwe jest przeprowadzenie ligacji bliskości i amplifikacji, co prowadzi do późniejszej detekcji dzięki hybrydyzacji sond oligonukleotydowych znakowanych Texas red (Rysunek 1, panel d). Każda fluorescencyjna kropka reprezentuje oddziaływania między VDAC1/IP3R1, co pozwala na ilościowe określenie oddziaływań ER-mitochondria in situ w pojedynczych komórkach.

Schemat interakcji mitochondria z ER; białka VDAC i IP3R; ilustracja szlaku sygnalizacji komórkowej.
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie detekcji oddziaływań między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami za pomocą In situ Analiza ligacji bliskości (Proximity Ligation Assay). a) mysi przeciwciało pierwotne skierowane przeciwko VDAC1 oraz królicze przeciwciało pierwotne skierowane przeciwko IP3R1 mogą wiązać się z ich epitopami w bliskiej odległości na interfejsie MAM, b) Dodanie pary sond do ligacji zbliżeniowej skierowanych przeciwko IgG mysiego i króliczego. Sondy te posiadają przyłączone nici DNA, które mogą stanowić matryce do ligacji oligonukleotydów łączących. c) Kolista nić DNA powstała po ligacji może zostać poddana amplifikacji i d) wizualizowane za pomocą mikroskopii jako fluorescencyjna kropka z wykorzystaniem oligonukleotydów znakowanych Texas Red. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Podobne eksperymenty z wykorzystaniem testu ligacji w pobliżu in situ można przeprowadzić z użyciem pary przeciwciał GRP75/IP3R1, a także przeciwciał cyklofiliny D (CypD)/IP3R1, biorąc pod uwagę, że wykazano interakcję CypD z kompleksem IP3R/GRP75/VDAC na styku MAM12-14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotować 10% formaldehydu w PBS (o niskiej zawartości soli), rozcieńczając 5,5 ml 37% formaldehydu w 14,5 ml PBS. Przygotować 1 M glicynę o pH 8,0, rozpuszczając 3,8 g glicyny w 50 ml PBS; rozcieńczyć ten roztwór, aby uzyskać 100 mM glicyny w 1x PBS.
  2. Przygotuj 0,1% Triton-X100 w 1x PBS. Przygotować 20x sól fizjologiczną cytrynianu sodu (SSC) używając 3,0 M chlorku sodu i 0,30 M cytrynianu trisodowego przygotowanych w dejonizowanym buforze wodnym o pH 7,0 w temperaturze 25 °C. Rozcieńczyć ten bufor do 1x i 0,01x przy użyciu wody dejonizowanej.

2. Utrwalanie komórek

UWAGA: W tym badaniu użyliśmy linii komórkowej raka wątroby HuH7, ale ta metoda ma zastosowanie do innych przylegających kultur komórkowych.

  1. Płytki komórek HuH7 (hodowanych w DMEM 1 g / l glukozy, uzupełnionych 10% płodową surowicą cielęcą i 0,01% bulionu penicyliny-streptomycyny) w 150 000 komórek na niepowlekane naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Podczas pracy na pierwotnych hodowlach komórkowych używaj naczyń pokrytych kolagenem.
  2. Następnego dnia usuń pożywkę hodowlaną. Przemyć komórki 1 ml PBS i aspirat. Utrwalić komórki, dodając 1 ml formaldehydu 10% i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) pod mieszaniem.
  3. Zatrzymać reakcję za pomocą 1 ml 1 M glicyny i mieszać na zmianę. Usunąć roztwór reakcji zatrzymającej i przemyć komórki, dodając 1 ml 1x PBS; mieszać przez obracanie i aspirować. Dodać 1 ml 100 mM glicyny do komórek i inkubować je przez 15 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem, a następnie aspirować.
    UWAGA: W tym miejscu można zatrzymać protokół, a kolejne kroki można odłożyć na inny dzień. W takim przypadku dodać 1 ml 100 mM glicyny i w razie potrzeby utrzymywać w temperaturze 4 °C.

3. Przepuszczalność komórek

  1. Dodać 1 ml 0,1% Triton-X100 do 1x PBS, inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem, a następnie aspirować. Ten czas inkubacji można wydłużyć do 15 - 20 minut podczas pracy na pierwotnych hodowlach komórkowych (np. pierwotnych hepatocytach myszy). Umyj komórki, dodając 1 ml 1x PBS; Aspirować.

4. Blokowanie

  1. Dodać 40 μl roztworu blokującego do każdej próbki (dostarczonej przez zestaw); objętość tę można zwiększyć w celu pokrycia próbki. Inkubować szalki przez 30 minut w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej.
  2. Stuknij roztwór blokujący z naczyń. Staraj się uzyskać równe objętości resztkowe dla każdego szkiełka, ponieważ wpłynie to na odtwarzalność. Nie dopuścić do wyschnięcia próbek!

5. Przeciwciała pierwotne

  1. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w 1x PBS i dodać roztwór do szalek (przeciwciało myszy VDAC1: 1/100, przeciwciało królika IP3R1: 1/500). Alternatywnie zamiast VDAC1 można zastosować przeciwciała GRP75 lub CypD (oba przeciwciała mysie stosowane w stosunku 1/500).
  2. Inkubować przez noc w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C. Umyć szkiełka dwa razy za pomocą Tris Buffered Saline with 0,01% Tween (TBS-T).

6. Sondy do ligacji zbliżeniowej

  1. Sondy do ligacji zbliżeniowej są dostarczane przez zestaw. Wybierz sondy zgodnie z gatunkami przeciwciał pierwszorzędowych.
  2. Przygotować dwie sondy do oznaczania ligacji zbliżeniowej w stosunku 1:5 w rozcieńczalniku przeciwciał. Pozostawić mieszaninę na 20 minut w temperaturze pokojowej tonacji. Dodać rozcieńczony roztwór sondy do ligacji zbliżeniowej. Inkubować naczynia w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Umyć naczynia dwa razy za pomocą TBS-T.

7. Podwiązanie

  1. Użyj odczynnika do wykrywania in situ Texas red kit.
  2. Rozcieńczyć 5x podwiązanie (dostarczone przez zestaw) w stosunku 1:5 w wodzie o wysokiej czystości i dobrze wymieszać. Rozcieńczyć ligazę w 1x roztworze ligacyjnym (dostarczonym przez zestaw) 1:40 i wirować. Poczekaj z dodaniem ligazy do momentu bezpośrednio przed dodaniem do próbek.
  3. Dodać ten roztwór do każdej próbki (40 μl dla naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm) i inkubować szkiełka w wstępnie podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Umyć szkiełka dwa razy za pomocą TBS-T.

8. Wzmocnienie

UWAGA: Bądź ostrożny, odczynniki wrażliwe na światło.

  1. Rozcieńczyć 5-krotny materiał wzmacniający (dostarczony przez zestaw) 1:5 w wodzie o wysokiej czystości. Wyjmij polimerazę z zamrażarki za pomocą bloku zamrażającego (-20 °C). Rozcieńczyć polimerazę (dostarczoną przez zestaw) w stosunku 1:80 w roztworze 1x amplifikacyjnym i wirować. Dodaj polimerazę bezpośrednio przed użyciem mieszaniny.
  2. Dodać ten roztwór do każdej próbki (40 μl dla naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm). Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 100 minut w temperaturze 37 °C. Stuknąć roztwór polimerazy amplifikacyjnej ze szkiełek.

9. Końcowe pranie

  1. Myć szkiełka w 1x buforze myjącym SSC przez 2 min. Myć szkiełka w 0,01x buforze myjącym SSC przez 2 min. Pozostaw naczynia do wyschnięcia w temperaturze RT w ciemności.

10. Przygotowanie do obrazowania

  1. Zamontuj szkiełka przy użyciu minimalnej objętości medium montażowego zawierającego DAPI (wodnego i nie krzepnie), upewniając się, że żadne pęcherzyki powietrza nie dostaną się pod szkiełko nakrywkowe. Do uszczelnienia krawędzi można użyć lakieru do paznokci. Odczekaj około 15 minut przed analizą za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego (wzbudzenie: 594 nm, emisja: 624 nm, powiększenie: 63X).
  2. Po zobrazowaniu przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C w ciemności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W oparciu o nasze doświadczenie w stosowaniu tego protokołu, możemy z pełnym przekonaniem polecić tę metodę do wizualizacji i kwantyfikacji oddziaływań między siateczką endoplazmatyczną (ER) a mitochondriami w utrwalonych komórkach. Przedstawiono reprezentatywne obrazy oddziaływań ER-mitochondria wizualizowanych za pomocą testu bliskości ligacji in situ w linii komórkowej raka wątroby HuH7, przy użyciu kilku par przeciwciał. Jak pokazano na Rysunku 2 za pomocą mi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podsumowując, nasze badania wskazują, że test ligacji zbliżeniowej in situ jest naprawdę istotną strategią do śledzenia i ilościowego określania endogennych interakcji ER-mitochondriów w stałych komórkach, bez konieczności stosowania fluoroforów specyficznych dla organelli lub białek fluorescencyjnych. Specyficzne zastosowanie przeciwciał VDAC1/IP3R1 zostało dostosowane do badania interakcji ER-mitochondria w komórkach HuH7. Można jednak stosować alternatywne izoformy VDAC i IP3R, w zależności od typu ogniwa. W ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim osobom w naszym laboratorium, które przyczyniły się do optymalizacji i walidacji protokołu. Prace te były wspierane przez INSERM i narodową agencję badawczą (ANR-09-JCJC-0116 I ANR-11-BSV1-033-02). Podczas studiów doktoranckich E.T. otrzymała stypendium naukowe we francuskim ministerstwie szkolnictwa wyższego i badań naukowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FormaldehydSigmaF-8775
GlycineSigmaG-8898
TritonSigmaT8532
35 mm Naczynia hodowlane ze szklanym dnemMatTeK corporationP35G-0-14-C
Rozwiązanie blokująceSigmaDUO-92004 lub DUO-92002dostarczane w sondach Duolink PLA, przeciwciało Sigma
VDAC1Abcamab14734
IP3R1-H80 przeciwciałoSanta Cruzsc28614
Przeciwciało CypDAbcamab110324
Grp75 przeciwciałoSanta Cruzsc13967
TBS 10xeuromedexET220Rozcieńczyć do uzyskania 1x
Tween 100xeuromedex2001-Brozcieńczyć w TBS w celu uzyskania 0,01%
PLA Probes Mouse MINUSSigmaDUO-92004Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUSSigmaDUO-92002Duolink, Sigma
Duolink odczynniki detekcyjne czerwoneSigmaDUO-92008Duolink,
Sigma Ligation solutionSigmaDUO-92008Część odczynników detekcyjnych Duolink czerwony, Sigma
LigaseSigmaDUO-92008Część odczynników detekcyjnych Duolink czerwona, roztwór wzmacniający Sigma
DUO-92008Część odczynników detekcyjnych Duolink czerwona, Sigma
PolymeraseSigmaDUO-92008Część odczynników detekcyjnych Duolink czerwona, Sigma
Duolink Mounting MediumSigmaDUO80102Duolink, Sigma
Softwares
do wyszukiwania obiektów blobBlobFinder to swobodnie dystrybuowane oprogramowanie, które może wykonywać obliczenia na komórkach z obrazów mikroskopii fluorescencyjnej. Oprogramowanie to można pobrać bezpłatnie z Centrum Analizy Obrazów Uniwersytetu w Uppsali, które opracowało oprogramowanie, a prace były wspierane przez projekt ENLIGHT i Olink Bioscience w ramach 6PR. Oprogramowanie
ImageJmożna pobrać bezpłatnie ze strony: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Oprogramowanie http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm

Bibliografia

  1. Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
  2. Giorgi, C., et al. Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications. Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).
  3. Phillips, M. J., Voeltz, G. K. Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles. Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).
  4. Cosson, P., et al. The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes. PLoS One. 7, 39169(2012).
  5. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).
  6. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).
  7. Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum. Biofactors. 8, 225-228 (1998).
  8. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280, 1763-1766 (1998).
  9. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).
  10. Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
  11. Szabadkai, G., et al. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels. J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).
  12. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).
  13. Paillard, M., et al. Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury. Circulation. 128, 1555-1565 (2013).
  14. Rieusset, J., et al. Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance. Diabetologia. 59, 614-623 (2016).
  15. Allalou, A., Wahlby, C. BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry. Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).
  16. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of molecular cell biology. , (2016).
  17. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
  18. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature methods. 3, 995-1000 (2006).
  19. De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane. FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).
  20. Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. Mortalin: present and prospective. Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interakcje siateczki r dplazmatycznej z mitochondriamib ony zwi zane z mitochondriamikompleks VDAC1 IP3R1obrazowanie utrwalonych kom rekprotok testu ligacji w blisko cikwantyfikacja kontakt w mi dzy ER a mitochondriamikompleks kana w wapniowychpara GRP75 IP3R1cyklofilina D IP3R1
Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.