Artykuł metodologiczny

Zastosowanie techniki rękawowej w mysim modelu przeszczepu aorty - film instruktażowy

DOI:

10.3791/54915

⸱

22 października 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery and Interdisciplinary Vein Center, St. Josef-Hospital, Ruhr- University Bochum, 2Institute of Molecular Cardiovascular Research, University Hospital, RWTH Aachen University Department of Medicine, 3Institute of Pharmacology and Clinical Pharmacology, Düsseldorf University Hospital, 4Department of Cardiology, Vascular Medicine and Intensive Care Medicine, Hospital Robert Koch Gehrden, 5Division of Vascular Surgery, Asklepios Klinik St. Georg, 6Institute of Experimental Biomedicine, Würzburg University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy model ortotopowego przeszczepu aorty przy użyciu techniki rękawowej u myszy. Jest to bardzo szybka metoda zespolenia, która może być stosowana w badaniach nad chorobami naczyniowymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ortotopowy przeszczep aorty przy użyciu techniki rękawowej zmniejsza uszkodzenia aorty przy wskaźniku niepowodzeń wynoszącym zaledwie 10-20%. Czas zespolenia aorty u myszy metodą rękawową był krótki i łatwy, wynosił średnio 20 minut, co pozwoliło na badania przeszczepów iso/allo. Poniższy artykuł opisuje procedurę przeszczepu aorty stosowaną w naszym laboratorium. Myszy znieczulono mieszaniną izofluranu o objętości 1,5% i 100% tlenu przez maskę na twarz. W tym miejscu odcinek aorty między tętnicami nerkowymi i jego rozwidleniem został oddzielony od żyły głównej, swobodnie przygotowany i zaciśnięty na bliższym i dalszym odcinku za pomocą jednego szwu jedwabnego. Przed usunięciem aorty do żyły głównej dolnej wstrzyknięto roztwór soli fizjologicznej zawierający heparynę. Następnie aorta została przecięta między klamrami i użyto roztworu heparyny soli fizjologicznej do przepłukania światła. W celu przeszczepienia aorty brzusznej w pozycji ortotopowej zastosowano technikę rękawową z użyciem szwów monofilamentowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak wskazano w poprzednim badaniu, dużą uwagę zwrócono na modele przeszczepu aorty u myszy, które umożliwiają rozróżnienie między specyficznymi reakcjami naczyniowymi spowodowanymi przez sam przeszczep a pewnymi czynnikami ogólnoustrojowymi związanymi ze środowiskiem tętniczym1,2,3. Głównym czynnikiem, który odgrywa tutaj kluczową rolę, jest dostępność myszy nokautujących i transgenicznych. Ich udział w takim modelu daje możliwość identyfikacji i wyznaczenia nowych ścieżek patofizjologicznych związanych z rozwojem choroby zwyrodnieniowej naczyń krwionośnych, takich jak miażdżyca i powstawanie tętniaków4,5.

Warto zauważyć, że podczas szczepienia może pojawić się wewnętrzne uszkodzenie niedokrwienia/reperfuzji naczyń przeznaczonych do przeszczepu. W związku z tym nie można wykluczyć wystąpienia określonych problemów z integralnością przeszczepu lub nieoczekiwanej reakcji zapalnej w okresie pooperacyjnym, co może wykluczać zmiany patofizjologiczne w zwyrodnieniowych chorobach naczyniowych3,4,5,6,7. Zespolenie rękawowe jest alternatywną metodą end-in-end do zespolenia tętniczego naczyń o średnicy mniejszej niż jeden milimetr i zostało z powodzeniem zastosowane w transplantacji nerek i serca u szczurów, które zostało następnie przystosowane do przeszczepu aorty u myszy przez Dambrina i wsp.8,9,10,11.

Uszkodzenia aorty przy użyciu techniki przeszczepu rękawowego są zminimalizowane dzięki bardzo niskiemu wskaźnikowi niepowodzeń technicznych, dzięki temu, że trwają średnio tylko 20 minut. Nasze dotychczasowe wyniki wykazały doskonałe właściwości funkcjonalne i strukturalne przeszczepu in vivo po przeszczepieniu przy użyciu techniki rękawowej1. Dambrin i wsp. opisują, że po krótkiej krzywej uczenia się wskaźnik sukcesu wynosił ponad 78%10. Powikłania, takie jak zakrzepica, występują rzadko, na przykład Engelbrecht i wsp. nie zaobserwowali zakrzepicy przy użyciu techniki rękawowej w przeszczepie nerki u szczura8.

Model przeszczepu mysiego aorty z zespoleniami rękawowymi to szybkie i łatwe narzędzie do badania reakcji izo/alloprzeszczepu w przeszczepionym naczyniu. Ten film ilustruje zabieg przeszczepu aorty przeprowadzany w naszym laboratorium. Ten model transplantacji może być przydatny w definiowaniu podstawowych mechanizmów patologicznych choroby zwyrodnieniowej naczyń krwionośnych i może przyczynić się do dalszej oceny interwencji molekularnych i farmakologicznych12.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie RWTH w Akwizgranie, AZ 84-02.04.2012.A234.

UWAGA: Procedura jest demonstrowana na użyciu dorosłych samców myszy typu dzikiego z tłem CD1. Trzymaj myszy w specjalistycznej jednostce laboratoryjnej przed i po operacji, zapewniając odpowiedni dostęp do pożywienia, specjalistyczną kontrolę weterynaryjną i leczenie. Jeśli zwierzęta są kupowane z zewnątrz, przed wykonaniem operacji należy odczekać tygodniową aklimatyzację.

1. Przygotowanie Dawcy

  1. Używaj sterylnych materiałów i narzędzi, aby utrzymać sterylne warunki podczas operacji, aby uniknąć infekcji.
  2. Znieczulij każdą mysz mieszaniną 1,5% objętości izofluranu i 100% tlenu przez maskę na twarz. Połóż mysz na platformie w pozycji leżącej na plecach i przyklej wszystkie jej nogi do stołu operacyjnego. Sprawdź jej odruchy, szczypiąc tylne łapy, aby upewnić się, że mysz jest wystarczająco znieczulona. Umieść maść okulistyczną na oczach, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.
  3. Usuń wszystkie włosy z brzucha za pomocą żelu do depilacji lub golarki. Operację należy wykonać w sterylnych warunkach. Zdezynfekuj brzuch naprzemiennie peelingami chlorheksydyny i sterylnej wody.
  4. Usuń aortę dawczą przez nacięcie brzucha w linii środkowej za pomocą nożyczek lub skalpela. Cofnij jelito ręcznie w prawo. Delikatnie ręcznie odbij jelita na bok za pomocą rękawiczek bezpudrowych.
    1. Ułóż jelito na kawałku gazy zwilżonej solą fizjologiczną, aby było wilgotne.
    2. Bardzo ostrożnie wypreparuj aortę brzuszną z otaczającej tkanki za pomocą cięcia pęsetą.
    3. Oddziel odcinek aorty między tętnicami nerkowymi i jej rozwidleniem od żyły głównej za pomocą pęsety.
    4. Zabezpiecz wszystkie małe gałęzie tego segmentu bardzo ostrożnie za pomocą pojedynczego szwu monofilamentowego 11-0.
    5. Przed usunięciem aorty wstrzyknąć 0,5 mililitra (ml) roztworu soli fizjologicznej zawierającego 50 j. heparyny do żyły głównej dolnej.
    6. Pozwól zwierzęciu dawcy wykrwawić się po usunięciu odcinka aorty.
    7. Całkowicie spłucz przeszczep solą fizjologiczną, a następnie natychmiast przenieś go do pojemnika z lodowatą solą fizjologiczną.

2. Przygotowanie odbiorcy

  1. Znieczulić zwierzę biorcy mieszaniną izofluranu o stężeniu 1,5% objętościowym i 100% tlenu za pomocą maski na twarz, a następnie usunąć sierść i zdezynfekować (punkt 1). Wykonaj nacięcie w linii środkowej od mieczyka mieczykowatego do miednicy za pomocą skalpela i cofnij ściany brzucha. Umieść maść okulistyczną na oczach, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.
  2. Owiń jelito w gazie zwilżonej roztworem soli fizjologicznej i bardzo delikatnie przesuń w prawo zwierzęcia.
  3. Wypreparuj aortę podnerkową wolną między tętnicami nerkowymi proksymalnie a rozwidleniem dystalnie za pomocą pęsety.
  4. Zabezpiecz wszystkie małe gałęzie tego segmentu bardzo ostrożnie za pomocą pojedynczego szwu monofilamentowego 11-0.
  5. Zacisnąć bliższą i dalszą część aorty za pomocą pojedynczego szwu jedwabnego 6-0.
  6. Podziel aortę pośrodku między zaciski i przepłucz odcięte końce heparynizowaną solą fizjologiczną, aby wypłukać światło.
  7. Umieść przeszczep w pozycji ortotopowej z końcem naczynia do karmienia włożonym do naczynia odbiorczego, a następnie zszyj żyłką 11-0, uważając, aby uniknąć skręcenia aorty poprzez prawidłowe ustawienie dawcy i biorcy (Rysunek 1)10.
  8. Ostrożnie zwolnij ligatury po przeprowadzeniu oględzin zespolenia. Najpierw zwolnij dystalny zacisk. Powoduje to, że niskie ciśnienie utrzymuje ściany razem przed uwolnieniem proksymalnej strony wysokiego ciśnienia.
  9. Natychmiast wykonaj przeszczep i sprawdź, czy nie ma widocznego impulsu. Delikatnie usuń resztki jedwabiu. Optymalna długość zachodzenia na siebie aorty dawcy i biorcy wynosi 1-2 mm.
  10. Z powrotem zawartość brzuszną należy wprowadzić z powrotem do jamy brzusznej i zamknąć całą ranę szokiem z kwasem poliglikolowym 3-0.
  11. Podać myszy buprenorfinę (0,05 mg/kg masy ciała podskórnie (SC)) przed zakończeniem znieczulenia.
  12. Nie zostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie będzie w pełni przytomne. Leczenie bólu należy stosować buprenofiną w dawce 0,05 mg/kg masy ciała, podawaną podskórnie trzy razy dziennie przez trzy dni po operacji, zgodnie z aprobatą instytucjonalnego organu nadzoru.
  13. W celu pobrania tkanek znieczulij myszy biorcę zgodnie z powyższym opisem i przepłucz naczynia solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie 4% formaldehydem/PBS (pH = 7,4) przez nakłucie serca. Delikatnie usuń przeszczepy. Po utrwaleniu przez noc w 4% formaldehydzie/PBS, próbki należy poddać dalszej obróbce i zatopić w parafinie.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy wyzdrowiały po znieczuleniu w ciągu 15-30 minut, nie zauważając żadnego fizycznego upośledzenia, chociaż istniało podwyższone ryzyko zakrzepicy. W trakcie obserwacji pooperacyjnej zastosowano analizę ultrasonograficzną. Myszy typu dzikiego wykorzystane w badaniu nie wykazywały zmian w wymiarach ich światła. W związku z tym nie zaobserwowano ani zwężeń, ani formacji tętniakowych. U zwierząt po przeszczepie nie stwierdzono rozwoju płytki nazębnej na ścianach naczyń krwionośnych (Ryc. 2).

Konwencjonalne procedury barwienia, takie jak immunohistologia, mogą być używane do określenia płytki nazębnej, wzoru komórek mięśni gładkich i akumulacji makrofagów. W naszym badaniu barwienie histologiczne i immunohistochemiczne przeprowadzono 6 tygodni po szczepieniu w celu sprawdzenia integralności przeszczepu. Barwienie histologiczne (Hematoksylina i eozyna (HE) oraz barwienie immunohistochemiczne (aktyna mięśni gładkich (SMA) i makrofagi (MAC2)) (Rysunek 3) pokazały nam niezmienione wzorce rozmieszczenia komórek mięśni gładkich, nienaruszoną wyściółkę komórek śródbłonka i brak akumulacji komórek w błonie wewnętrznej. Wyniki te wskazują, że nie wykryto żadnej znaczącej zmiany ani aktywacji komórek w przeszczepionych naczyniach (Ryc. 3).

figure-results-1
Rysunek 1: Technika rękawowa. Aorta brzuszna została przeszczepiona techniką rękawową. W tej procedurze aorta dawcy została umieszczona w pozycji ortotopowej z powierzchownymi zgryzami obecnymi w naczyniu do karmienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Obrazy śródoperacyjne i ultrasonograficzne. Przykłady śródoperacyjnego (nesekcji zwłok) przeszczepów 6 tygodni po przeszczepie (A), jego trójwymiarowego USG (B) i widoku w trybie B (C). Obserwację pooperacyjną prowadzono za pomocą ultradźwięków. Zdjęcia pokazują drożność przeszczepu bez zmiany wymiarów światła. Dodatkowo nie zaobserwowano zwężeń ani powstałych powstałych tętniaków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Obrazy histologiczne i immunohistochemiczne. Reprezentatywne obrazy histologiczne i immunohistochemiczne przeszczepionych zwierząt po 6 tygodniach od przeszczepu. Nie zaobserwowano istotnych zmian w przeszczepionych aortach metodą histologiczną (Hematoksylina i eozyna, HE, powiększenie 100X, podziałka = 50 μm), barwienie immunohistochemiczne (Smooth Muscle Actin SMA (czerwona) lub Macrophage MAC2 (zielona), powiększenie 200X, podziałka = 25 μm). Jądra zostały wybarwione przeciwstawnie przez DAPI (kolor niebieski). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed tym badaniem dokładnie przeanalizowano różne inne modele przeszczepiania u myszy 3,6,7,10,13,14. Model przeszczepienia aorty techniką rękawową z modyfikacjami Dambrina i wsp. został wybrany, ponieważ odpowiadał naszym kryteriom i wykazał wysoką wiarygodność zespolenia rękawowego w porównaniu z konwencjonalnymi metodami szwów typu end-to-end 1,10.

Technika ta jest korzystna pod wieloma względami, ponieważ czas zacisku krzyżowego jest znacznie skrócony, co minimalizuje uszkodzenie aorty podczas operacji. Zaobserwowano niską częstość występowania zakrzepicy, a także uniknięto potencjalnej niezgodności kalibru naczyń między dawcą a biorcą. Powyższe obserwacje sprawiają, że technika ta jest wysoce odpowiednia do badania chorób naczyniowych w przeszczepach aorty u myszy.

W badaniu kontrolnym, w którym wykonano badanie ultrasonograficzne 8 tygodni po przeszczepie, nie wykryto żadnych istotnych zmian. Potwierdziło to przypuszczenia, że jakiekolwiek uszkodzenie aorty podczas operacji będzie minimalne1.

Przedstawiona w tym artykule procedura szczepienia gwarantuje brak upośledzenia zarówno integralności przeszczepu, jak i jego funkcji. W związku z tym można stwierdzić, że ten eksperymentalny model transplantacji może służyć jako cenne narzędzie dla przyszłych badań molekularnych i farmakologicznych choroby naczyń zwyrodnieniowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Wierzymy, że przewodnik wideo może służyć jako materiał dydaktyczny ilustrujący zastosowanie tego prostego modelu tętniczo-tętniczego i że przyczyni się do dalszej owocnej debaty na temat wielu ważnych kwestii w patologiach naczyniowych. Ta bardzo szybka metoda zespolenia może być wykorzystana do badania chorób naczyniowych u genetycznie modyfikowanych myszy. Może być również stosowany jako modyfikacja modelu tętniaka połączona z przeszczepem.

Podczas zabiegu występują punkty krytyczne. Założenie samego szwu jest najbardziej krytycznym krokiem. Chirurg musi zadbać o to, aby uniknąć skrętu aorty poprzez odpowiednie ustawienie dawcy i biorcy. Klamry są ostrożnie usuwane po oględzinach zespolenia. Dystalny zacisk powinien być zawsze zwalniany jako pierwszy, co powoduje niskie ciśnienie utrzymujące ścianki razem przed proksymalnym zwolnieniem bocznym wysokiego ciśnienia. Konsekwencją niewłaściwego przestrzegania kolejności uwalniania byłoby krwawienie.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Romie Wieczorek i Peterowi Kurdybacha za doskonałą pomoc w edycji, a Leonowi Deckerowi i Uli Heuterowi za doskonałą pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Uchwyt na igły HalseyFine Science Tools12001-13
Dumont #5 Kleszcze -Fine Science Tools11254-20
Lexer-Nożyczki dla niemowlątFine Science Tools14079-10
Castroviejo Micro NeedleHolder Fine Science Tools12060-01
Vannas NożyczkiAesculap, NiemcyTyp OC498R
Castroviejo Kleszcze do szwówGeuder, Niemcy19015
6-0 jedwab (Jedwab)Deknatel, Research Triangle Park NC, USA18020-60- FST
11-0 monofilament (Ethilon)Ethicon, Norderstedt, NiemcyEH7438G
3-0 szew z kwasem poliglikolowym (Serafit)Serag-Wiessner, Naila, Niemcy60203214
IzofluoranDowolna generikona
HeparynaDowolna generyka
0,9% sól fizjologicznaDowolna generikona
BuprenorfinaDowolna generikona
Bepanthene krem pod oczy i nosBayer, Niemcy
MicroscopZeissOpmi MDO/S5
WaporyzatorEickemeyerTEC3
UltrasonografiaVevo, Kanada770,2100

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rowinska, Z., et al. Non- invasive in vivo analysis of a murine aortic graft using high resolution ultrasound microimaging. Eur J Radiol. 81 (2), 244-249 (2012).
  2. Daugherty, A. Mouse models of atherosclerosis. Am J Med Sci. 323 (1), 3-10 (2002).
  3. Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
  4. Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc .Biol. 24 (3), 429-434 (2004).
  5. Zernecke, A., Shagdarsuren, E., Weber, C. Chemokines in atherosclerosis: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (11), 1897-1908 (2008).
  6. Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. J Surg Res. 111 (2), 171-176 (2003).
  7. Koulack, J., McAlister, V. C., Giacomantonio, C. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Development of a mouse aortic transplant model of chronic rejection. Microsurgery. 16 (2), 110-113 (1995).
  8. Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
  9. Baxter, K., Hao, P. M., Howden, B. O., Saunder, A., Jablonski, P. Modified technique of abdominal heart transplantation in the rat. J Heart Lung Transplant. 17 (11), 1057-1064 (1998).
  10. Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J Heart Lung Transplant. 18 (10), 946-951 (1999).
  11. Siemionow, M. Histopathology of microarterial anastomoses: end-to-end versus end-in-end (sleeve) technique. J Hand Surg Am. 15, 619-625 (1990).
  12. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354 (6), 610-621 (2006).
  13. Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18 (6), 368-371 (1998).
  14. Guo, L., Agarwal, A., George, J. F. Orthotopic aortic transplantation in mice for the study of vascular disease. J Vis Exp. (69), e4338(2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pozycja ortotopowas l fizjologiczna z heparynszwy monofilamentoweaorta brzusznaanastomoza naczyniowaznieczulenie izofluranemperfuzja przeszczepu

Powiązane artykuły