Macierze 2D i 3D do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak przygotować mieszaną matrycę 2D, składającą się z żelatyny i kolagenu I, oraz wtyczkę 3D kolagenu I do badania liniowych inwadosomów. Protokoły te pozwalają na badanie liniowego tworzenia inwadosomu, aktywności degradacji macierzy oraz zdolności inwazji komórek pierwotnych i linii komórek rakowych.

Streszczenie

Przyleganie, migracja i inwazja komórek są zaangażowane w wiele procesów fizjologicznych i patologicznych. Na przykład podczas tworzenia przerzutów komórki nowotworowe muszą przekraczać bariery anatomiczne, aby zaatakować i migrować przez otaczającą tkankę, aby dotrzeć do naczyń krwionośnych lub limfatycznych. Wymaga to interakcji między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM). Na poziomie komórkowym wiele komórek, w tym większość komórek nowotworowych, jest w stanie tworzyć inwadosomy, które są strukturami opartymi na F-aktynie zdolnymi do degradacji ECM. Inwadosomy to wystające struktury aktynowe, które rekrutują i aktywują metaloproteinazy macierzy (MMP). Skład molekularny, gęstość, organizacja i sztywność ECM mają kluczowe znaczenie w regulacji tworzenia i aktywacji inwadosomu. In vitro test żelatyny jest standardowym testem stosowanym do obserwacji i ilościowego określenia aktywności degradacji inwadosomu. Jednak żelatyna, która jest denaturowanym kolagenem I, nie jest fizjologicznym elementem matrycy. Opracowano nowatorski test z wykorzystaniem włókien kolagenu typu I, który wykorzystano do wykazania, że ta fizjologiczna matryca jest silnym induktorem inwadosomów. Inwadosomy, które tworzą się wzdłuż włókien kolagenowych, są znane jako inwadosomy liniowe ze względu na ich liniową organizację na włóknach. Co więcej, analiza molekularna liniowych inwadosomów wykazała, że receptor domeny dyskoidyny 1 (DDR1) jest receptorem zaangażowanym w ich powstawanie. Dane te wyraźnie pokazują, jak ważne jest stosowanie fizjologicznie istotnej matrycy w celu zrozumienia złożonych interakcji między komórkami a ECM.

Wprowadzenie

Przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) zachodzi podczas procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak angiogeneza i inwazja komórek nowotworowych. W warunkach fizjologicznych wiele typów komórek, głównie z linii krwiotwórczej, jest zdolnych do degradacji elementów ECM. Na przykład makrofagi są w stanie przekraczać bariery anatomiczne, aby dotrzeć do tkanek, a osteoklasty degradują macierz kostną, aby zapewnić homeostazę wapnia. Mówiąc bardziej globalnie, wszystkie matryce w organizmie odnawiają się, aby zachować swoje właściwości fizyczne i chemiczne. W tkankach nowotworowych skład mikrośrodowiska guza ulega zmianie. Na przykład w raku piersi i płuc kolagen typu I ulega nadekspresji i gromadzi się wokół guza. Co więcej, ta kumulacja wiąże się ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia przerzutów^1,2. Przerzuty nowotworowe są zależne od zdolności komórek rakowych do degradacji ECM i inwazji sąsiednich tkanek.

Inwazyjna aktywność komórek jest przypisywana wyspecjalizowanym strukturom bogatym w aktynę, znanym jako inwadosomy. Termin ten obejmuje podosomy i inwadopodia, które są obecne odpowiednio w komórkach normalnych i rakowych (np. Makrofagach, komórkach śródbłonka i komórkach rakowych, takich jak linia komórkowa raka piersi MDA-MB-231). In vitro inwadosomy mogą organizować się w różne kształty: kropki, agregaty lub rozety³. Klasycznie inwadosomy składają się z rdzenia F-aktyny zawierającego kilka białek, takich jak białko rusztowania Tks5 i kortaktyna, otoczone cząsteczkami płytki adhezyjnej, takimi jak integryny i winkulina⁴. Niedawno wykazano, że Tks5 i RhoGTPase Cdc42 mogą być używane jako minimalna sygnatura molekularna dla funkcjonalnych inwadosomów⁵. Struktury te są zdolne do degradacji ECM poprzez rekrutację i aktywację specyficznych białek metaloproteazy, takich jak MT1-MMP i MMP-2⁶. W poprzednim badaniu informowaliśmy, że interakcja między włókienkami kolagenu typu I a receptorem domeny dyskoidyny 1 (DDR1), specyficznym receptorem włókien kolagenowych typu I, prowadzi do powstania nowej klasy inwadosomów, zwanych inwadosomami liniowymi. Liniowe inwadosomy powstają wzdłuż włókien kolagenu typu I⁷. Struktury te są zdolne do degradacji włókien kolagenu typu I poprzez rekrutację i aktywację MT1-MMP/MMP2. Co więcej, ich tworzenie jest zależne od Tks5 i Cdc42⁵. In vitro wykazaliśmy istnienie liniowych inwadosomów i udział DDR1 w ich tworzeniu i aktywności⁸ przy użyciu różnych strategii składających się z kombinacji różnych elementów matrycy, w tym: i) fluorescencyjnych szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną, ii) fluorescencyjnych szkiełek nakrywkowych pokrytych fibrylami kolagenowymi typu I oraz iii) czopów kolagenowych 3D typu I. Dzięki zastosowaniu różnych matryc byliśmy w stanie zbadać i scharakteryzować liniowe powstawanie inwadosomów oraz ich aktywność degradacyjną^7,8.

Na koniec, aby lepiej zrozumieć biologię komórek inwazyjnych, zastosowano kombinację komponentów ECM w systemach hodowli 2D i 3D, naśladując złożoność składu mikrośrodowiska guza. Poniżej znajdują się protokoły powlekania szkiełek nakrywkowych żelatyną/kolagenem typu I w systemach hodowli 2D i 3D.

Protokół

UWAGA: Przed utrwaleniem wszystkie kroki są wykonywane w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym.

1. Macierz 2D

UWAGA: Macierze 2D służą do określania procentu komórek tworzących inwadosomy oraz obszaru degradacji matrycy na komórkę.

Rysunek 1: Protokół. Podsumowanie protokołu stosowanego do przygotowania matryc żelatyny i kolagenu I. Możliwe jest wykonanie samej matrycy żelatynowej lub matrycy mieszanej żelatyny i kolagenu I. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Matryca żelatynowa
   UWAGA: Fluorescencyjne matryce żelatynowe służą do ilościowego określania degradacji matrycy, a żelatyna niefluorescencyjna służy do promowania adhezji włókien kolagenu I. Fluorescencyjne matryce żelatynowe są również używane do badań podosomu i inwadopodia (patrz ryc. 1).
   1. Pod sterylnym okapem z przepływem laminarnym umieść kawałek parafilmu (20 cm x 15 cm) na obszarze roboczym i zdezynfekuj go 70% etanolem.
   2. Podwielokrotność 20 μl kropelek żelatyny o stężeniu 1 mg/ml w linii, w odstępach około 1 cm od siebie; patrz rysunek 1 w celu zapoznania się z organizacją kropel.
   3. Przykryj każdą kroplę żelatyny o objętości 20 μl autoklawizowanym szkiełkiem nakrywkowym (o średnicy 12 mm).
   4. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli żelatyna jest fluorescencyjna, chroń ją przed światłem.
   5. Podwielokrotność 40 μl kropelek 0,5% aldehydu glutarowego w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w linii, każda w odstępach około 1 cm poniżej linii szkiełek nakrywkowych z kroku 1.1.3.
      UWAGA: Aldehyd glutarowy jest toksycznym środkiem utrwalającym. Używaj rękawiczek i nie wdychaj powietrza.
   6. Za pomocą biżuteryjnych kleszczyków przenieś każde pokryte żelatyną szkiełko nakrywkowe do kropli aldehydu glutarowego.
      UWAGA: To normalne, że na parafilmie pozostaje mała kropelka żelatyny. Nie używaj tego ponownie w innym eksperymencie.
   7. Inkubować przez 40 minut w temperaturze pokojowej. W przypadku fluorescencyjnych szkiełek nakrywkowych należy je chronić przed światłem.
   8. Weź 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej i napełnij każdą studzienkę 500 μl sterylnego 1x PBS. Umieść szkiełka nakrywkowe żelatynową stroną do góry w każdym dołku.
   9. Prać dwa razy w 1x PBS przez 5 minut każdy.
      UWAGA: Na tym etapie szkiełka nakrywkowe mogą być używane do eksperymentów lub przechowywane w 1x PBS w temperaturze 4 °C. Szkiełka nakrywkowe niefluorescencyjne można przechowywać przez tydzień, a szkiełka nakrywkowe fluorescencyjne można przechowywać przez 48 godzin.
2. Fibrillar kolagen typu I matrix
   UWAGA: Macierz kolagenu fibrylarnego typu I służy do badania liniowego tworzenia inwadosomów i związanej z tym degradacji matrycy. Połączenie fluorescencyjnego kolagenu I i niefluorescencyjnych żelatynowych szkiełek nakrywkowych służy do kolokalizacji markerów inwadosomów z włóknami kolagenowymi (np. F-aktyna w kanale dalekiej czerwieni, kolagen I w kanale czerwonym, Tks5 w kanale zielonym i barwnik Hoechst do barwienia jądrowego). Z drugiej strony, połączenie niefluorescencyjnego kolagenu I z niefluorescencyjnymi żelatynowymi szkiełkami nakrywkowymi stosuje się w celu maksymalizacji liczby barwionych markerów inwadosomów (np. F-aktyna w kanale dalekiej czerwieni, kortaktyna w kanale czerwonym, Tks5 w kanale zielonym i barwnik Hoechsta do barwienia jądrowego). Wreszcie, połączenie niefluorescencyjnego kolagenu I z fluorescencyjnymi żelatynowymi szkiełkami nakrywkowymi stosuje się do ilościowego określenia degradacji związanej z żelatyną (np. F-aktyna w kanale dalekiej czerwieni, Tks5 w kanale czerwonym, w kanale zielonym i barwnik Hoechsta do barwienia jądrowego) (patrz ryc. 1). Barwnik Hoechst służy do barwienia jądra, a także sprawdza zanieczyszczenie mykoplazmą, oprócz testu PCR wykonywanego regularnie na używanych liniach komórkowych.
   1. Kolagen fluorescencyjny I
      1. Użyj komercyjnego kolagenu, który wyekstrahowałem ze ścięgna ogona szczura w 0,02 N kwasie octowym. Pobrać ilość kolagenu I niezbędną do przygotowania 500 μl roztworu na szkiełko nakrywkowe przy końcowym stężeniu 0,4 mg/ml kolagenu I.
      2. Dodać 5-karboksylowy x rhodamino-sukcynimidylowy ester o końcowym stężeniu 10 μg/ml, obliczonym dla końcowej objętości roztworu kolagenu I (n x 500 μl).
      3. Wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół, i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
      4. Rozcieńczyć do ostatecznej objętości roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco zawierającą wapń i magnez i użyć bezpośrednio.
   2. Fibrillar collagen I szkiełko nakrywkowe
      1. Należy użyć niefluorescencyjnych lub fluorescencyjnych żelatynowych szkiełek nakrywkowych przygotowanych wcześniej w kroku 1.1.
      2. Przygotować roztwór fluorescencyjnego lub niefluorescencyjnego kolagenu I o końcowym stężeniu 0,4 mg/ml w 1X DPBS zawierającym wapń i magnez.
      3. Dodać 500 μl fluorescencyjnego lub niefluorescencyjnego roztworu kolagenu I na szkiełko nakrywkowe na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej.
      4. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w celu polimeryzacji kolagenu I.
      5. Po inkubacji usunąć nadmiar kolagenu I, przechylając płytkę i pipetując z boku dołka (nie bezpośrednio na szkiełko nakrywkowe), aby uniknąć uszkodzenia matrycy.
         UWAGA: Tej matrycy nie można przechowywać. Wysiewaj komórki natychmiast po usunięciu nadmiaru kolagenu I.

2. Sadzenie komórek, czas hodowli i utrwalanie

1. W zależności od typu komórek, przygotować komórki w odpowiedniej pożywce hodowlanej i dodać komórki do końcowej objętości 500 μl na studzienkę.
2. Aby scharakteryzować zdolność linii komórkowej do tworzenia liniowych inwadosomów i degradacji matrycy, należy umieścić komórki przez 4 godziny, 12 godzin i 24 godziny na matrycy kolagenu I, aby określić kinetykę liniowego tworzenia inwadosomów i związaną z tym aktywność degradacji.
   UWAGA: Tabela 1 zawiera przykłady linii komórkowych przebadanych w laboratorium. Linia komórkowa Liczba komórek na szkiełko nakrywkowe Czas kontaktu z matrycą w celu liniowego oznaczania ilościowego inwadosomów Czas kontaktu z matrycą w celu ilościowego określenia liniowej aktywności degradacji inwadosomu MDA MB 231 40 000 osób 4 godz. 12 h HUH7 powiedział: 40 000 osób 12 h 24 h HEP 3B 40 000 osób 12 h 24 h Zobacz materiał SNU 398 40 000 osób 12 h 24 h NIH 3T3 src 30 000 osób 4 godz. 12 h Ciągnik siodłowy A431 50 000 osób 6 godzin 24 h Ciągnik siodłowy A549 40 000 osób 12 h 24 h surowy 40 000 osób 12 h 12 h PAE (Ból Nietrzeźw 40 000 osób 12 h 12 h Tabela 1: Odniesienie do czasu wysiewu komórek i inkubacji. Poniższa tabela przedstawia niewyczerpującą listę linii komórkowych wykorzystywanych do badania liniowych inwadosomów. Wskazuje liczbę komórek do zasiewu na matrycy, czas niezbędny do obserwacji liniowych inwadosomów oraz czas niezbędny do obserwacji powiązanej degradacji matrycy. Liniowe inwadosomy mają krótką żywotność. Aby móc zaobserwować liniowe inwadosomy w maksymalnej liczbie komórek, komórki muszą przez krótki czas stykać się z matrycą kolagenu I. Z drugiej strony, aby móc zobrazować zgłaszaną degradację żelatyny, komórki muszą mieć kontakt z matrycą kolagenu I przez dłuższy czas niż te wymienione powyżej.
3. Po usunięciu pożywki z hodowli komórkowej utrwalić szkiełka nakrywkowe na 10 minut w 500 μl 4% paraformaldehydu w 1X PBS.
4. Umyć dwukrotnie 1x PBS.
5. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.

3. Immunofluorescencja

1. Przepuszczalność komórek przez 10 minut świeżo przygotowanym roztworem 0,2% Triton X-100 w 1x PBS. Nie używaj ponownie tego rozwiązania.
2. Umyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie 1x PBS.
3. Umieść kawałek parafilmu (20 cm x 15 cm) na ławce.
4. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w 4% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w 1x PBS, jak opisano w tabeli materiałów.
5. Podwielokrotność 50 μl kropelek roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w linii, każda w odległości około 1 cm od siebie.
6. Umieść każde szkiełko nakrywkowe na kropli.
7. Inkubować przez 40 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
8. Po okresie inkubacji przemyć dwukrotnie 1x PBS.
9. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe, falloidynę i barwnik Hoechsta w 4% BSA w 1x PBS.
10. Podwielokrotność 50 μl kropelek mieszanki, z których każda znajduje się około 1 cm poniżej pierwszej linii szkiełek nakrywkowych, jak to miało miejsce poprzednio.
11. Umieść każde szkiełko nakrywkowe na kropli.
12. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
13. Po inkubacji przemyć dwukrotnie 1x PBS.
14. Umyj raz wodą destylowaną, aby usunąć sole.
15. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku podstawowym z polimeryzującym medium montażowym.
16. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej, chronione przed światłem, przed mikroskopią.

4. Kwantyfikacje

Rysunek 2: Liniowa kwantyfikacja inwadosomów. Makro wymaga konfokalnych obrazów barwienia F-aktyną i Tks5 (format: 1,024 x 1,024). (A) Najpierw otwórz obrazek F-aktyny i zrób maskę. (B) Następnie otwórz obraz Tks5 i przesuń go progowo. Zastosuj makro. (C) Analizowane wyniki pojawią się w dwóch tabelach. Liczba inwadosomów liniowych na komórkę i inne informacje, takie jak procentowy obszar używany przez liniowe inwadosomy w komórce, będą znajdować się w tabeli Podsumowanie. Rozmiar każdego liniowego inwadosomu będzie znajdował się w tabeli wyników. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Odsetek komórek tworzących inwadosomy liniowe
   1. Policz komórki tworzące liniowe inwadosomy, około 100 komórek na szkiełko nakrywkowe (użyj technicznych trzech komórek). Określić ilościowo co najmniej 300 komórek na n, gdzie n = 3.
   2. Oblicz procent komórek tworzących liniowe inwadosomy, biorąc średnią z trzech niezależnych eksperymentów, w wyniku których uzyskano 900 komórek oznaczonych ilościowo.
2. Liniowy rozmiar i liczba inwadosomu na komórkę
   UWAGA: Użyj mikroskopu konfokalnego, aby wykonać sekwencyjne obrazy barwników F-aktyny i Tks5. Makro jest dostosowane do formatu obrazu 1,024 x 1,024.
   1. Użyj ImageJ z dodatkowym makrem.
3. Degradacja na komórkę
   1. Użyj trzech szkiełek nakrywkowych na każdy warunek.
   2. Wykonaj 30 zdjęć na szkiełko nakrywkowe fluorescencyjnej żelatyny i jąder barwionych metodą Hoechsta.
   3. Użyj oprogramowania ImageJ zgodnie z opisem w Martin KH i wsp.⁹.

5. 3D Test inwazji kolagenu

Rysunek 3: Schemat testu inwazji. Streszczenie protokołu testu inwazji. Kolagen I jest sieciowany barwnikiem estrowym sukcynimidylu i polimeryzowany przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Komórki dodaje się w podłożu bez surowicy na wierzchu zatyczki kolagenu I. Wkładkę umieszcza się w medium z 10% FBS. Zatyczki kolagenu I utrwala się 1 godzinę po wysiewie komórek w grupie kontrolnej i 3 dni po wysiewie komórek w warunkach eksperymentalnych w celu określenia zdolności inwazyjnej komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Preparat zatyczki kolagenowej I
   1. Wykonaj kurs czasowy 4 godzin, 12 godzin, 24 godziny, 48 godzin i 72 godziny dla pierwszego eksperymentu, aby określić kinetykę inwazji w żelu w zależności od typu komórki. Dla każdego eksperymentu dodaj 1-godzinny punkt czasowy jako punkt odniesienia, w którym nie dochodzi do inwazji.
   2. Przygotuj roztwór kolagenu I na lodzie pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym. Przygotować 500 μl roztworu na 3 wkłady komory Boydena.
   3. Odessać 1 mg komercyjnego kolagenu ze szczurzego ogona I, aby przygotować roztwór o końcowym stężeniu 2 mg/ml kolagenu I.
   4. Dodać 5-karboksyl x ester sukcynimidylowy rodaminy w końcowym stężeniu 1 μg/ml, obliczonym dla końcowej objętości roztworu kolagenu I (w tym przypadku 500 μl).
   5. Dobrze wymieszać i inkubować przez 5 minut na lodzie pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym, chronionym przed światłem.
   6. Dodać 50 μl lodowatego, przefiltrowanego 10X PBS i 6,25 μl lodowatego 1 M wodorotlenku sodu (NaOH).
   7. Dodać sterylną wodę według wzoru 443,75 - x μL kolagenu I.
   8. Dodać 100 μl roztworu na wkład komory Boydena.
   9. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić polimeryzację.
   10. Dodać pożywkę do hodowli komórkowych wzbogaconą płodową surowicą bydlęcą (FBS) do nowych studzienek; umieścić wkładki w tych studzienkach.
   11. Zasiej 30 000 komórek na wierzchu kolagenu, które podłączam do podłoża wolnego od FBS.
   12. Po wyhodowaniu komórek w temperaturze 37 °C, utrwal korek kolagenowy I na 30 minut w 4% paraformaldehydzie w 1x PBS.
   13. Pełna immunofluorescencja jak w kroku 3, z wyjątkiem następujących etapów: przepuszczalność 0,2% Triton X-100 w 1x PBS przez 30 minut, a nie 10 minut; inkubacja z roztworami przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych przez 1,5 godziny każda, a nie odpowiednio 40 min i 30 min. Barwienie F-aktyny lub jąder w celu zlokalizowania komórek.
   14. Po immunofluorescencji za pomocą skalpela przeciąć błonę wkładu i ostrożnie przenieść kolagen I plug do naczynia ze szklanym dnem. Upewnij się, że górna część zatyczki kolagenu I styka się ze szkłem. Utrzymuj membranę wkładki przymocowaną do dolnej części zatyczki kolagenu I, aby zachować integralność wtyczki.
       UWAGA: Zatyczka kolagenowa I pozostaje nienaruszona w naczyniu ze szklanym dnem. Głębokość między szklanym dnem a tworzywem sztucznym otaczającym szklane dno jest równa grubości korka.
   15. Umieść szkiełko nakrywkowe na korku kolagenu I i zamontuj go za pomocą polimeryzującego medium montażowego, aby zapobiec wysychaniu korka.
   16. Użyj odwróconego mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować zatyczkę kolagenu I; górna część zatyczki styka się ze szklanym dnem naczynia.
       1. Uzyskaj stos Z od góry do dołu zatyczki kolagenowej I, aby zobrazować inwazję komórek. Określ grubość stosu z, badając, jak głęboko komórki atakują pole obrazowania. Wykonuj akwizycje za pomocą obiektywu olejowego 40X w formacie 512 x 512 z krokiem Z 0,25 μm.
          UWAGA: Dla porównania, średni stos z dla komórek MDA-MB-231 3 dni po wysiewie wynosi 30 μm.

Wyniki

Korzystając z kombinacji dwóch rodzajów matryc, żelatyny i kolagenu typu I (Rysunki 1 i 4), wyróżniliśmy nowy typ inwadosomu, znany jako inwazosomy liniowe. Znakowanie tych matryc pozwala na obserwację liniowego tworzenia się inwadosomów wzdłuż włókien kolagenu I oraz ich zdolności do degradacji (ryc. 5). Liczbę struktur inwazyjnych można następnie określić ilościowo za pomocą opisanego wcześniej makra (krok 4.2), a aktywność degradacji m...

Dyskusja

Klasycznie inwadosomy są badane in vitro bez względu na mikrośrodowisko i matrycę, na której są platerowane komórki. Obecnie stosuje się kilka rodzajów matryc, w tym żelatynę, fibronektynę, witronektynę lub kolagen fibrylarny o dużej gęstości (HDFC)^7,11; Jednak często nie są one reprezentatywne dla mikrośrodowiska, w którym znajdują się komórki, i nie są fizjologicznie istotne. W tym przypadku zastosowano nowy rodzaj matrycy, który polega na powiązaniu ż...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór żelatyny	Sigma	G1393	Zapas 20 mg/ml stosowany w stężeniu 1 mg/ml
Żelatyna ze skóry świni Koniugat Oregon green 488	Sonda molekularna technologie życia	G13186	5 mg rozcieńczony w 1 mg / ml w sterylnej wodzie
Okulary nakrywkowe do mikroskopu	Marlenfeld GmbH & Co	111520	Ø 12mm No.1
2,5% Aldehyd glutarowy w 0,1 M bufor kakodylanu sodu pH 7,4	Mikroskopia elektronowa	15960	Rozcieńczyć 0,5% w sterylnej wodzie
1x PBS pH 7,4	Gibco by life technologies	10010-015	Użyj tego PBS na wszystkich etapach przed utrwaleniem
Kolagen I Ogon szczura	Corning	354236
5 karboksyl X rhodamin siccinimidyl ester	Technologie życiowe	C-6125
DPBS 1x + wapń + magnez	Gibco firmy life technologies	14040-091
Roztwór paraformaldehydu 16%	Mikroskopia elektronowa	15710	Rozcieńczyć 4% w 1X PBS
Triton X 100	Sigma	T9284
10x bufor PBS pH 7,4	Ambion	AM9625	Rozcieńczyć w stężeniu 1X w wodzie Stosować stopniowo po utrwaleniu
Przeciwciało	Tks5Santa Cruz	sc-30122	Markery inwadosomu Rozcieńczenie: 1/100
Przeciwciało Cortactin 4F11	Millipore	5180	Markery inwadosomu Rozcieńczenie: 1/100
Przeciwciało DDR1	Sygnalizacja komórkowa	5583	Liniowy receptor inwadosomu
Rozcieńczenie: 1/100
Phalloidin FluoProbes	Interchim	FT-AZ0330	Fibrylarny marker aktynowy Rozcieńczenie :1/200
Hoechst	Sigma	33258	Marker jądra Rozcieńczenie: 1/200
Przeciwciała drugorzędowe FluoProbes	Interchim	FP-488 FP-547H lub FP-647H
Albumina z surowicy bydlęcej	Sigma	A2153	Rozcieńczyć w 4% w 1X PBS
Fluoromount G podłoże montażowe	Interchim	FP 483331
Oprogramowanie ImageJ	Domena		publicznahttp://www.macbiophotonics.ca/imagej/
Wkładka do hodowli komórkowych	Corning	353097	8.0 i mikro; m wielkość porów / 24 dołki
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Sigma	221465