Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Histologiczna ocena ilościowa przewlekłego zawału mięśnia sercowego u szczurów

15.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54914

⸱

11 grudnia 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cardiology, Department of Medicine, University of Fribourg

W tym artykule

Podsumowanie

Pośmiertna ocena zawału mięśnia sercowego (MI) u gryzoni opiera się na ilościowym określeniu zawału na barwionych odcinkach serca. Opisujemy dokładną metodę ilościowego określania wielkości zawału przy użyciu systematycznego pobierania próbek pobranych serc szczurów od podstawy do wierzchołka oraz analiz obrazowych skrawków histologicznych barwionych trichromem.

Streszczenie

Zawał mięśnia sercowego definiowany jest jako śmierć kardiomiocytów z powodu przedłużającego się niedokrwienia; reakcja zapalna i powstawanie blizn (zwłóknienie) następują po urazie niedokrwiennym. Po początkowej ostrej fazie, przewlekła przebudowa lewej komory (LV) modyfikuje strukturę i funkcję serca. Stałe podwiązanie naczyń wieńcowych u małych zwierząt jest szeroko stosowane jako model referencyjny dla przewlekłego modelu zawału serca. Ścieńczenie ściany zawału stopniowo rozwija się do zwłóknienia przezściennego. Często przeprowadza się histologiczną ocenę wielkości zawału; Brakuje jednak standaryzacji metod oznaczania ilościowego. W rzeczywistości ważne aspekty metodologiczne, takie jak liczba analizowanych odcinków oraz metody pobierania próbek i kwantyfikacji, zwykle nie są opisane, a zatem uniemożliwiają porównanie między badaniami. Zbyt często kwantyfikacja jest wykonywana na pojedynczym odcinku uzyskanym na poziomie mięśni brodawkowatych. Ponieważ badane są nowe strategie mające na celu zmniejszenie ekspansji i przebudowy zawału, istnieje ważna potrzeba standaryzacji dokładnych protokołów pobierania próbek serca. Opisujemy dokładną metodę ilościowego określania wielkości zawału przy użyciu systematycznego pobierania próbek pobranego serca szczura i analiz obrazowych trójchromatycznych barwionych skrawków histologicznych uzyskanych od podstawy do wierzchołka. Przedstawiamy również dowody na to, że obliczenie wskaźnika ekspansji (EI) pozwoliło na ocenę wielkości zawału, biorąc pod uwagę zmiany lewej komory w trakcie przebudowy.

Wprowadzenie

Zawał mięśnia sercowego (MI) jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie. Główną przyczyną jest choroba niedokrwienna serca; Zawał mięśnia sercowego wynika z niedokrwienia następującego po zdarzeniach wieńcowych, takich jak niedrożność. Gdy reperfuzja nie zostanie wykonana w ciągu pierwszych 6 godzin, niedokrwienie wywołuje nieodwracalną martwicę mięśnia sercowego. U pacjentów charakterystyka zawału mięśnia sercowego opiera się na różnych narzędziach diagnostycznych, w tym objawach klinicznych, elektrokardiografii, ocenie poziomów biomarkerów w osoczu, echokardiografii, obrazowaniu MRI i analizach histologicznych1. Ostra i przewlekła zawała mięśnia sercowego jest klasyfikowana jako dwie różne fazy urazu w zależności od czasu martwicy mięśnia sercowego w stosunku do czasu niedrożności naczyń wieńcowych. Ostra faza, występująca w ciągu pierwszych 7 dni, wiąże się z utratą kardiomiocytów, rozległym stanem zapalnym i rekrutacją fibroblastów. Faza podostra, charakteryzująca się gojeniem się tkanki serca i powstawaniem blizny, występuje od 1 do 4 - 6 tygodni. Rozszerzenie zawału, ścieńczenie ściany komory i poszerzenie komory charakteryzują fazę przewlekłą. Rozległa przebudowa lewej komory stopniowo prowadzi do ciężkiej niewydolności serca2.

MI wywołane stałym podwiązaniem lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD) reprezentuje standardowy model przewlekłego zawału mięśnia sercowego u gryzoni. Więzadło wieńcowe naśladuje niedrożność naczyń wieńcowych. Wielkość zawału zależy od miejsca ligatury. Charakterystyka uszkodzenia niedokrwiennego mięśnia sercowego w modelu gryzoni jest klasycznie przeprowadzana przy użyciu poziomów biomarkerów w osoczu, takich jak troponina I i T3, echokardiografia, rezonans magnetyczny i histologia4,5. Poziomy biomarkerów są skorelowane ze stopniem śmierci kardiomiocytów. Echokardiografia ocenia upośledzenie funkcji lewej komory wynikające z nieprawidłowości ruchomości regionalnej ściany. Ponadto nieinwazyjne techniki obrazowania, takie jak rezonans magnetyczny lub echokardiografia o wysokiej rozdzielczości, pozwalają na ocenę zmniejszenia ruchomości ściany, objętości obszaru blizny ze zmniejszoną perfuzją i żywotną mięśniem sercowym oraz ścieńczenia ściany. Wymiary LV pozwalają na dokładną ocenę wielkości zawału. Wreszcie, oznaczanie ilościowe żywotnego i martwego mięśnia sercowego można przeprowadzić post mortem przy użyciu specyficznych barwień histologicznych skrawków pobranych serc i umożliwia weryfikację wielkości zawału (IS). Kolejną ważną funkcją jest ocena wskaźnika rozszerzalności zawału (EI)6. EI jest związany z zawałem przezściennym i rozpoczyna się w ciągu pierwszych 3 dni. EI charakteryzuje się postępującym zmniejszaniem grubości ścianek, wzrostem wielkości wnęki nn, a co za tym idzie zmianami kształtu lewej kominy.

Aby ocenić skuteczność terapeutyczną nowych metod leczenia - w szczególności strategii regeneracyjnych opartych na komórkach, matrycach i dostarczaniu genów - dokładna ocena MI u gryzoni ma ogromne znaczenie. Przy pomiarze na pojedynczym przekroju poprzecznym uzyskanym na poziomie mięśnia brodawkowatego, rozmiar IS może być obciążony ze względu na dużą zmienność, która występuje w rozwoju zawału po podwiązaniu LAD; Zawał wierzchołka może być wtedy zakryty. Co ważne, dokładniejsze metodologie określania wielkości MI opisano dla myszy7-9 lub szczurów10. Niemniej jednak IS jest niewystarczające do dokładnego ilościowego określenia przebudowy lewej komory lub terapeutycznie wywołanych redukcji (lub zapobiegania) przebudowy. Rzeczywiście, IS jest zwykle wyrażany jako procent całkowitej objętości lewej komory oceniany na przekrojach serca. Chociaż metoda ta jest ważna w przypadku ostrego zawału mięśnia sercowego, ścieńczenie ściany lewej komory zachodzące podczas przebudowy pozostaje niedostatecznie ocenione11,12. Pełna morfometryczna kwantyfikacja wielkości zawału i zmian strukturalnych powinna określić ilościowo kilka parametrów, takich jak długości i średnice wsierdzia i nasierdzia, a także zawał i zdrowe obszary. Opisujemy podejście metodologiczne do dokładnej oceny zawału mięśnia sercowego i przebudowy w przewlekłym modelu szczura.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z Europejską Konwencją o Opiece nad Zwierzętami. Zabiegi chirurgiczne zostały wykonane zgodnie ze szwajcarską ustawą o ochronie zwierząt po uzyskaniu zezwolenia Państwowego Urzędu Weterynaryjnego we Fryburgu, zatwierdzonego przez Szwajcarski Federalny Urząd Weterynaryjny, Szwajcaria.

1. Zbieranie serc

UWAGA: Wszystkie interwencje chirurgiczne były wykonywane w znieczuleniu izofluranem. Podjęto wysiłki, aby zmniejszyć cierpienie zwierząt. W szczególności wszystkie zwierzęta otrzymały podskórne wstrzyknięcie w dawce 0,1 mg/kg buprenorfiny przed znieczuleniem. Chirurgiczny protokół indukcji zawału mięśnia sercowego został wcześniej opisany w innym miejscu13.

  1. Wykonać sternotomię u zwierzęcia z zawałem mięśnia sercowego w znieczuleniu (zwierzę zaintubowane, 2,5% izofluranu, znieczulenie właściwe potwierdzone odruchem szczypania łapy).
    1. Otwórz zwierzę, przecinając skórę, a następnie mięśnie nożyczkami chirurgicznymi. Wytnij żebra po lewej i prawej stronie, a następnie usuń klatkę piersiową.
    2. Usuń zrosty pozostałe po poprzednim zabiegu (podwiązanie LAD). Przetnij aortę i usuń serce. Umieść chusteczkę w 1 M KCl (w PBS), a następnie umyj ją PBS.

2. Przygotowanie tkanek

  1. Umieść serce z zawałem wzdłużnie w akrylowej matrycy serca szczura. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę.
  2. Wytnij serce bezpośrednio w matrycy za pomocą żyletki z poprzecznym otworem. Upewnij się, że każdy plasterek ma grubość 2 mm. Wytnij około 5-7 slajdów na każde serce (w zależności od poziomu przebudowy); Nazywa się to systematycznym pobieraniem próbek.
  3. Na tym etapie barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) jest opcjonalne (należy zachować orientację plastrów serca od podstawy do wierzchołka).
    1. Inkubować w 1% TTC w PBS przez 50 minut w temperaturze 37 °C. Inkubować w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 20 minut do 1 godziny. Umieścić skrawki między dwiema szklanymi płytkami z 2-milimetrowymi przekładkami i robić zdjęcia za pomocą mikroskopu stereologicznego sprzężonego z kamerą przy 15-krotnym powiększeniu.
      ostrożność! Paraformaldehyd jest toksyczny.
  4. Zamrażanie szkiełka (1. opcja)
    1. Umieść każde szkiełko w plastikowej formie (10 x 10 x 5 mm) z podłożem montażowym do kriotomii (optymalna temperatura cięcia, OCT), zachowaj orientację (umieść wierzchołkową stronę sekcji w dół na dnie formy). Zamrozić bloki z oparami 2-metylobutanu pod chłodzeniem ciekłym azotem przez 10 - 15 min. Na koniec należy przechowywać tkankę w temperaturze -80 °C.
  5. Parafinizacja (2. opcja)
    1. Umieść każdy szkiełko w kasetach do zatapiania (zachowaj orientację, umieszczając stronę sekcji zorientowaną wierzchołkowo na dole kasety), a następnie w 4% PFA na 24 godziny. Włóż go na noc do procesora tkanek.
      1. Inkubować w etanolu 70% przez 2 godziny. Inkubować w etanolu 95% przez 2 godziny. Inkubować w etanolu 100% przez 3 godziny. Inkubować w ksylolu przez 4 godziny. Inkubować w parafinie (stopionej w temperaturze 60 °C w piecu) przez 5 godzin. Na koniec uformuj bloki, zatapiając każdy szkiełko serca w parafinie.

3. Barwienie trichromowe Massona-Goldnera

  1. Wykonać skrawki tkanek z bloków parafinowych za pomocą mikrotomu ręcznego (grubość: 5 μm) lub z bloczków OCT z kriostatem ustawionym na -18 °C (grubość: 7 μm).
  2. Wybarwić jedno szkiełko z każdej części serca dla każdego szczura (3 - 4 przekroje poprzeczne na szkiełko) barwieniem trichromowym Massona-Goldnera (patrz załącznik).
    UWAGA: Zacznij od tego kroku dla sekcji parafinowych.
    1. Stopić szkiełka w temperaturze 60 °C w piekarniku. Pod wyciągiem odparafinować je w ksylolu dwukrotnie przez 10 minut każdy. Nawadniaj je w 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu i wodzie destylowanej przez 3 minuty każde.
      UWAGA: Zacznij od tego kroku w przypadku kriosekcji.
    2. Napraw je w roztworze Bouina na noc. Następnie płucz je pod bieżącą wodą z kranu przez 10 - 15 minut. Opłucz je w wodzie destylowanej. Inkubuj je w hematoksynie Mayera przez 3 minuty.
    3. Wyjmij szkiełka i pozostaw je w wodzie destylowanej na 5 minut. Następnie inkubuj je w kwasie Fuchsin-Ponceau przez 5 minut. Opłucz je w 1% kwasie octowym przez 1 min.
    4. Następnie inkubuj je w kwasie fosfomolibdenowym Orange G przez 1 min. Opłucz je w 1% kwasie octowym przez 1 min, inkubuj w jasnozielonym barwniku przez 10 min i płucz w 1% kwasie octowym przez 1 min.
    5. Odwodnić je w 70% etanolu (30 sekund), 95% etanolu (30 sekund) i 100% etanolu (5 minut). Nałóż jedną kroplę żywicznego podłoża mocującego na skrawki tkanki, przykryj je szkiełkami nakrywkowymi i pozostaw do wyschnięcia.

4. Analiza wielkości zawału

  1. Uzyskaj jeden obraz z każdego szkiełka na mikroskopie stereoskopowym (powiększenie 15x) w połączeniu z kamerą. Sfotografuj linijkę z tymi samymi ustawieniami.
  2. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby zmierzyć grubość blizny w środku zawału, grubość przegrody, obszar jamy lewej komory (LV), obszar zawału i obszar tkanki lewej komory za pomocą.
    1. Ustaw skalę za pomocą obrazu linijki (Rysunek 1A).
      1. Kliknij Pomiary, a następnie wybierz Ustaw współczynnik konwersji. Narysuj linię na pasku kalibracji. Kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazku i kliknij Zakończ kalibrację. Zanotuj wartość słupka, a następnie kliknij przycisk OK.
    2. Wybierz LV z poplamionego obrazu serca (Rysunek 1B). Użyj narzędzia Wiele segmentów. Wybierz LV punkt po punkcie, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy Kopiuj/Wklej w dowolnym miejscu.
    3. Zmierz grubość blizny i przegrody za pomocą jednosegmentowego narzędzia pomiarowego (Rysunek 1C).
    4. Automatycznie wykrywaj wnękę niskiego napięcia, zawał i obszary niskiego napięcia za pomocą narzędzia do automatycznego pomiaru obszaru w trybie RGB (rysunek 1D).
      1. Kliknij narzędzie. Aktywuj tylko obramowania i ciągłe w trybie RGB. Na koniec kliknij wewnątrz obszaru zainteresowania, aby go wykryć. W razie potrzeby użyj precyzyjnych narzędzi.
  3. Oblicz rozmiar zawału jako stosunek powierzchni zawału do obszaru LV.
  4. Obliczyć wskaźnik rozszerzalności w następujący sposób: [powierzchnia lewej komory / cała powierzchnia lewej komory] / [grubość zawału / grubość przegrody], przy czym cały obszar lewej komory obejmuje zarówno jamę lewej komory, jak i obszar tkanki lewej komory.
  5. Na koniec oblicz "średnią" dla każdego serca w następujący sposób: [średnia wskaźnika ekspansji ze szkiełek z zawału] * [Liczba szkiełek z zawałem / Całkowita liczba szkiełek].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Sześć tygodni po podwiązaniu LAD, pobrano serca szczurów szczepu Lewis. Uzyskano przekroje tkanki o grubości 2 mm, od wierzchołka do podstawy. Wykonano procedurę barwienia TTC w celu wizualizacji obszaru zawału, który barwi się na biało, oraz zdrowego mięśnia sercowego, który barwi się na czerwono (Rysunek 2). W zależności od miejsca podwiązania LAD wielkość zawału jest zmienna. W przypadku rozległego MI zaobserwowano zawały transmuralne od wierzchołka do podstawy (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe kroki w ramach protokołu

Tkankę zwłóknieniową można dokładnie ocenić w modelu szczura z przewlekłym zawałem mięśnia sercowego przy użyciu systematycznego pobierania próbek serca i analiz obrazów trójbarwnych wycinków histologicznych uzyskanych od podstawy do wierzchołka. Dwa kroki są szczególnie ważne dla pomyślnego wdrożenia protokołu. Po pierwsze, zastosowanie KCl do pobierania serca pozwala na utrzymanie mięśnia sercowego w stanie zrelaksowanym. Ten krok jest ważny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badanie było wspierane przez Szwajcarską Fundację Narodową [SNF 310030-149986 do MNG], Uniwersytet we Fryburgu i Szpital we Fryburgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Akrylowa matryca serca szczura 2 mm72-5015Harvard Appartus
Inspira zaawansowany respirator z regulacją objętościHarvard Aparat 557058
Cewnik Insyte 14 GBD381267
O.C.TBDHA361603EVWR
TTCT8877-10GSigma Aldrich
Mayer hematoksylinaMHS32-1LSigma Aldrich
Acid Fuchsin
CI 42685		F8129-50GSigma Aldrich
Ponceau Xylidin
CI 16150		P2395-25GSigma Aldrich
Orange G
CI 16230		O3756-100GSigma Aldrich
Jasnozielony
CI 42095		L5382-25GSigma Aldrich
KClP9333-500GSigma Aldrich
Xylol10315083HoneyWell
Etanol absolutny10303990HoneyWell
2-metylobutanM32631-1LSigma Aldrich
Mikroskop stereogicznySM2800Nikon
Formaldehyd99340Reactolab
Kaseta do zatapianiaK113.1Carl Roth
Bersoft OprogramowanieBersoft.comLicencjonowane oprogramowanie
do pomiaru obrazu

Bibliografia

  1. Amsterdam, E. A., et al. AHA/ACC Guideline for the Management of Patients with Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 64, e139-e228 (2014).
  2. Konstam, M. A., Kramer, D. G., Patel, A. R., Maron, M. S., Udelson, J. E. Left ventricular remodeling in heart failure: current concepts in clinical significance and assessment. JACC Cardiovasc Imaging. 4, 98-108 (2011).
  3. Frobert, A., et al. Prognostic Value of Troponin I for Infarct Size to Improve Preclinical Myocardial Infarction Small Animal Models. Front Physiol. 6, 353(2015).
  4. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17, 268-272 (2012).
  5. Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, 2996-3006 (2014).
  6. Landa, N., et al. Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat. Circulation. 117, 1388-1396 (2008).
  7. Valente, M., et al. Optimized heart sampling and systematic evaluation of cardiac therapies inmouse models of ischemic injury: Assessment of cardiacremodeling and semi-automated quantification of myocardial infarctsize. Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 359-391 (2015).
  8. Csonka, C., et al. Measurement of myocardial infarct size in preclinical studies. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 163-170 (2010).
  9. Zornoff, L. A., Paiva, S. A., Minicucci, M. F., Spadaro, J. Experimental myocardium infarction in rats: Analysis of the model. Arq. Bras Cardiol. 93, 434-440 (2009).
  10. Lichtenauer, M., et al. Myocardial infarct size measurement using geometric angle calculation. Eur J Clin Invest. 44, 160-167 (2014).
  11. Lutgens, E., et al. Chronic myocardial infarction in the mouse: cardiac structural and functional changes. Cardiovasc Res. 41, 586-593 (1999).
  12. Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, L., Giraud, M. N. Cell-based therapy for heart failure in rat: double thoracotomy for myocardial infarction and epicardial implantation of cells and biomatrix. J Vis Exp. , e51390(2014).
  13. Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. J Appl Physiol (1985). 102, 2104-2111 (2007).
  14. Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. Am Heart J. 101, 593-600 (1981).
  15. Weisman, H. F., Bush, D. E., Mannisi, J. A., Weisfeldt, M. L., Healy, B. Cellular mechanisms of myocardial infarct expansion. Circulation. 78, 186-201 (1988).
  16. Mannisi, J. A., Weisman, H. F., Bush, D. E., Dudeck, P., Healy, B. Steroid administration after myocardial infarction promotes early infarct expansion. A study in the rat. J Clin Invest. 79, 1431-1439 (1987).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zawał mięśnia sercowegoilościowe oznaczanie wielkości zawałusystematyczne pobieranie próbek sercabarwienie trichromoweanaliza obrazuobliczanie indeksu ekspansjiprzebudowa lewej komorymodel serca szczurasekcjonowanie histologicznebarwienie TTC
Histologiczna ocena ilościowa przewlekłego zawału mięśnia sercowego u szczurów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.