Prezentujemy model ortotopowego przeszczepu aorty przy użyciu techniki rękawowej u myszy. Jest to bardzo szybka metoda zespolenia, która może być stosowana w badaniach nad chorobami naczyniowymi.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie techniki rękawowej w mysim modelu przeszczepu aorty - film instruktażowy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ortotopowy przeszczep aorty przy użyciu techniki rękawowej zmniejsza uszkodzenia aorty przy wskaźniku niepowodzeń wynoszącym zaledwie 10-20%. Czas zespolenia aorty u myszy metodą rękawową był krótki i łatwy, wynosił średnio 20 minut, co pozwoliło na badania przeszczepów iso/allo. Poniższy artykuł opisuje procedurę przeszczepu aorty stosowaną w naszym laboratorium. Myszy znieczulono mieszaniną izofluranu o objętości 1,5% i 100% tlenu przez maskę na twarz. W tym miejscu odcinek aorty między tętnicami nerkowymi i jego rozwidleniem został oddzielony od żyły głównej, swobodnie przygotowany i zaciśnięty na bliższym i dalszym odcinku za pomocą jednego szwu jedwabnego. Przed usunięciem aorty do żyły głównej dolnej wstrzyknięto roztwór soli fizjologicznej zawierający heparynę. Następnie aorta została przecięta między klamrami i użyto roztworu heparyny soli fizjologicznej do przepłukania światła. W celu przeszczepienia aorty brzusznej w pozycji ortotopowej zastosowano technikę rękawową z użyciem szwów monofilamentowych.
Wprowadzenie
Jak wskazano w poprzednim badaniu, dużą uwagę zwrócono na modele przeszczepu aorty u myszy, które umożliwiają rozróżnienie między specyficznymi reakcjami naczyniowymi spowodowanymi przez sam przeszczep a pewnymi czynnikami ogólnoustrojowymi związanymi ze środowiskiem tętniczym1,2,3. Głównym czynnikiem, który odgrywa tutaj kluczową rolę, jest dostępność myszy nokautujących i transgenicznych. Ich udział w takim modelu daje możliwość identyfikacji i wyznaczenia nowych ścieżek patofizjologicznych związanych z rozwojem choroby zwyrodnieniowej naczyń krwionośnych, takich jak miażdżyca i powstawanie tętniaków4,5.
Warto zauważyć, że podczas szczepienia może pojawić się wewnętrzne uszkodzenie niedokrwienia/reperfuzji naczyń przeznaczonych do przeszczepu. W związku z tym nie można wykluczyć wystąpienia określonych problemów z integralnością przeszczepu lub nieoczekiwanej reakcji zapalnej w okresie pooperacyjnym, co może wykluczać zmiany patofizjologiczne w zwyrodnieniowych chorobach naczyniowych3,4,5,6,7. Zespolenie rękawowe jest alternatywną metodą end-in-end do zespolenia tętniczego naczyń o średnicy mniejszej niż jeden milimetr i zostało z powodzeniem zastosowane w transplantacji nerek i serca u szczurów, które zostało następnie przystosowane do przeszczepu aorty u myszy przez Dambrina i wsp.8,9,10,11.
Uszkodzenia aorty przy użyciu techniki przeszczepu rękawowego są zminimalizowane dzięki bardzo niskiemu wskaźnikowi niepowodzeń technicznych, dzięki temu, że trwają średnio tylko 20 minut. Nasze dotychczasowe wyniki wykazały doskonałe właściwości funkcjonalne i strukturalne przeszczepu in vivo po przeszczepieniu przy użyciu techniki rękawowej1. Dambrin i wsp. opisują, że po krótkiej krzywej uczenia się wskaźnik sukcesu wynosił ponad 78%10. Powikłania, takie jak zakrzepica, występują rzadko, na przykład Engelbrecht i wsp. nie zaobserwowali zakrzepicy przy użyciu techniki rękawowej w przeszczepie nerki u szczura8.
Model przeszczepu mysiego aorty z zespoleniami rękawowymi to szybkie i łatwe narzędzie do badania reakcji izo/alloprzeszczepu w przeszczepionym naczyniu. Ten film ilustruje zabieg przeszczepu aorty przeprowadzany w naszym laboratorium. Ten model transplantacji może być przydatny w definiowaniu podstawowych mechanizmów patologicznych choroby zwyrodnieniowej naczyń krwionośnych i może przyczynić się do dalszej oceny interwencji molekularnych i farmakologicznych12.
Protokół
Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie RWTH w Akwizgranie, AZ 84-02.04.2012.A234.
UWAGA: Procedura jest demonstrowana na użyciu dorosłych samców myszy typu dzikiego z tłem CD1. Trzymaj myszy w specjalistycznej jednostce laboratoryjnej przed i po operacji, zapewniając odpowiedni dostęp do pożywienia, specjalistyczną kontrolę weterynaryjną i leczenie. Jeśli zwierzęta są kupowane z zewnątrz, przed wykonaniem operacji należy odczekać tygodniową aklimatyzację.
1. Przygotowanie Dawcy
- Używaj sterylnych materiałów i narzędzi, aby utrzymać sterylne warunki podczas operacji, aby uniknąć infekcji.
- Znieczulij każdą mysz mieszaniną 1,5% objętości izofluranu i 100% tlenu przez maskę na twarz. Połóż mysz na platformie w pozycji leżącej na plecach i przyklej wszystkie jej nogi do stołu operacyjnego. Sprawdź jej odruchy, szczypiąc tylne łapy, aby upewnić się, że mysz jest wystarczająco znieczulona. Umieść maść okulistyczną na oczach, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.
- Usuń wszystkie włosy z brzucha za pomocą żelu do depilacji lub golarki. Operację należy wykonać w sterylnych warunkach. Zdezynfekuj brzuch naprzemiennie peelingami chlorheksydyny i sterylnej wody.
- Usuń aortę dawczą przez nacięcie brzucha w linii środkowej za pomocą nożyczek lub skalpela. Cofnij jelito ręcznie w prawo. Delikatnie ręcznie odbij jelita na bok za pomocą rękawiczek bezpudrowych.
- Ułóż jelito na kawałku gazy zwilżonej solą fizjologiczną, aby było wilgotne.
- Bardzo ostrożnie wypreparuj aortę brzuszną z otaczającej tkanki za pomocą cięcia pęsetą.
- Oddziel odcinek aorty między tętnicami nerkowymi i jej rozwidleniem od żyły głównej za pomocą pęsety.
- Zabezpiecz wszystkie małe gałęzie tego segmentu bardzo ostrożnie za pomocą pojedynczego szwu monofilamentowego 11-0.
- Przed usunięciem aorty wstrzyknąć 0,5 mililitra (ml) roztworu soli fizjologicznej zawierającego 50 j. heparyny do żyły głównej dolnej.
- Pozwól zwierzęciu dawcy wykrwawić się po usunięciu odcinka aorty.
- Całkowicie spłucz przeszczep solą fizjologiczną, a następnie natychmiast przenieś go do pojemnika z lodowatą solą fizjologiczną.
2. Przygotowanie odbiorcy
- Znieczulić zwierzę biorcy mieszaniną izofluranu o stężeniu 1,5% objętościowym i 100% tlenu za pomocą maski na twarz, a następnie usunąć sierść i zdezynfekować (punkt 1). Wykonaj nacięcie w linii środkowej od mieczyka mieczykowatego do miednicy za pomocą skalpela i cofnij ściany brzucha. Umieść maść okulistyczną na oczach, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.
- Owiń jelito w gazie zwilżonej roztworem soli fizjologicznej i bardzo delikatnie przesuń w prawo zwierzęcia.
- Wypreparuj aortę podnerkową wolną między tętnicami nerkowymi proksymalnie a rozwidleniem dystalnie za pomocą pęsety.
- Zabezpiecz wszystkie małe gałęzie tego segmentu bardzo ostrożnie za pomocą pojedynczego szwu monofilamentowego 11-0.
- Zacisnąć bliższą i dalszą część aorty za pomocą pojedynczego szwu jedwabnego 6-0.
- Podziel aortę pośrodku między zaciski i przepłucz odcięte końce heparynizowaną solą fizjologiczną, aby wypłukać światło.
- Umieść przeszczep w pozycji ortotopowej z końcem naczynia do karmienia włożonym do naczynia odbiorczego, a następnie zszyj żyłką 11-0, uważając, aby uniknąć skręcenia aorty poprzez prawidłowe ustawienie dawcy i biorcy (Rysunek 1)10.
- Ostrożnie zwolnij ligatury po przeprowadzeniu oględzin zespolenia. Najpierw zwolnij dystalny zacisk. Powoduje to, że niskie ciśnienie utrzymuje ściany razem przed uwolnieniem proksymalnej strony wysokiego ciśnienia.
- Natychmiast wykonaj przeszczep i sprawdź, czy nie ma widocznego impulsu. Delikatnie usuń resztki jedwabiu. Optymalna długość zachodzenia na siebie aorty dawcy i biorcy wynosi 1-2 mm.
- Z powrotem zawartość brzuszną należy wprowadzić z powrotem do jamy brzusznej i zamknąć całą ranę szokiem z kwasem poliglikolowym 3-0.
- Podać myszy buprenorfinę (0,05 mg/kg masy ciała podskórnie (SC)) przed zakończeniem znieczulenia.
- Nie zostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie będzie w pełni przytomne. Leczenie bólu należy stosować buprenofiną w dawce 0,05 mg/kg masy ciała, podawaną podskórnie trzy razy dziennie przez trzy dni po operacji, zgodnie z aprobatą instytucjonalnego organu nadzoru.
- W celu pobrania tkanek znieczulij myszy biorcę zgodnie z powyższym opisem i przepłucz naczynia solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie 4% formaldehydem/PBS (pH = 7,4) przez nakłucie serca. Delikatnie usuń przeszczepy. Po utrwaleniu przez noc w 4% formaldehydzie/PBS, próbki należy poddać dalszej obróbce i zatopić w parafinie.
Wyniki
Myszy wybudziły się z narkozy w ciągu 15-30 min bez obserwowanych zaburzeń fizycznych, choć istniało podwyższone ryzyko zakrzepicy. Podczas obserwacji pooperacyjnych zastosowano analizę ultradźwiękową. U myszy typu dzikiego wykorzystanych w badaniu nie stwierdzono zmian w wymiarach ich światła naczyń. W związku z tym nie zaobserwowano ani zwężeń, ani formacji tętniakowych. U zwierząt z przeszczepem nie stwierdzono rozwoju blaszek miażdżycowych w ścianach naczyń (Rycina 2).
Konwencjonalne procedury barwienia, takie jak immunohistohistochemia, mogą być wykorzystane do określenia obecności blaszki miażdżycowej, układu komórek mięśni gładkich oraz akumulacji makrofagów. W naszym badaniu barwienie histologiczne i immunohistochemiczne wykonano 6 tygodni po przeszczepieniu w celu sprawdzenia integralności przeszczepu. Barwienie histologiczne (hematoksyliną i eozyną (HE)) oraz barwienie immunohistochemiczne (aktyna mięśni gładkich (SMA) i makrofagi (MAC2)) (Rycina 3) wykazały niezmienione wzorce rozkładu komórek mięśni gładkich, nienaruszoną wyściółkę z komórek śródbłonka oraz brak akumulacji komórek w błonie wewnętrznej. Wyniki te wskazują, że w przeszczepionych naczyniach nie stwierdzono istotnych zmian chorobowych ani aktywacji komórkowej (Rycina 3).
Rysunek 1: Technika mankietowa (Sleeve technique). Aorta brzuszna została przeszczepiona z wykorzystaniem techniki mankietowej. W tej procedurze aorta dawcy została umieszczona w pozycji ortotopowej przy zastosowaniu powierzchownych szwów w naczyniu doprowadzającym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Obrazy śródoperacyjne i ultrasonograficzne. Przykłady widoku śródoperacyjnego (sekcyjnego) przeszczepów 6 tygodni po transplantacji (A), ich obrazowania ultrasonograficznego trójwymiarowego (B) oraz obrazowania w trybie B (C). Pooperacyjna obserwacja była prowadzona za pomocą ultrasonografii. Zdjęcia wykazują drożność przeszczepu bez zmian w wymiarach światła naczynia. Dodatkowo nie zaobserwowano zwężeń ani formacji tętniakowatych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Obrazy histologiczne i immunohistochemiczne. Reprezentatywne obrazy histologiczne i immunohistochemiczne zwierząt po przeszczepie w 6 tygodniu po zabiegu. W przeszczepionych aortach nie zaobserwowano istotnych zmian w badaniu histologicznym (hematoksylina i eozyna, HE, powiększenie 100X, pasek skali = 50 µm) oraz w barwieniu immunohistochemicznym (aktyna mięśni gładkich SMA (czerwony) lub makrofagi MAC2 (zielony), powiększenie 200X, pasek skali = 25 µm). Jądra komórkowe przeciwbarwiono DAPI (niebieski). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Przed tym badaniem dokładnie przeanalizowano różne inne modele przeszczepiania u myszy 3,6,7,10,13,14. Model przeszczepienia aorty techniką rękawową z modyfikacjami Dambrina i wsp. został wybrany, ponieważ odpowiadał naszym kryteriom i wykazał wysoką wiarygodność zespolenia rękawowego w porównaniu z konwencjonalnymi metodami szwów typu end-to-end 1,10.
Technika ta jest korzystna pod wieloma względami, ponieważ czas zacisku krzyżowego jest znacznie skrócony, co minimalizuje uszkodzenie aorty podczas operacji. Zaobserwowano niską częstość występowania zakrzepicy, a także uniknięto potencjalnej niezgodności kalibru naczyń między dawcą a biorcą. Powyższe obserwacje sprawiają, że technika ta jest wysoce odpowiednia do badania chorób naczyniowych w przeszczepach aorty u myszy.
W badaniu kontrolnym, w którym wykonano badanie ultrasonograficzne 8 tygodni po przeszczepie, nie wykryto żadnych istotnych zmian. Potwierdziło to przypuszczenia, że jakiekolwiek uszkodzenie aorty podczas operacji będzie minimalne1.
Przedstawiona w tym artykule procedura szczepienia gwarantuje brak upośledzenia zarówno integralności przeszczepu, jak i jego funkcji. W związku z tym można stwierdzić, że ten eksperymentalny model transplantacji może służyć jako cenne narzędzie dla przyszłych badań molekularnych i farmakologicznych choroby naczyń zwyrodnieniowych u genetycznie modyfikowanych myszy.
Wierzymy, że przewodnik wideo może służyć jako materiał dydaktyczny ilustrujący zastosowanie tego prostego modelu tętniczo-tętniczego i że przyczyni się do dalszej owocnej debaty na temat wielu ważnych kwestii w patologiach naczyniowych. Ta bardzo szybka metoda zespolenia może być wykorzystana do badania chorób naczyniowych u genetycznie modyfikowanych myszy. Może być również stosowany jako modyfikacja modelu tętniaka połączona z przeszczepem.
Podczas zabiegu występują punkty krytyczne. Założenie samego szwu jest najbardziej krytycznym krokiem. Chirurg musi zadbać o to, aby uniknąć skrętu aorty poprzez odpowiednie ustawienie dawcy i biorcy. Klamry są ostrożnie usuwane po oględzinach zespolenia. Dystalny zacisk powinien być zawsze zwalniany jako pierwszy, co powoduje niskie ciśnienie utrzymujące ścianki razem przed proksymalnym zwolnieniem bocznym wysokiego ciśnienia. Konsekwencją niewłaściwego przestrzegania kolejności uwalniania byłoby krwawienie.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Romie Wieczorek i Peterowi Kurdybacha za doskonałą pomoc w edycji, a Leonowi Deckerowi i Uli Heuterowi za doskonałą pomoc techniczną.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Uchwyt na igły Halsey | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Dumont #5 Kleszcze - | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Lexer-Nożyczki dla niemowląt | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Castroviejo Micro Needle | Holder Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vannas Nożyczki | Aesculap, Niemcy | Typ OC498R | |
| Castroviejo Kleszcze do szwów | Geuder, Niemcy | 19015 | |
| 6-0 jedwab (Jedwab) | Deknatel, Research Triangle Park NC, USA | 18020-60- FST | |
| 11-0 monofilament (Ethilon) | Ethicon, Norderstedt, Niemcy | EH7438G | |
| 3-0 szew z kwasem poliglikolowym (Serafit) | Serag-Wiessner, Naila, Niemcy | 60203214 | |
| Izofluoran | Dowolna generikona | ||
| Heparyna | Dowolna generyka | ||
| 0,9% sól fizjologiczna | Dowolna generikona | ||
| Buprenorfina | Dowolna generikona | ||
| Bepanthene krem pod oczy i nos | Bayer, Niemcy | ||
| Microscop | Zeiss | Opmi MDO/S5 | |
| Waporyzator | Eickemeyer | TEC3 | |
| Ultrasonografia | Vevo, Kanada | 770,2100 |
Bibliografia
- Rowinska, Z., et al. Non- invasive in vivo analysis of a murine aortic graft using high resolution ultrasound microimaging. Eur J Radiol. 81 (2), 244-249 (2012).
- Daugherty, A. Mouse models of atherosclerosis. Am J Med Sci. 323 (1), 3-10 (2002).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc .Biol. 24 (3), 429-434 (2004).
- Zernecke, A., Shagdarsuren, E., Weber, C. Chemokines in atherosclerosis: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (11), 1897-1908 (2008).
- Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. J Surg Res. 111 (2), 171-176 (2003).
- Koulack, J., McAlister, V. C., Giacomantonio, C. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Development of a mouse aortic transplant model of chronic rejection. Microsurgery. 16 (2), 110-113 (1995).
- Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
- Baxter, K., Hao, P. M., Howden, B. O., Saunder, A., Jablonski, P. Modified technique of abdominal heart transplantation in the rat. J Heart Lung Transplant. 17 (11), 1057-1064 (1998).
- Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J Heart Lung Transplant. 18 (10), 946-951 (1999).
- Siemionow, M. Histopathology of microarterial anastomoses: end-to-end versus end-in-end (sleeve) technique. J Hand Surg Am. 15, 619-625 (1990).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354 (6), 610-621 (2006).
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18 (6), 368-371 (1998).
- Guo, L., Agarwal, A., George, J. F. Orthotopic aortic transplantation in mice for the study of vascular disease. J Vis Exp. (69), e4338(2012).
Przedruki i uprawnienia
