Artykuł metodologiczny

Inżynieria sztucznych czynników w celu specyficznego manipulowania alternatywnym splicingiem w komórkach ludzkich

DOI:

10.3791/54967

⸱

26 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Computational Biology, CAS-MPG Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS), 2Institute of Cancer Stem Cell, Second Affiliated Hospital, Cancer Center, Dalian Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport opisuje metodę bioinżynierii do projektowania i konstruowania nowych sztucznych czynników splicingu (ASF), które specyficznie modulują splicing docelowych genów w komórkach ssaków. Metoda ta może być dalej rozszerzana w celu inżynierii różnych sztucznych czynników w celu manipulowania innymi aspektami metabolizmu RNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przetwarzanie większości eukariotycznych RNA odbywa się za pośrednictwem białek wiążących RNA (RBP) o modułowych konfiguracjach, w tym modułu rozpoznawania RNA, który specyficznie wiąże cel pre-mRNA i domenę efektorową. Wcześniej wykorzystaliśmy unikalny tryb wiązania RNA domeny PUF w ludzkim Pumilio 1 do wygenerowania programowalnego rusztowania wiążącego RNA, które zostało wykorzystane do inżynierii różnych sztucznych RBP w celu manipulowania metabolizmem RNA. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół konstruowania Engineered Splicing Factors (ESF), które są specjalnie zaprojektowane do modulowania alternatywnego splicingu docelowych genów. Protokół obejmuje sposób projektowania i konstruowania niestandardowego rusztowania PUF dla określonego celu RNA, jak konstruować plazmid ekspresyjny ESF poprzez fuzję zaprojektowanej domeny PUF i domeny efektorowej oraz jak używać ESF do manipulowania splicing docelowych genów. W reprezentatywnych wynikach tej metody opisaliśmy również powszechne testy aktywności ESF z wykorzystaniem reporterów splicingowych, zastosowanie ESF w hodowanych komórkach ludzkich oraz późniejszy efekt zmian splicingu. Postępując zgodnie ze szczegółowymi protokołami zawartymi w tym raporcie, możliwe jest zaprojektowanie i wygenerowanie EFS do regulacji różnych typów alternatywnego splicingu (AS), zapewniając nową strategię badania regulacji splicingu i funkcji różnych izoform splicingu. Co więcej, łącząc różne domeny funkcjonalne z zaprojektowaną domeną PUF, naukowcy mogą zaprojektować sztuczne czynniki, które celują w określone RNA, aby manipulować różnymi etapami przetwarzania RNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość ludzkich genów jest poddawana alternatywnemu splicingowi (AS) w celu wytworzenia wielu izoform o różnych aktywnościach, co znacznie zwiększyło złożoność kodowania genomu1,2. AS stanowi główny mechanizm regulujący funkcję genów i jest ściśle regulowany przez różne szlaki na różnych etapach komórkowych i rozwojowych3,4. Ponieważ nieprawidłowa regulacja splicingu jest częstą przyczyną chorób u ludzi5,6,7,8, ukierunkowana regulacja splicingu staje się atrakcyjną drogą terapeutyczną.

Zgodnie z uproszczonym modelem regulacji splicingu, AS jest głównie kontrolowany przez Splicing Regulatory cis-Elements (SREs) w pre-mRNA, które funkcjonują jako wzmacniacze splicingu lub tłumiki alternatywnych eksonów. Te SRE w szczególności rekrutują różne transaktywne czynniki białkowe (tj. czynniki splicingowe), które promują lub hamują reakcję splicingu3,9. Większość transakcyjnych czynników splicingu ma oddzielne specyficzne dla sekwencji domeny wiążące RNA, które rozpoznają swoje cele, oraz domeny efektorowe do kontrolowania splicingu. Najbardziej znanymi przykładami są członkowie rodziny białek bogatych w serynę/argininę (SR), które zawierają N-końcowe motywy rozpoznawania RNA (RRM), które wiążą egzoniczne wzmacniacze splicingu, oraz C-końcowe domeny RS, które promują inkluzję eksonów10. I odwrotnie, hnRNP A1 wiąże się z egzonicznymi tłumikami splicingowymi poprzez domeny RRM i hamuje inkluzję eksonów poprzez C-końcową domenę bogatą w glicynę11. Korzystając z takich modułowych konfiguracji, naukowcy powinni być w stanie zaprojektować sztuczne czynniki splicingu, łącząc określoną domenę wiążącą RNA (RBD) z różnymi domenami efektorowymi, które aktywują lub hamują splicing.

Kluczem takiego projektu jest użycie RBD, który rozpoznaje dane cele z programowalną specyficznością wiązania RNA, która jest analogiczna do trybu wiązania DNA w domenie TALE. Jednak większość natywnych czynników splicingu zawiera domeny RRM lub K Homology (KH), które rozpoznają krótkie elementy RNA o słabym powinowactwie, a zatem nie mają predykcyjnego rozpoznawania RNA-białka "kod"12. RBD białek powtórzeń PUF (tj. domena PUF) ma unikalny tryb rozpoznawania RNA, co pozwala na przeprojektowanie domen PUF w celu specyficznego rozpoznawania różnych celów RNA13,14. Kanoniczna domena PUF zawiera osiem powtórzeń trzech α-helis, z których każda rozpoznaje pojedynczą zasadę w celu 8-nt RNA. Łańcuchy boczne aminokwasów w określonych pozycjach drugiej α-helisy tworzą specyficzne wiązania wodorowe z krawędzią zasady Watsona-Cricka, która określa specyficzność wiązania RNA każdego powtórzenia (ryc. 1A). Kod do rozpoznawania zasad RNA powtórzeń PUF jest zaskakująco prosty (Rysunek 1A), co pozwala na generowanie domen PUF, które rozpoznają każdą możliwą kombinację 8-zasad (sprawdzone przez Wei i Wang15).

Ta modułowa zasada projektowania pozwala na generowanie Engineered Splicing Factor (ESF), który składa się z dostosowanej domeny PUF i domeny modulacji splicingu (tj. domeny SR lub domeny bogatej w Gly). Te ESF mogą funkcjonować zarówno jako aktywatory splicingu, jak i jako inhibitory do kontrolowania różnych typów zdarzeń splicingu i okazały się przydatne jako narzędzia do manipulowania splicing endogennych genów związanych z chorobami ludzkimi16,17. Jako przykład skonstruowaliśmy ESF typu PUF-Gly, aby specyficznie zmienić splicing genu Bcl-x, przekształcając antyapoptotyczną długą izoformę (Bcl-xL) w proapoptotyczną krótką izoformę (Bcl-xS). Przesunięcie proporcji izoformy Bcl-x było wystarczające do uwrażliwienia kilku komórek nowotworowych na wiele przeciwnowotworowych leków stosowanych w chemioterapii16, co sugeruje, że te sztuczne czynniki mogą być przydatne jako potencjalne odczynniki terapeutyczne.

Oprócz kontrolowania splicingu za pomocą znanych domen efektorowych splicingu (np. domeny bogatej w RS lub Gly), zmodyfikowane czynniki PUF mogą być również wykorzystywane do badania aktywności nowych czynników splicingowych. Na przykład, stosując to podejście, wykazaliśmy, że domena C-końcowa kilku białek SR może aktywować lub hamować splicing podczas wiązania z różnymi regionami pre-mRNA18, że bogaty w alaninę motyw RBM4 może hamować splicing19, oraz że bogaty w prolinę motyw DAZAP1 może wzmacniać splicing20,21. Te nowe domeny funkcjonalne mogą być używane do konstruowania dodatkowych typów sztucznych czynników w celu precyzyjnego dostrojenia splicingu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa rusztowania PUF z niestandardową specyficznością wiązania RNA poprzez nakładanie się PCR

  1. Zaprojektuj serię starterów PCR zawierających sekwencje PUF, które specyficznie rozpoznają różne nukleotydy RNA w każdej pozycji12 (patrz Tabela 1 dla sekwencji starterów i zobacz Rysunek 1A dla kodu rozpoznawania RNA:PUF). Dla każdego powtórzenia PUF zaprojektuj cztery różne podkłady, aby rozpoznać inną bazę w każdej pozycji.
    UWAGA: Te startery zostaną użyte w serii czterech rund reakcji PCR w celu wygenerowania fragmentów PUF, które są ze sobą połączone ( Rysunek 1B).
  2. Wybierz miejsce rozpoznania docelowego genu w pobliżu alternatywnego miejsca splicingu.
    UWAGA: O tej stronie może decydować użytkownik i zwykle jest ona wybierana w ciągu 10 - 50 nt spośród alternatywnych miejsc łączenia.
  3. Runda 1: Wygeneruj sekwencje kodowania dla 4 powtórzeń PUF, uniwersalnych fragmentów mostka i fragmentów czapki.
    1. Użyj lokacji docelowej, aby zdefiniować kod rozpoznawania dla każdego powtórzenia dostosowanego PUF. Wybierz zestaw starterów PCR dla powtórzeń PUF 1 - 8. Przeprowadź cztery kolejne rundy PCR, aby uzyskać niestandardową domenę PUF, jak opisano poniżej (Rysunek 1B).
    2. W pierwszej rundzie PCR należy ustawić standardowe mieszaniny reakcyjne PCR (zawierające 2,5 μl buforu 10x, 0,5 μl 10 mM dNTP, 0,5 μl starterów 10 μM do przodu i do tyłu, 50 ng matrycy DNA (ludzkie cDNA lub wektor ekspresyjny domeny PUF WT) i polimerazę DNA o wysokiej wierności 0,5 U w objętości końcowej 25 μl).
      UWAGA: W tych reakcjach powstaną sekwencje DNA odpowiadające każdemu powtórzeniu PUF, uniwersalnym fragmentom mostka i dwóm fragmentom czapeczki o różnych miejscach restrykcji (Rysunek 1B). Krótka lista szablonów, starterów i wygenerowanych produktów PCR użytych w tym kroku znajduje się w tabeli 2.
    3. Ustaw program PCR w następujący sposób: 5 minut w temperaturze 95 °C; 28 cykli po 30 s w temperaturze 95 °C, 30 s w temperaturze 55 °C i 15 s w temperaturze 72 °C oraz 5 minut inkubacji w temperaturze 72 °C. Użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności, aby zminimalizować mutacje punktowe podczas PCR.
  4. Runda 2: Wygeneruj sekwencje kodowania dla R1/R2/R3/R4 (R1 - 4) i R5/R6/R7/R8 (R5 - 8).
    1. Oddzielić produkty PCR otrzymane w kroku 1.3.3 za pomocą elektroforezy z 1,5% żelem agarozowym (25 minut przy stałym napięciu 120 V). Żel oczyszcza wszystkie produkty o oczekiwanej wielkości za pomocą zestawu do oczyszczania żelu. Użyj innej mieszanki tych produktów jako szablonu w kolejnych rundach PCR.
      UWAGA: Wymieszaj trzy produkty PCR w stosunku mniej więcej 1:1:1. Zwykle nie trzeba ich określać ilościowo, o ile intensywność każdego produktu wygląda podobnie w żelu.
    2. Wymieszaj około 5% oczyszczonych produktów PCR jako matrycę w następnej rundzie PCR. Alternatywnie, należy określić ilościowo oczyszczone produkty PCR za pomocą spektrofotometru UV-Vis i użyć 15 ng każdego produktu PCR w mieszaninie matrycowej.
    3. Użyj oczyszczonych produktów PCR R1/R2, R3/R4 i Bridge 2/3 jako mieszanych szablonów oraz R1-F i R4-R jako starterów. Ustawić reakcję PCR zgodnie z opisem w kroku 1.3, aby uzyskać nakładający się produkt PCR R1 - 4.
    4. Użyj oczyszczonych produktów PCR R5 / R6, R7 / R8 i Bridge 6-7 jako mieszanych matryc oraz R5-F i R8-R jako starterów, aby uzyskać nakładający się produkt PCR R5-8 (Rysunek 1B). Ustaw program PCR w następujący sposób: 5 min w temperaturze 95 °C; 28 cykli po 30 s w temperaturze 95 °C, 30 s w temperaturze 55 °C i 30 s w temperaturze 72 °C; i 5 min w temperaturze 72 °C. Żel oczyszczający R1-4 i R5-8.
  5. Runda 3: Wygeneruj sekwencje kodowania dla R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 bez czapek).
    1. W trzeciej rundzie PCR, używając oczyszczonych R1-4, R5-8 i Bridge 4/5 jako mieszanych matryc oraz R1-F i R8-R jako starterów, ustaw reakcję PCR zgodnie z opisem w kroku 1.3, aby uzyskać nakładający się produkt PCR R1-8 bez nasadek.
    2. Ustaw program PCR w następujący sposób: 5 minut w 95 °C; 28 cykli po 30 s w 95 °C, 30 s w 55 °C i 55 s w 72 °C; i 5 minut w 72 °C. Oczyść R1-8 żelem bez nakrętek.
  6. Runda 4: Wygeneruj sekwencje kodowania dla kompletnych domen PUF.
    1. W ostatniej rundzie PCR, używając oczyszczonego R1-8 bez czapek i kapeczek z końcami 5' i 3' jako mieszanych matryc oraz Cap-F i Cap-R jako starterów, ustaw reakcję PCR zgodnie z opisem w kroku 1.3, aby uzyskać końcowe zmutowane domeny PUF.
    2. Ustaw program PCR w następujący sposób: 5 minut w 95 °C; 28 cykli po 30 s w 95 °C, 30 s w 55 °C i 1 minuta w 72 °C i 5 minut w 72 °C.
    3. Żelowe oczyszczanie produktów PCR z końcowych przeprogramowanych domen PUF. Wykorzystaj te produkty do budowy plazmidu ekspresyjnego ESF w kolejnych krokach. Sekwencjonuj końcową konstrukcję, aby zweryfikować przeprogramowane sekwencje domen PUF.
      UWAGA: Cap-F koduje NLS (PPKKKRKV) między miejscami BamHI i XbaI, a Cap-R koduje kodon stop i miejsce SalI (miejsca restrykcyjne zostały zaprojektowane do konstruowania wektorów ekspresyjnych ESF, Rysunek 1C).

2. Budowa funkcjonalnego modułu ESF

  1. Do klonowania funkcjonalnych modułów ESF (domen RS lub domen bogatych w Gly) powszechnie stosuje się dwie strategie: amplifikację tych domen metodą PCR przy użyciu całkowitego ludzkiego cDNA jako matrycy (krok 2.2) lub bezpośrednią syntezę fragmentów DNA, które kodują różne domeny bogate w RS lub Gly (krok 2.3).
  2. Użyj PCR do sklonowania domen RS z reszt 123 - 238 9G8 (NP001026854), reszty 180-272 SRP40 (NP008856) lub reszt 117 - 221 SC35 (NP003007). Klonować domeny bogate w Gly z reszt 195 - 320 hnRNP A1 (NP_002127), reszty 203 - 353 hnRNP A2 (NP112533) lub reszty 211 - 378 hnRNP A3 (NP919223).
    1. Użyj narzędzia NCBI primer design tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) lub Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), aby zaprojektować startery do klonowania domen RS lub domen bogatych w Gly (moduł funkcjonalny ESF).
      UWAGA: Starter do przodu zawiera N-końcowy znacznik FLAG po miejscu NheI. Odwrotny starter zawiera miejsce BamHI do klonowania do wektorów wyrażeń (Rysunek 1C).
    2. Ustaw standardową reakcję PCR, jak opisano w kroku 1.3, aby amplifikować domeny bogate w RS lub Gly. Ustaw program PCR w następujący sposób: 5 min w temperaturze 95 °C; 28 cykli po 30 s w temperaturze 95 °C, 30 s w temperaturze 55 °C i 30 s w temperaturze 72 °C; i 5 min w temperaturze 72 °C.
  3. Klonuj domeny RS lub domeny bogate w Gly poprzez bezpośrednią syntezę DNA. Zamiast generować produkty PCR, które kodują domeny efektorowe w kroku 2.2, zsyntetyzuj oligonukleotyd, który koduje domenę RS o krótkich fragmentach (RSRSRSRSRSRS) lub domenę bogatą w Gly (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) przy użyciu komercyjnego źródła oligonukleotydów DNA.

3. Budowa plazmidów ekspresyjnych ESF

  1. Skonstruuj plazmidy ekspresji ESF przy użyciu dowolnego wektora ekspresji.
    UWAGA: Pierwotnie użyto konstruktu wyrażenia pGL-Gly-MS2 (prezent od dr R. Breathnach z Institute de Biologie-CHR11), który koduje od N- do C-końca, epitop FLAG, bogatą w Gly domenę hnRNP A1 i białko płaszcza MS2. W związku z tym ta konstrukcja wyrażenia jest używana jako przykład w poniższym kroku.
    UWAGA: Można również użyć innych wektorów wyrażeń z wieloma miejscami klonowania, a standardowe kroki klonowania zostaną zastosowane w celu połączenia fragmentów ze sobą.
  2. Trawić 1,5 μg plazmidów ekspresyjnych (pGL-Gly-MS2) wymienionych w kroku 3.1 w celu usunięcia fragmentu białka płaszcza MS2. Stosować endonukleazy restrykcyjne BamHI i SalI przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przetrawić moduł rozpoznawania ESF (kodujących NLS i przeprogramowane domeny PUF, wygenerowane w kroku 1.5) z BamHI i SalI w tym samym stanie.
  3. Dodaj 5x barwnik ładujący do reakcji trawienia restrykcyjnego i powoli elektroforezuj całkowitą objętość 1,5% żelem agarozowym zawierającym barwnik żelowy DNA przez 40 minut przy 120 V. Oczyszczaj żelem strawione produkty.
  4. Przygotować 10 μl reakcji ligacji z oczyszczonym modułem rozpoznającym insercji ESF i wektora ekspresyjnego DNA w stosunku 3:1, 1 μl ligazy DNA i 1 μl 10-krotnego buforu ligacyjnego. Reakcje ligacji inkubować przez noc w temperaturze 4 °C; otrzymany konstrukt wyraża ESF typu Gly-PUF (pGL-Gly-PUF) pod kontrolą promotora CMV (Rysunek 1C).
  5. Usunąć fragment kodujący domenę FLAG/bogatą w Gly z mineralizacją NheI i BamHI przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zastąp go fragmentem kodującym domenę RS (wygenerowanym w kroku 2.2, również trawionym przez NheI i BamHI); otrzymany konstrukt wyraża ESF typu RS-PUF ( Rysunek 1C).

4. Budowa Reportera Łączenia

Przewodów
  1. Zsyntetyzować oligonukleotydy zawierające sekwencje kandydujące (tj. sekwencje docelowe domen PUF) otoczone miejscami XhoI i ApaI lub miejscami XhoI i EcoRI. Wyżarzać oligonukleotydy przez 5 minut w temperaturze 55 °C w celu uzyskania dwuniciowych wstawek zawierających miejsca rozpoznawania domen PUF otoczonych spoistymi końcami miejsc XhoI i ApaI lub XhoI i EcoRI.
  2. Zacznij od wcześniej opisanego modułowego splicingu reporter22, pGZ3, który zawiera dwa eksony GFP oddzielone eksonem testowym (ekson 12 IGF2BP1 ludzkiego, Ensembl ID ENSG00000159217) i jego flankujące introny.
    UWAGA: Ekson testowy został zaprojektowany z miejscami XhoI i ApaI, które można wykorzystać do wstawiania zsyntetyzowanych oligonukleotydów zawierających sekwencje kandydujące (sekwencje docelowe domen PUF). Ten modułowy reporter splicingowy (pGZ3) jest dostarczany przez repozytorium plazmidu Add-gene.
  3. Trawić zasadowy reporter pGZ3 (przygotowany w kroku 4.2) za pomocą endonukleaz restrykcyjnych XhoI i ApaI przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  4. Żelowo oczyścić strawione produkty zgodnie z opisem w kroku 3.3.
  5. Przygotować 10 μl reakcji ligacji z dwuniciowymi wstawkami wygenerowanymi w kroku 4.1 i strawionym wektorem pGZ3 wygenerowanym w kroku 4.4 w stosunku molowym 3:1, 1 μl ligazy DNA i 1 μl 10-krotnego buforu ligacyjnego. Inkubować reakcje ligacji przez noc w temperaturze 4 °C w celu uzyskania wektora reporterowego pGZ3 do konstruowania splicingu.
  6. Wstaw dwuniciowe wstawki wygenerowane w kroku 4.1 do poprzednio opublikowanych reporterów, pEZ-1B (przy użyciu witryn XhoI i EcoRI) i pEZ-2F (przy użyciu witryn XhoI i ApaI)23, aby uzyskać konkurujący reporter 5' ss i konkurencyjny reporter 3' ss, zgodnie z opisem w krokach 4.3-4.5.
    UWAGA: Oba typy reporterów do łączenia będą dostępne za pośrednictwem Add-gene.

5. Budowa wektorów ekspresji lentiwirusowej dla ESF

  1. Ustawić standardową reakcję PCR zgodnie z opisem w kroku 1.3 w celu amplifikacji ESF o pełnej długości z oryginalnych wektorów ekspresyjnych (pGL-Gly-PUF lub pGL-RS-PUF) za pomocą starterów zawierających miejsca MluI/SpeI. Ustaw program PCR w następujący sposób: 5 min w temperaturze 95 °C; 28 cykli po 30 s w temperaturze 95 °C, 30 s w temperaturze 55 °C i 1,5 minuty w temperaturze 72 °C; i 5 min w temperaturze 72 °C.
  2. Poprzez reakcję trawienia, oczyszczanie żelu i reakcję ligacji, zintegruj ESF z wektorem ekspresyjnym lentiwirusa, pWPXLd, między miejscami MluI/SpeI, jak opisano w krokach 3.2-3.4.
  3. Użyj standardowej metody wytrącania fosforanu wapnia, jak wcześniej opisano24, aby wygenerować lentiwirusy poprzez kotransfekcję komórek HEK293T poprzez pakowanie wektorów, psPAX2 i pMD2.G, z pWPXLd-Gly-PUF(Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF(wt) (jako kontrola swoistości) lub pWPXLd-GFP (makieta).
    1. Wysiewaj 5x106 HEK293T komórek na 10 cm szalkach i hoduj komórki przez noc w 10 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) na miskę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Wykonaj transfekcję, gdy komórki zlewają się w 70 - 90%.
    2. Przygotować mieszaninę plazmidów, dodając trzy plazmidy (7,5 μg wektora opakowania, psPAX2; 2,5 μg pMD2.G; i 10 μg pWPXLd-Gly-PUF(Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF(wt) lub pWPXLd-GFP) do probówki o pojemności 2 ml.
    3. Dodać 560 μl 0,25 M CaCl2 i 560 μl 2x roztworu BBS do probówki 2 ml. Delikatnie wymieszać kilka razy i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby przygotować mieszaninę transfekcji.
    4. Dodaj wszystkie mieszanki transfekcji do 10-centymetrowych szalek. Delikatnie zamieszać naczynia i inkubować je przez noc w temperaturze 3% CO2 i temperaturze 37 °C.
    5. Usunąć pożywkę, dodać 10 ml świeżego DMEM z 2% FBS do każdej potrawy i inkubować je w temperaturze 10% CO2 i 37 °C O/N.
    6. Zbierz pierwszy supernatant z szalek. Dodaj 10 ml świeżego DMEM z 2% FBS do każdego dania. Inkubować szalki O/N w temperaturze 10% CO2 i temperaturze 37 °C. Przechowywać supernatant w temperaturze 4 °C.
    7. Zbierz drugi supernatant z szalek. Połącz supernatant z pierwszego i drugiego zbioru. Oczyść supernatant z resztek komórkowych, filtrując go przez filtr 0,4 μm. Oczyszczony supernatant należy stosować bezpośrednio lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Określ miano lentiwirusa, infekując HEK293T komórki seryjnymi rozcieńczeniami preparatu wirusa, jak wcześniej zgłoszono25.

6. W szczególności modulowanie inkluzji eksonów i alternatywne wykorzystanie miejsc łączenia za pomocą ESF

  1. Zasiej 2 x105 HEK293T komórek do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Hoduj komórki przez noc w 500 μl DMEM uzupełnionym 10% FBS w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Wymieszaj odczynnik do transfekcji liposomalnej, delikatnie odwracając butelki przed użyciem. Rozcieńczyć 2 μl odczynnika do transfekcji liposomalnej w 50 μl zredukowanej pożywki surowicy. Delikatnie wymieszaj i inkubuj je przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Rozcieńczyć 0,04 μg wektorów ekspresyjnych pGL-Gly-PUF i 0,2 μg plazmidów reporterowych pGZ3 w 50 μl zredukowanej pożywki surowicy w sterylnej probówce. Rozcieńczyć 0,4 μg wektorów ekspresyjnych pGL-RS-PUF i 0,2 μg plazmidów reporterowych pGZ3 w 50 μl zredukowanej pożywki surowicy w sterylnej probówce. Rozcieńczyć 0,4 μg wektorów ekspresyjnych pGL-RS-PUF i 0,2 μg plazmidów reporterowych pEZ-1B lub pEZ-2F w 50 μl zredukowanej pożywki surowicy w sterylnej probówce.
  4. Po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej delikatnie wymieszać rozcieńczony odczynnik do transfekcji liposomalnej przygotowany w kroku 6.2 z rozcieńczonymi plazmidami przygotowanymi w kroku 6.3. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dodać całe mieszaniny transfekcji zawierające wektory ekspresji i odczynnik do transfekcji przygotowany w kroku 6.4 do każdej studzienki i inkubować przez co najmniej 12 godzin w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  6. Po 12 godzinach spędzonych w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 należy wyrzucić pożywkę z każdej studzienki i przemyć ją 500 μl buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej (PBS)/studzienkę.
  7. Wyrzuć PBS i dodaj 200 μl trypsyny do każdej studzienki. Inkubować płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 minut. Dodać 1 ml pożywki, aby zatrzymać trawienie i przenieść komórki do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml.
  8. Odwirować probówki przez 3 minuty przy 5 000 x g i wyrzucić pożywkę. Dodaj 0,5 ml buforu do ekstrakcji RNA na probówkę, aby lizować komórki przez powtarzalne pipetowanie. Inkubować homogenizowane próbki przez 5 minut.
  9. Do każdej próbki poddanej działaniu buforu do ekstrakcji RNA dodać 0,1 ml chloroformu na 0,5 ml buforu do ekstrakcji RNA. Odwróć probówki przez 15 s i inkubuj je przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  10. Odwirować probówki przez 15 minut w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C. Przenieść fazę wodną do świeżej probówki. Dodać 0,25 ml izopropanolu na 0,5 ml buforu ekstrakcyjnego RNA użytego do wstępnej homogenizacji.
  11. Wymieszać przez wirowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odwirować probówki o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu osad RNA jest zwykle widoczny na dnie probówki.
  12. Odrzucić supernatant i przemyć osad RNA 0,5 ml 75% etanolu na 0,5 ml buforu do ekstrakcji RNA.
  13. Energicznie wirować i odwirowywać przy 7 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i wysuszyć osad RNA. Rozpuść RNA w 50 μl wody wolnej od RNaz.
  14. Dodaj 2 μl 5U/μL DNazy I, 7 μl 10x buforu i 11 μlH2Odo każdego 50-μl roztworu RNA. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Podgrzewać je w temperaturze 70 °C przez 15 minut, aby dezaktywować DNazę.
  15. Do każdej próbki dodaj następujące składniki do probówki bez nukleazy o pojemności 0,2 ml: 1 μl 50 μM oligo dT, 5 μl 400 ng/μL RNA (2 μg), 1 μl 10 mM dNTP i 3 μLH2O. Wykonaj odwrotny PCR.
    1. Podgrzewać mieszaninę do temperatury 65 °C przez 5 minut i inkubować ją na lodzie przez co najmniej 2 minuty, aby zapobiec odtworzeniu się struktury drugorzędowej. Do tej samej probówki dodać następujące składniki: 4 μl 5x buforu pierwszej nici, 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl 200 U/μL odwrotnej transkryptazy i 4 μLH2O. Wymieszać delikatnie pipetując w górę i w dół i inkubować w temperaturze 50 °C przez 60 min. Zatrzymać reakcję, ogrzewając ją w temperaturze 70 °C przez 15 minut.
  16. Dla każdej próbki dodać następujące składniki do probówki PCR w celu zakończenia znakowanego ciałem PCR: 2,5 μl 10x buforu PCR, 0,5 μl 10 mM mieszanki dNTP, 1 μL 10 μM startera do przodu, 1 μL 10 μM startera odwrotnego, 0,25 μL 5 U/μL polimerazy DNA Taq, 0,5 μl 25 nM Cy5-dCTP i 2 μl cDNA przygotowanego w kroku 6.15.
    1. Podgrzać reakcję do 94 °C przez 2 minuty w celu denaturacji cząsteczek, wykonać 25 cykli PCR (94 °C przez 30 s, 60 °C 30 s i 72 °C 30 s), utrzymać reakcję w temperaturze 72 °C przez 7 minut, a następnie pozostawić ją w 4 °C w celu utrzymania 4 °C.
  17. Rozpuścić produkty PCR przez elektroforezę za pomocą 10% żelu poliakryloamidowego z 1x zasadą Tris, kwasem borowym i buforem EDTA (TBE). Wykonaj skan za pomocą skanera fluorescencyjnego. Zmierz ilość każdej izoformy splicingu za pomocą oprogramowania do densytometrii.

7. Użyj ESF do modulacji endogennego splicingu Bcl-x i zmierz jego wpływ na apoptozę

  1. Płytka 2 x 105 komórek HeLa do każdej studzienki płytki 24-dołkowej. Hoduj komórki przez noc w 500 μl DMEM uzupełnionym 10% FBS w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Po 12 godzinach transfekować komórki 2 μg pGL-Gly-PUF (WT) lub 0,2 μg, 1 μg i 2 μg pGL-Gly-PUF (531) (przeprogramowana domena PUF, która rozpoznaje Bcl-x pre-mRNA o wysokim powinowactwie, patrz Rysunek 2A).
  3. 24 godziny później zbierz komórki. 1/3 komórek jest przeznaczona do izolacji RNA i analizy PCR (kroki 6.8 - 6.17), a 2/3 do izolacji białka.
  4. W przypadku analizy Western blot zagotuj wszystkie granulki komórek w buforze ładującym 2X Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) przez 10 minut, a następnie rozpuść białka w 12% żelu SDS-PAGE. Przenieś białka na membranę nitrocelulozową.
  5. Zablokować błonę 5% mlekiem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i inkubować błonę O/N z pierwszorzędowymi przeciwciałami kaspazy-3 (1:1 000), PARP (1:1 000) lub beta-aktyny (1:5 000) (rozcieńczonymi w 5% mleku) w temperaturze 4 °C.
  6. Przemyć membranę PBS zawierającym 0,1% Tween 20 (PBS-T) przez 5 minut w temperaturze 3x RT na wstrząsającym shakerze. Inkubować błonę z przeciwciałami związanymi z HRP (1:5 000, rozcieńczone w 5% mleku) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Umyj membranę PBS-T 3x w temperaturze pokojowej, a następnie wywołaj membranę za pomocą odczynników do wykrywania ECL Western blotting.
  8. Dodać 250 μl poli-L-lizyny (PLL) na szkiełka nakrywkowe, inkubować je przez 15 minut w temperaturze pokojowej i odsysać płyn. Szkiełka nakrywkowe ze szkła pokrytego PLL myć PBS 3x przez 5 minut każde. W teście immunofluorescencyjnym mierzącym apoptozę, należy zasiać 5 x 105 komórek HeLa na szkiełkach nakrywkowych pokrytych polilizyną na płytce 6-dołkowej. Transfekcję plazmidów pGL-Gly-PUF(WT) lub pGL-Gly-PUF(531) do komórek HeLa za pomocą odczynnika do transfekcji liposomalnej (patrz kroki 6.1 - 6.5).
  9. 24 godziny po transfekcji utrwalić komórki na szkiełkach nakrywkowych za pomocą 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS przez 20 minut w temperaturze RT. UWAGA: PFA jest toksyczny; należy obchodzić się z nim ostrożnie w dygestorium.
  10. Delikatnie umyj komórki na szkiełkach nakrywkowych, dodając 2 ml 1x PBS. Inkubuj je przez 5 minut. Wyjmij PBS za pomocą pipet. Powtórz pranie 3x.
  11. Przesiąknij komórki 0,2% Triton X-100 w 1x PBS przez 10 min, a następnie umyj je 3x 1x PBS.
  12. Zablokuj komórki 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w 1x PBS przez 10 minut i umyj je 3x 1x PBS.
  13. Rozcieńczyć przeciwciało FLAG w stosunku 1:1000 w 3% BSA/PBS i odpipetować 30 μl rozcieńczonego przeciwciała FLAG na arkusz parafilmu.
  14. Wyjmij szkiełko nakrywkowe z komórkami, ostrożnie osusz nadmiar buforu chusteczkami laboratoryjnymi i połóż go do góry nogami (komórką do dołu) na 30 μl roztworu anty-FLAG. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  15. Dodaj około 500 μl 1x PBS na bok szkiełka nakrywkowego inkubowanego z przeciwciałem pierwszorzędowym, aż szkiełko nakrywkowe unosi się na wierzchu roztworu. Włóż go z powrotem do płytki 6-dołkowej z 1x PBS w studzienkach.
  16. Umyj go 3x z 1x PBS przez 5 min każdy.
  17. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszom (1:500) w 3% BSA/PBS; ponownie użyć 30 μl na każde szkiełko nakrywkowe. Umieścić szkiełko nakrywkowe do góry nogami na roztworze przeciwciał drugorzędowych i inkubować je przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  18. Usunąć szkiełko nakrywkowe z parafilmu, jak opisano w kroku 7.15. Włóż go z powrotem do płytki 6-dołkowej i umyj 1x PBS 3x przez 5 minut każdy.
  19. Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą medium montażowego (za pomocą DAPI), usuń nadmiar podłoża i uszczelnij krawędź lakierem do paznokci.
  20. Wizualizuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (przy 100-krotnym powiększeniu) i fotografuj je za pomocą aparatu cyfrowego.
    UWAGA: Ekspresja ESF jest wizualizowana przez znakowane fluorescencyjnie przeciwciało wtórne przeciwko znacznikowi FLAG, a fragmentacja jądra jest wizualizowana za pomocą barwienia DAPI.

8. Pomiar apoptozy różnych komórek nowotworowych wykazujących ekspresję ESF

  1. Podziel 2 x 106 komórek HeLa, komórek MDA-MB-231 i komórek A549 na 60-milimetrowe szalki z 4 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu wykrycia apoptozy za pomocą barwienia jodkiem propidyny (PI).
  2. 24 godziny później odśwież pożywkę i przygotuj lentiwirusa, jak wcześniej zgłoszono24.
  3. Rozcieńczyć 10 x 106 lentiwirusa pWPXld-Gly-PUF(WT), pWPXld-Gly-PUF(531) lub pWPXld-GFP w 4 ml świeżej pożywki, aby stosunek wirusa do liczby komórek był równy 5.
  4. Zmienić pożywkę w płytkach na 4 ml pożywki zawierającej wirusa, przygotowanej w kroku 8.3 i inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . 12 godzin po zakażeniu zmienić pożywkę.
  5. Po 24 godzinach od zakażenia zebrać i barwić komórki przez 5 minut w roztworze PBS zawierającym końcowe stężenie 2 μg/ml PI.
  6. Przeanalizuj komórki wybarwione PI za pomocą cytometru przepływowego, jak opisano wcześniej16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport opisuje kompletny protokół projektowania i budowy ESF oraz raportów do łączenia. Przedstawiono w nim również dalsze zastosowanie ESF w manipulowaniu AS genów endogennych16. Aby zilustrować typowe wyniki zmian splicingu za pośrednictwem ESF, jako przykładu posłużymy się danymi z naszej poprzedniej pracy. ESF z różnymi domenami funkcjonalnymi mogą być używane do promowania lub hamowania inkluzji docelowego eksonu kasetowego (Rysunek 1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy raport zawiera szczegółowy opis projektowania i budowy sztucznych czynników splicingowych, które mogą specyficznie manipulować alternatywnym splicing docelowego genu. Metoda ta wykorzystuje unikalny tryb wiązania RNA powtórzeń PUF w celu wytworzenia rusztowania wiążącego RNA o niestandardowej specyficzności. Może być używany do aktywacji lub ponownego słączenia.

Krytycznym krokiem w tym protokole jest wygenerowanie przeprogramowanej domeny PUF, która definiuje specyfikę ESF. Protokół...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant NIH R01-CA158283 i grant NSFC 31400726 dla Z.W. Y.W. jest finansowany przez Young Thousand Talents Program i National Natural Science Foundation of China (granty 31471235 i 81422038). X.Y. jest finansowany przez podoktorancką fundację naukową Chin (2015M571612).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Polimeraza DNA o wysokiej wierności (Phusion High-Fidelity) z buforem PCRLigaza DNA New England BiolabsM0530L
(ligaza DNA T4)England BiolabsM0202L
(Lipofectamine 2000)Invitrogen11668-019
Zredukowana pożywka surowicy (Opti-MEM)Gibco31985-062
RNA bufor ekstrakcyjny (odczynnik TRIzol)ambion15596018odczynnik TRIzol zawiera fenol, który może powodować oparzenia. Nosić rękawice podczas obchodzenia się
z PBS (1x)Life Technologies10010-031
SuperScript III Odwrotna transkryptaza (RT)Invitrogen18080044
Przeciwciało kaspazy-3Technologia sygnalizacji komórkowej9668
Przeciwciało PARPTechnologia sygnalizacji komórkowej9542
Przeciwciało Bcl-xBD Bioscience610211
przeciwciało beta-aktynySigma-AldrichA5441
przeciwciało alfa-tubulinySigma-AldrichT5168
Przeciwciało FLAGSigma-AldrichF4042
Membrana nitrocelulozowaAmersham-PharmaciaRPN203D
ECL Odczynniki do wykrywania Western BlottingInvitrogenWP20005
Cy5-dCTPGE HealthcarePA55021
Aktywowany fluorescencyjnie sortownik komórek (FACS)BD BioscienceFACSCalibur 
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)GE HealthcareSH30243.01
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Invitrogen26140079
Jodek propidyny (PI)SigmaP4170
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA7638-5G
Triton-X100PromegaH5142
Poli-L-lizyna SigmaP-4832Filtruj-sterylizuj i przechowuj w temperaturze 4 stopni; C
Vector pWPXLdAddgene12258
Vector pMD2.GAddgene12259
Vector psPAX2Addgene12260
DNaza I (bez RNaz)New England BiolabsM0303S
Oligo(dT)18 PrimerThermo ScientificSO131 
Przeciwciało wtórne przeciwko mysom (przeciwciało anty-mysie IgG, przeciwciało sprzężone z HRP)Technologia sygnalizacji komórkowej7076S
Odczynnik do transfekcji liposomalnej New

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).
  3. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14 (5), 802-813 (2008).
  4. Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).
  5. Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).
  6. Wang, G. -S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).
  7. Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352 (6285), 600-604 (2016).
  8. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).
  9. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).
  10. Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).
  11. Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).
  12. Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).
  13. Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).
  14. Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).
  15. Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).
  16. Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).
  17. Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147(2012).
  18. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).
  19. McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).
  20. Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).
  21. Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
  22. Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).
  23. Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).
  24. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031(2012).
  25. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
  26. Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).
  27. Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).
  28. He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4 (3), 4732(2009).
  29. Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).
  30. Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7 (8), 1002218(2011).
  31. David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).
  32. Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
  33. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).
  34. Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Engineered Splicing FactorsPUF Domain ScaffoldRNA Binding ProteinsSplicing Reporter AssaysHEK 293T TransfectionRT PCR AnalysisImmunofluorescence MicroscopyRNA Extraction ProtocolGlycine Rich Domain

Powiązane artykuły