Artykuł metodologiczny

Analiza przestrzenna i czasowa aktywnego ERK w linii rozrodczej C. elegans

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54901

⸱

29 listopada 2016

 , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy metodę obrazowania immunofluorescencyjnego opartą na przestrzennej i czasowej lokalizacji aktywnego ERK w wypreparowanej gonadzie C. elegans. Opisany tutaj protokół może być dostosowany do wizualizacji dowolnego białka sygnalizacyjnego lub strukturalnego w gonadzie C. elegans, pod warunkiem, że dostępny jest odpowiedni odczynnik przeciwciała.

Streszczenie

Ewolucyjnie zachowany szlak sygnału zewnątrzkomórkowego transdukujący RTK-RAS-ERK jest ważną kaskadą sygnalizacji kinazy, która kontroluje wiele procesów komórkowych i rozwojowych, głównie poprzez aktywację ERK, końcowej kinazy szlaku. Ścisła regulacja aktywności ERK jest niezbędna do prawidłowego rozwoju i homeostazy; nadmiernie aktywny ERK powoduje nadmierną proliferację komórkową, podczas gdy niedostateczna ERK powoduje śmierć komórki. C. elegans to potężny system modelowy, który pomógł scharakteryzować funkcję i regulację szlaku sygnałowego RTK-RAS-ERK podczas rozwoju. W szczególności szlak RTK-RAS-ERK jest niezbędny do rozwoju linii zarodkowej C. elegans, na czym skupia się ta metoda. Stosując przeciwciała specyficzne dla aktywnej, difosforylowanej formy ERK (dpERK), można uwidocznić stereotypowy wzorzec lokalizacji w linii zarodkowej. Ponieważ wzorzec ten jest kontrolowany zarówno przestrzennie, jak i czasowo, zdolność do powtarzalnego oznaczania dpERK jest przydatna do identyfikacji regulatorów szlaku, które wpływają na czas trwania i amplitudę sygnału dpERK, a tym samym na rozwój linii zarodkowej. Tutaj pokazujemy, jak skutecznie preparować, barwić i obrazować dpERK w obrębie gonady C. elegans. Metoda ta może być dostosowana do lokalizacji przestrzennej dowolnego białka sygnałowego lub strukturalnego w gonadzie C. elegans, pod warunkiem, że dostępne jest przeciwciało zgodne z immunofluorescencją.

Wprowadzenie

Szlak kinazy tyrozynowej receptora (RTK)-mięsaka RAt (RAS)-Kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) przekazuje sygnały zewnątrzkomórkowe przez konserwatywną kaskadę kinazy, która powoduje fosforylację i aktywację ERK1-3. Białka ERK należą do konserwatywnej rodziny kinaz MAP (Mitogen Activated Protein) seryny/treoniny skierowanej proliną i są bezpośrednio aktywowane przez MEK poprzez podwójną fosforylację treoniny (T) i tyrozyny (Y) konserwatywnego motywu TEY. Aktywny ERK (określany jako difosforylowany ERK lub dpERK) następnie reguluje wiele procesów komórkowych i rozwojowych poprzez fosforylację baterii dalszych substratów1-3. Tak więc nieprawidłowa aktywność ERK prowadzi do wielu wad komórkowych i rozwojowych4-7.

Ścisła regulacja aktywności ERK jest kluczowa dla normalnego rozwoju: w systemach ssaków zbyt duża aktywność ERK prowadzi do nadmiernej proliferacji komórek, co prowadzi do wzrostu onkogennego; zbyt mała aktywność prowadzi do śmierci komórki4,6. Dodatkowo, zmiany w czasie trwania aktywności ERK mogą również prowadzić do odmiennych wyników: w komórkach PC12 aktywacja ERK przez 30 minut lub krócej indukuje proliferację komórek, ale aktywacja ERK przez 60 minut lub dłużej indukuje różnicowanie neuronów8,9. Ścisła regulacja aktywności ERK jest zatem wyraźnie niezbędna dla prawidłowego rozwoju i homeostazy.

C. elegans to potężny i genetycznie plastyczny system modelowy do analizy funkcji i regulacji szlaku sygnałowego RTK-RAS-ERK3,10-15. W porównaniu z systemami ssaków, które zawierają wiele genów dla RAS i ERK, C. elegans zawiera jeden gen RAS (let-60) i jeden gen ERK (mpk-1), co czyni go genetycznie łatwiejszym systemem, w którym można przeanalizować funkcję tego szlaku3,10-14. Linia zarodkowa C. elegans jest zasadniczo rurką, która składa się z mitotycznych komórek macierzystych na jej dystalnym końcu i dojrzałych oocytów na jej bliższym końcu (ryc. 1)16. Komórki rozrodcze inicjują mejozę tuż proksymalnie do dystalnej strefy mitotycznej i przechodzą przez rozszerzoną profazę mejotyczną (pachyten), po czym zaczynają tworzyć oocyty w okolicy pętli, ostatecznie przechodząc dojrzewanie oocytów w regionie proksymalnym16.

Badania genetyczne z wielu laboratoriów, w tym z naszego, wykazały, że szlak RTK-RAS-ERK jest niezbędny do rozwoju linii zarodkowej u C. elegans12,13,15,17-19. W szczególności odkryliśmy, że ERK kontroluje i koordynuje co najmniej dziewięć odrębnych procesów biologicznych podczas rozwoju linii zarodkowej, począwszy od przełączników rozwojowych, takich jak apoptoza komórek rozrodczych, po procesy biologiczne komórek, takie jak wzrost oocytów11,18. Podobnie jak w systemach ssaków, zbyt duża aktywność ERK w linii rozrodczej C. elegans powoduje produkcję wielu małych oocytów, podczas gdy zbyt mała aktywność powoduje powstanie jednego dużego oocytu11. Tak więc ścisła regulacja dpERK jest niezbędna do prawidłowego rozwoju linii zarodkowej. Aktywna forma ERK, uwidoczniona przez przeciwciało specyficzne dla dpERK, wykazuje stereotypowy, dynamiczny, bimodalny wzorzec lokalizacji: dpERK jest wysoki w środkowym pachytenie (strefa 1, ryc. 1), niski w regionie pętli i ponownie wysoki w dojrzałych oocytach (strefa 2, ryc. 1). Niedawno odkryliśmy, że odżywianie działa poprzez receptor insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 (daf-2) w celu aktywacji ERK w strefie 112; wcześniejsze prace wykazały, że sygnał plemnika (poprzez kinazę tyrozynową receptora Efryny) aktywuje ERK w strefie 213.

Biorąc pod uwagę, że aktywny ERK funkcjonuje jako reostat w linii zarodkowej regulujący wzrost oocytów, lokalizacja przestrzenna i czasowa, a także amplituda dpERK, jest kluczem do zrozumienia jego normalnego wyniku sygnalizacji. Za pomocą opisanej tutaj metody można łatwo monitorować zmiany w stereotypowej lokalizacji dpERK i wyprowadzać prognozy dotyczące wpływu zaburzeń środowiskowych lub genetycznych na aktywność ERK, a tym samym na funkcjonowanie. W związku z tym oznaczanie dpERK umożliwia kompleksowe zrozumienie jego roli podczas rozwoju linii zarodkowej.

Protokół

Opisany tutaj protokół dotyczy przede wszystkim modelowego systemu bezkręgowców C. elegans i jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi etycznymi określonymi przez instytucję.

1. Opieka nad zwierzętami

  1. Utrzymuj robocze kultury podstawowe C. elegans na agarze Nematode Growth Ground20,21 (NGM, patrz tabela materiałów) wysianym E. coli OP50.
  2. Utrzymuj stada robaków w temperaturach od 16 °C do 25 °C.
    UWAGA: Hodowla robaków w wyższych temperaturach skutkuje szybszym tempem wzrostu, często nieprawidłowym rozwojem linii zarodkowej i mniejszymi rozmiarami lęgów. Dodatkowo, genotypy wrażliwe na temperaturę będą wykazywać różne fenotypy w różnych temperaturach.
  3. Przenoś robaki na nowe płytki NGM co 2 - 3 dni, w zależności od ich tempa wzrostu, aby utrzymać stały dopływ dobrze odżywionych robaków.
    UWAGA: W każdym eksperymencie obejmującym poziomy dpERK, robaki NIE powinny być pozyskiwane z wygłodzonej lub zatłoczonej płytki. Stłoczenie lub głód wpływa na sygnalizację insuliny u robaków22, a sygnalizacja insuliny reguluje aktywność ERK12. W ten sposób robaki z wygłodzonych lub przepełnionych talerzy spowodują zmienne i trudne do odtworzenia wzory barwienia.

2. Sekcja dorosłych robaków w celu uzyskania gonad

  1. Pobrać 100 - 150 WT (N2) lub pożądany genotyp robaków w pożądanym i specyficznym stadium rozwoju (L1, L2, L3, L4, dorosłe itp.) w 100 μl buforu M9 w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Napełnij probówkę mikrowirówki 900 μl buforu M9 (patrz tabela materiałów). Odwirować probówki o stężeniu 1 000 x g w mikrowirówce przez 1 minutę w temperaturze otoczenia.
  3. Delikatnie usunąć 900 μl buforu M9 i wyrzucić. Usuń bufor pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że robaki nie zostaną przypadkowo usunięte.
  4. Powtórz kroki 2.2 - 2.3 jeszcze dwa razy, za każdym razem z nowym buforem M9. Gwarantuje to, że wszelkie bakterie, które zostały przeniesione wraz z robakami, zostaną skutecznie zmyte.
  5. Po końcowym płukaniu należy wyjąć z probówki 900 μl buforu M9 i wyrzucić.
  6. Pozostałe 100 μl buforu M9 zawierającego 100 - 150 robaków z końcówką do mikropipet o pojemności 200 μl przenieść do szklanego naczynia do zegarka z płaskim dnem. Przed użyciem należy upewnić się, że końcówka mikropipety została przecięta w miejscu oznaczonym 10 μl. Brak przecięcia końcówki spowoduje ścinanie robaków.
  7. Dodać 1 - 3 μl 0,1 M lewamizolu do szklanego naczynia zegarka zawierającego robaki w buforze M9. Delikatnie zakręć lewamizolem i M9, aby umożliwić równomierne mieszanie, aż robaki przestaną się poruszać.
    UWAGA: Zapasy lewamizolu mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania. W tym przypadku należy zastosować wyższe stężenie 1 - 3 mM niż opisane w literaturze23 0,2 - 0,25 mM lewamizolu w celu uzyskania szybkiej utraty mobilności u zwierząt. Jeśli zwierzęta zbyt długo obdzierają się ze skóry w płynnej zawiesinie, wynikające z tego wzorce dpERK w gonadach mogą być zmienne (z powodu stresu lub braku odżywiania, lub obu). Bardziej powtarzalne wzory barwienia uzyskano przy użyciu 1 - 3 mM lewamizolu do sekcji.
  8. Podłącz dwie igły 25 G do dwóch strzykawek o pojemności 1 ml (rozmiar strzykawki nie ma znaczenia, grubość igły ma kluczowe znaczenie). Umieścić po jednej strzykawce w każdej ręce (Rysunek 2).
  9. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść każdą igłę pod i nad każdym robakiem, jak pokazano na rysunku 2 i umieść drobne nacięcie na robaku w pobliżu drugiej opuszki gardłowej ruchem przypominającym nożyce. Po jednym nacięciu robaka przejdź do następnego zwierzęcia, aż wszystkie zwierzęta w naczyniu zostaną przynajmniej raz pokrojone.
    UWAGA: Należy pamiętać, że kroki 2.8 - 2.9 są zależne od czasu. Wytnij wszystkie robaki w naczyniu w czasie krótszym niż pięć minut, aby uzyskać powtarzalny wzór dpECK. Dłuższe czasy rozbioru spowodują wyłączenie sygnału dpERK, szczególnie w strefie 1. Dostosuj liczbę robaków na rundę sekcji (tj. 50 robaków vs. 150), jeśli to konieczne, aby pozostać w wyznaczonym przedziale czasowym.
    1. W przypadku, gdy wyciśnięta gonada nie jest widoczna podczas sekcji, nie próbuj kolejnego cięcia w tym samym zwierzęciu. Zwykle powoduje to tylko ścinanie zwierzęcia i nie powoduje wytłaczania gonady. Zamiast tego przejdź do następnego zwierzęcia. Robaki, w których gonady nie wytłaczają się, pojawią się jako takie na szkiełkach, które zostaną wykonane w sekcji 6 i mogą być ignorowane podczas obrazowania
      UWAGA: Na wszystkich etapach sekcji i przetwarzania ważne jest, aby pamiętać, że gonada pozostanie przyczepiona do ciała/tuszy. Nie rozdzielaj gonady i ciała na siłę za pomocą igły. Często nieprawidłowe rozdarcie tkanki gonad w próbie odcięcia gonady od organizmu może skutkować fałszywym sygnałem przeciwciała. Ciało/tusza mogą być ignorowane podczas etapów obrazowania (sekcja 6), a obrazowana jest tylko gonada. Dodatkowo, czasami komórki jelitowe mogą również służyć jako wewnętrzne kontrole/kontrole somatyczne dla testowanego przeciwciała.

3. Fiksacja gonad

  1. Po zakończeniu sekcji dodać 2 ml 3% paraformaldehydu (PFA) bezpośrednio do szklanego naczynia zegarka zawierającego 100 μl M9 i wypreparowanych zwierząt i przykryć Parafilmem. Umieść zakrytą szklaną miskę zegarka w dygestoriach chemicznych.
    ostrożność: PFA jest niebezpieczną substancją chemiczną. Dlatego utrwalanie powinno odbywać się w dygestoriach chemicznych.
  2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  3. Za pomocą jednorazowej pipety Pasteura ze szkła 9" dodaj 3 ml 1x PBS-T (patrz tabela materiałów) do szklanej naczynia zegarka zawierającej wypreparowane zwierzęta. Wymieszaj, wciągając roztwór PFA i 1x PBS-T z wypreparowanymi zwierzętami do pipety Pasteura i delikatnie uwalniając z powrotem do szklanego naczynia zegarka. Nie obracaj rurek podczas prania.
  4. Za pomocą świeżej szklanej pipety Pasteura pobrać 5 ml płynu (zawierającego wypreparowane robaki, PFA i 1x PBS-T) ze szklanego naczynia zegarka do pipety Pasteura i przenieść zawartość do świeżej szklanej stożkowej probówki o pojemności 5 ml.
  5. Odwiruj stożkowe probówki przez 30 sekund w wirówce klinicznej o stężeniu 1,000 x g. Użyj szklanych pipet Pasteura i stożkowych probówek, ponieważ wypreparowane gonady przyklejają się do plastiku.
  6. Usunąć i wyrzucić szwaczony szwaczek, uważając, aby nie przeszkadzać rozbiorowanym zwierzętom. Usuń płyn po każdym myciu ze stożkowej rurki pod mikroskopem preparacyjnym, aby nie wpływać na wypreparowane gonady i zminimalizować ich utratę.
  7. Używając świeżej pipety Pasteura, dodaj 5 ml 1x PBS-T do stożkowych probówek. Odwirować stożkowe probówki w wirówce klinicznej przez 30 s przy 1,000 x g. Usunąć i wyrzucić szwaczony szwaczek, uważając, aby nie przeszkadzać rozbiorowanym zwierzętom.
  8. Powtórz krok 3.7 w sumie trzy razy.
  9. Używając świeżej pipety Pasteura, dodaj 2 ml 100% metanolu do probówek i delikatnie wymieszaj gonady z metanolem, pobierając do pipety Pasteura. Inkubować probówkę w temperaturze -20 °C przez minimum 1 h.
    UWAGA: Wypreparowane gonady można przechowywać w metanolu do 2 dni w celu barwienia dpECK. Przechowywanie przez więcej niż 2 dni i do 2 tygodni jest zgodne z innymi aplikacjami do barwienia przeciwciał, takimi jak przeciwciało anty-Lamina, ale nie z przeciwciałem dpECK.
  10. Po upływie pożądanego czasu inkubacji powtórzyć krok 3.7 w sumie trzy razy w celu umycia gonad. Nie obracaj rurek podczas prania. Po końcowym umyciu pozostaw 500 μL 1x PBS-T w stożkowej probówce o pojemności 5 ml.
  11. Za pomocą świeżej pipety Pasteura przenieś zawartość stożkowej szklanej probówki do świeżej szklanej probówki o pojemności 1 ml (6 mm x 50 mm). Pozwól wypreparowanym zwierzętom osiąść grawitacyjnie przez 5 - 10 minut.
  12. Używając świeżej pipety Pasteura i pod mikroskopem preparacyjnym, usuń jak najwięcej płynu ze szklanych probówek o pojemności 1 ml, nie naruszając wypreparowanych gonad.

4. Blokowanie i leczenie przeciwciałami pierwotnymi

  1. Dodaj 100 μl 30% normalnej surowicy koziej (NGS) rozcieńczonej w 1x PBS-T (patrz tabela materiałów) do wypreparowanych zwierząt w szklanych probówkach o pojemności 1 ml. 30% NGS służy jako bufor blokujący. Przykryj probówkę Parafilmem, aby uniknąć odparowania płynu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Po upływie pożądanego czasu inkubacji usunąć bufor blokujący za pomocą świeżej pipety Pasteura, usuwając jak najwięcej płynu. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że gonady nie zostały pobrane w pipecie Pasteura.
  3. Rozcieńczyć przeciwciało MAPKYT (patrz Tabela materiałów, określane w niniejszej metodzie jako dpERK) w stosunku 1:400 w 30% NGS. Przygotować wystarczającą ilość rozcieńczenia przeciwciała, aby użyć 100 μl na probówkę. Niewykorzystane, rozcieńczone przeciwciało można przechowywać w temperaturze 4 °C przez tydzień.
  4. Dodać 100 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciała anty-dpERK do szklanych probówek o pojemności 1 ml zawierających wypreparowane zwierzęta. Uszczelnij probówki za pomocą Parafilm. Inkubować probówki w temperaturze 4 °C przez noc.
  5. Po całonocnej inkubacji dodać 800 μl 1x PBST do probówek w temperaturze pokojowej.
  6. Pobrać próbkę do świeżej szklanej pipety Pasteura i delikatnie zwolnić, aby upewnić się, że gonady są równomiernie zawieszone w 1x PBS-T. Niech gonady osiądą na dnie z grawitacją. Usunąć supernatant. Gwarantuje to, że wypreparowane gonady są myte, ale nie uszkadzane podczas procesu.
  7. Powtórz kroki 4.5 - 4.6, co daje w sumie trzy prania. Nie obracaj rurek podczas prania. Po trzecim praniu należy usunąć i wyrzucić jak najwięcej supernatantu, nie przeszkadzając wypreparowanym zwierzętom. Upewnij się, że za każdym razem używana jest świeża pipeta Pasteura.

5. Wtórne leczenie przeciwciałami

  1. Podczas płukania przeciwciał pierwszorzędowych należy przygotować rozcieńczenie dla przeciwciała drugorzędowego. Rozcieńczyć drugorzędowe przeciwciało anty-mysie w stosunku 1:500 w 30% NGS. Podobnie jak w przypadku przeciwciała pierwszorzędowego, użyj 100 μl na probówkę. Niewykorzystane przeciwciało można przechowywać w temperaturze 4 °C przez tydzień.
  2. Dodać 100 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do 1 ml szklanych probówek zawierających wypreparowane zwierzęta. Przykryj każdą tubkę Parafilmem, a następnie zawiń probówki w folię aluminiową, aby zawartość probówki była ciemna. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub alternatywnie w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Po pożądanym czasie inkubacji dodać 800 μL 1x PBS-T do probówek i powtórzyć kroki 4,5 - 4,6, w sumie trzy razy. Po ostatnim płukaniu usunąć i wyrzucić jak najwięcej supernatantu pod mikroskopem preparacyjnym przy użyciu świeżej pipety Pasteura.
  4. Przygotuj roztwór DAPI podczas płukania dla przeciwciała wtórnego. Rozcieńczyć 1 μl DAPI (z 1,000x zapasu 1 mg/ml przechowywanego w temperaturze -20 °C) w 1 ml 1x PBST.
  5. Dodać 800 μl rozcieńczonego roztworu DAPI do probówek zawierających wypreparowane zwierzęta. Przykryj wylot probówki Parafilmem i zawiń każdą tubkę w folię aluminiową. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  6. Po inkubacji z DAPI usunąć jak najwięcej roztworu DAPI za pomocą świeżej pipety Pasteura, pod mikroskopem preparacyjnym, aby nie przeszkadzać wypreparowanym zwierzętom.
  7. Dodaj 1 kroplę roztworu montażowego do rurek. Owiń każdą tubę folią aluminiową.
    UWAGA: W celu wizualizacji barwienia dpERK należy natychmiast zamontować barwione gonady do mikroskopii. W przypadku innych zastosowań przeciwciał, takich jak fosforylowana seryna 10 histon H3, gonady można przechowywać w pożywce montażowej do 2 tygodni w temperaturze 4 °C w ciemności.

6. Montaż preparatów i obrazowanie

  1. Umieść warstwę taśmy laboratoryjnej wzdłuż, na wierzchu, dwóch szklanych szkiełek mikroskopowych (25 mm x 75 mm x 1 mm), jak pokazano na rysunku 3. Umieść świeże, czyste szkło mikroskopowe między dwoma zaklejonymi taśmą szkiełkami.
    UWAGA: Grubość taśmy pomaga wytworzyć podkładkę agarozową na środkowym suwaku. Grubość podkładki agarozowej jest prawie równa grubości taśmy, ponieważ taśma służy jako przekładka do tworzenia podkładki agarozowej.
  2. Upuść ~ 200 μL stopionej 2% agarozy (wytworzonej w wodzie destylowanej) na szkiełko mikroskopowe pośrodku. Szybko umieść świeże, czyste szkiełko agarozy, prostopadle do i na górze.
  3. Niech agaroza zastygnie (1 - 2 min).
  4. Zdejmij górne szkiełko mikroskopu bardzo delikatnie, tak aby podkładka agarozowa nie została zniszczona. Podkładka agarozowa może pozostać przymocowana do górnego lub dolnego suwaka. Nie ma znaczenia, do której prowadnicy pozostaje przyczepiona podkładka agarozowa, o ile jest to gładka powierzchnia agarozy.
  5. Za pomocą pipety Pasteura przenieś wypreparowane zwierzęta na podkładkę agarozową. Usunąć nadmiar płynu ze szkiełka za pomocą pipety Pasteura pod mikroskopem preparacyjnym.
  6. Za pomocą włosków rzęs lub drobno narysowanych naczyń włosowatych odepchnij gonady i jelita od siebie, aby rozłożyć gonady na szkiełku.
  7. Przykryj szkiełko mikroskopowe szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 50 mm. Należy upewnić się, że szkiełko nakrywkowe jest delikatnie opuszczane na szkiełko, tak aby między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem powstawały minimalne pęcherzyki powietrza.
  8. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc w pudełku na szkiełka podstawowe (nieprzezroczyste pudełko na szkiełka podstawowe z szkiełkami leżącymi płasko, szkiełkiem nakrywkowym do góry), aby umożliwić odparowanie nadmiaru płynu i nieznaczne spłaszczenie gonad (ze względu na ciężar szkiełka nakrywkowego na gonadach). Nieznaczne spłaszczenie gonad pozwala na lepsze obrazowanie okrągłej rurki gonadalnej.
    1. Po zamontowaniu szkiełka nakrywkowego nie należy naciskać palcami na górną część szkiełka nakrywkowego. Często powoduje to zniekształcenia gonad i utratę sygnału dpRK.
    2. Spłaszcz gonady przez noc tylko w celu bardziej efektywnego obrazowania. Slajdy są gotowe do oglądania zaraz po ich złożeniu. Aby natychmiast zrobić zdjęcia, delikatnie wchłoń nadmiar płynu między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem z rogów za pomocą czystej chusteczki laboratoryjnej.
  9. Po upływie nocy uszczelnij szkiełko i szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem nawierzchniowym do paznokci w czterech rogach szkiełka nakrywkowego i granicy szkiełka. Uszczelka lakieru do paznokci/szkiełka nakrywkowego zapewnia, że szkiełko nakrywkowe nie przesuwa się podczas obrazowania i chroni przed zniszczeniem próbek.
  10. Zobrazuj gonady za pomocą mikroskopu złożonego z prędkością 63X. Jednak obiektyw, soczewkę i mikroskop można zmieniać w zależności od dostępności mikroskopów i zastosowania użytkownika. Ponieważ rozmiar całej gonady od regionu proliferacyjnego do oocytów jest większy, niż można uchwycić na jednym obrazie, obrazy są wykonywane jako montaż z nakładającymi się granicami, jak pokazano na rysunku 4. 11-14, 18.
    1. W wielu przypadkach tuszę należy edytować po ostatecznym obrazowaniu i złożeniu, o ile nie zostaną wprowadzone żadne poważne zmiany w obrazie linii zarodkowej. Przechowuj surowe obrazy wzdłuż zmontowanego obrazu, aby umożliwić porównanie "przed" montażem/edycją i "po" montażu/edycji obrazów.
      UWAGA: Obrazy mikroskopowe nie mogą być zmieniane pod kątem siły sygnału lub nasycenia podczas montażu montażu.

Wyniki

U dorosłych zwierząt hermafrodytycznych typu WT, dpERK jest zazwyczaj widoczny w regionie środkowego pachytenu, w Strefie 1, oraz w najbardziej dojrzałych oocytach od -1 do -4 lub -5 (Strefa 2). Zaburzenia tego wzorca aktywacji odzwierciedlają zmiany w szlaku sygnalizacyjnym. Linie zarodkowe samic nie różnicują się w plemniki, w związku z czym nie wykazują aktywacji ERK w Strefie 2, a jedynie słabą aktywację w Strefie 1. Są one przedstawione na Rysunku 5.

Schemat gonady C. elegans przedstawiający oocyty, pachiten i embriony do badań nad biologią rozwoju.
Rysunek 1: Morfologia linii zarodkowej C. elegans. Obraz z wykorzystaniem kontrastu interferencyjnego (DIC) dorosłego hermafrodyty, z zaznaczonym białą linią jednym ramieniem gonady w kształcie litery U. Dorosła gonada hermafrodyty zawiera komórki mitotyczne na dystalnym końcu. Komórki mitotyczne wchodzą w mejozę i przechodzą przez profazę mejozy (pachiten), przekształcając się w dojrzałe oocyty w proksymalnej części gonady. Strefa 1 i Strefa 2 wyznaczają stereotypową lokalizację dpERK w dorosłej gonadzie hermafrodyty. Skala: 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Mikroskop sekcyjny, strzykawka wstrzykująca, nicień, ustawienie eksperymentu, mikroskopia, badania biologiczne.
Rysunek 2: Prezentacja ułożenia igieł podczas sekcji. Po lewej: Zdjęcie przebiegającej sekcji. Po prawej: Pozycje igieł w odniesieniu do nicienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Proces przygotowania preparatu z agarem i taśmą; ustawienie laboratoryjne do obserwacji mikroskopowych.
Rycina 3: Demonstracja przygotowania szkiełka z agarozą. (A) Przykleić taśmę wzdłuż dwóch czystych szkiełek przedmiotowych. Umieścić świeże, czyste szkiełko przedmiotowe pomiędzy dwoma szkiełkami z taśmą, jak pokazano na schemacie. Trzy szkiełka znajdują się obok siebie wzdłuż. (B) Nalać stopioną agarozę na szkiełko znajdujące się w centrum. (C) Umieścić świeże szkiełko przedmiotowe prostopadle na górze środkowego szkiełka, na którym znajduje się kropla agarozy. (D) Odczekać do zastygnięcia agarozy. (E) Zdjąć górne szkiełko, pozostawiając zastygłą warstwę agarozy. Użyć dolnego szkiełka z warstwą agarozy do montażu wypreparowanych i zabarwionych linii zarodkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy, próbki barwione DAPI i dpERK, analiza lokalizacji białek, struktura komórkowa.
Rycina 4: Obrazowanie preparatów jako montaż. Montaż linii zarodkowej typu dzikiego w kanale DAPI (góra) i dpERK (dół). Obrazy wykonane przy powiększeniu 63X z nakładającymi się granicami; białe ramki dla paneli A i B oraz zielone ramki dla paneli B i C. Obrazy DAPI i dpERK dla każdego panelu zostały wykonane jednocześnie w dwóch różnych kanałach. Złożony obraz przedstawiono na Rycini 5A. Pasek skali: 20 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przebieg mejozy; dpERK, barwienie DNA w komórkach rozrodczych; mikroskopia fluorescencyjna, badanie mutacji fog-2.
Rysunek 5: Dynamiczna czasowa/przestrzenna aktywacja ERK. (A-C) Linie zarodkowe dorosłych (24 godziny po etapie mid-L4 rozwoju) hermafrodytów typu WT (N2) barwione na DNA (B, DAPI, biały) i dpERK (C, czerwony). Wyróżniono sygnał dpERK w Strefie 1, regionie pachitenowym, oraz w Strefie 2, dojrzałych oocytach. (D-F) fog-2(oz40) linie zarodkowe samic (8 h po etapie mid-L4 rozwoju) barwione na DNA (E, DAPI) i dpERK (F). Młode linie zarodkowe samic wykazują słaby sygnał dpERK w Strefie 1 oraz w pojedynczym oocycie w sposób niezależny od plemników. Strefa 2 jest zależna od plemników, a zatem nie występuje w linii zarodkowej samicy. Pasek skali: 20 μm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

Active ERK (dpERK) podąża za stereotypowym przestrzennym i dynamicznym wzorcem lokalizacji w linii zarodkowej C. elegans . Ten stereotypowy wzorzec przestrzenny dpERK (ryc. 5) i amplituda dorosłej gonady C. elegans mogą być skutecznie skorelowane z wieloma procesami biologicznymi, które ERK reguluje. Na przykład niezdolność do aktywacji ERK w strefie 2 powoduje zatrzymanie oocytów w profazie mejozy, fenotypu obserwowanego w żeńskich liniach zarodkowych, które nie określają plemników, a tym samym nie aktywują ERK w dojrzałych oocytach (ryc. 5). Krycie z samcami skutkuje efektywną akumulacją dpERK w strefie 2 w żeńskich liniach rozrodczych11,13, w połączeniu z początkiem dojrzewania oocytów i owulacji. Tak więc analiza wzorców przestrzennych i czasowej aktywacji dpERK w przypadku pewnych zaburzeń genetycznych (takich jak inaktywacja genów za pośrednictwem interferencji RNA) lub zabiegów chemicznych pozwala na identyfikację czynników regulujących sygnalizację ERK, a tym samym procesy biologiczne zależne od ERK. Takie analizy umożliwiają również odkrycie nowych interakcji genetycznych między szlakami sygnałowymi.

Krytycznym wąskim gardłem dla każdej analizy opartej na obrazowaniu jest dostępność funkcjonalnych odczynników, takich jak przeciwciała, które są specyficzne dla danego zastosowania. Jeśli taki odczynnik istnieje, metody takie jak opisana powyżej mogą być łatwo dostosowane do analizy wzorca lokalizacji dla dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Zastosowanie jest zatem ograniczone dostępnością działającego przeciwciała. Dodatkowo, ponieważ metoda opisuje rozbiór i barwienie w danym czasie rozwojowym, umożliwia ona uchwycenie informacji tylko w jednym przedziale czasowym i nie rzuca światła na dynamikę lub regulację białek w czasie rzeczywistym ani tempo obrotu białek.

Opisana powyżej metoda została zaadaptowana z Francis et al.23, która różni się od metody Seydoux i Dunna24 do ekstruzji gonad i barwienia przeciwciał. Metoda oparta na Francis i wsp. będzie nazywana dla porównania "metodą zawiesiny", a metoda Seydoux i Dunna nazywana "metodą krakingu zamrażalnego". Metoda zawiesiny okazała się bardzo skuteczna w naszych rękach w uzyskiwaniu powtarzalnych wzorców lokalizacji cząsteczek sygnałowych, takich jak dpERK, które są z natury bardziej wrażliwe na trudne warunki obsługi. W przypadku lokalizacji dpERK, z naszego doświadczenia wynika, że sygnał w strefie 1 jest praktycznie niewykrywalny metodą freeze crackingu. Ponadto suszenie próbki, które często może wystąpić w przypadku metody krakingu przez wymrażanie, powoduje fałszywe sygnały przeciwciał. Metoda zawiesinowa minimalizuje wysuszanie próbki, ponieważ gonady są zawieszone w cieczy przez cały proces. Odkryliśmy również, że metoda zawiesinowa jest przydatna do obrazowania wielu różnych genotypów na jednym szkiełku. Na przykład, jeśli dwa genotypy, takie jak hermafrodyty i samice, mają być bezpośrednio porównane pod kątem lokalizacji dpRK, oba genotypy można mieszać ze sobą i przetwarzać. Jest to możliwe, ponieważ fenotypy są odrębne i można je odróżnić za pomocą morfologii DAPI. Barwienie w tej samej probówce, a następnie obrazowanie na tym samym szkiełku pozwala na bezpośrednie porównanie gonad z różnych genotypów. Alternatywnie, jeśli morfologie DAPI nie są rozróżnialne, można zastosować dwuetapowe barwienie przeciwciałami. Najpierw każdy pojedynczy genotyp jest traktowany dwoma odrębnymi przeciwciałami, przeciwciałem A dla WT i przeciwciałem B dla mutanta (oba przeciwciała muszą być wyhodowane w gospodarzu innym niż przeciwciało dpERK). Po wybarwieniu dwóch genotypów przeciwciałem pierwotnym i umyciu, można je wymieszać razem w jednej probówce, a następnie wybarwić przeciwciałem dpECK, a następnie zastosować wtórne leczenie przeciwciałami w celu uwidocznienia wszystkich przeciwciał w probówce. Możliwość porównywania różnych genotypów na jednym szkiełku, zwłaszcza gdy dokonywane są dedukcje wzorców aktywacji, zapewnia dokładne interpretacje, na które nie mają wpływu różne warunki barwienia.

Chociaż jest to korzystne, w całej metodzie zawieszenia istnieje wiele etapów, które wymagają ostrożnej manipulacji. Bardzo ważne jest, aby sekcje odbywały się w sposób efektywny czasowo; Co ważne, sekcje nie powinny trwać dłużej niż 5 minut. Dłuższe czasy analizy skutkują zmiennym sygnałem dpERK, który często może być błędnie interpretowany jako regulowane zmiany w aktywacji ERK, a nie jako awarie techniczne. Bardzo ważne jest, aby zacząć od ponad 100 do 150 zwierząt na każdą sekcję, ponieważ na różnych etapach płukania gonady mogą łatwo zostać utracone z probówek z powodu błędów pipetowania. Utratę gonad można zmniejszyć albo przez preparację w wielu małych partiach (takich jak trzy partie po 50 zwierząt każda), które można połączyć, albo przez rozbiór jednej dużej partii 150 sztuk. Kolejnym wyzwaniem jest sprawienie, aby gonady leżały w dobrze rozmieszczonej formacji na szkiełku, tak aby można było zobrazować całą dystalną gonadę. Aby to umożliwić, użyj rzęsy na zapałce lub wyciągniętej pipety, aby rozmieścić gonady. Należy jednak zachować ostrożność, aby nie uszkodzić gonad podczas tego procesu. Często przy użyciu tych technik potrzeba wielu prób, aby opanować sekcje, a także ułożenie gonad na szkiełkach.

Po opanowaniu tej techniki służy ona jako potężna metoda do różnych analiz biologicznych i może być używana do badania nie tylko poziomów dpECK. Na przykład metoda ta może być wykorzystana do wizualizacji aktywnych poziomów p38 lub aktywnych poziomów CDK lub dowolnego białka, dla którego istnieje odczynnik przeciwciała. Ponadto metodę tę można połączyć z przesiewowym badaniem przesiewowym inhibicji chemicznej u całych zwierząt w celu oznaczenia nowych inhibitorów lub aktywatorów szlaku poprzez oznaczanie poziomów dpERK. Pozwoli to na odczyt in vivo zarówno reakcji, jak i wrażliwości na wszelkie inhibitory, które mogą wchodzić w interakcje ze szlakiem sygnałowym RTK-RAS-ERK. Co więcej, metoda ta może być stosowana w kombinacjach przeciwciał z wieloma wyjściami sygnalizacyjnymi, które mogą być używane i wizualizowane w tym samym czasie. Użycie wielu przeciwciał umożliwia korelację między wieloma szlakami, ich statusem aktywacji i wynikami w tej samej tkance, umożliwiając lepsze zrozumienie tych interakcji. To tylko kilka przykładów dalszych zastosowań tej metody, ale system ten może być modyfikowany w celu badania wielu zainteresowań badawczych.

Oświadczenia

Autorzy stwierdzili, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Podziękowania

Praca w Arur Lab jest wspierana przez granty z National Institutes of Health, NIHGM98200; Instytut Badań nad Profilaktyką Raka w Teksasie, CPRIT RP160023; Nagroda Naukowego Amerykańskiego Towarzystwa Onkologicznego (ACS RSG014-044-DDC); oraz przez Fundusze Anny Fuller.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaSigma Inc.A9539Rozpuścić 2 g w 100 ml, aby uzyskać 2% roztwór
Szklane naczynie do zegarka z płaskim dnemAgar ScientificAGL4161Używamy szkła, ponieważ wypreparowane gonady często przyklejają się do plastikowych
igieł 25 GBD PrecisionGlide305122
(mogą mieć 1 lub 5 ml)Strzykawki BD1 ml: BD 309659
Szkiełka mikroskopowe (25 x 75 x 1,0 mm)Fisherbrand12-550-343
Szkiełka nakrywkowe (24 x 50 mm)Corning2935-245
Szklana rurka stożkowa 5 mlCorning8060-5
9-calowa jednorazowa pipeta PasteuraFisherbrand13-678-20D
Kliniczna wirówka
stołowa Szklane probówki (6 x 50 mm)Fisherbrand14-958-A
*M9 roztwór
LewamizolSigmaL9756
3% paraformaldehyd (PFA)Usługi mikroskopii elektronowej17500Otrzymywany jako 16% roztwór w ampułkach i rozcieńczany do 3% w buforze fosforanu potasu
1x PBS-T1x PBS z 0,1% Tween 20
MetanolUsługi mikroskopii elektronowej18510
Koza normalna surowica (NGS)Sygnalizacja komórkowa5425Rozcieńczona do 30% w 1x przeciwciałie PBS-T
MAPKYT (dpERK) Sigma Inc.M9692Rozcieńczenie 1:400 w 30% NGS
Przeciwciało drugorzędoweInvitrogenA-11005Rozcieńczenie 1:500 w 30% NGS
DAPISigmaD9542
VectashieldVector LabsH-1000
*M9 Receptura3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 L. 
**PBS (1x)8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, 0,133 g CaCl2, 0,10 g MgCl2, H2O do 1 l
pożywki do wzrostu nicieni (NGM)3 g NaCl, 17 g agaru, 2,5 g peptonu, 975 ml wody w 2 l kolbie Erlenmayera. Autoklaw przez 50 min. Ostudzić i dodać 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu, 1 ml 1 M MgSO4 i 25 ml 1 M KPO4. 
Strzykawki bufora

Bibliografia

  1. Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410, 37-40 (2001).
  2. McKay, M. M., Morrison, D. K. Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK. Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).
  3. Sundaram, M. V. Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways. WormBook. , 1-38 (2013).
  4. Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer. Liver Int. 27, 155-162 (2007).
  5. Hackett, A., Rowe, L. FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report. Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).
  6. Murphy, L. O., Blenis, J. MAPK signal specificity: the right place at the right time. Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).
  7. Vogels, A., Fryns, J. P. Pfeiffer syndrome. Orphanet J Rare Dis. 1, 19(2006).
  8. Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells. Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80, 179-185 (1995).
  10. Chang, C., Sternberg, P. W. C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling. Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).
  11. Lee, M. H., et al. Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development. Genetics. 177, 2039-2062 (2007).
  12. Lopez, A. L., et al. DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis. Dev Cell. 27, 227-240 (2013).
  13. Miller, M. A., et al. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation. Science. 291, 2144-2147 (2001).
  14. Ohmachi, M., et al. C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation. Curr Biol. 12, 427-433 (2002).
  15. Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121, 2525-2535 (1995).
  16. Hubbard, E. J., Greenstein, D. The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology. Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).
  17. Arur, S., et al. MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module. Dev Cell. 20, 677-688 (2011).
  18. Arur, S., et al. Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).
  19. Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline. Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).
  20. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans. Genetics. 141, 1399-1406 (1995).
  23. Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139, 579-606 (1995).
  24. Seydoux, G., Dunn, M. A. Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster. Development. 124, 2191-2201 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Barwienie immunofluorescencyjneprotok sekcjiwizualizacja dpERKprzeciwcia o MAPKYTfiksacja paraforymialdehydempermeabilizacja metanolemprzemywanie w PBS Tprzeciwbarwienie DAPI
Analiza przestrzenna i czasowa aktywnego ERK w linii rozrodczej C. elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.