Indukcja różnicowania chondrogennego komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej przez grawitację odśrodkową

Podsumowanie

Stres mechaniczny może indukować chondrogenne różnicowanie komórek macierzystych, dostarczając potencjalnego podejścia terapeutycznego do naprawy uszkodzonej chrząstki. Przedstawiamy protokół indukowania chondrogennego różnicowania komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) za pomocą grawitacji odśrodkowej (CG). Indukowana przez CG regulacja w górę SOX9 powoduje rozwój fenotypów chondrogennych.

Streszczenie

Uszkodzona chrząstka nie może się naturalnie zagoić. Obecnie najbardziej zaawansowaną terapią ubytków w chrząstce jest przeszczepianie chondrocytów różnicowanych z komórek macierzystych za pomocą cytokin. Niestety, różnicowanie chondrogenne wywołane cytokinami jest kosztowne, czasochłonne i wiąże się z wysokim ryzykiem zanieczyszczenia podczas różnicowania in vitro. Jednak bodźce biomechaniczne służą również jako kluczowe czynniki regulacyjne dla chondrogenezy. Na przykład stres mechaniczny może indukować chondrogenne różnicowanie komórek macierzystych, co sugeruje potencjalne podejście terapeutyczne do naprawy uszkodzonej chrząstki. W tym badaniu wykazaliśmy, że grawitacja odśrodkowa (CG, 2,400 × g), naprężenie mechaniczne łatwe do zastosowania przez wirowanie, indukowała regulację w górę regionu determinującego płeć Y (SRY)-box 9 (SOX9) w komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC), powodując ekspresję fenotypów chondrogennych. Odwirowane ASC wyrażały wyższe poziomy chondrogennych markerów różnicowania, takich jak agrekan (ACAN), kolagen typu 2 alfa 1 (COL2A1) i kolagen typu 1 (COL1), ale niższe poziomy kolagenu typu 10 (COL10), markera przerostowych chondrocytów. Ponadto w odwirowanych ASC zaobserwowano tworzenie się agregatów chondrogennych, co jest warunkiem wstępnym chondrogenezy.

Wprowadzenie

Ubytki w chrząstce stawowej nie goją się naturalnie. W związku z tym przeszczep komórek macierzystych został zaproponowany jako obiecujące podejście do naprawy uszkodzonej chrząstki. Metoda ta wymaga jednak zarówno pozyskania wystarczającej liczby komórek macierzystych, jak i indukcji tych komórek do ulegania różnicowaniu chondrogennemu. Szpik kostny (BM) jest szeroko stosowany jako źródło komórek macierzystych, ale izolacja komórek z BM ma dwie główne wady: inwazyjność i niewystarczającą wydajność. Ze względu na łatwość pozyskiwania, tkanka tłuszczowa jest preferowanym źródłem komórek macierzystych. Wcześniejsze badania wykazały możliwość wyizolowania komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i indukowania różnicowania chondrogennego w tych komórkach za pomocą cytokin, takich jak TGF-β1^1,2. Te metody są skuteczne, ale drogie.

Jako tańsza alternatywa dla cytokin, naprężenia mechaniczne mogą być wykorzystane do wywołania różnicowania chondrogennego. Obciążenie mechaniczne odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu zdrowia chrząstki stawowej³ i może indukować chondrogenne fenotypy w różnych komórkach. Na przykład ciśnienie hydrostatyczne indukuje chondrogenne fenotypy w komórkach progenitorowych pochodzących z błony maziowej za pośrednictwem szlaku kinazy MAP/JNK ⁴, a kompresja mechaniczna indukuje chondrogenezę w ludzkich mezenchymalnych komórkach macierzystych (MSC) poprzez regulację w górę genów chondrocytarnych⁵. Ponadto naprężenie ścinające przyczynia się do ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) związanej z chondrogenezą w ludzkich MSCs⁶. Grawitacja odśrodkowa (CG), łatwe do zastosowania i kontrolowane naprężenie mechaniczne generowane przez wirowanie, może indukować różnicową ekspresję genów w komórkach⁷. Na przykład w komórkach raka nabłonka płuc ekspresja interleukiny (IL)-1b jest regulowana w górę przez wirowanie⁸. Dlatego, jako eksperymentalnie indukowane naprężenie mechaniczne, CG może być stosowany do indukowania ekspresji genów chondrocytarnych w komórkach macierzystych. Nie jest jednak jasne, czy CG może indukować chondrogenne różnicowanie komórek macierzystych.

W tym badaniu odkryliśmy, że CG indukuje regulację w górę SOX9, głównego regulatora chondrogenezy, u ludzkich ASC, co skutkuje nadekspresją genów chondrocytarnych. Ponadto porównaliśmy wpływ CG na chondrogenezę z TGF-β1, czynnikiem wzrostu najczęściej stosowanym do indukowania chondrogenezy in vitro w komórkach macierzystych.

Protokół

Ten protokół badania został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną Katolickiego Uniwersytetu Korei (KC16EAME0162) i przeprowadzony zgodnie z wytycznymi NIH. Wszystkie tkanki zostały pobrane za pisemną świadomą zgodą.

1. Odśrodkowe ładowanie grawitacyjne i hodowla granulek

1. Hodowla komórkowa i zbiór
   1. Hodowla ASC (P2-P3; patrz wykaz materiałów) w zmodyfikowanym Dulbecco's Eagle's Medium-low glucose (DMEM-LG) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (P/S) w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO₂ .
   2. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, wyrzuć pożywkę i umyj komórki 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   3. Dodać 1 ml PBS zawierającego 1 mM EDTA i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO₂ .
   4. Delikatnie postukać w płytkę hodowlaną, dodać 4 ml świeżej pożywki, przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować komórki przy 250 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
2. Odśrodkowe obciążenie grawitacyjne
   1. Po odwirowaniu (krok 1.1.4) usunąć supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić osad w 10 ml DMEM-LG z 10% FBS. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
   2. W celu załadowania CG przenieś 2,5 × 10⁵ komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 2 400 × g przez 15 minut.
3. Kultura granulek
   1. Natychmiast po odwirowaniu odessać supernatant i dodać 500 μl zdefiniowanej pożywki do różnicowania chondrogennego (CDM, DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełniony 1% FBS, 1% ITS+Premix, 100 nM deksametazon, 1x MEM roztwór aminokwasów endogennych, 50 μg/ml L-proliny i 1% penicyliny/streptomycyny). Dodawać 50 μg/ml świeżo przygotowanego 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego przy każdej zmianie podłoża. Jako kontrolę pozytywną indukować różnicowanie chondrogenne w nieodwirowanych komórkach poprzez dodanie CDM zawierającego 10 ng / ml TGF-β1.
   2. Umieścić luźno zakorkowane probówki zawierające granulki w pozycji stojącej i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO₂ .
   3. Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez 3 tygodnie.
4. Hodowla mikromas
   1. Natychmiast po odwirowaniu (etap 1.2.2; 2 400 × g przez 15 minut) odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 μl CDM.
   2. Aby utworzyć mikromasę, umieść zawieszone komórki w środku dołka 24-dołkowej płytki.
   3. Po 2 godzinach ostrożnie dodać 1 ml CDM do dołka, pipetując do ścianki płytki, aby uniknąć uszkodzenia mikromasy. Jako kontrolę pozytywną należy przeprowadzić hodowlę mikromasową z nieodwirowanymi komórkami, dodając CDM zawierający 10 ng / ml TGF-β1.
   4. Inkubować mikromasę w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze zawierającym 5% CO₂ .
   5. Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez 3 tygodnie.

2. Reakcja łańcuchowa odwrotnej transkryptazy-polimerazy (RT-PCR) w celu wykrycia regulacji w górę transkrypcji markerów różnicowania chondrogennego

1. W dniu 14 użyj pipety, aby przenieść kulisy sferoidalne do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i umyj je w 1x PBS.
2. Ekstrahować całkowite RNA z osadów za pomocą metody ekstrakcji tiocyjanianianem guanidyny-fenolem-chloroformem⁹.
3. Zsyntetyzować cDNA z 2 μg całkowitego RNA za pomocą odwrotnej transkryptazy zgodnie z protokołem producenta (inkubować w temperaturze 42 °C przez 1 godzinę, a następnie inaktywować enzym w temperaturze 70 °C przez 5 minut).
4. Wykonaj PCR ze starterami specyficznymi dla markerów różnicowania chondrogennego¹⁰.

3. Barwienie w celu wykrycia nadekspresji białek markera różnicowania chondrogennego

1. Granulki komórkowe zatapiające parafinę
   1. W 21 dniu użyj pipety, aby zebrać granulki sferoidów i umyć je 1x PBS.
   2. Utrwalić sferoidalne granulki przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny
      Uwaga: Paraformaldehyd jest wysoce toksyczny. Unikać kontaktu z oczami, skórą lub błonami śluzowymi. Zminimalizuj narażenie i unikaj inhalacji podczas przygotowywania. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
   3. Wyrzuć utrwalacz i spłucz osady komórkowe wodą dejonizowaną (DW).
   4. Umieść jedną warstwę gazy na kasecie i przenieś utrwalone granulki za pomocą pipety. Przykryj granulkę, składając gazę i zamknij pokrywę kasety.
   5. Odwodnić granulki.
      1. Zanurz granulki w 70% etanolu (EtOH) na 5 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Zanurz granulki w 80% EtOH na 5 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Zanurz granulki w 95% EtOH na 5 minut w temperaturze pokojowej.
      4. Zanurz granulki w 100% EtOH na 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz dwukrotnie.
      5. Zanurz granulki w 100% ksylenie na 15 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz dwukrotnie.
   6. Osadzać granulki o stałych komórkach w parafinie w temperaturze 56 °C w formie; granulki mogą być zatopione w parafinie za pomocą specjalistycznych zautomatyzowanych systemów przetwarzania tkanek.
   7. Wyciąć odcinki o grubości 5 μm z osadzonego w parafinie granulatu komórkowego za pomocą mikrotomu obrotowego.
   8. Zanurzyć sekcje w 50% EtOH, a następnie przenieść je do łaźni wodnej o temperaturze 50 °C za pomocą szkiełka.
   9. Umieść ruchome sekcje na slajdach.
2. Safranina O i barwienie błękitem Alcian
   1. Uwodnić sekcje parafiny.
      1. Zanurz szkiełka w ksylenie na 15 minut. Powtórz dwukrotnie.
      2. Zanurz szkiełka w 100% EtOH na 5 minut. Powtórz dwukrotnie.
      3. Zanurz szkiełka w 90% EtOH na 5 minut.
      4. Zanurz szkiełka w 80% EtOH na 5 minut.
      5. Zanurz szkiełka w 70% EtOH na 5 minut, a następnie umyj je w 1x PBS.
   2. Uwodnione skrawki należy barwić 1% roztworem Safraniny O i 3% błękitem Alcian przez 30 minut.
   3. Wyrzuć roztwór barwiący i spłucz sekcje DW.
   4. Wybarwić skrawki roztworem Hematoksyliny/Eozyny (przeciwbarwienie) przez 1 min.
   5. Wyrzuć roztwór barwiący i spłucz sekcje DW.
   6. Umieść kroplę podłoża montażowego na szkiełku nakrywkowym po usunięciu resztek wody. Ostrożnie umieść szkiełko (komórką do dołu) na szkiełku nakrywkowym zawierającym nośnik montażowy.
   7. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 2-3 godziny w temperaturze pokojowej.
   8. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu jasnego pola (automatyczny mikroskop pionowy, 50X i 200X).
3. Test immunofluorescencyjny
   1. Ponownie nawodnić sekcje zgodnie z opisem w sekcji 3.2.1.
   2. Zanurz szkiełka w buforze cytrynianu sodu (10 mM cytrynian sodu, 0,05% Tween 20, pH 6,0), a następnie utrzymuj je w temperaturze poniżej wrzenia przez 10 minut za pomocą kuchenki mikrofalowej.
   3. Schłodzić szkiełka przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umyć je wodą z kranu.
   4. Inkubuj szkiełka w 3% H₂O₂ (w 1x PBS) przez 15 minut, a następnie myj je wodą z kranu przez 15 minut¹¹.
   5. Zablokować szkiełka buforem blokującym (10% normalnej surowicy koziej w PBS) na 1 godzinę.
   6. Odessać roztwór blokujący, a następnie nałożyć na szkiełka przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone 5% normalną surowicą kozią.
   7. Inkubować szkiełka przez noc w temperaturze 4 °C.
   8. Umyj szkiełka trzy razy w 1x PBS przez 5 minut każda.
   9. Inkubować szkiełka w przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z fluorochromem rozcieńczonym 5% normalną surowicą kozią przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
   10. Umyj szkiełka trzy razy w 1x PBS przez 5 minut każdy w ciemności.
   11. Inkubować szkiełka z DAPI (1 μg/ml) przez 10 minut, a następnie myć je dwa razy w 1x PBS przez 5 minut każde.
   12. Umieść kroplę podłoża montażowego na szkiełku nakrywkowym po usunięciu resztek wody. Ostrożnie umieść suwak (komórką do dołu) na nośniku montażowym.
   13. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 2-3 godziny w ciemności przy RT.
   14. Wizualizacja preparatów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; powiększenie 60X i 200X)¹².

Wyniki

Grawitacja odśrodkowa powoduje nadekspresję chondrogennych markerów różnicowania w komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.

Aby określić stopień siły grawitacji odśrodkowej, która jest odpowiednia do wywołania różnicowania chondrogennego, ASC były stymulowane różnymi stopniami CG (0, 300, 600, 1,200 i 2,400 x g) przez 15 min. Po stymulacji ASC ponownie wysiano na płytki hodowlane i hodowano przez 24 godziny. Ja...

Dyskusja

Stan macierzysty komórek jest bardzo ważny dla nadekspresji SOX9 indukowanej przez CG. W naszym badaniu ekspresja SOX9 może być indukowana przez CG w ASC we wczesnym pasażowaniu (2-3), ale nie w ASC w późniejszym pasażowaniu. Doniesiono, że podczas hodowli komórki ASC zawierają komórki CD34 + do 3 pasaży¹⁶. ASC mają tendencję do utraty ekspresji CD34 podczas pasażu komórek, co skutkuje niską odpowiedzią na CG.

Dzięki odśrodkowej sile grawitacji ciśnienie hydrostatyczne ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Plasticware
100 mm Naczynie	TPP	93100
60 mm Naczynie	TPP	93060
50 ml Rurka rogówkowa	SPL	50050
15 mL Rurka rogówkowa	SPL	50015
10 ml Jednorazowa pipeta	Falcon	7551
5 ml	Falcon	7543
ASC Materiały do hodowli
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM Technologie życia o niskiej glikemii		11885-084	podłoże bazowe
dla wzrostu Penicilina Streptomycyna	Sigma Aldrich	P4333	1%
Technologie życia	surowicy bydlęcej dla płodu	16000-044	10%
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose	Life Technologies	11995	pożywka bazowa do różnicowania chondrogenowego
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)	Life Technologies	11140-050
Deksametazon	Sigma Aldrich	D2915	100 nM
Penicilina Streptomycyna	Life Technologies	P4333	1%
Płodowa surowica bydlęca Life	Technologies	16000-044	1%
Askorbinian-2-fosforan	Sigma Aldrich	A8960	50 i #956; g/ml
L-prolina	Sigma Aldrich	P5607	50 μ g/mL
JEGO	BD		1%
Ludzkie TGF i beta; 1	Peprotech	100-21	10 ng/mL
Materials
18 mm Szkło osłonowe	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innowacja	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Albumina surowicy bydlęcej	Wektor Lab	SP-5050
Przeciwciało antykolagenowe II	abcam	ab34712	1:100
Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (H + L), sprzężona sonda	molekularna	A-11037	1:200
Sonda molekularna	DAPI	D1306
Prolong złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu	Invitrogen	P36934
Szkło ślizgowe, powlekane	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Alkohol izoprypylowy	Milipor	109634
Etanol	Duksan	64-17-5
Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA RevertAid	Thermo Scientfic	K1622
Polimeraza DNA Taq	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
gwiazda ładowania	Dyne Bio	A750
Agaroza	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) Marker drabinkowy DNA	Enzynomics	DM003
Ludzkie komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC)	Katolickie komórki