Badanie porównawcze metod dostarczania leków ukierunkowanych do ucha wewnętrznego myszy: pęcherzyk a wstrzyknięcie przezbębenkowe

Podsumowanie

Opisano tutaj i porównano dwa podejścia mikrochirurgiczne do miejscowego dostarczania leków do ucha wewnętrznego pod względem wpływu na parametry słuchu, cytoarchitekturę ślimaka i ekspresję markerów stanu zapalnego.

Streszczenie

Prezentujemy dwie minimalnie inwazyjne techniki mikrochirurgiczne u gryzoni, które pozwalają dostarczyć określone leki do ucha środkowego, tak aby mogły dotrzeć do ucha wewnętrznego. Pierwszy zabieg polega na perforacji pęcherza bębenkowego, zwanej pęcherzem pęcherzowym; Drugi to iniekcja przezbębenkowa. Oba naśladują kliniczne procedury wewnątrzbębenkowe u ludzi.

Chitozan-glicerofosforan (CGP) i bufor mleczanowy Ringera (RL) zostały użyte jako biokompatybilne nośniki do lokalnego dostarczania leków. CGP to nietoksyczny, biodegradowalny polimer szeroko stosowany w zastosowaniach farmaceutycznych. W temperaturze pokojowej jest lepką cieczą, ale w temperaturze ciała zastyga do fazy półstałej. RL jest roztworem izotonicznym stosowanym do podawania dożylnego ludziom. Niewielka objętość tego pojazdu jest precyzyjnie umieszczana we wnęce okrągłego okna (RW) za pomocą bulgotomii. Wstrzyknięcie przezbębenkowe wypełnia ucho środkowe i umożliwia mniejszą kontrolę, ale szerszy dostęp do ucha wewnętrznego.

Profile bezpieczeństwa obu technik zostały zbadane i porównane za pomocą testów funkcjonalnych i morfologicznych. Słuch oceniano, rejestrując słuchową odpowiedź pnia mózgu (ABR) przed i kilka razy po mikrooperacji. Cytoarchitekturę i poziom zachowania struktur ślimaka badano za pomocą konwencjonalnych technik histologicznych w próbkach ślimaka utrwalonych i odwapnionych paraformaldehydem. Równolegle pobrano nieutrwalone próbki ślimaka i natychmiast je zamrożono w celu analizy profili ekspresji genów markerów stanu zapalnego za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR).

Obie procedury są odpowiednie jako metody dostarczania leków do ucha środkowego myszy, chociaż wstrzyknięcie przezbębenkowe okazało się mniej inwazyjne w porównaniu do pęcherzowej stopy.

Wprowadzenie

Upośledzenie słuchu jest najczęstszym deficytem sensorycznym u ludzi i dotyka 5,3% światowej populacji oraz 30% osób powyżej 65 roku życia (http://www.who.int/topics/deafness/en, aktualizacja 2016). Ubytek słuchu wpływa na przyswajanie języka u dzieci i przyspiesza spadek funkcji poznawczych u osób starszych. W związku z tym jest to poważny problem zdrowotny o ogromnych skutkach społeczno-gospodarczych. Może to być spowodowane wadami genetycznymi, czynnikami środowiskowymi lub kombinacją obu¹, które ostatecznie powodują uszkodzenie i śmierć komórek rzęsatych i neuronów w ślimaku. Komórki te nie regenerują się u ssaków, dlatego utraty komórek i towarzyszącej jej utraty słuchu nie można odwrócić. Opcje kliniczne opierają się na urządzeniach protetycznych, w tym aparatach słuchowych oraz implantach ślimakowych, ucha środkowego i implantów przewodnictwa kostnego². Niestety, nie ma specyficznych medycznych metod leczenia odtwórczego dla osób niedosłyszących, dlatego kilka kierunków badawczych koncentruje się na rozwoju terapii prewencyjnych i reparatywnych. Nowe opcje terapeutyczne obejmują terapie genowe i komórkowe, a także rozwój małych cząsteczek do terapii farmakologicznej².

Jednym z najważniejszych wyzwań w farmakologicznej terapii ślimakowej jest dostarczanie leków. Leczenie ogólnoustrojowe ma ograniczoną skuteczność w ślimaku ze względu na barierę krew-labirynt³, ciągły śródpanel w kontakcie z naczyniami krwionośnymi ślimaka, który działa jako fizyczna i biochemiczna bariera utrzymująca homeostazę płynu w uchu wewnętrznym, ograniczając w ten sposób przepływ leku do ucha wewnętrznego. Jest przepuszczalny tylko dla małych cząsteczek rozpuszczalnych w tłuszczach, chociaż przepuszczalność może być zwiększona podczas zapalenia ślimaka, a także przy stosowaniu diuretyków lub środków osmotycznych. Objętość leku, która ostatecznie dociera do ślimaka po podaniu ogólnoustrojowym, jest zmniejszona; Dlatego wymagane są wysokie dawki, które mogą powodować toksyczność organiczną. Ponadto metabolizm wątrobowy leku może wytwarzać toksyczne lub nieaktywne metabolity^4,5,6,7. W przeciwieństwie do tego, interwencje miejscowe pozwalają na umieszczenie znanej ograniczonej ilości leku w uchu środkowym lub wewnętrznym bez niepożądanych skutków ubocznych^4,7,8,9. W obecnej praktyce klinicznej podawanie dobębenkowe jest ograniczone do niektórych patologii ślimaka, takich jak gentamycyna w chorobie Meniere'a¹⁰, kortykosteroidy w nagłej głuchocie, choroba Meniere'a, utrata słuchu o podłożu immunologicznym i hałasie,^{11,12,13,14,15} oraz insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF1) w nagłej głuchocie^4,16,17.

Preparaty do podawania miejscowego powinny zachować delikatną homeostazę (pH i osmolarność) płynów ślimakowych. Ponadto bardzo ważne jest utrzymanie sterylności przez cały proces, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego płynu mózgowo-rdzeniowego. Substancja pomocnicza stosowana do podawania leku powinna być biokompatybilna, nieototoksyczna i mieć odpowiednią konsystencję. Roztwory płynne są zalecane do wstrzykiwań wewnątrzślimakowych, ale nie są odpowiednie do wstrzykiwań dobębenkowych ze względu na klirens przez trąbkę Eustachiusza. W tym przypadku leki są zwykle przenoszone przez półstałe żele, aby zwiększyć ich trwałość w uchu środkowym^4,18,19. Alternatywnymi systemami dostarczania stosowanymi jako nośniki w celu zwiększenia przepływu leku do ucha wewnętrznego są nanocząstki²⁰ i adenowirusy²¹ Tutaj porównaliśmy dwa pojazdy: CGP i rozwiązanie RL. CGP to hydrożel utworzony przez chitozan, liniowy polisacharyd składający się z D-glukozaminy i N-acetylo-D-glukozaminy uzyskanych ze skorupiaków oraz β-glicerofosforanu, poliolu, który tworzy tarczę wodną wokół łańcuchów chitozanu i utrzymuje go w postaci płynnej. CGP jest termoczuły i może być degradowany przez lizozymy, co pozwala na długotrwałe uwalnianie leku w uchu środkowym^22,23,24,25. Hydrożele na bazie chitozanu są odpowiednimi nośnikami do zastosowań klinicznych, takich jak dostarczanie leków, ze względu na ich brak immunogenności i brak aktywacji miejscowych reakcji zapalnych^23,24. Z drugiej strony, bufor RL jest niepirogennym roztworem izotonicznym (273 mOsm/L i pH 6,5) przeznaczonym do podawania dożylnego u ludzi jako źródło wody i elektrolitów, zwłaszcza w przypadku utraty krwi, urazów lub oparzeń, ponieważ produkty uboczne metabolizmu mleczanu w wątrobie przeciwdziałają kwasicy.

Tutaj opisujemy i porównujemy dwie metody chirurgiczne, które zostały udoskonalone do miejscowego dostarczania leków do ucha wewnętrznego myszy. Profil bezpieczeństwa obu technik oceniono za pomocą testów funkcjonalnych, morfologicznych i molekularnych. Słuch oceniano za pomocą Słuchowej Odpowiedzi Pnia Mózgu (ABR)^26,27 wykonywanych przed i po mikrooperacji w różnym czasie. Zastosowano procedury punktu końcowego w celu przeprowadzenia sekcji ślimaka i porównania anatomicznego, komórkowego i molekularnego wpływu tych dwóch procedur mikrochirurgicznych.

Protokół

Upewnij się, że procedury postępowania ze zwierzętami są zgodne z międzynarodowymi i krajowymi przepisami. Protokół jest zgodny odpowiednio ze Wspólnotą Europejską 2010/63/UE i hiszpańskimi wytycznymi RD 53/2013.

1. Ogólne obchodzenie się ze zwierzętami

1. Karm myszy ad libitum standardową dietą i wodą pitną. Kontroluj zdrowie i dobre samopoczucie, postępując zgodnie z zaleceniami Federacji Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (FELASA).

2. Ocena słuchu

UWAGA: Śledź funkcjonalny wpływ procedur mikrochirurgicznych, badając słuch przed i wiele razy po operacji (w tej pracy 2, 7, 14 i 28 d po mikrochirurgii) za pomocą nieinwazyjnych procedur, takich jak ABR⁹.

1. W przypadku badania ABR należy znieczulić myszy za pomocą protokołów krótkotrwałego efektu, tj. dootrzewnowego wstrzyknięcia ketaminy (100 mg/kg masy ciała (BW) i ksylazyny (10 mg/kg, BW). Alternatywnie należy wykonać badania słuchu w znieczuleniu wziewnym.
   UWAGA: Ponieważ na parametry ABR może mieć wpływ protokół anestezjologiczny²⁸, należy używać tego samego parametru przez cały czas trwania eksperymentu.
2. Sprawdź głębokość znieczulenia, testując odruch szczypania palców.
   UWAGA: Gdy odruch wycofania zanika, zwierzę osiągnęło odpowiednią głębokość znieczulenia do wykonania badań słuchowych.
3. Chronić oczy przed wysuszeniem i wtórnym zapaleniem rogówki i spojówki poprzez miejscowe podawanie suplementów przeciw łzom, takich jak żele na bazie hydroksypropylometylocelulozy.
4. Utrzymuj mysz w temperaturze fizjologicznej (37,5-38 °C) podczas całego zabiegu. Aby uniknąć zakłóceń elektrycznych, użyj pompy ciepłej wody i poduszek grzewczych. Monitoruj temperaturę ciała za pomocą sond doodbytniczych. Zawsze uważaj, aby nie przegrzać zwierzęcia.
   UWAGA: Zalecamy czyszczenie poduszki grzewczej środkiem do dezynfekcji powierzchni między myszami. Do indukcji znieczulenia i rekonwalescencji można użyć elektrycznych poduszek grzewczych, żarówek lub lamp podczerwonych.
5. Procedura ABR
   UWAGA: Do rejestracji ABR należy użyć komputerowej stacji roboczej z wbudowaną kartą dźwiękową do tworzenia przebiegów (cyfrowy na analogowy, wyjście DA, konwersja) oraz do digitalizacji przebiegów odpowiedzi elektrycznej (analogowo-cyfrowej, wejście A-D), tłumika, oscyloskopu i wzmacniacza o niskiej impedancji. Nowoczesne słuchowe stacje robocze (np. Tucker Davis Techonologies) zawierają wszystkie te elementy w jednym kompaktowym systemie.
   1. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na poduszkach grzewczych w komorze tłumiącej dźwięk, aby uniknąć zakłóceń i pogłosu hałasu otoczenia (rysunek 1).
   2. Dostarczaj bodźce akustyczne do zewnętrznego przewodu słuchowego. Korzystaj z gotowych bodźców lub nowych sygnałów zaprojektowanych za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Podłącz wyjście stacji roboczej DA do wybranego głośnika.
      UWAGA: Można używać głośników swobodnego pola lub zamkniętego pola włożonych do zewnętrznego kanału słuchowego. Te pierwsze są preferowane podczas pracy z myszami ze względu na trudności we wprowadzaniu sondy i kalibracji dźwięku w systemach zamkniętych. Głośniki swobodnego pola stymulują oba uszy i wywołują reakcję różnicową. Aby uzyskać głównie monofoniczne odpowiedzi u osób mówiących w polu swobodnym, aktywność kontralateralna musi zostać wyeliminowana przez okluzję (tj. za pomocą zatyczek do uszu) lub przez maskowanie hałasu.
      1. Umieść głośnik swobodnego pola w stałej odległości (zwykle 5-20 cm) przodem do głowy lub wybranego ucha, tak aby środek głośnika był wyrównany z zewnętrznym kanałem słuchowym. Upewnij się, że między głośnikiem a uchem nie ma żadnych przeszkód i że małżowina uszna jest całkowicie otwarta.
   3. Umieść podskórne elektrody igłowe ze stali nierdzewnej w następujący sposób: i) elektrodę aktywną (dodatnią) w skórze głowy między uszami (nad wierzchołkiem czaszki), ii) elektrodę referencyjną (ujemną) w okolicy ślinianki przyusznej poniżej małżowiny usznej oraz iii) elektrodę uziemiającą w okolicy kończyny tylnej, ogonowej lub tylnej (ryc. 1).
      1. Sprawdź impedancję elektryczną elektrod dodatnich i ujemnych. Upewnij się, że impedancja jest mniejsza niż 3 kOhm (najlepiej 1 kOhm). Jeśli jest wyższy, zmień położenie, wyczyść alkoholem lub wymień elektrody.
   4. W przypadku nagrywania ABR generuj szerokopasmowe kliknięcia i czyste częstotliwości tonów oraz prezentuj malejące natężenia od 90 do 10 dB w stosunku do poziomu ciśnienia akustycznego (SPL) w krokach co 5-10 dB SPL^27,29,30.
      1. Prezentuj krótkie bodźce kliknięcia lub impulsy dźwiękowe (1-5 ms), zaczynając od wysokiego poziomu (tj. 80 lub 90 dB SPL) i zmniejszając intensywność w krokach co 5-10 dB SPL. Zarejestruj odpowiedź elektryczną w ciągu pierwszych 10 ms po stymulacji (wywołane reakcje ABR pojawiają się po 6-8 ms).
         UWAGA: Z tego powodu szybkość stymulacji nie powinna być wyższa niż 50 bodźców/s (normalna szybkość 20-50).
   5. Wzmacniaj, rejestruj i uśredniaj wywołaną reakcję elektryczną na każdy bodziec i intensywność. Użyj wzmacniacza o niskim poziomie szumów i dobrym stosunku sygnału do szumu i podłącz go do wejścia A-D.
      UWAGA: ABR mają bardzo niskie amplitudy, zwykle poniżej 1 μV (peak-to-peak) i muszą być nagrywane za pomocą wzmacniacza o bardzo niskim poziomie szumów. U normalnie słyszących myszy wyraźne fale ABR pojawiają się po uśrednieniu 100 - 200 odpowiedzi, jednak w celu uzyskania wysokiej jakości nagrań lub w przypadku upośledzenia słuchu zaleca się więcej powtórzeń (750-1,000)²⁷.
   6. Wizualnie określ próg ABR podczas testu.
      UWAGA: Próg ABR to najniższe natężenie bodźców dźwiękowych, które wywołuje wiarygodne nagranie ABR z wyraźnie widocznymi falami od I do IV i średnim napięciem międzyszczytowym 2 SD powyżej średniej aktywności tła³¹. Dane te muszą zostać potwierdzone podczas analizy off-line, wraz z innymi parametrami, w tym opóźnieniami szczytowymi i międzyszczytowymi oraz amplitudami fal.
   7. Wykonuj analizę danych ręcznie lub automatycznie.
      1. W przypadku analizy ręcznej zidentyfikuj 4-5 fal ABR (I, II, III... itp.) i zaznacz szczyty (P1, P2, P3...) i doliny (N1, N2, N3...) dla każdej fali. Po zakończeniu analizy wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego lub pliku tekstowego.
         UWAGA: Specjalne oprogramowanie do rejestrowania odpowiedzi elektrycznej zwykle wykonuje analizę automatycznie. Dodatkowe pomiary można określić w nagraniu ABR w odpowiedzi na stałe natężenie (tj. 70 lub 80 dB SPL) lub przy natężeniach w stosunku do poszczególnych progów kliknięcia (tj. 15 dB SPL powyżej progu).
6. Wykonaj analizę statystyczną danych ABR za pomocą odpowiedniego oprogramowania. W zależności od projektu eksperymentalnego, użyj standardowego sparowanego testu T lub analizy wariancji (ANOVA), aby porównać główne parametry ABR w różnych grupach^26,30.
   UWAGA: W badaniach podłużnych wiele danych funkcjonalnych zbiera się od tego samego zwierzęcia w różnych punktach czasowych (tj. przed i po mikrooperacji). W takim przypadku ogólny test powtarzanych pomiarów modelu liniowego zapewnia szczegółową analizę wariancji.

3. Przygotowanie pojazdu

1. Przygotować i stosować roztwory do pożywek w sterylnych warunkach.
   UWAGA: Płynne roztwory są zwykle szybko usuwane przez trąbkę Eustachiusza. W celu wydłużenia czasu przebywania leku w uchu środkowym można zastosować różne systemy dostarczania do wstrzykiwań, w tym hydrożele i nanocząsteczki³².
   1. Aby przygotować hydrożel CGP, należy rozpuścić 75% deacetylowanego chitozanu w 0,2 M kwasie octowym, otrzymując 1,5-2% (wag./wag.) roztwór chitozanu. Dodać 9% glicerofosforanu (mt/wt) do tego roztworu⁷. Przygotować roztwór tuż przed podaniem i przechowywać hydrożel w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Hydrożel CGP jest umiarkowanie lepki, ale nadal można go wstrzykiwać w tej temperaturze. Poniżej 4 °C przechodzi w fazę stałą, blokując jej aplikację. Po aplikacji CGP ulega przemianie fazowej do półstałego żelu w ciągu około 15 minut w temperaturze 37 °C.
   2. Podwielokrotność (0,5 ml) handlowego buforu RL i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

4. Zabiegi mikrochirurgiczne

1. Wywołać znieczulenie ogólne za pomocą kombinacji środków uspokajających i przeciwbólowych na bazie ketaminy (tj. ketaminy 100 mg/kg, medetomidyny 0,05 mg/kg i fentanylu 0,025 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe, a następnie środków wziewnych (tj. izofluranu).
   1. Po podaniu środków iniekcyjnych należy przyłożyć maskę znieczulającą do pyska myszy i podłączyć dopływ_O2 do oparów izofluranu. Utrzymuj znieczulenie wziewne podczas mikrochirurgii i monitoruj płaszczyznę znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palców u nóg i wzorca oddychania. Rozpocznij przygotowanie chirurgiczne, gdy odruch zostanie całkowicie zniesiony, a mysz zacznie regularnie oddychać.
   2. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą poduszek grzewczych podczas całego zabiegu i chroń oczy przed zapaleniem rogówki za pomocą żelu na bazie hydroksypropylometylocelulozy.
2. Przygotuj czyste pole operacyjne za pomocą sterylnych obłożeń. Przed zabiegiem wysterylizuj narzędzia mikrochirurgiczne za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi. Utrzymuj sterylne warunki podczas całego zabiegu chirurgicznego (sterylne rękawiczki, obłożenia, narzędzia chirurgiczne itp.).
3. Mikrochirurgia
   1. Bullostomia
      UWAGA: Bullostomia jest zabiegiem jednostronnym. Używaj jednego ucha myszy i używaj ucha przeciwległego jako elementu sterującego.
      1. Umieść mysz w pozycji odleżynowej na wznak. Przygotuj obszar operacyjny na brzusznej powierzchni szyi za pomocą maszynki do strzyżenia, aby usunąć sierść. Oczyść skórę roztworem antyseptycznym na bazie jodonu powidonu i przykryj sterylnymi zasłonami.
      2. Za pomocą skalpela wykonaj 2 cm podłużne nacięcie od żuchwy do obojczyka.
      3. W powiększeniu za pomocą mikroskopu chirurgicznego zidentyfikuj gruczoły podżuchwowe i oddziel je kleszczami. Cofnij gruczoły podżuchwowe i zlokalizuj początek mięśnia dwubrzuścowego i nerwu twarzowego.
      4. Wykonaj nacięcie w początkowym miejscu mięśnia dwubrzuścowego nożyczkami i cofnij go brzusznie, odsłaniając leżący pod spodem dolno-przyśrodkowy aspekt pęcherza bębenkowego.
      5. Wykonaj otwór w pęcherzu, wiercąc w nim igłą 27 G (ryc. 2A). Zlokalizuj tętnicę strzemiączkową i błonę ogonową RW do niej (ryc. 2B). Oczyść krew z wierconego obszaru za pomocą wchłanialnej gąbki żelatynowej.
      6. Za pomocą cewnika 34 G i szklanej mikrostrzykawki powoli wstrzyknąć 3-5 μl roztworu nośnika (hydrożel CGP lub RL) przez pęcherzyk stomijny bezpośrednio do wnęki RW, wypełniając ją (ryc. 2C). Uszczelnij pęcherzową przestrzeń za pomocą 1-2 kropli kleju tkankowego.
      7. Przywróć gruczoły podżuchwowe do ich początkowej pozycji i zamknij nacięcia skóry jedwabnym szwem chirurgicznym 5-0. Zastosuj środek antyseptyczny na bazie chlorheksydyny wokół nacięcia, aby uniknąć zakażenia rany. UWAGA: Można stosować szwy wchłanialne i niewchłanialne. Szwy niewchłanialne należy usunąć w ciągu 2 tygodni. Jedwab nie jest zalecany do zamykania skóry, ponieważ jego stosowanie wiąże się z infekcją nacięcia i miejscowymi reakcjami tkankowymi.
   2. Obustronne wstrzyknięcie przezbębenkowe
      1. Umieścić mysz w bocznej pozycji odleżynowej i przygotować aseptyczne pole chirurgiczne poniżej przewodu słuchowego zewnętrznego, jak opisano w ppkt 4.3.1.1.
      2. Wykonaj 0,5 cm podłużne nacięcie w pionowej części zewnętrznego przewodu słuchowego w pobliżu tragusa i przetnij wewnętrzny fałd skórny małżowiny usznej (opcjonalnie).
      3. Zlokalizuj błonę bębenkową na końcu zewnętrznego przewodu słuchowego za pomocą mikroskopu chirurgicznego (ryc. 2E) i zidentyfikuj górną pars laxida i dolną pars tensa, która jest podzielona na przednią i tylną część za pomocą uchwytu młoteczka (ryc. 2F).
      4. Wykonaj małą myringostomię w ogonowej części pars flaccida. Wykonać dodatkowe nacięcie w pars tensa błony bębenkowej, aby umożliwić ewakuację powietrza podczas iniekcji³³. Delikatnie wstrzyknąć 10-15 μl roztworu nośnika (CGP-hydrożel lub RL) za pomocą szklanej mikrostrzykawki podłączonej do cewnika 34 G przez pars flaccida, w pobliżu wnęki RW, aż ucho środkowe będzie wyraźnie pełne.
      5. Zamknąć nacięcia skóry jedwabnym szwem chirurgicznym 5-0 i oczyścić zgodnie z opisem w 4.3.1.7.
      6. Umieść mysz na drugim boku i obsługuj ucho przeciwległe (kroki od 4.3.2.1 do 4.3.2.5).
4. Trzymaj mysz na poduszce grzewczej, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.
5. Monitoruj stan ciała, aktywność i obecność oznak bólu lub stresu. W razie potrzeby należy podać leki przeciwbólowe (np. buprenorfina 0,05 mg/kg, karprofen 5-10 mg/kg). Codziennie przeglądaj ranę pooperacyjną i usuwaj zamknięcia skóry 7-14 dni po operacji po sprawdzeniu, czy rana się zagoiła.

5. Ocena morfologiczna cytoarchitektury ślimaka

1. Poddaj mysz eutanazji pod koniec eksperymentu (w tej pracy 28 dni po mikrochirurgii), z przedawkowaniem pentobarbitalu dootrzewnowego (100 mg / kg) w celu zbadania długoterminowych skutków operacji.
2. Przeprowadzić perfuzję przezsercową zimną 0,1 M solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), pH 7,5, a następnie 4% (wag./v) paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M PBS, pH 7,5 zgodnie z opisem²⁶,
   UWAGA: Paraformaldehyd jest wysoce toksyczny; Unikać kontaktu ze skórą, oczami lub błonami śluzowymi. Unikać wdychania proszku podczas odmierzania i przygotowywania.
3. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby oddzielić ucho wewnętrzne od kości skroniowej zgodnie z opisem^34,35 bez oddzielania elementów przedsionkowych i ślimakowych ucha wewnętrznego.
4. Zamocować izolowane ucho wewnętrzne za pomocą 4% (wag./v) PFA w 0,1 M PBS, pH 7,5 w temperaturze 4 °C przez 12 godzin, delikatnie potrząsając. Myć 3x przez 5 min 0,1 M PBS, pH 7,5.
5. Odwapnić próbki 10% kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) przygotowanym w 0,1 M PBS, pH 6,5 w temperaturze 4 °C przez 10 dni, stale wstrząsając, zmieniając roztwór EDTA co 3 dni.
6. Gdy ślimaki uzyskają miękką konsystencję, usuń EDTA i myj 3x przez 5 minut 0,1 M PBS, pH 7,5, wstrząsając w temperaturze pokojowej.
7. Zanurz próbki w wosku parafinowym zgodnie z opisem³⁴ i wykonaj odcinki ślimaka o grubości 7 μm równolegle do modiolus.
8. Aby ocenić cytoarchitekturę ślimaka, wybarwić skrawki hematoksyliną i eozyną (H&E)³⁰ i użyć mikroskopu świetlnego podłączonego do aparatu cyfrowego, aby uchwycić obrazy za pomocą obiektywów 4X i 20X.

6. Ekspresja genu ślimaka

1. Oczyść powierzchnię roboczą i narzędzia chirurgiczne roztworem do odkażania RNAzą.
2. Poddać mysz eutanazji zgodnie z opisem w 5.1 i szybko wyciąć ucho wewnętrzne z kości skroniowej za pomocą mikroskopu. Zanurz ucho wewnętrzne w szklanym naczyniu zawierającym ochraniacz kwasu rybonukleinowego (RNA) i odczynnik stabilizujący.
3. Usuń pozostałą kość skalistą za pomocą kleszczyków jubilerskich i delikatnie oddziel ślimak od przedsionka za pomocą nożyczek do oczu Vanny³⁵.
4. Natychmiast przenieś ślimak do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml z 80 μl roztworu ochronnego i stabilizującego RNA, a następnie zamroź tkankę, umieszczając probówkę w suchym lodzie. Próbki ślimaka należy przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu użycia.
5. Wyizoluj RNA ślimaka zgodnie z opisem³⁵ i określ jego jakość i ilość spektrofotometrycznie.
6. Wygeneruj cDNA ślimaka z równych ilości całkowitego mysiego RNA za pomocą komercyjnego zestawu do odwrotnej transkrypcji.
7. Wykonaj qRT-PCR w celu amplifikacji komplementarnego kwasu dezoksyrybonukleinowego (cDNA) w trzech egzemplarzach, aby zmierzyć transkrypty genów^35,36.
   UWAGA: W niniejszej pracy zmierzono pro- i przeciwzapalne transkrypty genów Il1b, Il6, Tgfb1, Tnfa, Il10 i Dusp1.
8. Oblicz względne współczynniki ekspresji, normalizując poziomy progu docelowego cyklu transkryptywnego (Ct) do średniej arytmetycznej referencyjnego poziomu genu i względną kwantyfikację poprzez normalizację poziomów transkrypcji grupy problemowej do średniej arytmetycznej grupy kalibratorów³⁷.

Wyniki

Słuch był testowany przez ABR przed i kilka razy po mikrooperacji, aby ocenić wpływ na funkcje słuchowe (Rysunek 1A). Rejestry ABR zostały wykonane w znieczuleniu, aby uniknąć artefaktów związanych z ruchem zwierząt i napięciem, a tym samym poprawić jego odtwarzalność²⁷. Podawane dootrzewnowo kombinacje na bazie ketaminy lub wziewny izofluran były zwykle stosowane do znieczulania zwierząt podczas testów ABR. Kombinacja ketaminy/ksylazyny zapewnia krótkotrwałą (2-3 min) indukcję oraz stabilną, bezpieczną fazę konserwacji podczas wykonywania rejestrów ABR. Należy zauważyć, że izofluran może wpływać na czułość pomiaru ABR³⁸. W przypadku rejestrów ABR elektrody podskórne umieszcza się w określonych miejscach (rysunek 1B) i mierzy impedancję elektryczną. Jeśli impedancja wynosi 3 kOhm lub więcej, należy sprawdzić położenie elektrody, aby uniknąć zmian amplitudy fali ABR.

Podawanie do błony bębenkowej odbywa się u myszy za pomocą dwóch zabiegów mikrochirurgicznych (Rysunek 2). Odsłonięcie pęcherza podczas pęcherza polega na cofnięciu gruczołów podżuchwowych i mięśnia dwubrzuścowego. Zabieg ten przeprowadza się z najwyższą ostrożnością, ponieważ tętnica szyjna i nerw błędny są bardzo blisko siebie (ryc. 2A). Następnie pęcherz jest wiercony w celu zlokalizowania tętnicy strzemiączkowej i błony RW (ryc. 2B). Aby uniknąć pękania kości, przed wierceniem wykonuje się mały otwór 0,5 mm za pomocą igły 27 G. Cewnik 34 G jest kierowany przez pęcherzykową przestrzeń w kierunku błony RW, a niewielka objętość nośnika jest dostarczana do wnęki okiennej (ryc. 2C). Iniekcję przezbębenkową wykonuje się przez nacięcie w pars flaccida błony bębenkowej za pomocą igły 27 G; Większy może spowodować rozdarcie membrany. Przed iniekcją zalecamy wykonanie dodatkowego nacięcia w pars tensa, aby umożliwić odpływ powietrza podczas wstrzykiwania pojazdu (rys. 2F). Bardzo ważne jest, aby uniknąć uszkodzenia tętnicy strzemiączkowej, gałęzi tętnicy szyjnej wewnętrznej, co mogłoby doprowadzić do zagrażającego życiu krwawienia.

Myszy z pęcherzową lub przezbębenkową operacją zachowały słuch przez cały czas trwania eksperymentu, podobnie jak myszy bez operacji (Rysunek 3). Progi ABR w odpowiedzi na kliknięcia i impulsy tonalne nie zmieniły się znacząco po mikrooperacji w porównaniu z wartościami wyjściowymi. Nie zaobserwowano istotnych różnic między dostępem pęcherzowym a transtympanalnym. Przeprowadzono badania morfologiczne w celu potwierdzenia prawidłowego podania nośnika do ucha środkowego oraz oceny potencjalnych zmian wywołanych zabiegami w cytoarchitekturze ślimaka. Żaden z głównych regionów ślimaka nie wykazywał zmian morfologicznych, a zwierzęta z obu procedur prezentowały podobną morfologię wszystkich struktur ślimaka (ryc. 4A). Ponadto badano również profile ślimakowe pod kątem ekspresji genów cytokin pro- i przeciwzapalnych. Pomimo braku funkcjonalnych różnic w danych ABR między obiema procedurami, pęcherzykowa stopomia powodowała silniejszą reakcję zapalną niż dostęp transtympanalny (ryc. 4B).

Rysunek 1. Projekt eksperymentalny i ocena słuchu. (A) Schemat procedury doświadczalnej. Słuch oceniano za pomocą ABR przed i po mikrooperacji. Próbki ślimaka pobrano 28 dni po mikrooperacji. oraz Znieczulona mysz w pozycji leżącej nad poduszką grzewczą w komorze tłumiącej dźwięk, z elektrodami podskórnymi umieszczonymi w skórze głowy między uszami nad wierzchołkiem czaszki (aktywna, dodatnia); w okolicy ślinianki przyusznej poniżej małżowiny usznej (odniesienie, negatyw) i z tyłu (ziemia). Głośnik swobodnego pola umieszcza się w stałej odległości (5 cm) od prawego ucha. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Mikrochirurgia do zastosowań w pojazdach. (A) Widok brzuszny pęcherza bębenkowego. Pęcherzową stopę wykonano doogonowo do nerwu twarzowego za pomocą igły 27 G. (B) Przez perforację można zaobserwować RWN i tętnicę strzemiączkową. (C) Cewnik 34 G jest kierowany przez pęcherzyk w kierunku niszy RW. (D) Miesiąc po bullostomii w miejscu otworu (grot strzały) pojawia się niewielka blizna kostna. (E) Widok boczny ucha, pokazujący nacięcie w przewodzie słuchowym zewnętrznym i błonie bębenkowej (kwadrat). (F) Szczegół błony bębenkowej. Nakłucie wykonano w górnym kwadrancie ogonowym błony bębenkowej za pomocą igły 27 G (gwiazdka, w pars flaccida); wstrzyknięcie zostało wykonane przez tę perforację za pomocą cewnika 34 G. Przed wstrzyknięciem wykonano dodatkowy otwór w dolnym kwadrancie czaszki błony (biała gwiazdka, w pars tensa) w celu zrównoważenia ciśnienia bębenkowego. (G) Widok cewnika 34 G przez nakłucie błony bębenkowej. (H) Widok okolicy ślimakowej 24 godziny po mikrooperacji. RWN wypełniony roztworem podłoża (gwiazdka). Szerokość, boczna; Ro, rostral; Do, grzbietowy; Ma, młoteczek; Co, ślimak; OW, Okno owalne; RWN, okrągła wnęka okienna. Podziałka = 200 μm w A, D, F; Podziałka = 100 μm w B, C, H; Podziałka = 1,000 μm w E, G. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Ocena słuchu. Ewolucja progów ABR (średnia ±SEM, w dB SPL) w odpowiedzi na bodźce kliknięcia (A) i impulsu tonu (B), przed i 7, 14 i 28 dni po mikrooperacji u samców ośmiotygodniowych myszy C57BL/6J. Bullostomia (pomarańczowy; n = 11); iniekcja przezbębenkowa (niebieska; n = 6); nieobsługiwany (szary; n = 11), Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Morfologia ślimaka i analiza ekspresji genów. (A) Morfologia głównych struktur ślimaka u podstawy ślimaka. Barwienie hematoksyną eozyną skrawków parafiny środkowej części modiolarnej (7 μm) uszu myszy nieoperowanych oraz myszy miesiąc po interwencji mikrochirurgicznej przez pęcherzykową lub wstrzyknięcie przezbębenkowe. Komora mediów scala (a,b,c) prezentuje wszystkie główne komponenty. Szczegóły każdej z tych struktur (ponumerowane ramki) pokazano na kolejnych zdjęciach: zwój spiralny (1), narząd Cortiego (2), więzadło spiralne (3) i prążek naczyniowy (4). Wewnętrzna komórka rzęsata (gwiazdka); zewnętrzne komórki rzęsate (głowa strzały). Podziałka = 100 μm w a,b,c; Podziałka = 50 μm w a-1,2,3,4. (B) Ślimakowa ekspresja markerów stanu zapalnego 28 dni po mikrooperacji. Porównanie między pęcherzykową stopią (pomarańczowa) a wstrzyknięciem przezbębenkowym (niebieska) oraz z myszami nieoperowanymi (biała). *: grupy nieobsługiwane vs. obsługiwane; ^: porównanie między obsługiwanymi grupami. Poziomy ekspresji genów są reprezentowane jako ^2-ΔΔCt, czyli n-krotna różnica w stosunku do grupy nieoperowanej. Wartości są przedstawione jako średnia SEM trzech ± próbek z puli próbek 3 myszy na warunek. Istotność statystyczna: **p ≤0,01; p ≤0,001; ^{^^} ≤0,01; ^^^p ≤0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Miejscowe podawanie leku do ucha wewnętrznego może odbywać się bezpośrednio przez wstrzyknięcie do ślimaka lub pośrednio przez podanie dobębenkowe, umieszczając lek w uchu środkowym ^4,19,39. Podawanie wewnątrzślimakowe zapewnia kontrolowane i precyzyjne dostarczanie leku do ślimaka, unikając dyfuzji przez błony okienne, gradientów stężeń od podstawy do wierzchołka i klirensu przez trąbkę Eustachiusza. Jest to jednak zazwyczaj zabieg wysoce inwazyjny, wymagający skomplikowanej i delikatnej mikrochirurgii ^7,39. W tym kontekście przemysł opracowuje nowe, powlekane, wszczepialne urządzenia do przedłużonego uwalniania leków ^40,41. Z drugiej strony, podanie dobębenkowe jest mało inwazyjną i łatwą do wykonania procedurą, która pozwala na wstrzyknięcie większych objętości leku do ucha środkowego, chociaż farmakokinetyka nie jest łatwa do kontrolowania. Większość leku jest usuwana przez trąbkę Eustachiusza, a pozostała frakcja musi dyfundować przez błonę RW, aby dotrzeć do ślimaka¹⁸. RW jest miejscem maksymalnego wchłaniania substancji z ucha środkowego do wypełnionego perylimfą przewodu bębenkowego ślimaka⁷. Jest to półprzepuszczalna struktura trójwarstwowa, chociaż jej przepuszczalność zależy od właściwości leku (wielkość, stężenie, rozpuszczalność i ładunek elektryczny) oraz od systemów transportu transbłonowego (dyfuzja, transport aktywny lub fagocytoza)⁴². Okienko owalne i torebki uszne są alternatywnymi, ale mniej skutecznymi wejściami do ślimaka^43,44.

Tutaj demonstrujemy i porównujemy dwie metody mikrochirurgiczne do celowanego dostarczania leku do ucha środkowego myszy: pęcherzykową i procedury iniekcji przezbębenkowej. Typowe krytyczne etapy tych procedur obejmują: i) ocenę słuchu przed i po mikrooperacji, ii) przygotowanie jednorodnego roztworu podłoża w sterylnych warunkach, iii) staranny nadzór nad procedurą znieczulenia oraz monitorowanie temperatury ciała i stałych parametrów ciała zwierzęcia, iv) powolne umieszczanie odpowiedniej objętości nośnika ukierunkowanego na RW oraz iv) pobieranie próbek ślimaka w celu przeprowadzenia pełnej analizy molekularnej i morfologicznej.

Dostęp zauszny i brzuszny w przypadku pęcherzowej stopy został opisany ^7,45. Zastosowaliśmy przybliżenie brzuszne, ponieważ z naszego doświadczenia wynika, że skutkowało to mniejszą zachorowalnością i zapewniło lepszy dostęp do RW⁴⁶. Iniekcje przezbębenkowe są zwykle przeprowadzane przez pars tensa błony bębenkowej, przed lub za młoteczkiem¹². W tej pracy wykonaliśmy modyfikację techniki, czyli wstrzyknięcie przez pars flaccida poza młoteczek z uprzednim dodatkowym nakłuciem pars tensa, aby umożliwić ewakuację powietrza podczas iniekcji.

Iniekcja przezbębenkowa była mniej inwazyjna niż bullostomia, chociaż obie mikrooperacje były szybkie (20 i 5 minut na ucho odpowiednio w przypadku pęcherzyki i dostępu przezbębenkowego), z krótkim czasem rekonwalescencji pooperacyjnej i brakiem zachorowalności. Co najważniejsze, oba zabiegi utrzymały słuch, a parametry ABR były identyczne z tymi, które zostały określone przed mikrooperacją. Dostęp transtympaniczny trwa krócej niż pęcherzykowa i może być wykonany w obu uszach tego samego zwierzęcia podczas tej samej interwencji. Zaletą iniekcji przezbębenkowej jest to, że można ją wykonać obustronnie i powtórzyć, jeśli jest to wymagane. Z drugiej strony, pęcherzowa stopa zapewnia bezpośredni dostęp wzrokowy do błony RW i umożliwia wypełnienie niszy RW. Natomiast iniekcja przezbębenkowa nie pozwala na kontrolę umieszczenia pojazdu w niszy RW.

Procedury opisane w tej pracy opisują, w jaki sposób przeprowadzać miejscowe dostarczanie nośnika leku do ucha środkowego w zastosowaniach przedklinicznych, takich jak ocena ototoksyczności i ocena skuteczności w ubytku słuchu. Opisano dwie procedury mikrochirurgiczne, które zapewniają alternatywne metody o określonych zaletach i wadach. Oba zachowują słuch i nie powodują zmian morfologicznych. Miejscowy stan zapalny jest opisywany jako potencjalne powikłanie pęcherzykowej czynności. Opisano również zestaw uzupełniających się technik dla zabiegów pooperacyjnych, w tym ocenę słuchu, morfologii i ekspresji markerów stanu zapalnego. Przyszłe zastosowania tych technik obejmują przedkliniczną ocenę nowych terapii ubytku słuchu, w tym metod genetycznych, komórkowych i farmakologicznych, na modelach zwierzęcych. Podawanie dotymbębenkowe zapewnia dostarczanie leku do ucha środkowego, w kontakcie z błoną okienka okrągłego, ułatwiając przejście do perylimfy bez widocznego uszkodzenia ślimaka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ketamina (Imalgen)	Merial	# 2529	UWAGA: unikaj kontaktu leku ze skórą lub oczami lub przypadkowych samookaleczeń
Xylacine (Xilagesic)	Calier	# 6200025225
Nawilżający żel pod oczy (Artific)	Angelini	# 784710
Pompa wodna	Gaymar	# TP472
Płyn do dezynfekcji powierzchni	José Collado SA	# CR-36
Podskórne elektrody igłowe	Spes Medica	# MN4013D10SM
Scena czołowa o niskiej impedancji  (RA4LI)	Tucker-Davis Technologies
(wielopolowy głośnik magnetyczny MF1)	Tucker-Davis Technologies
System 3	Tucker-Davis Technologies		System składa się z: procesora RP2, stacji bazowej RA16, tłumika PA5, wzmacniacza SA1, wzmacniacza mikrofonowego MA3, stacji czołowej o impedancji RA4LI i przedwzmacniacza medusa RA4A
Oprogramowanie SigGenRP	Tucker-Davis Technologies
Podkładki rozgrzewające (podkładki TP)	Gaymar	# TP3E
Oprogramowanie statystyczne (SPSS)	IBM
Chitozan (deacetylowany)	Sigma-Aldrich	# C3646
Kwas octowy (lodowaty)	VWR	# 20103.295	UWAGA: ciecz łatwopalna, działanie na skórę, drogi oddechowe i skórę Uczulacz
Glicerofosforan	Sigma	# SLBG3671V
Ringer´ s bufor mleczanowy	Braun	# 1520-ESP
Medetomidine (Domtor)	Esteve	# 02400190
Phentanile (Fentanest)	Kern Pharma	# 756650.2	UWAGA:     unikać kontaktu leku z otwartymi ranami lub przypadkowymi wstrzyknięciami z własnej ręki
Isoflurane (IsoVet)	Braun	# 469860	UWAGA: Unikać narażenia na stężenie halogenowe środka znieczulającego przy stężeniach górnych większych niż 2 ppm w okresie pobierania próbek nieprzekraczającym 1 godziny.
Mikroskop chirurgiczny (OPMI pico)	Zeiss
Sterylna serweta (Foliodrape)	Hartmann	# 277546
Sterylizator	Fine Science Tools	# 18000-45
Ostrze skalpela	Swann Morton	# 0205	UWAGA
Rękojeść skalpela	Fine Science Tools	# 91003-12
Povidone antyseptyczny na bazie jodu (Betadine)	Meda Pharma SAU#	M-12207
Nożyczki Adventitia (SAS18-R8)	S& T	# 12075-12
Nożyczki zakrzywione	CM Instrumente	# AJ023-18
Kleszcze	CM Instrumente	# BB019-18
Gąbka żelatynowa (Spongostan)	ProNaMAc	# MS0001
Microlance 27 G	Becton Dickinson	# 302200
Strzykawka mikrolitrowa (701 RN SYR)	Hamilton	# 80330
Cewnik (Microfil 34 G)	Światowe instrumenty precyzyjne	# MF34G-5
Klej tkankowy (Vetbond)	3M	# 1469SB
Uchwyt na igłę (uchwyt na igłę z okrągłym uchwytem)	Fine Science Tools	# 12075-12
Jedwabny szew chirurgiczny (Pleciony jedwab 5/0)	Arago	# 990011
Chlorheksydyna (Cristalmina)	Salvat	# 787341
Pentobarbital  (Dolethal)	Ventochinol	# VET00040	UWAGA:     Unikaj kontaktu leku z otwartymi ranami lub przypadkowymi samookaleczeniami
Mikroskop stereoskopowy (Leica)	Instrumenty Meyera	# MZ75
Vannas Nożyczki do mikropreparowania (oka) Aparat	Harvard o	# 28483
Jubiler' kleszcze s (Dumont)	Fine Science Tools	# 11252-00
Roztwór do dekontaminacji RNazy  (RNaseZap)	Sigma-Aldrich	# R2020
(RNAlater)	Thermo Fisher Scientific	# R0901
(RNeasy)	Qiagen	# 74104
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA	Thermo Fisher Scientific	# 4368814
Test ekspresji genów (sondy TaqMan)	Thermo Fisher Scientific	Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1
System PCR w czasie rzeczywistym (7900HT)	Applied Biosystems	# 4329001
Paraformaldehyd (PFA)	Merck	# 1040051000	TOKSYCZNY: PFA to potencjał  rakotwórczy
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Merck	# 405491	UWAGA:  szkodliwy w przypadku wdychania, może powodować uszkodzenie dróg oddechowych poprzez długotrwałe lub powtarzające się narażenie, jeśli wdychany.
Roztwór hematoksyliny	Sigma-Aldrich	# HHS16
Eozyna Y	Sigma-Aldrich	# E4382	Zagrożenia: powoduje poważne podrażnienie oczu