Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej myszy

15.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54929

⸱

15 grudnia 2016

 ,  , 
1Department of Anatomy, Korea University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ustanowienie systemów hodowli do ekspansji dorosłych nerwowych komórek macierzystych (aNSC) pozwala na badanie i zastosowanie aNSC w terapii. Strefa podmodzelowa (SCZ) została niedawno uznana za nowy region tworzący neuroblasty u dorosłych myszy. W tym miejscu opisano metody izolacji, ekspansji i różnicowania SCZ-aNSC.

Streszczenie

Dorosłe nerwowe komórki macierzyste (aNSC) mogą być używane do regeneracji uszkodzonej tkanki mózgowej. NSC mają potencjał do różnicowania i proliferacji w trzech typach komórek: neuronach, astrocytach i oligodendrocytach. Identyfikacja regionów pochodnych aNSC i scharakteryzowanie właściwości aNSC ma kluczowe znaczenie dla potencjalnego zastosowania aNSC i wyjaśnienia ich roli w regeneracji neuronów. Niedawno doniesiono, że strefa podmodzelowa (SCZ), znajdująca się między istotą białą a hipokampem, zawiera aNSC i stale powoduje powstawanie neuroblastów. Niewielki odsetek aNSC z SCZ jest zróżnicowany w neurony; Większość komórek jest zróżnicowana w komórki glejowe, takie jak oligodendrocyty i astrocyty. Sugeruje się, że komórki te mają potencjał terapeutyczny w przypadku urazowego uszkodzenia kory mózgowej. Protokół ten szczegółowo opisuje proces generowania SCZ-aNSC z mózgu dorosłej myszy. Macierz mózgowa w odstępach 1 mm służy do uzyskania wycinków koronalnych zawierających SCZ i do precyzyjnego wypreparowania SCZ z całego mózgu. Sekcje SCZ są początkowo poddawane hodowli neurosfery. Dobrze rozwinięty system hodowli pozwala na weryfikację ich cech i może przyczynić się do wzrostu badań nad NSC. System hodowli neurosfery stanowi użyteczne narzędzie do określania proliferacji i zbierania prawdziwych NSC. Hodowla jednowarstwowa jest również systemem in vitro do oznaczania proliferacji i różnicowania. Co istotne, ten system hodowli zapewnia bardziej jednorodne środowisko dla NSC niż system hodowli neurosfery. Tak więc, wykorzystując dyskretny region mózgu, te systemy hodowli będą pomocne w poszerzaniu naszej wiedzy na temat aNSC i ich zastosowań terapeutycznych.

Wprowadzenie

NSC mają cechy samoodnawiania się i różnicowania wielu linii. Aby potwierdzić te właściwości, szeroko zastosowano system hodowli neurosfery. System hodowli neurosfery został opracowany na początku lat 90. i służył jako standardowy system hodowli komórek macierzystych1. W zależności od siły samoodnawiania, NSC stale się namnażają i wytwarzają masę komórkową w kulturze zawiesinowej. Uważa się, że liczba komórek i wielkość neurosfery są ściśle związane z właściwościami proliferacyjnymi NSC. Hodowle jednowarstwowe są również szeroko stosowane do utrzymywania i różnicowania NSC. W porównaniu z kulturą neurosferyczną, system hodowli jednowarstwowej zapewnia lepsze jednorodne utrzymanie i ekspansję NSC2. Te dwa dobrze rozwinięte systemy hodowli przyczyniły się do scharakteryzowania aNSC in vitro.

NSC znajdują się w różnych obszarach mózgu, takich jak strefa podkomorowa (SVZ) komory bocznej i strefa subziarnista (SGZ) hipokampa3-5. Strefa podmodzelowa (SCZ) ogonowej podkorowej istoty białej jest rozpoznawana jako nowy region neurogenny6-8. Niedawno doniesiono, że SCZ-aNSC mają potencjał terapeutyczny w urazowym uszkodzeniu mózgu9. W porównaniu z innymi regionami neurogennymi, SCZ znajduje się wzdłuż podkorowej istoty białej. W ludzkim mózgu podkorowa istota biała zajmuje większy obszar niż w mózgu myszy10. Dlatego ważne jest zrozumienie charakterystyki SCZ-aNSC przy użyciu systemu hodowli in vitro, aby promować potencjalne wykorzystanie tych komórek do regeneracji neuronów. Wymagana jest precyzyjna sekcja pożądanego obszaru mózgu, aby wykluczyć możliwe zanieczyszczenie przez niepożądane obszary zawierające aktywne lub uśpione NSC. Na przykład aNSC w regionach nieneurogennych mogą być aktywowane i wytwarzać nowe komórki nerwowe w uszkodzonych mózgach lub podczas hodowli in vitro 11. Aby uzyskać NSC z SCZ, komórki pobrano z wycinków mózgu zawierających SCZ. Następnie przeprowadzono staranną mikrosekcję obszaru SCZ za pomocą cienkiej igły. Aby wygenerować neurosferę z SCZ, mikrowypreparowane fragmenty tkanki SCZ zostały zdysocjowane na pojedyncze komórki, a następnie wyhodowane jako zawiesina w obecności naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF). Po utworzeniu neurosfer SCZ-aNSC mogą być również utrzymywane jako neurosfery lub monowarstwy do ekspansji. Procedura ta demonstruje również procesy barwienia immunologicznego za pomocą różnych markerów do wykrywania NSC i ich potomstwa po ich ekspansji i różnicowaniu w hodowli jednowarstwowej. W tym miejscu przedstawiono wizualny protokół systemu hodowli SCZ-aNSC. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące mikropreparacji obszaru SCZ oraz konserwacji i pasażowania komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów i podłoża hodowlanego

  1. W celu rozwarstwienia i dysocjacji SCZ owiń macierz mózgu, obosieczną żyletkę i kleszcze folią aluminiową, a następnie wysterylizuj je w autoklawie.
  2. Przygotuj 50 ml zimnego buforu PBS, aby umyć cały mózg myszy.
  3. Ustaw mikroskop preparacyjny i przygotuj narzędzia chirurgiczne wymagane do wypreparowania mózgu (autoklawowane nożyczki i kleszcze) oraz izolacji SCZ (strzykawka 1 ml, igła 30 G, matryca mózgowa i cienkie kleszcze).
  4. Przygotowanie podłoża N2:
    1. Przygotuj pożywkę F-12/DMEM (+L-glutamina, + wodorowęglan sodu) z 2% suplementami B27, 1% N2 i 1% penicyliną-streptomycyną.
      Uwaga: Pożywka wzrostowa składa się z pożywki N2 i czynników wzrostu (20 ng/ml oczyszczonego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i 20 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF2)).
  5. Przygotować bufor do trawienia (40 jednostek/ml papainy, 2,4 jednostki/ml dypazy II i 2% penicyliny-streptomycyny w PBS) do trawienia tkankowego.
  6. Przygotowanie płytki powlekającej i szkiełka nakrywkowego:
    1. Przygotować poli-L-ornitynę (PLO; 0,01%) i lamininę (10 μg/ml rozpuszczoną w DH2O). W celu pokrycia płytek 6-dołkowych w celu utrzymania SCZ-aNSC w postaci monowarstwy lub szkiełek nakrywkowych o średnicy 18 mm do barwienia immunologicznego, należy je inkubować z PLO przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie umyj je 3 razy za pomocą DH2O. Po ostatnim praniu pozostaw płytki i szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia.
    2. Następnie inkubować płytki z lamininą przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie umyj je 3 razy za pomocą DH2O.
      Uwaga: Nie susz lamininy, co wpłynie na przyczepianie komórek.
      Uwaga: Roztwory powłokowe mogą być ponownie użyte 3 razy.

2. Izolacja i dysocjacja dorosłego SCZ

  1. Przed przygotowaniem hodowli umieść macierz mózgową i obosieczną maszynkę do golenia na lodzie.
    Uwaga: Nie zamrażaj macierzy mózgowej, ponieważ mózg może się do niej przyłączyć.
  2. Uświęć mysz (w wieku 8 tygodni) przez uduszenie CO2 lub zwichnięcie szyjki macicy.
    1. Odetnij głowę ostrymi nożyczkami po rozpyleniu 70% etanolu. Aby unieruchomić głowę, trzymaj mocno obie strony głowy. Przetnij skórę nożyczkami na linii środkowej w kierunku ogonowo-rostralnym. Sprzyja to całkowitemu usunięciu skóry z czaszki.
    2. Najpierw usuń ogonową część czaszki (tylną do lambdy), a następnie włóż kleszcze między czaszkę a mózg w grzbietowej pozycji linii środkowej. Chwyć lewą (lub prawą) kość ciemieniową i ostrożnie ją oderwij. Powtórz tę procedurę w celu usunięcia drugiej kości ciemieniowej.
      Uwaga: Odłączenie nerwu wzrokowego i usunięcie opon mózgowych z mózgu ułatwia odłączenie mózgu od czaszki.
    3. Przenieś mózg do zimnego buforu PBS (25 ml) i przepłucz go dwukrotnie, aby usunąć nadmiar krwi.
  3. Umieść mózg w macierzy mózgowej na lodzie i wykonaj nacięcia koronalne, aby uzyskać plastry o grubości 1 mm. Przenieś wycinki mózgu (1 mm) zawierające obszary SCZ, które znajdują się w tylnej części mózgu, do zimnego PBS na plastikowej szalce Petriego o średnicy 35 mm.
    Uwaga: Aby uzyskać równoległą płaszczyznę odcinków koronalnych, upewnij się, że szczelina mózgu znajduje się w linii środkowej macierzy mózgowej; Bardzo ważne jest, aby uniknąć niepotrzebnych zmian w sekcjach.
    Uwaga: Uzyskaj plastry mózgu w odległości 2-3 mm za bregmą; pozwala to na oddzielenie SCZ od SVZ.
  4. Pod mikroskopem preparacyjnym o małym powiększeniu należy dokonać mikrosekcji SCZ z obszaru istoty białej kory i hipokampa za pomocą wygiętej igły 30G6,9. Następnie usuń obszary kory powyżej SCZ. Umieść wycięty obszar SCZ z plastrów na plastikowej szalce Petriego o średnicy 35 mm na lodzie bez zimnego PBS.
    Uwaga: Zanieczyszczenie dodatkowych regionów zawierających dojrzałe neurony może wpływać na żywotność aNSC i tworzenie neurosfery, ponieważ ulegają one śmierci komórkowej w warunkach hodowli aNSC.
  5. Za pomocą wygiętej igły 30 G natychmiast posiekaj wycięte tkanki na małe kawałki.
    Uwaga: Jeśli wypreparowanie tkanki SCZ wymaga dłuższego czasu, przed posiekaniem zanurz wypreparowane tkanki w zimnym PBS.
  6. Ponownie zawiesić rozdrobnioną tkankę w 1 ml buforu wytrawiającego, przenieść tkankę do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml buforu do wytrawiania i inkubować przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    Uwaga: Wstrząsaj probówką co 10 minut, aby dobrze wymieszać.

3. Hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych pochodzących ze strefy podmodzelowej

  1. Delikatnie postukać w probówkę, aby oddzielić strawioną tkankę, a następnie odwirować probówkę o sile 145 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić strawioną tkankę w 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki N2 w celu wypłukania buforu wytrawiającego i delikatnie pipetować roztwór próbki maksymalnie 5 razy za pomocą pipety P1000.
    Uwaga: Nadmierne rozcieranie za pomocą wąskiej końcówki pipety może zmniejszyć żywotność komórek i późniejszy wzrost.
  2. Odwirować probówkę o sile 145 x g przez 5 minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki N2.
  3. Przygotować 1 ml pożywki N2 na niepowlekanej płytce 6-dołkowej i dodać 1 ml zawieszonych komórek, aby uzyskać końcową objętość 2 ml.
  4. Dodaj EGF (20 ng/ml) i bFGF (20 ng/ml) do każdej studzienki. Delikatnie potrząśnij ręcznie 6-dołkową naczynią hodowlaną, aby wymieszać dodane czynniki wzrostu z posianymi komórkami. Przechowywać 6-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Dodawaj EGF (20 ng/ml) i bFGF (20 ng/ml) do każdej studzienki codziennie przez 8 dni. Co trzeci dzień dodawać 200 μl pożywki N2, aby utrzymać około 2 ml objętości pożywki.

4. Pasaż NSC jako neurosfery i do kultur jednowarstwowych

  1. Zbierz neurosfery i przenieś je do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    Uwaga: Liczba neurosfer (o średnicy >50 μm) na studzienkę z SCZ pojedynczego mózgu myszy wynosiła 64,3 ± 7,31, czyli mniej niż w SVZ (190,5 ± 6,33)9.
  2. Inkubować neurosfery z 0,5 ml buforu dysocjacyjnego przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu dysocjacji neurosfer na pojedyncze komórki. Pierwotne neurosfery mogą być dysocjowane na pojedyncze komórki i utrzymywane przez kilka przejść jako kultury neurosfery lub monowarstwy.
    Uwaga: Rozszerzanie SCZ-aNSC jako monowarstwy jest lepsze od neurosfer, ponieważ SCZ-aNSC mogą być pasażowane >10 razy w formacie kultury jednowarstwowej, ale <5 razy w formacie kultury neurosfery.
    Uwaga: SCZ-aNSC wykazują silną agregację i trudno jest je rozdzielić na pojedyncze komórki. W związku z tym format hodowli neurosfery nie jest zalecany do rutynowej ekspansji komórek.
  3. Delikatnie pipetować roztwór próbki w górę i w dół pipetą P1000 mniej niż 5 razy i odwirować probówkę przy 145 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić neurosfery w 1 ml pożywki N2.
    Uwaga: Nadmierne rozcieranie za pomocą wąskiej końcówki pipety może zmniejszyć żywotność komórek i późniejszy wzrost.
  4. Aby policzyć komórki, należy przygotować mieszaninę 1:1 zawiesiny komórek (10 μl) i 0,4% roztworu błękitu trypanowego, a następnie policzyć liczbę żywych komórek na hematocytometrze. Po pokryciu 6-dołkowej płytki PLO/lamininą, pokryj komórki w proporcji 2,5 x 105 komórek/ml 2 ml pożywki N2 dla każdej studzienki.
    Uwaga: Zmiany gęstości komórek mogą wpływać na ich stan i potencjał różnicowania.
  5. Utrzymuj SCZ-aNSC z codziennym leczeniem czynnikami wzrostu (2 ml, 20 ng/ml) przez 5 dni, a następnie je przechodź.

5. Różnicowanie dorosłych nerwowych komórek macierzystych pochodzących ze strefy podmodzelowej

  1. Umieścić aNSC na 18 mm szkiełku nakrywkowym pokrytym PLO/laminininą z 1 x 105 komórek/ml w 1 ml N2 z czynnikami wzrostu (20 ng/ml) w celu różnicowania SCZ-aNSC.
  2. Następnego dnia, gdy komórki są mocno przymocowane do szkiełka nakrywkowego, wymień pożywkę wzrostową na N2, aby usunąć czynniki wzrostu.
  3. Po 6 dniach przemyj zróżnicowane komórki 1 ml PBS, aby usunąć resztki komórek i utrwalić je do barwienia immunologicznego.
    Uwaga: BrdU może zostać włączony do nowo zsyntetyzowanego DNA proliferujących komórek. Dlatego, w razie potrzeby, BrdU (10 μg/ml) można dodać do żywych komórek przed ich utrwaleniem.

6. Immunologiczne barwienie dorosłych nerwowych komórek macierzystych i zróżnicowanych progenitorów

  1. W celu barwienia immunologicznego przemyj komórki PBS i utrwal je 4% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    Uwaga: PFA jest wysoce toksyczny; Unikać kontaktu ze skórą i oczami.
  2. Usunąć 4% PFA, przepłukać utrwalone komórki PBS 3 razy, a następnie przechowywać je w temperaturze 4 °C, aż będą potrzebne do barwienia immunologicznego.
  3. Inkubować komórki na szkiełku nakrywkowym z roztworem blokującym (3% albuminy surowicy bydlęcej i 0,1% Triton X-100 w 1x PBS) przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe w świeżym roztworze blokującym i inkubować próbki przez noc w temperaturze 4 °C.
    1. Barwienie immunologiczne aNSC
      1. Wybarwić aNSC za pomocą przeciwciał anty-Nestin i anty-BrdU. Przed utrwaleniem dodać 20 μg BrdU do aNSC i inkubować je przez 2 godziny. Przeprowadzić etap denaturacji przy użyciu 2 N HCl przez 20 minut w temperaturze 37 °C przed wykonaniem etapu blokowania.
    2. Barwienie immunologiczne zróżnicowanych komórek progenitorowych:
      1. Użyj przeciwciał anty-O4, anty-bIII-tubuliny i przeciwko glejowemu fibrylarnemu białku kwasowemu (GFAP), aby oznaczyć zróżnicowanych przodków.
  5. Przemyć próbki PBS 3 razy i inkubować je z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z barwnikami fluorescencyjnymi (1:500) w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj próbki 3 razy za pomocą PBS.
    Uwaga: Użyj przeciwciał drugorzędowych, które pasują do gospodarzy przeciwciał pierwszorzędowych. Hoechest33343 (1:2,000) służy do barwienia jądrowego.
  6. Dodaj roztwór montażowy do szkła przesuwnego i kontynuuj montaż. Obserwuj i zobrazuj próbkę pod mikroskopem konfokalnym na wielu długościach fali: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm) i Hoechest33343 (405 nm).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zdefiniowanie systemu hodowli aNSC z nieznanego regionu neurogennego jest niezbędne dla zrozumienia tych komórek oraz opracowania możliwości ich wykorzystania w regeneracji mózgu12. Wiadomo, że NSCs na różnych etapach rozwoju lub w różnych regionach zachowują się odmiennie3,4. Niedawno zgłoszono, że komórki pochodzące z SCZ wykazują inny potencjał do różnicowania neuronalnego in vivo i in vitro w porównaniu do komórek pochodzących z SVZ7-9

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule opisano szczegółowy protokół generowania NSC z dorosłej myszy SCZ i utrzymywania ich dla różnych zastosowań. Istnieją trzy kluczowe etapy tworzenia systemu hodowli in vitro potrzebnego do oczyszczania i namnażania SCZ-NSC. Po pierwsze, ważne jest, aby upewnić się, że region SCZ jest precyzyjnie wypreparowany z innych potencjalnych regionów neurogennych (ryc. 1B). Grube i precyzyjne skrawki zawierające obszary SCZ uzyskano za pomocą matrycy mózgowej o odstępie 1 mm, a następnie cie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Program Badań nad Mózgiem przez Narodową Fundację Badawczą (NRF), finansowany przez Koreańskie Ministerstwo Nauki, ICT, and Future Planning (Granty NRF-2015M3C7A1028790); oraz przez grant z Korea Health Technology R&D Project przez Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansowany przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej, Republiki Korei (HI14C3347).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Średnie komponenty
DMEM/F12 Gibco11320-033+L-glutamina, +Pióro wodorowęglanu sodu
/StrepInvitrogen15140-122
Suplement N2Gibco17502-048
B27suplement Gibco17504-044
Czynnik wzrostu
bFGFR& D233-FB
EGFGibcoPHG0313
Buffer
PBS (10x)BIOSOLUTIONBP007a1x rozcieńczenie
HBSSGibco14175-095
Dissociattion buffer
Dispase IIRoche04-942-078-001
PapainWorthington3126
AccutaseICTAT-104
Tool
Szczypce do drobnychrobin WPI555229F
NożyczkiStorzE3321-C
Macierz mózgu (1 mm)RWD68707
Maszynka do golenia obosiecznaDORCOST-300
30 G igłaSUNGSHIMN1300
Materiały
15 ml tubkiSPL50015
Tubki 50 mlSPL50050
35 mm szalkaSPL10035szalka Petriego
100 mm szalkaSPL10090szalka Petriego
Szkiełko nakrywkowe (18 mm)Deckglaser111580
Naczynie 12-dołkoweSPL32012niepowlekające
Naczynie 6-dołkoweSPL32006niepowlekające
Materiały powłokowe
PLOSigmaP49570,01%
LamininGibco23017-01510 mg/ml
Przeciwciała pierwszorzędowe 
NestinMilliporeMAB353mysz (1:1,000)
EGFRAbcamab2430królik (1:1,000)
DCXSanta CruzSC8066koza (1:500)
Tuj1SigmaT2200królik (1:2,000)
GFAPInvitrogen13-0300szczur (1:1,000)
O4Mysz MilliporeMAB345(1:500)
BrdUAbcamab6326Szczur (1:500)
przeciwciała wtórne
anty-myszy 488InvitrogenA212021:500
anty-mysie cy3Jackson715-165-151
anty-mysz 647Jackson715-606-150
anty-królik 488AlexaA21206
anty-królik cy3Jackson711-165-152
anty-królik 647Jackson711-605-152
anty-koza 488AlexaA11055
anty-koza cy3Jackson705-165-147
anty-koza 647InvitrogenA21447
anty-szczur 488InvitrogenA21208
anty-szczur cy3Jackson712-166-150
antyszczur 647Jackson712-605-153
Materiały do barwienia immunologicznego
BSAMillipore82-100-63% BSA z 0,1% Triton X-100 w PBS
Triton X-100usb22686
4% PFABiosesangP2031
Hoechest33342Life TechnologyH3570Barwnik do barwienia jąder

Bibliografia

  1. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
  2. Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388(2007).
  3. Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M. Neurogenesis in adult subventricular zone. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 629-634 (2002).
  4. Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812(2015).
  5. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  6. Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
  7. Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
  8. Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
  9. Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
  10. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
  11. Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).
  12. Gage, F. H., Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  13. Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro. Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).
  14. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).
  15. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).
  16. Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).
  17. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  18. Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).
  19. Wachs, F. P., et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).
  20. Xiong, F., et al. Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures. Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).
  21. Lee, S. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).
  22. Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).
  23. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Izolacja strefy podwołiściowejhodowla neurosferhodowla monowarstwowatrawienie tkanekproliferacja komórektest różnicowaniatraktowanie czynnikami wzrostuprocedura immunobarwieniasekcja macierzy mózgowej
Izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.