Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Macierze 2D i 3D do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54911

⸱

2 czerwca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM U1053, 2Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Tisch Cancer Institute, 3Faculté de Médecine, Casablanca, Université Mohammed 6 des Sciences de la Santé (UM6SS), 4Laboratoire National de Référence

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak przygotować mieszaną matrycę 2D, składającą się z żelatyny i kolagenu I, oraz wtyczkę 3D kolagenu I do badania liniowych inwadosomów. Protokoły te pozwalają na badanie liniowego tworzenia inwadosomu, aktywności degradacji macierzy oraz zdolności inwazji komórek pierwotnych i linii komórek rakowych.

Streszczenie

Przyleganie, migracja i inwazja komórek są zaangażowane w wiele procesów fizjologicznych i patologicznych. Na przykład podczas tworzenia przerzutów komórki nowotworowe muszą przekraczać bariery anatomiczne, aby zaatakować i migrować przez otaczającą tkankę, aby dotrzeć do naczyń krwionośnych lub limfatycznych. Wymaga to interakcji między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM). Na poziomie komórkowym wiele komórek, w tym większość komórek nowotworowych, jest w stanie tworzyć inwadosomy, które są strukturami opartymi na F-aktynie zdolnymi do degradacji ECM. Inwadosomy to wystające struktury aktynowe, które rekrutują i aktywują metaloproteinazy macierzy (MMP). Skład molekularny, gęstość, organizacja i sztywność ECM mają kluczowe znaczenie w regulacji tworzenia i aktywacji inwadosomu. In vitro test żelatyny jest standardowym testem stosowanym do obserwacji i ilościowego określenia aktywności degradacji inwadosomu. Jednak żelatyna, która jest denaturowanym kolagenem I, nie jest fizjologicznym elementem matrycy. Opracowano nowatorski test z wykorzystaniem włókien kolagenu typu I, który wykorzystano do wykazania, że ta fizjologiczna matryca jest silnym induktorem inwadosomów. Inwadosomy, które tworzą się wzdłuż włókien kolagenowych, są znane jako inwadosomy liniowe ze względu na ich liniową organizację na włóknach. Co więcej, analiza molekularna liniowych inwadosomów wykazała, że receptor domeny dyskoidyny 1 (DDR1) jest receptorem zaangażowanym w ich powstawanie. Dane te wyraźnie pokazują, jak ważne jest stosowanie fizjologicznie istotnej matrycy w celu zrozumienia złożonych interakcji między komórkami a ECM.

Wprowadzenie

Przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) zachodzi podczas procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak angiogeneza i inwazja komórek nowotworowych. W warunkach fizjologicznych wiele typów komórek, głównie z linii krwiotwórczej, jest zdolnych do degradacji elementów ECM. Na przykład makrofagi są w stanie przekraczać bariery anatomiczne, aby dotrzeć do tkanek, a osteoklasty degradują macierz kostną, aby zapewnić homeostazę wapnia. Mówiąc bardziej globalnie, wszystkie matryce w organizmie odnawiają się, aby zachować swoje właściwości fizyczne i chemiczne. W tkankach nowotworowych skład mikrośrodowiska guza ulega zmianie. Na przykład w raku piersi i płuc kolagen typu I ulega nadekspresji i gromadzi się wokół guza. Co więcej, ta kumulacja wiąże się ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia przerzutów1,2. Przerzuty nowotworowe są zależne od zdolności komórek rakowych do degradacji ECM i inwazji sąsiednich tkanek.

Inwazyjna aktywność komórek jest przypisywana wyspecjalizowanym strukturom bogatym w aktynę, znanym jako inwadosomy. Termin ten obejmuje podosomy i inwadopodia, które są obecne odpowiednio w komórkach normalnych i rakowych (np. Makrofagach, komórkach śródbłonka i komórkach rakowych, takich jak linia komórkowa raka piersi MDA-MB-231). In vitro inwadosomy mogą organizować się w różne kształty: kropki, agregaty lub rozety3. Klasycznie inwadosomy składają się z rdzenia F-aktyny zawierającego kilka białek, takich jak białko rusztowania Tks5 i kortaktyna, otoczone cząsteczkami płytki adhezyjnej, takimi jak integryny i winkulina4. Niedawno wykazano, że Tks5 i RhoGTPase Cdc42 mogą być używane jako minimalna sygnatura molekularna dla funkcjonalnych inwadosomów5. Struktury te są zdolne do degradacji ECM poprzez rekrutację i aktywację specyficznych białek metaloproteazy, takich jak MT1-MMP i MMP-26. W poprzednim badaniu informowaliśmy, że interakcja między włókienkami kolagenu typu I a receptorem domeny dyskoidyny 1 (DDR1), specyficznym receptorem włókien kolagenowych typu I, prowadzi do powstania nowej klasy inwadosomów, zwanych inwadosomami liniowymi. Liniowe inwadosomy powstają wzdłuż włókien kolagenu typu I7. Struktury te są zdolne do degradacji włókien kolagenu typu I poprzez rekrutację i aktywację MT1-MMP/MMP2. Co więcej, ich tworzenie jest zależne od Tks5 i Cdc425. In vitro wykazaliśmy istnienie liniowych inwadosomów i udział DDR1 w ich tworzeniu i aktywności8 przy użyciu różnych strategii składających się z kombinacji różnych elementów matrycy, w tym: i) fluorescencyjnych szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną, ii) fluorescencyjnych szkiełek nakrywkowych pokrytych fibrylami kolagenowymi typu I oraz iii) czopów kolagenowych 3D typu I. Dzięki zastosowaniu różnych matryc byliśmy w stanie zbadać i scharakteryzować liniowe powstawanie inwadosomów oraz ich aktywność degradacyjną7,8.

Na koniec, aby lepiej zrozumieć biologię komórek inwazyjnych, zastosowano kombinację komponentów ECM w systemach hodowli 2D i 3D, naśladując złożoność składu mikrośrodowiska guza. Poniżej znajdują się protokoły powlekania szkiełek nakrywkowych żelatyną/kolagenem typu I w systemach hodowli 2D i 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Przed utrwaleniem wszystkie etapy są wykonywane w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.

1. Macierz 2D

UWAGA: Macierze 2D są wykorzystywane do określenia procentowego udziału komórek tworzących invadosomy oraz powierzchni degradacji macierzy przypadającej na jedną komórkę.

Schemat przygotowania hodowli komórkowej; proces powlekania szkiełek żelatyną; metoda krok po kroku.
Rycina 1: Protokół. Podsumowanie protokołu wykorzystanego do przygotowania macierzy żelatynowych i kolagenowych typu I. Możliwe jest przygotowanie wyłącznie macierzy żelatynowej lub mieszanej macierzy żelatynowo-kolagenowej typu I. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Macierz żelatynowa
    UWAGA: Fluorescencyjne macierze żelatynowe są wykorzystywane do ilościowego określania degradacji macierzy, natomiast żelatyna niefluorescencyjna służy do promowania adhezji włókien kolagenu I. Fluorescencyjne macierze żelatynowe są również stosowane w badaniach nad podosomami i invadopodiami (patrz Rycina 1).
    1. Pod sterylną kopułą z laminarnym przepływem powietrza umieść kawałek parafilmu (20 cm x 15 cm) na obszarze roboczym i zdezynfekuj go 70% etanolem.
    2. Nanieś krople żelatyny o stężeniu 1 mg/mL w ilości 20 µL każda w linii, w odstępach około 1 cm; organizację kropli przedstawiono na Rycynie 1.
    3. Przykryj każdą 20 µL kroplę żelatyny autoklawowaną szklaną lamelką (średnica 12 mm).
    4. Inkubuj przez 20 min w temperaturze pokojowej. Jeśli żelatyna jest fluorescencyjna, chroń ją przed światłem.
    5. Nanieś krople 0,5% glutaraldehydu w 1x soli fosforanowej buforze (PBS) w ilości 40 µL każda w linii, tak aby każda znajdowała się około 1 cm poniżej linii lamelkek z kroku 1.1.3.
      OSTRZEŻENIE: Glutaraldehyd jest toksycznym czynnikiem utrwalającym. Należy używać rękawiczek i nie wdychać oparów.
    6. Za pomocą pęsety z końcówkami z kamieni szlachetnych przenieś każdą lamelkę pokrytą żelatyną do kropli glutaraldehydu.
      UWAGA: To normalne, że na parafilmie pozostanie niewielka kropla żelatyny. Nie należy jej używać w kolejnych eksperymentach.
    7. Inkubuj przez 40 min w temperaturze pokojowej. W przypadku lamelkek fluorescencyjnych chroń je przed światłem.
    8. Użyj 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej i wypełnij każdy dołek 500 µL sterylnego 1x PBS. Umieść lamelki stroną z żelatyną do góry w każdym dołku.
    9. Przemyj dwukrotnie w 1x PBS przez 5 min za każdym razem.
      UWAGA: Na tym etapie lamelki mogą być wykorzystane do eksperymentów lub przechowywane w 1x PBS w temperaturze 4 °C. Lamelki niefluorescencyjne można przechowywać przez tydzień, a fluorescencyjne przez 48 h.
  2. Macierz włóknistego kolagenu typu I
    UWAGA: Macierz włóknistego kolagenu typu I jest stosowana do badania tworzenia się liniowych invadosomów oraz związanej z nimi degradacji macierzy. Kombinacja fluorescencyjnego kolagenu I i niefluorescencyjnych lamelkek żelatynowych służy do kolokalizacji markerów invadosomów z włóknami kolagenu (np. F-aktyna w kanale dalekiej czerwieni, kolagen I w kanale czerwonym, Tks5 w kanale zielonym i barwnik Hoechst do barwienia jąder). Z kolei kombinacja niefluorescencyjnego kolagenu I z niefluorescencyjnymi lamelkami żelatynowymi służy do maksymalizacji liczby barwionych markerów invadosomów (np. F-aktyna w kanale dalekiej czerwieni, kortaktyna w kanale czerwonym, Tks5 w kanale zielonym i barwnik Hoechst do barwienia jąder). Wreszcie, kombinacja niefluorescencyjnego kolagenu I z fluorescencyjnymi lamelkami żelatynowymi służy do ilościowego określania degradacji związanej z żelatyną (np. F-aktyna w kanale dalekiej czerwieni, Tks5 w kanale czerwonym, w kanale zielonym i barwnik Hoechst do barwienia jąder) (patrz Rycina 1). Barwnik Hoechst służy do barwienia jąder, a także do kontroli zanieczyszczenia mycoplasmami, jako uzupełnienie regularnie przeprowadzanych testów PCR dla stosowanych linii komórkowych.
    1. Fluorescencyjny kolagen I
      1. Użyj komercyjnego kolagenu I ekstrahowanego z ścięgna ogona szczura w 0,02 N kwasie octowym. Pobierz ilość kolagenu I niezbędną do przygotowania 500 µL roztworu na lamelkę przy końcowym stężeniu kolagenu I wynoszącym 0,4 mg/mL.
      2. Dodaj 5-karboksy-x-rodaminy ester succinimidylowy w końcowym stężeniu 10 µg/mL, obliczonym dla końcowej objętości roztworu kolagenu I (n x 500 µL).
      3. Wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół, i inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
      4. Rozcieńcz do końcowej objętości za pomocą 1X soli fosforanowej buforu Dulbecco (DPBS) zawierającego wapń i magnez i użyj bezpośrednio.
    2. Lamelka z włóknistym kolagenem I
      1. Użyj niefluorescencyjnych lub fluorescencyjnych lamelkek żelatynowych przygotowanych wcześniej w kroku 1.1.
      2. Przygotuj roztwór fluorescencyjnego lub niefluorescencyjnego kolagenu I o końcowym stężeniu 0,4 mg/mL w 1X DPBS zawierającym wapń i magnez.
      3. Dodaj 500 µL roztworu fluorescencyjnego lub niefluorescencyjnego kolagenu I na każdą lamelkę w 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej.
      4. Inkubuj przez 4 h w 37 °C w celu polimeryzacji kolagenu I.
      5. Po inkubacji usuń nadmiar kolagenu I, przechylając płytkę i odsysając płyn z boku dołka (nie bezpośrednio z lamelki), aby uniknąć uszkodzenia macierzy.
        UWAGA: Tą macierzy nie można przechowywać. Wysiej komórki natychmiast po usunięciu nadmiaru kolagenu I.

2. Wysiew komórek, czas hodowli i fiksacja

  1. W zależności od rodzaju komórek, przygotować komórki w odpowiedniej pożywce hodowlanej i dodać komórki tak, aby objętość końcowa wynosiła 500 µL na dołek.
  2. Aby scharakteryzować zdolność linii komórkowej do tworzenia liniowych invadosomów oraz do degradacji macierzy, wysiać komórki na macierz kolagenu I na 4 h, 12 h i 24 h w celu określenia kinetyki tworzenia liniowych invadosomów i związanej z tym aktywności degradacyjnej.
    UWAGA: Tabela 1 zawiera przykłady linii komórkowych testowanych w laboratorium.
    Linia komórkowaLiczba komórek na szkiełku przedmiotowymCzas kontaktu z macierzą dla ilościowego oznaczenia liniowych invadosomówCzas kontaktu z macierzą dla ilościowego oznaczenia aktywności degradacyjnej liniowych invadosomów
    MDA MB 23140,0004 h12 h
    HUH740,00012 h24 h 
    HEP 3B40,00012 h24 h 
    SNU 39840,00012 h24 h 
    NIH 3T3 src30,0004 h12 h
    A43150,0006 h24 h 
    A54940,00012 h24 h 
    RAW40,00012 h12 h
    PAE40,00012 h12 h
    Tabela 1: Referencyjny czas wysiewania i inkubacji komórek. Tabela ta przedstawia niewyczerpującą listę linii komórkowych wykorzystywanych do badania liniowych invadosomów. Określa ona liczbę komórek do wysiania na macierz, czas niezbędny do zaobserwowania liniowych invadosomów oraz czas niezbędny do zaobserwowania związanej z nimi degradacji macierzy. Liniowe invadosomy mają krótki czas życia. Aby móc zaobserwować liniowe invadosomy w maksymalnej liczbie komórek, muszą one pozostawać w kontakcie z macierzą kolagenu I przez krótki czas. Z drugiej strony, aby móc zwizualizować opisaną degradację żelatyny, komórki muszą pozostawać w kontakcie z macierzą kolagenu I przez dłuższy czas niż wymienione powyżej.
  3. Po usunięciu pożywki hodowlanej zafiksować szkiełka przedmiotowe przez 10 min w 500 µL 4% paraformaldehydu w 1X PBS.
  4. Przepłukać dwukrotnie 1x PBS.
  5. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.

3. Immunofluorescencja

  1. Przeprowadź permeabilizację komórek przez 10 min, używając świeżo przygotowanego roztworu 0,2% Triton X-100 w 1x PBS. Nie używać tego roztworu ponownie.
  2. Przemyj szkiełka podstawowe dwukrotnie w 1x PBS.
  3. Połóż kawałek parafilmu (20 cm x 15 cm) na blacie.
  4. Rozcieńczyć przeciwciało pierwotne w 4% albuminie surowiczej bydlęcej (BSA) w 1x PBS, zgodnie z opisem w Tabela materiałów.
  5. Aliquota 50 µL krople roztworu przeciwciała pierwszego w linii, w odstępach około 1 cm każda.
  6. Umieść każde szkiełko nakrywkowe na kropli.
  7. Inkubować przez 40 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  8. Po okresie inkubacji przemyć dwukrotnie 1x PBS.
  9. Rozcieńczyć przeciwciało wtórne, falloidynę oraz barwnik Hoechst w 4% BSA w 1x PBS.
  10. Aliquota 50 µL krople mieszaniny, z których każda znajduje się w odległości około 1 cm poniżej pierwszej linii szkiełek nakrywkowych, zgodnie z wcześniejszą procedurą.
  11. Połóż każde szkiełko nakrywkowe na kropli.
  12. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  13. Po inkubacji przemyć dwukrotnie 1x PBS.
  14. Przemyć raz wodą destylowaną w celu usunięcia soli.
  15. Przymocuj szkiełka nakrywkowe do szkiełka przedmiotowego, używając polimeryzującego medium montażowego.
  16. Pozostaw szkiełka nakrywki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc, chroniąc je przed światłem, przed przystąpieniem do mikroskopii.

4. Ilościowe oznaczenia

Analiza komórkowa; kwantyfikacja invadosomów; schemat przetwarzania obrazu; podsumowanie wyników danych.
Rysunek 2: Liniowa kwantyfikacja invadosomów. Makro wymaga obrazów konfokalnych barwienia F-aktyny i Tks5 (format: 1 024 x 1 024). (A) Najpierw otwórz obraz F-aktyny i utwórz maskę. (B) Następnie otwórz obraz Tks5 i ustaw próg (threshold). Uruchom makro. (C) Analizowane wyniki zostaną wyświetlone w dwóch tabelach. Liczba liniowych invadosomów na komórkę oraz inne informacje, takie jak procentowy obszar zajmowany przez liniowe invadosomy w komórce, znajdą się w tabeli podsumowującej (Summary). Rozmiar każdego liniowego invadosomu zostanie zapisany w tabeli wyników (Results). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Procent komórek tworzących liniowe invadosomy
    1. Policz komórki tworzące liniowe invadosomy, około 100 komórek na szkiełko cover-slip (wykorzystaj triplikaty techniczne). Przeanalizuj co najmniej 300 komórek na n, przy n = 3.
    2. Oblicz procent komórek tworzących liniowe invadosomes, wyciągając średnią z trzech niezależnych eksperymentów, co daje łącznie 900 przeanalizowanych komórek.
  2. Rozmiar i liczba liniowych invadosomów na komórkę
    UWAGA: Użyj mikroskopu konfokalnego do wykonania sekwencyjnych obrazów barwień F-aktyny i Tks5. Makro jest dostosowane do formatu obrazu 1,024 x 1,024.
    1. Użyj programu ImageJ wraz z makrem uzupełniającym.
  3. Degradacja na komórkę
    1. Użyj trzech szkiełek cover-slip na każdą warunek.
    2. Wykonaj 30 obrazów na szkiełko, obrazując fluorescencyjną żelatynę oraz jądra barwione Hoechst.
    3. Użyj oprogramowania ImageJ zgodnie z opisem w pracy Martin KH et al.9.

5. Test inwazji w 3D kolagenie

Schemat testu inwazyjności z komorą Boydena przedstawiający kolagen, migrację komórek nowotworowych oraz etapy utrwalania.
Rysunek 3: Schemat testu inwazyjności. Podsumowanie protokołu testu inwazyjności. Kolagen I jest sieciowany barwnikiem z estrem sukcynimidylowym i polimeryzowany przez 1 h w 37 °C. Komórki nanosi się w medium bezsurowiczym na wierzch zatyczki z kolagenu I. Wkład nanosi się do medium z 10% FBS. Zatyczki z kolagenu I są utrwalane 1 h po wysianiu komórek w grupie kontrolnej i 3 dni po wysianiu komórek w warunkach eksperymentalnych w celu określenia zdolności inwazyjnych komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Przygotowanie wtyczki z kolagenu I
    1. W pierwszym eksperymencie ustal przebieg czasowy obejmujący 4 h, 12 h, 24 h, 48 h i 72 h, aby określić kinetykę inwazji w głąb żelu w zależności od typu komórek. Dla każdego eksperymentu dodaj punkt czasowy 1 h jako punkt odniesienia, w którym nie zachodzi inwazja.
    2. Przygotuj roztwór kolagenu I w lodzie pod sterylnym dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Przygotuj 500 µL roztworu na 3 wkładki do komór Boydena.
    3. Odmiar 1 mg komercyjnego kolagenu I z ogona szczura, aby przygotować roztwór o stężeniu końcowym 2 mg/mL kolagenu I.
    4. Dodaj ester sukcynimidylowy 5-karboksy-x-rodaminy do stężenia końcowego 1 µg/mL, obliczonego dla końcowej objętości roztworu kolagenu I (w tym przypadku 500 µL).
    5. Wymieszaj dokładnie i inkubuj przez 5 min w lodzie pod sterylnym dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, chroniąc przed światłem.
    6. Dodaj 50 µL lodowatego, filtrowanego 10X PBS oraz 6,25 µL lodowatego 1 M wodorotlenku sodu (NaOH).
    7. Dodaj sterylną wodę zgodnie ze wzorem 443,75 - x µL kolagenu I.
    8. Dodaj 100 µL roztworu do każdej wkładki do komóry Boydena.
    9. Inkubuj przez 1 h w temperaturze 37 °C, aby umożliwić polimeryzację.
    10. Do nowych dołków dodaj pożywkę do hodowli komórkowych wzbogaconą płodową surowicą bydlęcą (FBS); umieść wkładki w tych dołkach.
    11. Wysiej 30 000 komórek na wierzch wtyczki z kolagenu I w pożywce bez FBS.
    12. Po hodowaniu komórek w 37 °C, utrwal wtyczkę z kolagenu I przez 30 min w 4% paraformaldehydzie w 1x PBS.
    13. Przeprowadź immunofluorescencję zgodnie z krokiem 3, z wyjątkiem następujących etapów: permeabilizację wykonaj za pomocą 0,2% Triton X-100 w 1x PBS przez 30 min, a nie 10 min; inkubację z roztworami przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych przeprowadź przez 1,5 h dla każdego z nich, zamiast odpowiednio 40 min i 30 min. Wybarw F-aktynę lub jądra komórkowe, aby zlokalizować komórki.
    14. Po immunofluorescencji użyj skalpela, aby wyciąć obszar wokół membrany wkładki i ostrożnie przenieś wtyczkę z kolagenu I do szalki z szklanym dnem. Upewnij się, że góra wtyczki z kolagenu I styka się ze szkłem. Pozostaw membranę wkładki przymocowaną do spodu wtyczki z kolagenu I, aby zachować jej integralność.
      UWAGA: Wtyczka z kolagenu I pozostaje nienaruszona w szalce z szklanym dnem. Odległość między szklanym dnem a plastikiem otaczającym szkło odpowiada grubości wtyczki.
    15. Nałóż szkiełko nakrywkowe na wtyczkę z kolagenu I i zamocuj polimeryzującym medium montującym, aby zapobiec wysychaniu wtyczki.
    16. Użyj odwróconego mikroskopu konfokalnego do obrazowania wtyczki z kolagenu I; góra wtyczki styka się ze szklanym dnem szalki.
      1. Wykonaj serię obrazów z-stack od góry do dołu wtyczki z kolagenu I, aby zwizualizować inwazję komórek. Określ grubość z-stack, badając, jak głęboko komórki wnikają w pole obrazowania. Akwizycję przeprowadź przy użyciu obiektywu olejowego 40X w formacie 512 x 512 z rozmiarem kroku z wynoszącym 0,25 μm.
        UWAGA: Dla odniesienia, średni z-stack dla komórek MDA-MB-231 3 dni po wysianiu wynosi 30 µm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując kombinację dwóch rodzajów matryc, żelatyny i kolagenu typu I (Rysunki 1 i 4), wyróżniliśmy nowy typ invadosomów, znany jako invadosomy liniowe. Znakowanie tych matryc umożliwia obserwację formowania się liniowych invadosomów wzdłuż włókien kolagenu I oraz ich zdolności do degradacji (Rysunek 5). Liczbę struktur inwazyjnych można następnie określić ilościowo za pomocą makra opisanego wcześniej (krok 4.2), a aktywność degradac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Klasycznie inwadosomy są badane in vitro bez względu na mikrośrodowisko i matrycę, na której są platerowane komórki. Obecnie stosuje się kilka rodzajów matryc, w tym żelatynę, fibronektynę, witronektynę lub kolagen fibrylarny o dużej gęstości (HDFC)7,11; Jednak często nie są one reprezentatywne dla mikrośrodowiska, w którym znajdują się komórki, i nie są fizjologicznie istotne. W tym przypadku zastosowano nowy rodzaj matrycy, który polega na powiązaniu ż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

J.D.M. był wspierany przez stypendium doktoranckie z INSERM/Région Aquitaine, a teraz jest wspierany przez stypendium podoktoranckie ARC i Tisch Cancer Institute w Mount Sinai School of Medicine. E.H. jest wspierany przez doktorat z Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. Z.E. jest wspierany przez stypendium podoktorskie z Agence Nationale de la Recherche (ANR). C.M. jest wspierany przez Tisch Cancer Instytut w Mount Sinai School of Medicine i J.J.B.C. są wspierane przez K22CA196750 grantowe NIH/NCI, TCI Young Scientist Cancer Research Award JJR Fund oraz Tisch Cancer Institute w Mount Sinai School of Medicine. Prace te zostały wsparte grantem z ANR-13-JJC-JSV1-0005. F.S. jest wspierany przez "Ligue nationale contre le cancer". V.M. i F.S. są wspierane przez fundusze z "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016" oraz Institut National du Cancer, INCA_8036 i PLBio2012.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór żelatynySigmaG1393Zapas 20 mg/ml stosowany w stężeniu 1 mg/ml
Żelatyna ze skóry świni Koniugat Oregon green 488Sonda molekularna technologie życiaG131865 mg rozcieńczony w 1 mg / ml w sterylnej wodzie
Okulary nakrywkowe do mikroskopuMarlenfeld GmbH & Co111520Ø 12mm No.1
2,5% Aldehyd glutarowy w 0,1 M bufor kakodylanu sodu pH 7,4Mikroskopia elektronowa15960Rozcieńczyć 0,5% w sterylnej wodzie
1x PBS pH 7,4Gibco by life technologies10010-015Użyj tego PBS na wszystkich etapach przed utrwaleniem
Kolagen I Ogon szczuraCorning354236
5 karboksyl X rhodamin siccinimidyl esterTechnologie życioweC-6125
DPBS 1x + wapń + magnezGibco firmy life technologies14040-091
Roztwór paraformaldehydu 16%Mikroskopia elektronowa15710Rozcieńczyć 4% w 1X PBS
Triton X 100SigmaT9284
10x bufor PBS pH 7,4AmbionAM9625Rozcieńczyć w stężeniu 1X w wodzie Stosować stopniowo po utrwaleniu
PrzeciwciałoTks5Santa Cruzsc-30122Markery inwadosomu Rozcieńczenie: 1/100
Przeciwciało Cortactin 4F11Millipore5180Markery inwadosomu Rozcieńczenie: 1/100
Przeciwciało DDR1Sygnalizacja komórkowa5583Liniowy receptor inwadosomu
Rozcieńczenie: 1/100
Phalloidin FluoProbesInterchimFT-AZ0330Fibrylarny marker aktynowy Rozcieńczenie :1/200
HoechstSigma33258Marker jądra Rozcieńczenie: 1/200
Przeciwciała drugorzędowe FluoProbesInterchimFP-488 FP-547H lub FP-647H
Albumina z surowicy bydlęcejSigmaA2153Rozcieńczyć w 4% w 1X PBS
Fluoromount G podłoże montażoweInterchimFP 483331
Oprogramowanie ImageJDomenapublicznahttp://www.macbiophotonics.ca/imagej/
Wkładka do hodowli komórkowychCorning3530978.0 i mikro; m wielkość porów / 24 dołki
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma221465

Bibliografia

  1. Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).
  2. Gilkes, D. M., et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).
  3. Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
  4. Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
  5. Di Martino, J., et al. Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes. Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).
  6. Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).
  7. Juin, A., et al. Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes. Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).
  8. Juin, A., et al. Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway. J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).
  9. Martin, K. H., et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts. J. Vis. Exp. , e4119(2012).
  10. Diaz, B. Invadopodia detection and gelatin degradation assay. Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).
  11. Artym, V. V., et al. Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network. J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).
  12. Schachtner, H., et al. Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane. Blood. 121, 2542-2552 (2013).
  13. Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay. Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).
  14. Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102, 3262-3269 (2003).
  15. Geraldo, S., et al. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).
  16. Monteiro, P., et al. Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia. J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).
  17. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Linijne invadosomykolagen typu 1degradacja ECMtest elatynowymikroskopia konfokalnaimmunofluorescencjareceptor DDR1w kna kolagenoweinwazja kom rkowa
Macierze 2D i 3D do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.