Artykuł metodologiczny

Peptydowa metoda transportu genów i białek przez bariery komórkowe i organellarne w roślinach

13.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54972

⸱

16 grudnia 2016

 ,  , 
1Enzyme Research Team, RIKEN Center for Sustainable Resource Science

W tym artykule

Podsumowanie

Istniejące metody modyfikacji roślin mają ograniczone zastosowanie. Zaproponowana tu nowatorska technologia oparta na peptydach obiecuje zarówno prostotę, jak i skuteczność we wprowadzaniu egzogennych białek lub genów do pożądanych przedziałów wewnątrzkomórkowych nienaruszonych roślin.

Streszczenie

Zdolność do wprowadzania białek egzogennych i ekspresji (lub obniżania) specyficznych genów w roślinach stanowi potężne narzędzie do badań podstawowych, jak również nowych zastosowań w dziedzinie biotechnologii roślin. Realne metody, które obecnie istnieją do transferu białek lub genów do komórek roślinnych, a mianowicie Agrobacterium i bombardowanie mikropociskami, mają wady w postaci niskiej częstotliwości transformacji, ograniczonego zasięgu gospodarza lub wysokich kosztów sprzętu i mikronośników. Poniższy protokół przedstawia prostą i wszechstronną metodę, która wykorzystuje racjonalnie zaprojektowane peptydy jako środki dostarczające do roślin różne ładunki na bazie kwasów nukleinowych i białek. Peptydy są wybierane jako narzędzia do rozwoju systemu ze względu na ich biodegradowalność, zmniejszone rozmiary, zróżnicowane i regulowane właściwości, a także zdolność do uzyskania dostępu wewnątrzkomórkowego/organellarnego. Opisano przygotowanie, charakterystykę i zastosowanie zoptymalizowanych formulacji dla każdego rodzaju szerokiej gamy dostarczanych ładunków (plazmidowe DNA, dwuniciowe DNA lub RNA oraz białko). Omówiono również krytyczne etapy w ramach protokołu, możliwe modyfikacje i istniejące ograniczenia metody.

Wprowadzenie

Inżynieria genetyczna roślin jest tradycyjnie używana do przenoszenia korzystnych cech na rośliny. W ostatnich latach technologia ta została zastosowana do przekształcania roślin w biofabryki do produkcji ważnych farmaceutycznie i cennych komercyjnie białek, z których wiele nie może być syntetyzowanych chemicznie, a produkcja przy użyciu systemów zwierzęcych lub mikrobiologicznychjest bardzo kosztowna1. Poprzez wprowadzenie nowych genów, można manipulować własnym metabolizmem rośliny w celu produkcji różnych biofarmaceutyków, takich jak przeciwciała, enzymy metaboliczne, hormony, antygeny lub szczepionka2.

Uznane technologie transferu genów dla roślin to dostarczanie za pośrednictwem Agrobacterium 3, bombardowanie mikropociskami pokrytymi DNA (biolistyka)4 i elektroporacja5 lub glikolem polietylenowym6 traktowanie protoplastów. Techniki wymagające protoplastów są na ogół unikane, ponieważ są czasochłonne, kłopotliwe i dają niespójne wyniki7. W rezultacie, praktycznie wszystkie prace związane z modyfikacją roślin wykorzystują obecnie Agrobacterium lub mikropociski do transferu genów. Metoda Agrobacterium jest szerzej stosowana, ale nie ma zastosowania do wielu gatunków roślin ważnych gospodarczo. Tymczasem bombardowanie mikropociskami jest bardziej wszechstronne ze względu na szeroką gamę podatnych roślin, ale wymaga specjalistycznego sprzętu i często powoduje poważne uszkodzenia tkanek. Co więcej, metody te obejmują albo losowy (biolistyka), albo złożony (Agrobacterium) mechanizm dostarczania i mają zmienne tempo przemian8. W związku z tym potrzebna jest nowatorska technologia przekształcania roślin, która jest prosta, ale skuteczna i ma zastosowanie do różnych typów roślin.

Obecnie, rośliny są poddawane modyfikacji genetycznej głównie poprzez dostarczanie egzogennego DNA kodującego pożądaną cechę, a nie przez bezpośrednie dostarczanie docelowego białka. Wyższa stabilność DNA w porównaniu z białkami jest główną zaletą; niemniej jednak potencjalne problemy związane z dostarczaniem DNA obejmują losowe wprowadzanie egzogennego DNA do genomu rośliny i niezamierzone przekazywanie genów oporności na antybiotyki bakteriom chorobotwórczym poprzez horyzontalny transfer genów9. Do celów edycji genomu, możliwość edycji genomów roślinnych bez wprowadzania obcego DNA do komórek może obejść obawy regulacyjne związane z roślinami modyfikowanymi genetycznie. W związku z tym alternatywna, wolna od DNA strategia modyfikacji roślin poprzez bezpośrednie dostarczanie białka będzie w stanie zaspokoić te potrzeby.

Tutaj wprowadzamy system oparty na peptydach, pierwotnie opracowany dla ludzkiej terapii genowej10-14, do celowego dostarczania egzogennych genów lub białek do nienaruszonych roślin. Peptydy są w stanie chronić DNA przed degradacją nukleazy i mogą pośredniczyć w transferze genów przez błony komórkowe i organellarne15-17. Mają również różnorodne i regulowane właściwości, oprócz tego, że są niecytotoksyczne18-20. Co ważniejsze, dzięki zastosowaniu peptydów, geny mogą być precyzyjnie ukierunkowane na organelle wewnątrzkomórkowe, takie jak mitochondria21 lub plastydy (chloroplasty)22 w celu ekspresji - zadanie nieosiągalne przez transformację biologiczną lub za pośrednictwem Agrobacterium. W zależności od rodzaju ładunku, ta nowa technologia modyfikacji roślin może być wykorzystana do dostarczania białek23 i ekspresji (plazmid21,24 lub dwuniciowe DNA25) lub regulacji w dół (dwuniciowy RNA26) określonych genów w roślinie, w całej jej przestrzeni cytozolowej24-26 lub w określonym przedziale organellarnym21. Zaprojektowane peptydy nośnikowe składają się z domeny kationowej w postaci polilizyny (K8) lub polilizyno-ko-histydyny (KH)9 do wiązania i/lub kondensacji ujemnie naładowanych ładunków, która jest sprzężona z sekwencjami penetrującymi komórkę (peptyd BP100) lub mitochondrialnymi (peptyd Cytcox).

Protokół

1. Przygotowanie preparatów na bazie peptydów

  1. Przygotować roztwory podstawowe każdego peptydu w następujący sposób: (KH)9-BP100 (1 mg/ml lub 800 nM), Cytcox-(KH)9 (1 mg/ml), BP100 (1 mg/ml) i (BP100)2K8 (70 μM). Zważyć wymaganą ilość każdego peptydu w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i dodać autoklawowaną ultraczystą wodę w celu rozpuszczenia peptydu. Dobrze wymieszać przez wielokrotne pipetowanie, aż do uzyskania klarownego roztworu.
  2. Amplifikacja i oczyszczanie plazmidowego DNA (pDNA), dwuniciowego DNA (dsDNA) i dwuniciowego RNA (dsRNA) zgodnie ze standardowymi metodologiami molekularnymi. W probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przygotować roztwory podstawowe o stężeniu 1 mg/ml (pDNA i dsDNA) lub 400 nM (dsRNA).
  3. Przygotować białkowy roztwór podstawowy o stężeniu 7 μM, rozpuszczając 1 mg białka (np. dehydrogenazy alkoholowej, ADH) w proszku w 1 ml roztworu węglanu sodu (0,1 M, pH 9). Oznacz białko za pomocą sond fluorescencyjnych, takich jak rodamina B (RhB), zgodnie ze standardowymi protokołami, aby umożliwić mikroskopową wizualizację białka dostarczanego do komórek.
  4. Połączyć odpowiednie składniki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    1. W przypadku preparatów peptyd-pDNA ukierunkowanych na cytoplazmę, dodaj 6,4 μl (KH)9-BP100 (1 mg / ml) do 20 μl pDNA (1 mg / ml) i dobrze wymieszaj przez pipetowanie. Pozostawić mieszaninę do ustabilizowania się przez 15 minut w temperaturze 25 °C. Dodać 773,6 μl autoklawowanej ultraczystej wody w celu rozcieńczenia roztworu do końcowej objętości 800 μl. Użyj konstruktu pDNA przeznaczonego do ekspresji jądrowej (P35S-RLuc-TNOS, Tabela 1).
    2. W przypadku preparatów peptyd-pDNA ukierunkowanych na mitochondria dodaj 6,6 μl Cytcox-(KH)9 (1 mg / ml) do 20 μl pDNA (1 mg / ml) i dobrze wymieszaj przez pipetowanie. Pozostawić mieszaninę do ustabilizowania się przez 15 minut w temperaturze 25 °C, a następnie dodać 2,4 μl BP100 (1 mg/ml). Pozostawić mieszaninę do ustabilizowania się przez 15 minut w temperaturze 25 °C przez kolejne 15 minut. Dodać 771 μl autoklawizowanej ultraczystej wody, aby rozcieńczyć roztwór do końcowej objętości 800 μl. Użyj konstruktu pDNA zaprojektowanego do ekspresji mitochondrialnej (pDONR-cox2:rluc, Tabela 1).
    3. W przypadku preparatów peptydowo-dsDNA dodać 5,1 μl (KH)9-BP100 (1 mg/ml) do 8 μl dsDNA (1 mg/ml) i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Pozostawić mieszaninę do ustabilizowania się przez 15 minut w temperaturze 25 °C. Dodać 786,9 μl autoklawowanej ultraczystej wody w celu rozcieńczenia roztworu do końcowej objętości 800 μl.
    4. W przypadku preparatów peptydowo-dsRNA dodać 50 μl (KH)9-BP100 (800 nM) do 50 μl dsRNA (400 nM) i dobrze wymieszać pipetując. Pozostawić mieszaninę do ustabilizowania się przez 15 minut w temperaturze 25 °C. Dodać 700 μl wody wolnej od RNaz, aby rozcieńczyć roztwór do końcowej objętości 800 μl.
    5. W przypadku preparatów peptydowo-białkowych dodać 16 μl (BP100)2K8 (70 μM) do 16 μl ADH (7 μM) i dobrze wymieszać pipetując. Pozostawić mieszaninę do ustabilizowania się przez 15 minut w temperaturze 25 °C. Dodać 768 μl autoklawizowanej ultraczystej wody w celu rozcieńczenia roztworu do końcowej objętości 800 μl.
  5. Pozostawić preparaty do ustabilizowania się przez 15 minut w temperaturze 25 °C.

2. Charakterystyka preparatów na bazie peptydów

  1. Przenieś każdy roztwór (800 μl) do kuwety w celu analizy dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Określić średnicę hydrodynamiczną i wskaźnik polidyspersyjności utworzonych kompleksów za pomocą nanosizera zeta, używając lasera He-Ne o długości fali 633 nm w temperaturze 25 °C z kątem wykrywania rozproszenia wstecznego 173°.
  2. Po pomiarach wielkości przenieść każdy roztwór (800 μl) do złożonej celi kapilarnej w celu pomiaru potencjału zeta przy domyślnych parametrach stałej dielektrycznej, indeksu załamania światła i lepkości wody w temperaturze 25 °C.
  3. Obserwować niewielką objętość złożonego roztworu, używanego do analizy DLS, za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). Umieść 10 μl złożonego roztworu na świeżo odsłoniętej, rozszczepionej powierzchni arkusza miki i pozostaw mikę do wyschnięcia na powietrzu na noc na przykrytej plastikowej szalce Petriego.
  4. Uzyskać obraz kompleksów w powietrzu o temperaturze 25 °C przy użyciu wspornika krzemowego o stałej sprężystości 1,3 N/m w trybie gwintowania27,28.

3. Infiltracja liści roślin

  1. Używaj 3-tygodniowych roślin uprawianych w glebie (Arabidopsis thaliana24, Nicotiana benthamiana24 lub topola26). Przetransfekować co najmniej 3 liście, aby służyły jako trzykrotne określenie ilościowe ekspresji genów lub dostarczania białka.
  2. Załadować plastikową strzykawkę bezigłową o pojemności 1 ml ze 100 μl złożonego roztworu do transfekcji jednego liścia. Umieścić końcówkę strzykawki na osiowej powierzchni liścia.
  3. Lekko przycisnąć końcówkę strzykawki do liścia i powoli wcisnąć tłok strzykawki, wywierając jednocześnie przeciwny nacisk palcem wskazującym dłoni w rękawiczce lateksowej z przeciwnej strony. Udaną infiltrację można zaobserwować jako rozprzestrzenianie się nasiąkniętego wodą obszaru w liściu. Oznacz przesączone liście, aby ułatwić identyfikację.
  4. Inkubować transfekowany liść przez optymalny czas po infiltracji preparatami peptydu-pDNA (12 godzin), peptydu-dsDNA (12 godzin), peptydu-dsRNA (9 - 48 godzin) i peptydu-białka (6 godzin) w następujących warunkach: 16 godzin światła/8 godzin ciemności w temperaturze 22 °C dla A. thaliana i topoli lub 24 godziny stałego światła w temperaturze 29 °C dla N. benthamiana.

4. Ocena efektywności transfekcji

  1. W przypadku większych roślin (np. N. benthamiana) należy wyciąć cały transfekowany liść (np. A. thaliana) lub 1cm2 fragment naciekanego obszaru
    2. .
  2. W przypadku eksperymentów transfekcyjnych z wykorzystaniem wektora reporterowego lucyferazy Renilla (Rluc) należy określić ilościowo skuteczność transfekcji za pomocą zestawu testowego Rluc.
    1. Umieść każdy wycięty liść lub część liścia w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Dodać 100 μl 1× buforu do lizy do testu Rluc na probówkę. W ten sam sposób przygotować lizaty z nietransfekowanych liści kontrolnych (trzykrotnie).
    2. Zmielić liść za pomocą tłuczka homogenizacyjnego i inkubować powstały lizat w temperaturze 25 °C przez 6 - 10 godzin.
    3. Odwirować lizat o stężeniu 12 470 × g w mikrowirówce przez 1 minutę. Przenieść 20 μl oczyszczonego lizatu do studzienki na 96-dołkowej mikropłytce, a pozostałą objętość wykorzystać do ilościowego określenia całkowitego stężenia białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA zgodnie z protokołem producenta.
    4. Dodać 100 μl 1× substratu do testu Rluc (rozcieńczonego przy użyciu buforu do testów Rluc) do studzienki i wymieszać powoli. Umieścić mikropłytkę w wielomodowym czytniku mikropłytek i rozpocząć pomiar.
    5. Odejmij luminescencję tła (średnią z nietransfekowanego potrójnego tlenku) od luminescencji każdej próbki doświadczalnej. Oblicz stosunek fotoluminescencji (względne jednostki światła, RLU) do ilości białka (mg).
  3. W przypadku eksperymentów transfekcyjnych z użyciem wektora reporterowego białka zielonej fluorescencji (GFP) lub białka znakowanego fluorescencyjnie (np. ADH-RhB), obserwuj fluorescencję za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego.
    1. Przytnij krawędzie całego liścia (aby pomóc w usuwaniu przestrzeni powietrznych), podczas gdy cięty liść może być używany bez zmian. Wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 10 ml i umieścić w strzykawce każdy wycięty liść lub część liścia.
    2. Wymienić tłok i delikatnie docisnąć go do dna strzykawki, nie zgniatając listka. Wlać wodę do strzykawki do momentu, aż będzie wypełniona mniej więcej do połowy.
    3. Skierować strzykawkę do góry i wcisnąć tłok, aby usunąć powietrze ze strzykawki przez końcówkę. Przykryć końcówkę strzykawki i powoli pociągnąć tłok w dół, aby usunąć powietrze z liścia. Powtórz ten proces kilka razy, aż liść stanie się przezroczysty.
    4. Przykryj powierzchnię szkiełka mikroskopowego taśmą klejącą. Wytnij kwadratowy obszar na taśmie wystarczająco duży, aby pomieścić próbkę liścia za pomocą ostrza, a następnie oderwij kwadratowy kawałek taśmy kleszczami, aby utworzyć komorę na próbkę. Taśma posłuży jako przekładka między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym.
    5. Umieść liść w komorze z powierzchnią osiową skierowaną do góry i napełnij pozostałą powierzchnię komory wodą. Uszczelnij liść w komorze szklanym szkiełkiem nakrywkowym i zabezpiecz krawędzie szkiełka nakrywkowego taśmą klejącą.
    6. Zbadaj próbkę liści za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego pod obiektywem 40X lub obiektywem 63X zanurzonym w wodzie. Fluorescencję GFP lub RhB można wizualizować przy długościach fal wzbudzenia odpowiednio 488 nm lub 555 nm.

Wyniki

Zestaw ładunków kwasów nukleinowych i białek został pomyślnie wprowadzony do różnych roślin przy użyciu zaprojektowanych peptydów jako wektorów dostarczających. Oddziaływania elektrostatyczne między kationowymi peptydami a ujemnie naładowanymi ładunkami doprowadziły do powstania kompleksów transfekcyjnych, które można bezpośrednio infiltrować do liści roślin za pomocą strzykawki bezigłowej (Rysunek 1). Zoptymalizowane formulacje (wyznaczone empirycznie w niniejszych badaniach21,23-26) do transfekcji komórek roślinnych wymieniono w Tabeli 1, gdzie reprezentowany jest każdy typ z szerokiego zakresu dostarczanych ładunków (pDNA, dsDNA, dsRNA i białko). Średnice wszystkich formulacji opartych na peptydach mieściły się w przybliżonym zakresie 150 - 300 nm. Na podstawie analizy DLS wszystkie formulacje wykazały stosunkowo niską polidyspersyjność wielkości, co wskazuje, że utworzone agregaty peptyd-ładunek mają jednorodny rozkład wielkości. Morfologia kompleksów peptydu z pDNA (Rysunek 2A) lub białkiem (Rysunek 2B) na miki została zobrazowana za pomocą AFM. W obu przypadkach, dla kombinacji peptyd-pDNA i peptyd-białko, zaobserwowano jednorodne kompleksy globularne, co jest zgodne z danymi z pomiarów DLS. Pod względem potencjału zeta kompleksów (Tabela 1), kompleksy pochodne od pDNA i dsDNA miały wypadkowy ujemny ładunek powierzchniowy, podczas gdy kompleksy oparte na dsRNA miały ładunek powierzchniowy bliski neutralnemu. Z kolei kompleksy peptyd-białko były naładowane dodatnio.

Wydajność formulacji peptyd-pDNA oraz peptyd-dsDNA w pośredniczeniu w transfekcji A. thaliana lub N. benthamiana jako modelowych systemów roślinnych została oceniona ilościowo oraz jakościowo. Do kwantyfikacji poziomów ekspresji genów zastosowano test ekspresji genu RLuc (Tabela 1), w związku z czym w tym eksperymencie do kompleksowania z odpowiednimi peptydami nośnikowymi należało użyć pDNA lub dsDNA kodującego gen RLuc. Stosując formulację (KH)9-BP100/pDNA, po 12-godzinnym okresie inkubacji można osiągnąć dostarczanie i ekspresję pDNA ukierunkowaną na jądro komórkowe, z szacowaną wartością RLU/mg wynoszącą około 1 × 105. Do dostarczania i ekspresji pDNA ukierunkowanej na mitochondria wymagana jest kombinacja peptydów Cytcox-(KH)9 oraz BP100 w celu utworzenia kompleksu. Przy tym samym zoptymalizowanym czasie inkubacji wynoszącym 12 hr uzyskano jednak znacznie niższy poziom transfekcji (około 1 × 103 RLU/mg). Jednocześnie podobny okres inkubacji (12 hr) i poziom ekspresji genów (około 1 × 103 RLU/mg) odnotowano w przypadku kompleksów opartych na dsDNA, również sformułowanych z użyciem peptydu (KH)9-BP100. Jakościowe oceny ekspresji genów przeprowadzono poprzez bezpośrednią obserwację mikroskopową liści traktowanych kompleksami przygotowanymi z pDNA lub dsDNA kodującym gen reporterowy GFP. W komórkach transfekowanych nieukierunkowanymi kompleksami peptyd-pDNA wyraźnie zaobserwowano rozproszoną zieloną fluorescencję odpowiadającą ekspresji GFP, która lokalizowała się w cytosolu (Rysunek 3A). Wyraźne różnice w wzorcu lokalizacji fluorescencji GFP były widoczne w komórkach infiltrowanych kompleksami peptyd-pDNA ukierunkowanymi na mitochondria. W tym przypadku widoczna była punktowa zielona fluorescencja kolokalizująca się z barwieniem mitochondrialnym, co potwierdziło specyficzność ekspresji genów wyłącznie w przedziale mitochondrialnym komórek (Rysunek 3B).

W przypadku formulacji peptydowo-białkowych, koniugacja białka transportowanego (ADH) z fluorophorem (RhB) umożliwi wizualizację dostarczonego białka w przedziale wewnątrzkomórkowym. W krótkim czasie inkubacji wynoszącym 6 hr stwierdzono, że białko ADH-RhB (kolor niebieski) uległo rozmieszczeniu w cytosolu i wakuoli infiltrowanych komórek (Rycina 3C). Jednocześnie w różnych roślinach udało się osiągnąć szybkie i wydajne wyciszenie ekspresji genów przy użyciu formulacji peptydowo-dsRNA. W pierwszym eksperymencie liść A. thaliana został infiltrowany kompleksami peptydowo-dsRNA w celu wyciszenia genu syntazy chalkonu (CHS), odpowiedzialnego za biosyntezę antocyjanów (czerwonego pigmentu) w warunkach suszy. Różnica w wyglądzie liści A. thaliana w warunkach normalnych (Rycina 3D, a) oraz w warunkach suszy (Rycina 3D, b) stanowiła prosty sposób oceny wyciszenia CHS przy użyciu zoptymalizowanej formulacji peptydowo-dsRNA (strzałka 1 wskazuje obszar infiltrowany). W drugim eksperymencie kompleksy peptydowo-dsRNA infiltrowano do liści transgenicznej rośliny A. thaliana wykazującej ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego (YFP). Widoczny spadek ekspresji YFP można było zaobserwować w komórkach epidermy 9 hr po transfekcji (Rycina 3E, F). Zweryfikowano również skuteczność formulacji w wyciszaniu ekspresji genów w innym systemie roślinnym (topola, 12 hr po transfekcji) (Rycina 3G, H).

figure-results-1
Rysunek 1: Preparaty na bazie peptydów do dostarczania kwasów nukleinowych i białek do żywych roślin.
Zaprojektowane peptydy nośnikowe składają się z polikationów sprzężonych z sekwencjami przenikającymi przez błonę komórkową lub sekwencjami transportu organellarnego. Polikationy umożliwiają wiązanie i/lub kondensację ujemnie naładowanych ładunków, a także ucieczkę z przedziału endosomalnego po internalizacji do komórek. Dostarczanie ładunków do komórek, a następnie do konkretnych organelli, jest pośredniczone odpowiednio przez sekwencje przenikające przez błonę komórkową oraz sekwencje transportu organellarnego. Różnorodne ładunki, które mogą zostać pomyślnie dostarczone do roślin, obejmują kwasy nukleinowe, takie jak pDNA, dsDNA i dsRNA, a także białka modelowe, m.in. albuminę surowicy bydlęcej (BSA), dehydrogenazę alkoholową (ADH) oraz cytrynę (wariant żółtego białka fluorescencyjnego). Cząsteczki bioaktywne są zdolne do tworzenia kompleksów transfekcyjnych z koniugatami peptydowymi. poprzez oddziaływania elektrostatyczne, które wprowadza się do liści roślin za pomocą infiltracji strzykawką. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Morfologia formulacji opartych na peptydach.
(A) Obraz amplitudy AFM formulacji (KH)9-BP100/pDNA przy N/P 0,5. (B) Obraz wysokości AFM formulacji (BP100)2K8/ADH przy stosunku molowym 10. Powielono za zgodą z opublikowanych źródeł23,24. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Ocena mikroskopowa wydajności transfekcji z wykorzystaniem zoptymalizowanych formulacji opartych na peptydach.
(A) Ekspresja GFP w cytozolu (zielony), wyraźnie odróżniona od autofluorescencji chloroplastów (czerwony), została zaobserwowana w komórkach miękiszu gąbczastego liści A. thaliana infiltrowanych formulacją (KH)9-BP100/pDNA (N/P 0.5; 12 hr). (B) Ekspresję GFP (zielony) wykryto w mitochondriach (czerwony) w komórkach epidermy liścia A. thaliana infiltrowanego formulacją Cytcox-(KH)9/BP100/pDNA (N/P 0.5 dla każdego peptydu; 12 hr). Powiększone obrazy mitochondriów z ekspresją GFP przedstawiono na panelu skrajnie prawym. (C) Dostarczenie ADH-RhB (niebieski) do komórek miękiszu gąbczastego liści A. thaliana za pośrednictwem (BP100)2K8 przy molowym stosunku peptydu do białka wynoszącym 10, wizualizowane 6 hr po infiltracji. (D) Liść A. thaliana przed (a) i po (b) zastosowaniu formulacji (KH)9-BP100/dsRNA (stosunek molowy 2; 48 hr), co doprowadziło do supresji szlaku biosyntezy antocyjanów. Podobną formulację zawierającą dsRNA GFP5 zainfiltrowano do liścia jako kontrolę negatywną (c). Strzałki 1 i 3 wskazują obszar infiltrowany, natomiast strzałki 2 i 4 wskazują obszar nieinfiltrowany w obrębie liścia. (E) Liście A. thaliana wykazujące ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) i (F) zmniejszona fluorescencja YFP po infiltracji formulacją (KH)9-BP100/dsRNA (stosunek molowy 2; 9 hr). (G) Transgeniczne liście topoli wykazujące ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) oraz (H) zmniejszona fluorescencja YFP po infiltracji formulacją (KH)9-BP100/dsRNA (stosunek molowy 2; 12 hr). Reprodukowano za zgodą z opublikowanych źródeł21,23,24,26. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rysunek 4: Zależność właściwości biofizycznych kompleksów od stosunku peptydów do DNA (N/P).
Wraz ze wzrostem stosunku peptydów do DNA, formulacje oparte na peptydach zmniejszają swój rozmiar, a wartości ich potencjału zeta zmieniają się z ujemnych na dodatnie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Tabela 1: Charakterystyka i ocena różnych formulacji opartych na peptydach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej tabeli.

figure-results-6
Tabela 2: Porównanie technologii dostarczania DNA do nienaruszonych roślin opartych na peptydach oraz innych istniejących technologii. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej tabeli.

Dyskusja

Omówiono krytyczne etapy w ramach protokołu, które zostały zidentyfikowane empirycznie. Poprzez infiltrację strzykawką preparaty na bazie peptydów są wprowadzane do przestrzeni powietrznych wewnątrz liścia rośliny przez aparaty szparkowe. Aby zapewnić maksymalne pobieranie roztworu, proces infiltracji powinien być przeprowadzany, gdy rośliny znajdują się w warunkach sprzyjających otwieraniu aparatów szparkowych , tj. mają zapewnioną wystarczającą ilość wody oraz w okresie świetlnym. Jeśli chodzi o przygotowanie kompleksów transfekcyjnych, w przypadku preparatów, które obejmują kombinację dwóch peptydów (do dostarczania DNA ukierunkowanego na mitochondria), sekwencja dodawania każdego składnika ma kluczowe znaczenie i nie powinna być odwracana.

Istnieje wiele prawdopodobnych modyfikacji procedury. Inną opcją infiltracji komórek roślinnych jest zastosowanie infiltracji próżniowej, która jest w stanie wprowadzić złożony roztwór do całych roślin i/lub częściowych tkanek, w tym merystemów wierzchołkowych. W tej alternatywnej procedurze sadzonki zanurza się w roztworze transfekcji i w oparciu o ciśnienie wytwarzane przez próżnię, kompleksy peptyd-ładunek są przepychane przez aparaty szparkowe do komórek roślinnych (Yoshizumi, T., dane niepublikowane).

Wykazano, że przejściowa ekspresja genów, na podstawie badań z wykorzystaniem komórek zwierzęcych, wzrasta wraz z wyższymi stężeniami DNA29-31. Ważne jest, aby zauważyć, że stosunek peptydu do DNA wpływa na właściwości biofizyczne (wielkość, ładunek powierzchniowy) kompleksów (ryc. 4), co wpływa na wydajność transfekcji; w związku z tym optymalny stosunek musi być zachowany nawet przy zwiększonym stężeniu DNA.

Jedną z głównych zalet stosowania peptydów jako czynnika dostarczającego geny/białka jest to, że ich sekwencja jest podatna na dostrojenie, aby spełnić pożądaną funkcję. Na przykład domenę ukierunkowaną na mitochondria peptydu nośnikowego opisanego w tym badaniu można zastąpić sekwencjami ukierunkowanymi na chloroplastik lub peroksysomalne w celu lokalizacji tych organelli. Podczas gdy transformacja chloroplastów jest możliwa w kilku roślinach przy użyciu biolistyki32-34, ani Agrobacterium , ani metoda biolistyczna nie mogą wprowadzić genów do mitochondriów lub innych organelli poza jądrem (Tabela 2).

Nie ma sztywnych ograniczeń zakresu gospodarza dla transfekcji opartej na peptydach, w przeciwieństwie do metody opartej na Agrobacterium (Tabela 2). Do tej pory zoptymalizowano preparaty do transfekcji A. thaliana, N. benthamiana i topoli (tab. 1), ale metodę można również zastosować do Nicotiana tabacum, odmiany pomidora Micro-Tom, ryżu (na podstawie wstępnych doświadczeń) oraz innych roślin jedno- i dwuliściennych.

Jak dotąd nie ma znanego ograniczenia w wielkości transgenu, gdy peptydy są używane jako wektory transfekcji. W przeciwieństwie do tego, stwierdzono, że duże cząsteczki DNA zmniejszają wydajność transformacji metod za pośrednictwem Agrobacterium 35,36, a górna granica wielkości transgenów wynosi około 200 kb37-39. Z drugiej strony, przy użyciu biolistyki, duże fragmenty DNA mogą być ścinane podczas przygotowywania lub dostarczania do roślin38. Chociaż do tej pory nie ustalono górnej granicy dla transformacji biolistycznej, stwierdzono, że fizyczne ograniczenia ograniczają rozmiar DNA, który można przenieść, do znacznie mniej niż 150 kb40. Główne korzyści płynące ze stosowania systemu opartego na peptydach do transferu genów w porównaniu z istniejącymi podejściami wykorzystującymi Agrobacterium lub bombardowanie mikropociskami, omówione powyżej, podsumowano w Tabeli 2.

Istnieje kilka ograniczeń dotyczących tej metody w jej obecnym kształcie. Po pierwsze, udowodniono, że celowe dostarczanie pDNA do określonych organelli, takich jak mitochondria, jest możliwe dzięki prostemu połączeniu sekwencji wiążących DNA, penetrujących komórki i pasujących organelle, chociaż skuteczność była niska. Ekspresję transgenu można było wykryć za pomocą mikroskopii konfokalnej tylko w niewielkiej populacji mitochondriów w komórkach. W związku z tym konieczne są dalsze modyfikacje, aby: (i) wzmocnić translokację większej liczby kompleksów przez błonę komórkową/organellarną oraz (ii) poprawić dysocjację i transfer pDNA z peptydu nośnikowego do organelli docelowej w celu ekspresji. Po drugie, korzystając z tego systemu dostarczania DNA, udało się osiągnąć przejściową ekspresję egzogennych genów reporterowych w cytozolowym i mitochondrialnym kompartmencie komórek. Stabilna inkorporacja i ekspresja wprowadzonych genów w genomie jądrowym/organellarnym rośliny nie została jednak jeszcze ustalona ze względu na brak odpowiednich strategii selekcji.

Przyznając, że istnieją obszary wymagające poprawy lub dalszego rozwoju, opisana tutaj strategia oparta na peptydach pozostaje prostą i wszechstronną techniką, która utorowała drogę do dostarczania różnych ładunków do różnych typów roślin.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować za dofinansowanie ze strony Japońskiej Agencji Nauki i Technologii Exploratory Research for Advanced Technology (JST-ERATO), New Energy and Industrial Technology Development Organization (NEDO) oraz Międzyresortowego Programu Promocji Innowacji Strategicznych (SIP), Japonia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Peptyd (KH)9-BP100Specjalnie zsyntetyzowany przez RIKEN Brain Science InstituteN/ASekwencja: KHKHKHKHKHKHKHKH-
KHKKLFKKILKYL
(BP100)2-K8 PeptydSpecjalnie zsyntetyzowany przez RIKEN Brain Science InstituteNie dotyczySekwencja: peptyd KKLFKKKILKYLKKLFKKKK-
Peptyd KYLKKKKKKKK
BP100Zsyntetyzowany na zamówienie przez RIKEN Brain Science InstituteN/ASekwencja: KKLFKKILKYL
Peptyd Cytcox-(KH)9Specjalnie zsyntetyzowany przez RIKEN Brain Science InstituteN/ASekwencja: MLSLRQSIRFFKKHKHKH-
KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS i P35S-RLuc-TNOSNIEDOTYCZY NIE DOTYCZYKoduje odpowiednio białko zielonej fluorescencji i geny lucyferazy Renilla pod kontrolą konstytutywnego promotora CaMV 35S (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp i pDONR-cox2:rlucN/A N/AKoduje odpowiednio białko zielonej fluorescencji i geny lucyferazy Renilla pod kontrolą promotora specyficznego dla mitochondriów cox2 (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (amplifikowane PCR z pBI221-P35S-Rluc-TNOS)N/A/Akoduje odpowiednio białko zielonej fluorescencji i geny lucyferazy Renilla pod kontrolą konstytutywnego promotora CaMV 35S (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNAN/AN/ADo wyciszania białka zielonej fluorescencji za pośrednictwem interferencji RNA (Patrz: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNAN/AN/ADo wyciszania syntazy chalkonu za pośrednictwem interferencji RNA (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 ml i 10 ml Plastikowe strzykawkiTERUMO CorporationSS-01T, SS-10ESZ
1,5 ml Probówka mikrowirówkowaAS ONE Corporation151212
96-dołkowa płaska płyta dennaAsahi Glass Co., Ltd.3860-096
Taśma klejącaSekisui Chemical Co., Ltd.Nr 835
Dehydrogenaza alkoholowaSigma-Aldrich Co., LLC.A-7011
Mikroskop sił atomowychSeiko Instruments Inc.SPA 300HV
Hitachi High-Tech Science CorporationAFM5300E
Zestaw do oznaczania białek BCAThermo Fisher Scientific Inc.23227
CantileverHitachi High-Tech Science CorporationK-A102001593
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyCarl ZeissLSM700
Borowik korkowySigma-Aldrich Co., LLC.Z165220Do wycinania liści w krążki o średnicy 1 cm
Szkiełko nakrywkoweMatsunami Glass Ind., Ltd.C02261
KuwetaSarstedt759116
Składana komórka kapilarnaMalvern Instruments, Ltd.
KleszczeShimizu Akira Inc.Nierdzewny tłuczek homogenizacyjny 150
Ieda Trading Corp.9993
MicaNisshin EM Co., Ltd.LC23Z
MikrowirówkaBeckman CoulterBKA46472
Czytnik mikropłytekMolecular Devices CorporationSpectra MAX M3
Szkiełko mikroskopoweMatsunami Glass Ind., Ltd.
PipetaEppendorf Research® plus3120000909
Końcówki do pipetAS ONE Corporation2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Plastikowa szalka PetriegoAS ONE Corporation1-7484-01
Zestaw do oznaczania lucyferazy RenillaPromega corporationE2810
Izotiocyjanianrodaminy BSigma-Aldrich Co., Sp. z o.o.
Woda wolna od RNazQiagen129112
węglan soduWako Pure Chemical Industries, Ltd.199-01585
Ostrze chirurgiczne i rękojeśćFEATHER Safety Razor Co., Ltd.Stal nierdzewna nr 14 (ostrze), nr 3L (uchwyt)
Nasadka końcówki strzykawkiMusashi Engineering Inc.NC-3E
PotencjometrSartorius
ZetaMalvern Instruments, Ltd.Zetasizer Nano-ZS
NSPI3800, mikroskop sił atomowych DTS1070S011120283924Waga CPA225D

Bibliografia

  1. Altman, A., Hasegawa, P. M. Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , Academic Press. Cambridge, MA. (2011).
  2. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).
  3. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
  4. Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 327, 70-73 (1987).
  5. Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).
  6. Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature. 296, 72-74 (1982).
  7. Birch, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).
  8. Newell, C. A. Plant transformation technology. Developments and applications. Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).
  9. Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event? FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).
  10. Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. Engineering in Translational Medicine. Cai, W. , Springer. 667-689 (2014).
  11. Nitta, S., Numata, K. Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).
  12. Numata, K. Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials. Polym. J. 47, 537-545 (2015).
  13. Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based delivery systems of bioactive molecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).
  14. Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).
  15. Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).
  16. Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells. ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).
  17. Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).
  18. Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).
  19. Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery. Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).
  20. Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery. Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).
  21. Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers. Sci. Rep. 5, 7751(2015).
  22. Plant transformation method. Patent. , WO2015133652 A1 (2015).
  23. Ng, K. K., et al. Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides. PLoS ONE. 11, e0154081(2016).
  24. Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers. Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).
  25. Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes. Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).
  26. Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).
  27. Numata, K., et al. Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates. Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).
  28. Numata, K., et al. Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM. Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).
  29. Kawai, S., Nishizawa, M. New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide. Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).
  30. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  31. Luo, D., Saltzman, W. M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface. Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).
  32. Boynton, J. E., et al. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science. 240, 1534-1538 (1988).
  33. Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. Plastid transformation. Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).
  34. Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).
  35. Liu, Y. G., et al. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).
  36. Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).
  37. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).
  38. Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Front. Plant Sci. 5, 379(2014).
  39. Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).
  40. Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). Transgenic Crops I. Bajaj, Y. P. S. , Springer. 14-36 (2000).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dostarczanie peptyd wtransport gen wtransport bia ektransformacja ro lininfiltracja strzykawkowadynamiczne rozpraszanie wiat apomiar potencja u zetamikroskopia si atomowychmikroskopia konfokalnatest lucyferazy Renilla

Powiązane artykuły