Method Article

Opracowanie modelu bezpośredniego pokrywania miazgi do oceny gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia zębiny u myszy

DOI:

10.3791/54973

⸱

January 12th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Shapiro Family Laboratory of Viral Oncology and Aging Research, The UCLA School of Dentistry, 2UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, 3David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy krok po kroku metodę bezpośredniego pokrywania miazgi na zębach myszy w celu oceny gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia zębiny in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miazga zębowa jest ważnym organem zęba w pełni chronionym przez szkliwo i zębinę. Kiedy miazga jest odsłonięta z powodu urazów próchnicotwórczych lub jatrogennych, często jest pokryta materiałami biokompatybilnymi w celu przyspieszenia gojenia się ran miazgowych. Ostatecznym celem jest regeneracja regenerującej zębiny, fizycznej bariery, która działa jak "biologiczna pieczęć" i chroni leżącą pod nią tkankę miazgi. Chociaż ta bezpośrednia procedura pokrywania miazgi jest od dawna stosowana w stomatologii, mechanizm molekularny leżący u podstaw gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia się zębiny jest nadal słabo poznany. Aby wywołać naprawczą zębinę, pokrywanie miazgi przeprowadzono eksperymentalnie u dużych zwierząt, ale w mniejszym stopniu u myszy, prawdopodobnie ze względu na ich małe rozmiary i wynikające z tego trudności techniczne. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową, krok po kroku metodę wykonywania zabiegu zakładania miazgi u myszy, w tym przygotowanie ubytku podobnego do ubytku klasy I, umieszczenie materiałów do pokrywania miazgi oraz procedurę odbudowy przy użyciu kompozytu dentystycznego. Nasz mysi model pokrywki miazgi odegra zasadniczą rolę w badaniu podstawowych mechanizmów molekularnych gojenia się ran miazgi w kontekście naprawczej zębiny in vivo, umożliwiając wykorzystanie myszy transgenicznych lub knockoutowych, które są powszechnie dostępne w społeczności naukowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próchnica zębów jest jedną z najbardziej rozpowszechnionych chorób jamy ustnej i główną przyczyną interwencji chirurgicznych w uzębienie u prawie wszystkich osób1,2. Rokowanie w przypadku interwencji chirurgicznych i odbudowy zęba w dużej mierze zależy od prawidłowej odpowiedzi miazgi i pomyślnego gojenia się ran. Rzeczywiście, próchnica, która wnika głęboko przez szkliwo i zębinę, często prowadzi do odsłonięcia leżącej pod spodem tkanki miazgi, która często jest "pokryta" materiałami dentystycznymi, takimi jak wodorotlenek wapnia (Ca(OH)2) lub hydrauliczne cementy krzemianowo-wapniowe (HCSC), w tym agregaty trójtlenku mineralnego (MTA). Ostatecznym celem takiej procedury pokrywania miazgi jest przyspieszenie gojenia się ran miazgi poprzez regenerację naprawczej zębiny, fizycznej bariery, która działa jak "biologiczna pieczęć" chroniąca leżącą pod spodem tkankę miazgi i wydłużająca oczekiwaną długość życia zęba oraz ogólny stan zdrowia jamy ustnej. Jednak mechanizm leżący u podstaw gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia się zębiny nie jest w pełni poznany.

Aby lepiej zrozumieć mechanizmy gojenia się ran miazgowych i naprawczego tworzenia zębiny in vivo, wcześniej wykorzystano kilka zwierząt, w tym małpy, psy i świnie3-5. Wśród nich często wykorzystywane są szczury, ponieważ są stosunkowo mniejsze w porównaniu z innymi zwierzętami, ale ich zęby są wystarczająco duże, aby wykonać bezpośrednie pokrycie miazgi bez żadnych trudności technicznych6-10. Te modele zwierzęce są idealną alternatywą dla badań na ludziach w celu zbadania reakcji miazgi i naprawczego tworzenia zębiny. Jednak ich wykorzystanie jest ograniczone do badań obserwacyjnych na poziomie komórkowym i prawie nie dostarczają mechanistycznych wglądów podczas naprawczego tworzenia zębiny na poziomie molekularnym.

Ostatnie osiągnięcia techniczne w inżynierii genetycznej dostarczyły nieocenionych i niezbędnych narzędzi badawczych - myszy, które posiadają gen, który jest albo nadmiernie eksprymowany, albo usunięty - które są instrumentalne do badania molekularnych mechanizmów chorób ludzkich in vivo. Liczba różnych szczepów myszy transgenicznych lub nokautujących, które są strategicznie indukowane w sposób specyficzny dla komórki, stale rośnie w społeczności naukowej. Dlatego badanie gojenia się ran miazgi i naprawczej regeneracji zębiny u tych myszy znacznie pomogłoby w zrozumieniu tych procesów na poziomie molekularnym. Jednak wykorzystanie myszy jest znacznie ograniczone, ponieważ wykonanie procedury pokrywania miazgi na zębie myszy jest technicznie trudne ze względu na jego miniaturowe rozmiary. W tym miejscu przedstawiamy naszą powtarzalną metodę wykonywania bezpośredniego pokrywania miazgi u myszy w celu oceny gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia zębiny in vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy zakupiono w Jackson Laboratory i trzymano w wolnym od patogenów wiwarium na Wydziale Medycyny Zwierząt Laboratoryjnych UCLA (DLAM). Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnymi Komitetu Badań nad Zwierzętami Kanclerza (ARC#2016-037).

1. Znieczulenie myszy

  1. Użyj ośmiotygodniowych samic myszy C57 / BL6 (n = 3).
  2. Znieczulić myszy roztworami ketaminy (80-120 mg/kg masy myszy)/ksylazyny (5 mg/kg masy myszy) i podawać dootrzewnowo (ip) w dawce 10 ml/kg.
  3. Przygotować roztwory ketaminy (80 - 120 mg/kg)/ksylazyny (5 mg/kg) i podawać je dootrzewnowo (ip) w dawce 10 ml/kg.
  4. Upewnij się, że myszy są w pełni znieczulone, wykonując szczypanie palca u nogi.

2. Procedura zamykania miazgi

  1. Umieść uchwyt na usta w ustach myszy.
  2. Zamocuj uchwyt na usta na stole tak, aby głowa była skierowana do góry.
  3. Umieść mikroskop (10X) na górze jamy ustnej tak, aby pierwszy ząb trzonowy szczęki był w pełni widoczny.
  4. Używając wiertła 1/4-round w szybkoobrotowej rękojeści o prędkości 200 000 obr./min, usuń szkliwną część zęba pośrodku, aż miazga będzie widoczna przez przezroczystą zębinę. Nie odsłaniaj miazgi za pomocą wiertła.
  5. Za pomocą pilnika endodontycznego K #15 (średnica 150 μm) przebić zębinę i odsłonić miazgę.
    UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność, aby resztki zębiny nie dostały się do miazgi. Można tego uniknąć, obracając pilnik K co kwartał, a następnie wyciągając plik K.
  6. Wymieszać MTA ze sterylnymH2Ozgodnie z instrukcjami producenta. Dostarcz i umieść MTA na odsłoniętej miazdze za pomocą końcówki eksploratora. Użyj tylnej strony papierowego punktu (drobnego), aby zapakować MTA do odsłoniętej miazgi, delikatnie stukając. Grubsza strona papierowego punktu jest płaska, co pozwala na odpowiednią kondensację MTA w odsłoniętej masie celulozowej.
  7. Wytrawiaj ząb przez 15 sekund, umieszczając 35% wytrawiacz kwasem fosforowym w miejscu, w którym pokrywa on ząb. Należy zachować szczególną ostrożność, aby ograniczyć umieszczanie wytrawiacza, ponieważ może on podrażniać tkanki dziąseł.
    UWAGA: Wytrawiacz jest dostarczany w strzykawce i służy do szorstkowania powierzchni zębów, tak aby kleje dentystyczne mogły napływać, pośrednicząc w mikromechanicznym wiązaniu zęba. Ponieważ są lepkie, można je samodzielnie kontrolować, nakładając niewielkie ilości bezpośrednio na ząb.
  8. Użyj ssania podciśnieniowego, aby usunąć wytrawiacz. Użyj bawełnianej granulki, która jest lekko nasączonaH2O, aby usunąć pozostałości wytrawiacza. Powtarzaj ten krok, aż wytrawiacz zostanie całkowicie usunięty z zęba.
  9. Za pomocą miotełki do kurzu na sprężone powietrze delikatnie osusz ząb.
  10. Nałóż kleje dentystyczne za pomocą tylnej strony papierowego punktu.
  11. Cienkiej warstwę kleju za pomocą sprężonego powietrza przez 3 sekundy.
  12. Utwardzaj kleje dentystyczne przez 20 sekund za pomocą utwardzacza z lampą.
  13. Umieść płynny kompozyt w małych ilościach na zębie, który został pokryty MTA. Użyj końcówki eksploratora, aby wlać kompozyt do rowków zębów.
  14. Utwardzaj kompozyt przez 30 s za pomocą urządzenia światłoutwardzalnego do jego polimeryzacji. Upewnij się, że kompozyt jest w pełni utwardzony i twardy za pomocą eksploratora.

3. Opieka pooperacyjna

  1. Karprofen (5 mg/kg) należy podawać podskórnie (sc) bezpośrednio po zabiegu pokrywania miazgi.
  2. Umieść myszy na poduszce grzewczej o niskiej mocy, aby zwierzęta były ciepłe, zanim się obudzą.
  3. Zwróć myszy do wiwarium w celu schronienia.

4. Pobieranie tkanek

  1. Po 5-6 tygodniach poddać myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy w stanie całkowitego znieczulenia izofluranem.
  2. Ostrożnie wyjmij szczękę z podstawy czaszki i włóż ją do probówki o pojemności 50 ml. Zamocuj całą szczękę, która zawiera zarówno ząb pokryty miazgą, jak i przeciwległy ząb niezamknięty, w 4% paraformaldehydzie w PBS, pH 7,4, w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie przechowuj go w 70% roztworze etanolu.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny i rakotwórczy. Właściwe stosowanie paraformaldehydu powinno być monitorowane zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi (SOP).
  3. Zeskanuj szczęki myszy za pomocą tomografii komputerowej μCT. Aby zabezpieczyć szczęki podczas skanowania, owiń próbki gazą nasączoną 70% etanolem i umieść je w probówce do hodowli komórkowej o pojemności 15 ml.

5. Skanowanie μCT

  1. Przygotuj próbki do skanowania μCT. Krótko owiń próbki gazą nasączoną 70% etanolem i zabezpiecz je w ogólnej stożkowej probówce do hodowli komórkowej o pojemności 15 ml. Zamontuj rurkę na stoliku skanowania μCT, zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Ustaw źródło promieniowania rentgenowskiego na prąd 145 μA, napięcie 55 kVp i czas ekspozycji 200 ms.
  3. Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą skanera μCT o rozdzielczości 20 μm i z filtrem Al 0,5 mm.
  4. Zrekonstruuj obraz i zwizualizuj go11.
  5. Po zakończeniu badania μCT rozpocznij odwapnianie za pomocą 5% EDTA i 4% sacharozy w PBS (pH 7,4) przez 2 tygodnie.

6. Przetwarzanie i barwienie tkanek

  1. Odwapnione tkanki zanurzyć w parafinie. Przed osadzeniem przyciąć szczękę, wykonując strzałkowe cięcie bezpośrednio przed pierwszym zębem trzonowym. Podczas osadzania należy ustawić tę powierzchnię w dół, tak aby przekrój podłużny pierwszego zęba trzonowego był powierzchnią cięcia.
  2. Za pomocą mikrotomu przygotuj szkiełka o grubości 5 μm. Obszary przykrycia miazgi zwykle pokrywają się z korzeniem dystalnym (DP), który może być używany jako punkt orientacyjny. Określ dokładny obszar zainteresowania, badając histologię pod mikroskopem świetlnym i porównując obrazy μCT.
  3. W przypadku barwienia H&E należy odparafinować i ponownie uwodnić szkiełka ksylenem (2x) i seryjnie rozcieńczonym etanolem (100% EtOH 2x, 95% EtOH 2x i 70% EtOH 1x).
  4. Opłucz szkiełka pod bieżącą wodą z kranu.
  5. Plamić roztworem Hematoxyliny przez 2,5 minuty i spłukać wodą z kranu.
  6. Zanurz szkiełka w 95% etanolu na 1 minutę.
  7. Plamić roztworem Eozyny przez 1 minutę i spłukać wodą z kranu.
  8. Odwodnić seryjnie rozcieńczonym etanolem (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x i 100% EtOH 3x) i ksylenem (3x).
  9. Zamontuj prowadnice za pomocą rozwiązania montażowego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazaliśmy krok po kroku procedury wykonywania zakrywania miazgi na zębach myszy. Jednym z kluczowych aspektów pokrywania miazgi u myszy jest posiadanie odpowiedniej aparatury. W związku z tym niezbędne jest posiadanie mikroskopu z 10-krotnym powiększeniem (rysunek 1A). Aby stworzyć w zębie preparat podobny do klasy I, użyliśmy frezu 1/4-rundowego w elektrycznej rękojeści o dużej prędkości obrotowej przy 200 000 obr./min (rysunek 1B). Alternatywnie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie dostępnych jest kilka różnych modeli eksperymentalnych do walidacji wpływu in vivo materiałów dentystycznych, rusztowań lub czynników wzrostu na zębopochodne różnicowanie komórek macierzystych miazgi zębowej (DPSC)13. Modele te obejmują ektopowe autologiczne przeszczepienie DPSC do narządu, takiego jak torebka nerkowa, lub podskórne przeszczepienie DPSC myszom z obniżoną odpornością z rusztowaniami14,15. Metody te są jednak ograniczone, ponieważ ich zębopochodne działanie na DPSC ni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez R01DE023348 (RHK) z NIDCR/NIH oraz Grant Badawczy Wydziału (RHK) z Rady ds. Badań Senatu Akademickiego Wydziału Los Angeles Uniwersytetu Kalifornijskiego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mikroskop stereoskopowy BM-LEDMikroskop MEIJI Techno 
Optima MCX-LED Bien Air Dental1700588-001Silnik elektryczny
izofluranHenry schein zdrowie zwierzątNDC 11695-0500-2
1/4 okrągłego wiertłaBrasseler001092T0
Pilnik endodontyczny KRoydent98947
ProRoot MTADentsplyPROROOT5WMTA
Papierowy punktHenry schein100-3941
Ultra-EtchUltradent produkt Inc.Wytrawiacz kwasem fosforowym
OptiBond SoloPlusKerr29669Kleje
Coltolux LEDColtene/whaledent Inc.C7970100115Jednostka utwardzająca
Odcień charakteryzacjiBiscoT-14012Płynny kompozytowy
SkyscanBreuker1275uCT
MicromThermoHM355SMicrotome
Hematoxyline-1Thermo Scientific7221
Eosin-YThermo Scientific7111
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-16Rozwiązanie montażowe
skaner

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dye, B., Thornton-Evans, G., Li, X., Iafolla, T. Dental caries and tooth loss in adults in the United States, 2011-2012. NCHS Data Brief. (197), 197(2015).
  2. Bagramian, R. A., Garcia-Godoy, F., Volpe, A. R. The global increase in dental caries. A pending public health crisis. Am J Dent. 22 (1), 3-8 (2009).
  3. Koliniotou-Koumpia, E., Tziafas, D. Pulpal responses following direct pulp capping of healthy dog teeth with dentine adhesive systems. J Dent. 33 (8), 639-647 (2005).
  4. Tarim, B., Hafez, A. A., Cox, C. F. Pulpal response to a resin-modified glass-ionomer material on nonexposed and exposed monkey pulps. Quintessence Int. 29 (8), 535-542 (1998).
  5. Tziafa, C., Koliniotou-Koumpia, E., Papadimitriou, S., Tziafas, D. Dentinogenic responses after direct pulp capping of miniature swine teeth with Biodentine. J Endod. 40 (12), 1967-1971 (2014).
  6. Dammaschke, T., Stratmann, U., Fischer, R. J., Sagheri, D., Schafer, E. A histologic investigation of direct pulp capping in rodents with dentin adhesives and calcium hydroxide. Quintessence Int. 41 (4), 62-71 (2010).
  7. Jegat, N., Septier, D., Veis, A., Poliard, A., Goldberg, M. Short-term effects of amelogenin gene splice products A+4 and A-4 implanted in the exposed rat molar pulp. Head Face Med. 3, 40(2007).
  8. Paterson, R. C., Radford, J. R., Watts, A. The response of the rat molar pulp of two proprietary calcium hydroxide preparations. Br Dent J. 151 (6), 184-186 (1981).
  9. Sela, J., Ulmansky, M. Reaction of normal and inflamed dental pulp to Calxyl and zinc oxide and eugenol in rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 30 (3), 425-430 (1970).
  10. Maurice, C. G., Schour, I. Experimental cavity preparations in the molar of the rat. J Dent Res. 34 (3), 429-434 (1955).
  11. Skyscan, N. V. NRecon user manual. , Available from: http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf (2011).
  12. Sohn, S., et al. The Role of ORAI1 in the Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J Dent Res. 94 (11), 1560-1567 (2015).
  13. Kim, S., Shin, S. J., Song, Y., Kim, E. In Vivo Experiments with Dental Pulp Stem Cells for Pulp-Dentin Complex Regeneration. Mediators Inflamm. 2015, 409347(2015).
  14. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  15. Yu, J., et al. Odontogenic capability: bone marrow stromal stem cells versus dental pulp stem cells. Biol Cell. 99 (8), 465-474 (2007).
  16. Zhu, X., et al. Transplantation of dental pulp stem cells and platelet-rich plasma for pulp regeneration. J Endod. 38 (12), 1604-1609 (2012).
  17. Iohara, K., et al. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res. 83 (8), 590-595 (2004).
  18. Saito, K., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Osteopontin Is Essential for Type I Collagen Secretion in Reparative Dentin. J Dent Res. , (2016).
  19. Hunter, D. J., et al. Wnt Acts as a Pro-Survival Signal to Enhance Dentin Regeneration. J Bone Miner Res. , (2015).
  20. Goldberg, M., Kulkarni, A. B., Young, M., Boskey, A. Dentin: structure, composition and mineralization. Front Biosci (Elite Ed). 3, 711-735 (2011).
  21. Nascimento, A. B., Fontana, U. F., Teixeira, H. M., Costa, C. A. Biocompatibility of a resin-modified glass-ionomer cement applied as pulp capping in human teeth). Am J Dent. 13 (1), 28-34 (2000).
  22. Bogen, G., Kim, J. S., Bakland, L. K. Direct pulp capping with mineral trioxide aggregate: an observational study. J Am Dent Assoc. 139 (3), 305-315 (2008).
  23. Miller, R. A., Nadon, N. L. Principles of animal use for gerontological research. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 55 (3), 117-123 (2000).
  24. Shah, A., Song, M., Cao, Y., Kang, M. K., Kim, R. H. Osteoclasts are absent in pulpal and periapical inflammatory lesions. J Dent Res. 95, 1503(2016).
  25. Williams, D. W., et al. Impaired bone resorption and woven bone formation are associated with development of osteonecrosis of the jaw-like lesions by bisphosphonate and anti-receptor activator of NF-kappaB ligand antibody in mice). Am J Pathol. 184 (11), 3084-3093 (2014).
  26. McPherson, J. D., et al. A physical map of the human genome. Nature. 409 (6822), 934-941 (2001).
  27. Gregory, S. G., et al. A physical map of the mouse genome. Nature. 418 (6899), 743-750 (2002).
  28. Hilton, T. J. Keys to clinical success with pulp capping: a review of the literature. Oper Dent. 34 (5), 615-625 (2009).
  29. Holmdahl, R., Bockermann, R., Backlund, J., Yamada, H. The molecular pathogenesis of collagen-induced arthritis in mice--a model for rheumatoid arthritis. Ageing Res Rev. 1 (1), 135-147 (2002).
  30. Kalu, D. N., Chen, C. Ovariectomized murine model of postmenopausal calcium malabsorption. J Bone Miner Res. 14 (4), 593-601 (1999).
  31. Yokochi, T. A new experimental murine model for lipopolysaccharide-mediated lethal shock with lung injury. Innate Immun. 18 (2), 364-370 (2012).
  32. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Direct Pulp cappingPulpal Wound HealingReparative Dentin FormationMouse ModelCavity PreparationMTA PlacementDental CompositeMicro CT ScanHistological AnalysisDMP1 Staining

Related Articles