Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54980

⸱

27 grudnia 2016

 ,  ,  ,  , 
1Section of Nephrology, Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Section of Nephrology, Department of Medicine, Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania, 4Division of Rheumatology, Department of Medicine, Research Institute of the McGill University Health Centre, 5Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois at Chicago

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do określania wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez fizyczną interakcję z sąsiednimi martwymi lub umierającymi komórkami. Protokół koncentruje się na zdarzeniach sygnalizacyjnych wywołanych przez rozpoznawanie martwych komórek za pośrednictwem receptora, w przeciwieństwie do ich wychwytu fagocytarnego lub uwalniania rozpuszczalnych mediatorów.

Streszczenie

Komórki umierające w wyniku apoptozy, określanej również jako regulowana śmierć komórki, nabywają wiele nowych aktywności, które umożliwiają im wpływanie na funkcjonowanie sąsiednich żywych komórek. Czynności życiowe, takie jak przetrwanie, proliferacja, wzrost i różnicowanie, są jednymi z wielu funkcji komórkowych modulowanych przez komórki apoptotyczne. Zdolność do rozpoznawania i reagowania na komórki apoptotyczne wydaje się być uniwersalną cechą wszystkich komórek, niezależnie od linii lub narządu pochodzenia. Jednak różnorodność i złożoność odpowiedzi na komórki apoptotyczne wymaga zachowania dużej ostrożności w analizie zdarzeń sygnalizacyjnych i ścieżek odpowiedzialnych za każdy konkretny wynik. W szczególności należy rozróżnić wiele mechanizmów, za pomocą których komórki apoptotyczne mogą wpływać na wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe w żywotnych komórkach reagujących, w tym: rozpoznawanie komórki apoptotycznej za pośrednictwem receptora, uwalnianie rozpuszczalnych mediatorów przez komórkę apoptotyczną i / lub zaangażowanie maszynerii fagocytarnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych, które są indukowane w żywotnych komórkach reagujących po ich ekspozycji na komórki apoptotyczne. Główną zaletą protokołu jest uwaga, jaką poświęca on analizie mechanizmu, za pomocą którego komórki apoptotyczne modulują zdarzenia sygnalizacyjne w odpowiadających komórkach. Chociaż protokół jest specyficzny dla warunkowo unieśmiertelnionej linii komórek kanalików proksymalnych nerki myszy (BU. Komórki MPT), łatwo przystosowuje się do linii komórkowych, które są pochodzenia nienabłonkowego i/lub pochodzą z narządów innych niż nerka. Wykorzystanie martwych komórek jako bodźca wprowadza kilka unikalnych czynników, które mogą utrudniać wykrywanie wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych. Problemy te, a także strategie ich minimalizacji lub obejścia, są omawiane w protokole. Zastosowanie tego protokołu powinno pomóc nam w poszerzaniu wiedzy na temat szerokiego wpływu, jaki martwe lub umierające komórki wywierają na swoich żywych sąsiadów, zarówno w zdrowiu, jak i chorobie.

Wprowadzenie

Apoptoza, czyli regulowana śmierć komórki1, przyczynia się w istotny sposób do utrzymania i rozwoju tkanek. Patrząc najprościej, apoptoza pozwala na eliminację starych, uszkodzonych lub nadmiarowych komórek bez szkody dla otaczających tkanek2,3. Udział apoptozy w homeostazie tkanek jest jednak znacznie bardziej dynamiczny i zróżnicowany. Komórki umierające w wyniku apoptozy nabywają wiele nowych aktywności, zarówno wydzielanych, jak i związanych z komórkami, które umożliwiają im wpływanie na funkcję sąsiednich żywych komórek4-10. Wcześniejsze badania koncentrowały się na zdolności komórek apoptotycznych do tłumienia stanu zapalnego11-16, ale komórki apoptotyczne modulują również szeroki zakres funkcji komórkowych, w tym tak ważne czynności, jak przeżycie4,9,10, proliferacja4,9,10, różnicowanie17, migracja18 i wzrost19. Co więcej, efekty te nie ograniczają się do profesjonalnych fagocytów, takich jak makrofagi, ale rozciągają się na praktycznie wszystkie typy komórek i linie, w tym tradycyjnie komórki niefagocytarne, takie jak komórki nabłonkowe i śródbłonka7,9,10,18-21.

Specyficzna reakcja sąsiednich żywych komórek po ekspozycji na komórki apoptotyczne zależy od wielu czynników, które odnoszą się zarówno do żywotnych komórek reagujących, jak i samych komórek apoptotycznych. Na przykład, chociaż narażenie na komórki apoptotyczne hamuje proliferację zarówno mysich makrofagów, jak i komórek nabłonka kanalików proksymalnych nerek (PTEC), te dwa typy komórek różnią się znacznie pod względem odpowiedzi na przeżycie komórek apoptotycznych4,6,9,10. Komórki apoptotyczne sprzyjają przetrwaniu makrofagów, ale indukują apoptotyczną śmierć PTEC4,6,9,10. Warto zauważyć, że odpowiedź na komórki apoptotyczne może się różnić nawet między reagującymi komórkami tej samej linii, w zależności od narządu pochodzenia komórkiodpowiadającej 10 (np. PTEC nerki w porównaniu z komórkami nabłonka sutka) lub stanu aktywacji22 (np. neutrofile). I odwrotnie, komórki apoptotyczne mogą wywoływać różne reakcje w tej samej komórce w zależności od charakteru bodźca apoptotycznego10,23 lub etapu apoptozy10,14.

Biorąc pod uwagę różnorodność i złożoność odpowiedzi na komórki apoptotyczne, należy zachować dużą ostrożność przy analizowaniu zdarzeń sygnalizacyjnych i ścieżek odpowiedzialnych za poszczególne wyniki. Po pierwsze, odpowiedzi wymagające bezpośredniej fizycznej interakcji między komórkami żywotnymi i apoptotycznymi muszą być zróżnicowane od tych wywoływanych przez rozpuszczalne mediatory uwalniane lub generowane przez komórkę apoptotyczną3,6-10. Jeśli wymagana jest interakcja fizyczna, należy przeprowadzić dalsze różnicowanie. Zdarzenia sygnalizacyjne mogą zależeć od rozpoznania komórki apoptotycznej za pośrednictwem receptora, niezależnie od późniejszego pochłonięcia, lub od wychwytu fagocytarnego, niezależnie od specyficznego receptora, który wiąże komórkę apoptotyczną3-7,9,10,19. W tym drugim przypadku odpowiedź nie jest specyficzna dla komórek apoptotycznych i może być wywołana przez dowolny materiał fagocytarny4,6.

Znaczenie tych różnic można ponownie docenić poprzez porównanie reakcji makrofagów i nerek PTEC. W przypadku obu typów komórek ekspozycja na komórki apoptotyczne zmienia aktywność kinazy Akt, która sprzyja przeżyciu. Modulacja jest zależna od interakcji fizycznej, ponieważ oddzielenie komórek reagujących i apoptotycznych przez membranę poliwęglanową o grubości 0,4 μm znosi odpowiedź4,9,10,19. Jednak odpowiedź PTEC jest zależna od receptora i niezależna od fagocytozy, podczas gdy odpowiedź makrofagów jest napędzana przez fagocytozę4,9,10,19. Wniosek ten jest wzmocniony przez fakt, że ekspozycja na kulki lateksowe, neutralny bodziec fagocytarny, nie ma wpływu na aktywność Akt w PTEC, ale naśladuje działanie komórek apoptotycznych w makrofagach4,9.

Chociaż mniej zbadane, komórki umierające w wyniku nekrozy, czyli przypadkowej śmierci komórki1, również modulują funkcję pobliskich żywotnych komórek3-10,19. Podobnie jak komórki apoptotyczne, komórki martwicze wywierają swoje działanie poprzez różne mechanizmy, w szczególności wyciek treści wewnątrzkomórkowej przez pękniętą błonę komórkową3,5,6,9,24. Wiele komórek, w tym PTEC i makrofagi, posiada odrębne, niekonkurencyjne receptory dla komórek umierających w wyniku martwicy5,9. Zaangażowanie tych receptorów indukuje zdarzenia sygnalizacyjne, które często są przeciwne do tych indukowanych przez zaangażowanie receptorów dla komórek apoptotycznych4-10,19. Na przykład w PTEC komórki martwicze zwiększają fosforylację Akt, podczas gdy komórki apoptotyczne zmniejszają fosforylację9,10,19.

Tutaj opisujemy protokół identyfikacji wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych nerkach PTEC poprzez pośredniczące w receptorze rozpoznawanie sąsiednich apoptotycznych PTEC9,10,19. Chociaż protokół jest specyficzny dla warunkowo unieśmiertelnionej linii komórkowej PTEC znanej jako BU. Komórki MPT9,10,19,25,26, łatwo przystosowują się do linii komórkowych, które są pochodzenia nienabłonkowego i / lub pochodzą z narządów innych niż nerka. Co ważne, wykorzystanie komórek apoptotycznych jako bodźca komórkowego stwarza pewne nieodłączne trudności eksperymentalne, które nie występują w przypadku rozpuszczalnych ligandów. Najważniejszym z nich jest to, że komórki apoptotyczne muszą być dodawane w postaci zawiesiny, a nie roztworu. Trudności te, jak również strategie ich minimalizacji lub obejścia, są omówione w protokole. Prawie wszystkie techniki opisane w protokole są proste i standardowe dla hodowli komórkowych. Zaletą tego protokołu jest zwrócenie uwagi na wiele mechanizmów, za pomocą których komórki apoptotyczne modulują transdukcję sygnału w odpowiadających komórkach. Mechanizmy te obejmują wiązanie się za pomocą determinantów powierzchniowych lub cząsteczek mostkujących ze specyficznymi receptorami w reagującej komórce, uwalnianie rozpuszczalnych mediatorów i/lub angażowanie maszynerii fagocytarnej. Komórki martwicze są uwzględniane we wszystkich eksperymentach, aby zapewnić, że wyniki są specyficzne dla sposobu śmierci komórki, a nie uogólnionej odpowiedzi na martwe komórki. Ostrożne podejście, zgodnie z zaleceniami zawartymi w tym protokole, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia stale rosnącego wpływu, jaki umierające komórki wywierają na swoich żyjących sąsiadów, zarówno w zdrowiu, jak i chorobie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowania

Uwaga: W tym protokole, dwie lub więcej linii komórkowych, czyli pierwotnych hodowli komórek, są niezależnie przygotowywane w określonych warunkach. Preparaty te obejmują komórki apoptotyczne (Protokół 1), komórki martwicze (Protokół 2) i zdrowe komórki reagujące (Protokół 3). Po niezależnym przygotowaniu, komórki apoptotyczne lub martwicze są dodawane do komórek reagujących i monitorowana jest uzyskana transdukcja sygnału (protokoły 4, 5 i 6).

  1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i odczynników
    1. Przygotować 500 ml pożywki hodowlanej A (do stosowania podczas hodowli komórek w dopuszczalnych warunkach, patrz sekcja 1.2), łącząc następujące elementy: 1x Zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierająca 4,5 g/L glukozy, 584 mg/L ʟ-glutaminę, 110 mg/L pirogronianu sodu, 100 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny, 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), i 10 jednostek/ml interferonu-γ (IFN-γ).
    2. Przygotować 500 ml pożywki hodowlanej B (do użycia w przypadku komórek pozbawionych surowicy w warunkach niedopuszczalnych, patrz sekcja 1.2), pomijając FBS i IFN-γ w recepturze pożywki A. Aby wyhodować komórki w niesprzyjających warunkach (przed głodzeniem surowicy), dodaj 10% v/v FBS do pożywki hodowlanej B.
    3. Przygotować 0,4% (v/v) paraformaldehydu, pH 7,2, w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS) z 4% zapasu paraformaldehydu do utrwalania martwych komórek.
      Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny i należy zachować odpowiednią ostrożność podczas jego stosowania.
  2. Kultura BU. Komórki MPT
    1. Rozmrozić z ciekłego azotu jedną fiolkę BU. Komórki MPT.
      Uwaga: BU. MPT to linia proksymalnych komórek nabłonka kanalików nerkowych (PTEC) pochodząca od transgenicznej myszy z wrażliwą na temperaturę (ts) mutacją (tsA58) dużego antygenu nowotworowego SV40 (TAg) pod kontrolą mysiego głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) H-2Kb klasy Ipromotora 25,26.
    2. Płytki na sterylnych polistyrenowych szalkach do hodowli tkankowych poddanych działaniu plazmy próżniowej (~ 5 x 10,6 komórek na naczynie o średnicy 100 mm).
    3. Hoduj komórki w sprzyjających warunkach w nawilżonej atmosferze 5% (v/v) CO2 .
      Uwaga: Warunki permisywne, które definiuje się jako hodowlę w temperaturze 33 - 37 ºC w obecności IFN-γ, umożliwiają stabilną ekspresję transgenu TAg z mutacją tsA58. W przeciwieństwie do pierwotnych kultur PTEC nerki myszy, które nie przeżywają więcej niż jedno lub dwa pasaże, BU. MPT hodowany w warunkach permisywnych może być pasażowany w nieskończoność.
      1. Przejdź komórki co najmniej trzy razy po rozmrożeniu przed użyciem ich w eksperymencie.
        1. Do komórek pasażujących dodać 1 ml 0,05% trypsyny na 100 mm szalkę i inkubować w wilgotnej atmosferze 5% (v/v) CO2 w temperaturze 37 ºC przez 5 minut. Zneutralizować trypsynę, dodając 10 ml pożywki A. Odessać oderwane komórki i podzielić 1:3 do 1:5 na nowe, sterylne naczynia do hodowli tkankowych traktowane plazmą próżniową o średnicy 100 mm. Dodaj pożywkę A, aby zwiększyć objętość do 10 ml na 100 mm naczynia.
    4. W ramach przygotowań do zastosowania doświadczalnego jako komórki reagujące, hoduj komórki do konfluencji w nawilżonej atmosferze 5% (v/v) CO2 w warunkach niedopuszczalnych (tj. w temperaturze 39 ºC przy braku IFN-γ [pożywka B zawierająca 10% v/v FBS]).
      Uwaga: W warunkach niepermisywnych ekspresja transgenu TAg z mutacją tsA58 jest hamowana o >95% i BU. Komórki MPT zachowują się jak pierwotne hodowle PTEC nerki myszy.

2. Przygotowanie apoptotycznego BU. Komórki MPT (Protokół 1)

Uwaga: Ten protokół jest specyficzny dla BU. Komórki MPT jako źródło komórek apoptotycznych i staurosporyna jako metoda indukcji apoptozy. Alternatywnie, inna linia komórkowa lub pierwotna hodowla komórkowa może być wykorzystana jako źródło komórek apoptotycznych, z apoptozą indukowaną przez standardowe protokoły dla tego konkretnego typu komórki i metody indukcji apoptozy.

  1. Po przejściu na sterylne polistyrenowe naczynia do hodowli tkankowych poddanych działaniu plazmy próżniowej o średnicy 100 mm, wyhoduj BU. Komórki MPT do konfluencji w wilgotnej atmosferze 5% (v/v) CO2 w warunkach dopuszczalnych (tj. w temperaturze 37 °C w pożywce A w temperaturze 10 ml na 100 mm szalki), jak opisano w sekcji 1.2.3.
  2. Przepłukać przylegającą monowarstwę komórek trzykrotnie pożywką hodowlaną B, używając 10 ml na płukanie.
  3. Indukować apoptozę poprzez inkubację komórek w pożywce hodowlanej B zawierającej staurosporynę, nieselektywny inhibitor kinazy białkowej, w stężeniu 1 μg/ml przez 3 godziny w wilgotnej atmosferze 5% (v/v) CO2 w temperaturze 37 °C.
  4. Odessać pożywkę zawierającą staurosporynę zawierającą "pływające" komórki apoptotyczne, które oderwały się od monowarstwy. Odwirować tę pożywkę przez 10 minut przy 500 x g, wyrzucić supernatant, przemyć osad trzykrotnie pożywką hodowlaną B i dodać osad z powrotem do komórek zebranych w następnym kroku, 2,5.
  5. Odłączyć pozostałe przylegające komórki od etapów 2.3 i 2.4 przez dodanie 5 mM (kwas etylenodiaminotetraoctowy) EDTA w 1x DPBS wolnym od Ca2+ i Mg2+ w ilości 1 ml na szalkę przez 5 minut. Odessać pożywkę zawierającą EDTA zawierającą odłączone komórki apoptotyczne i połączyć odłączone komórki z "pływającymi" komórkami apoptozy z kroku 2.4 w sterylnej probówce wirówkowej z polistyrenu o pojemności 15 ml.
  6. Przemyć komórki apoptotyczne trzykrotnie przez odwirowanie przez 10 minut przy 500 x g i ponowne zawieszenie w 10 ml 1x DPBS bez Ca+2 i Mg+2 na przemycie.
  7. Po ostatnim płukaniu zawiesić komórki apoptotyczne w świeżej pożywce hodowlanej B w temperaturze ~ 5 x 106 komórek na ml przed użyciem w celu stymulacji komórek reagujących. Alternatywnie, utrwalić umyte komórki apoptotyczne w 0,4% (v/v) paraformaldehydzie w 1x DPBS przez 30 minut, a następnie przemyć trzykrotnie pożywką hodowlaną B, przed zawiesiną w pożywce hodowlanej B.
  8. W razie potrzeby potwierdzić indukcję apoptozy za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu oddzielnego preparatu komórek apoptotycznych (lub rezerwując niektóre komórki do tego celu), jak opisano wcześniej6,9,10,15.
    Uwaga: Wczesne komórki apoptotyczne mają nienaruszone błony komórkowe i pojawiają się jako komórki V-ujemne jodku propidyny (PI) i aneksyny V-dodatnie o zmniejszonej wielkości komórki (w stosunku do komórek żywotnych). Późne komórki apoptotyczne mają nienaruszone błony komórkowe i pojawiają się jako komórki V-dodatnie PI-dodatnie i aneksyny o zmniejszonej wielkości komórki. Przy obecnym protokole typowe preparaty zawierają ~ 85% komórek wczesnej apoptozy i ~ 15% późnej apoptozy.
  9. Dodaj komórki apoptotyczne do BU. Komórki odpowiadające MPT (Protokół 3) w stosunku komórek apoptotycznych do komórek odpowiadających 1:1, bezpośrednio lub po utrwaleniu komórek apoptotycznych przez 30 minut z 0,4% (v/v) paraformaldehydem w 1x DPBS.
    Uwaga: Utrwalenie komórek apoptotycznych przed stymulacją osób reagujących nie powinno wpływać na wyniki, chyba że obserwowane zdarzenia sygnalizacyjne są spowodowane uwolnieniem rozpuszczalnego mediatora (Tabela 1).

3. Przygotowanie nekrotycznego BU. Komórki MPT (Protokół 2)

Uwaga: Ten protokół jest specyficzny dla BU. Komórki MPT jako źródło komórek martwiczych, a ogrzewanie jako metoda indukcji martwicy. Alternatywnie, inna linia komórkowa lub pierwotna hodowla komórkowa może być wykorzystana jako źródło komórek martwiczych, z nekrozą indukowaną przez standardowe protokoły dla tego konkretnego typu komórki i metody indukcji martwicy.

  1. Po przejściu na sterylne polistyrenowe naczynia do hodowli tkankowych poddanych działaniu plazmy próżniowej o średnicy 100 mm, wyhoduj BU. Komórki MPT do zbiegania się w wilgotnej atmosferze 5% (v/v) CO2 w warunkach dopuszczalnych (tj. w temperaturze 37 ºC w pożywce A w ilości 10 ml na szalkę), jak opisano w sekcji 1.2.3.
  2. Przepłukać przylegającą monowarstwę komórek trzykrotnie pożywką hodowlaną B, używając 10 ml na płukanie.
  3. Odłączyć komórki przez dodanie 5 mM EDTA do 1x DPBS wolnego od Ca+2 i Mg+2 w ilości 1 ml na szalkę przez 5 minut. Odessać pożywkę zawierającą EDTA i dodać zawiesinę komórek do sterylnej probówki wirówkowej z polistyrenu o pojemności 15 ml.
  4. Przemyć komórki trzykrotnie przez odwirowanie przez 10 minut przy 500 x g i ponowne zawieszenie w 10 ml DPBS wolnych od Ca+2 i Mg+2 na przemycie.
  5. Po ostatnim płukaniu zawiesić komórki w świeżej pożywce hodowlanej B w temperaturze ~ 5 x 106 komórek na ml.
  6. Wywołać martwicę poprzez podgrzewanie komórek do temperatury 70 ºC przez 45 minut w łaźni wodnej, delikatnie wirując zawiesinę komórek co 10 minut.
  7. Inkubować komórki przez 2 godziny w wilgotnej atmosferzeCO2 o stężeniu 5% (v/v) w temperaturze 37 °C. Zawiesinę komórek należy delikatnie mieszać co 15 minut.
  8. W razie potrzeby potwierdzić indukcję martwicy za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu oddzielnego preparatu komórek martwiczych (lub rezerwując do tego celu niektóre komórki), jak opisano wcześniej6,9,10,15.
    Uwaga: Komórki martwicze mają pęknięte błony komórkowe i wyglądają jak komórki PI-dodatnie o zwiększonym rozmiarze komórki (w stosunku do komórek żywotnych). Przy użyciu obecnego protokołu, typowe preparaty zawierają ≥ 95% komórek martwiczych. Alternatywnie, indukcja martwicy i utrata integralności błony może być potwierdzona przez barwienie błękitem trypanowym.

4. Przygotowanie BU. Komórki odpowiedzi MPT (Protokół 3)

Uwaga: Ten protokół jest specyficzny dla BU. Komórki MPT jako źródło komórek reagujących. Alternatywnie, inna linia komórkowa lub pierwotna hodowla komórkowa może być użyta jako komórki reagujące. Przed użyciem eksperymentalnym stan spoczynku może zostać wywołany przez noc za pomocą standardowych protokołów w laboratorium.

  1. Uprawa BU. Komórki MPT w sterylnych 100 mm szalkach do hodowli tkankowej w warunkach permisywnych w pożywce A w ilości 10 ml na szalkę, aż osiągną ~ 85% konfluencji.
  2. Odessać pożywkę hodowlaną A i przepłukać komórki trzykrotnie pożywką hodowlaną B w ilości 10 ml na płukanie. Surowicę należy zagłodzić komórki przez noc przez 18 do 24 godzin w nawilżonej atmosferze 5% (v/v) CO2 w warunkach niedopuszczalnych (tj. w temperaturze 39 ºC w pożywce hodowlanej B w ilości 10 ml na szalkę), jak opisano w sekcji 1.2.4, w celu wywołania stanu spoczynku. Alternatywnie, hodować komórki w pożywce hodowlanej B plus 10% (v/v) FBS w temperaturze 39 ºC przez jeden dzień przed surowicą głodujących komórek przez noc w pożywce hodowlanej B bez FBS.
  3. Oznaczyć oddzielne naczynie do hodowli tkankowej z zlewającym się BU. Komórki MPT dla każdego warunku doświadczalnego.
  4. Uwzględnij następujące sześć warunków: stymulacja żywotnego BU. Pacjenci z odpowiedzią na MPT z nośnikiem lub naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF) przez 15 minut, po 30-minutowej ekspozycji na brak komórek, komórki apoptotyczne lub komórki martwicze.
    Uwaga: Narażenie na martwe komórki może stymulować lub hamować poziom aktywności danej cząsteczki sygnałowej. Stymulację najlepiej wykryć powyżej niskiego poziomu wyjściowego (np. brak EGF), natomiast zahamowanie najlepiej wykryć przy wysokim poziomie wyjściowym (np. obecność EGF). Ponieważ efekt stymulacji martwymi komórkami jest a priori nieznany, zaleca się przeprowadzenie wszystkich badań zarówno przy nieobecności, jak i obecności EGF.

5. Stymulacja komórek reagujących komórkami apoptozy i nekrotyki (Protokół 4)

  1. Odessać pożywkę hodowlaną B z wcześniej oznakowanych naczyń z resztkowym (pozbawionym surowicy) BU. Komórki odpowiedzi MPT (Protokół 3).
    Uwaga: Po całonocnym posiewie w warunkach niedopuszczalnych, BU. Komórki MPT powinny zachowywać się jak pierwotne hodowle PTEC nerki myszy.
  2. Na 100 mm szalkę dodać 2 ml jednego z pożywki: pożywki B (bez komórek); zawiesiny komórek apoptotycznych w ilości ~ 5 x 106 komórek na ml w pożywce hodowlanej B (Protokół 1); lub zawiesiny komórek martwiczych w ilości ~ 5 x 106 komórek na ml w pożywce hodowlanej B (Protokół 2).
    1. Rozprowadzić zawiesinę martwych komórek o objętości 2 ml równomiernie na naczyniu o średnicy 100 mm i ograniczyć czas do minimum, aby się uspokoiły. Aby to osiągnąć, rozprowadź zawiesinę martwych komórek kropla po kropli za pomocą pipety z szeroką końcówką na całej powierzchni naczyń komórek reagujących. Użyj objętości 2 ml jako kompromisu między zminimalizowaniem czasu osiadania a uniknięciem zlepiania się martwych komórek.
      Uwaga: Zastosowanie zawiesiny martwych komórek jako bodźca pociąga za sobą szereg specjalnych względów, które zostały opisane poniżej bardziej szczegółowo (Tabela 2 i Dyskusja).
    2. Osiągnij stosunek martwych komórek do odpowiedzi ~ 1:1, dodając 2 ml martwych komórek przy ~ 5 x 106 komórek na ml do zlewającej się 100 mm płytki, która zawiera ~ 10 x 106 komórek. Alternatywnie, w celu ustalenia zależności od dawki wszelkich zaobserwowanych zdarzeń sygnalizacyjnych, należy zmieniać stosunek komórek martwych do komórek reagujących w sposób ciągły poprzez stopniowe rozcieńczanie w pożywce hodowlanej B zawiesin martwych komórek przygotowanych w protokołach 1 i 2.
  3. Delikatnie zamieszaj naczynia, a następnie inkubuj w temperaturze 37 ºC w wilgotnej atmosferze 5% (v/v) CO2 .
  4. Po 30 minutach stymulować komórki reagujące nośnikiem lub 50 nM EGF, zgodnie ze wstępnym oznakowaniem szalki hodowlanej.
  5. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% (v/v) CO2 .
  6. Zmyj martwe komórki, dodając 5 ml lodowatego 1x DPBS, obracając naczynie i zasysając płyn do mycia. Powtórz trzy razy.
  7. Natychmiast umieść naczynia z komórkami reagującymi na lód w celu dalszego przetwarzania.
  8. Przygotuj lizaty komórkowe
    1. Przygotować bufor do lizy komórek zawierający: 1× soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS), 10 mM pirofosforanu sodu, 0,5% w/v deoksycholanu, 0,1% w/v SDS, 10% glicerolu i 25 mM fluorku sodu.
      1. Bezpośrednio przed lizą komórek dodaj następujące substancje w dokładnej kolejności podanej we wskazanych stężeniach: mini koktajl inhibitorów proteazy wolnych od EDTA (1 tabletka na 10 ml buforu do lizy), 10% (v/v) Triton X-100, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF) i 10 mM orthovanadan sodu.
    2. Dodać 700 μl lodowatego buforu do lizy komórek na 100 mm naczynie świeżo stymulowanych komórek reagujących na lód z kroku 5.7. Zeskrobać komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść lizat do wstępnie schłodzonych mikroprobówek o pojemności 1,5 ml. Trzymaj rurki na lodzie przez 15 minut.
    3. Sonikuj lizaty na lodzie za pomocą 10 impulsów o częstotliwości 20 Hz, z których każdy trwa krócej niż jedną sekundę. Należy unikać tworzenia się piany na granicy faz gaz/ciecz, ponieważ może to spowodować przegrzanie próbek. Całkowicie zanurz sondę sonikatora w mikroprobówkach zawierających lizaty przed włączeniem sonikatora i wyłącz sonikator przed wyjęciem sondy z lizatów.
    4. Odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, przenieść supernatanty do świeżych, wstępnie schłodzonych mikroprobówek i przechowywać w temperaturze -70 °C.
    5. Wykonać elektroforezę żelową i immunoblotting na supernatantach lizatów, jak opisano wcześniej6,9,10,15.

6. Zapobieganie bezpośredniemu kontaktowi fizycznemu między celami a osobami reagującymi za pomocą półprzepuszczalnej membrany poliwęglanowej (Protokół 5)

  1. Przygotuj BU. Komórki reagujące na MPT zgodnie z Protokołem 3, z jednym wyjątkiem; hodować komórki w sterylnej kulturze tkankowej polistyrenu poddanych działaniu 12-dołkowych klastrów.
  2. W wybranych studzienkach umieść przepuszczalny system nośny zawierający membranę poliwęglanową o grubości 0,4 μm, aby zapobiec fizycznej interakcji między martwymi i reagującymi komórkami. W tym samym eksperymencie należy uwzględnić studzienki kontrolne bez membrany.
  3. Odessać pożywkę hodowlaną B z dołków doświadczalnych BU pozbawionego surowicy. Komórki reagujące na MPT.
  4. Postępuj zgodnie z Protokołem 4 w celu stymulacji komórek reagujących komórkami apoptozy lub martwiczymi, z następującymi modyfikacjami:
    1. Do każdego dołka z 12-dołkowego klastra dodać 0,1 ml jednego z pożywki: pożywki B (brak komórek); zawiesiny komórek apoptotycznych w ilości ~5 x 106 komórek na ml w pożywce hodowlanej B (Protokół 1); lub zawiesiny komórek martwiczych w ilości ~5 x 106 komórek na ml w pożywce hodowlanej B (protokół 2).
      Uwaga: Ponieważ studzienka zlewająca się z 12-dołkowego klastra zawiera ~ 0,5 x 106 komórek, dodanie 0,1 ml martwych komórek przy ~ 5 x 106 komórek na ml daje stosunek martwych komórek do odpowiedzi ~ 1: 1.
    2. Do studzienek zawierających przepuszczalny system nośny dodaj martwe komórki na wierzchu membrany poliwęglanowej 0,4 μm w przepuszczalnym systemie nośnym, aby nie było bezpośredniej fizycznej interakcji między martwymi a reagującymi komórkami.

7. Hamowanie fagocytozy za pomocą cytochalazyny D (Protokół 6)

  1. Przygotuj BU. Komórki odpowiedzi MPT zgodnie z Protokołem 3.
  2. Przygotować inhibitor cytoszkieletu cytochalazynę D w dimetylosulfotlenku (DMSO) w dawce 4 mg/ml (1,000×). Dodaj do wstępnie oznaczonych potraw BU. Komórki reagujące na MPT 10 μl nośnika (DMSO) lub 10 μl cytochalazyny D, aby osiągnąć końcowe stężenie 4 μg/ml w 10 ml pożywki hodowlanej B.
    Uwaga: Przy tym stężeniu cytochalazyny D, fagocytoza przez BU. Komórki MPT i linia komórkowa makrofagów zostały zahamowane o ≥90%9,10.
  3. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% (v/v)CO2
    4. .
  4. Postępuj zgodnie z Protokołem 4 w celu stymulacji komórek reagujących komórkami apoptozy lub martwiczymi.
  5. W razie potrzeby potwierdzić hamowanie fagocytozy martwych komórek za pomocą cytometrii przepływowej, stosując oddzielny preparat komórek martwych i reagujących (lub komórek zarezerwowanych do tego celu), jak opisano wcześniej9,10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Na Rysunku 1 przedstawiono schemat obrazujący harmonogram i kluczowe etapy przygotowania komórek apoptotycznych (Protokół 1) i komórek nekrotycznych (Protokół 2), a także stymulację komórek odpowiadających zawiesinami komórek apoptotycznych i nekrotycznych (Protokół 4).

Na Rysunku 2 przedstawiamy reprezentatywne wyniki ukazujące wpływ komórek apoptotycznych na fosforylację dwóch izoform kinazy s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy tutaj protokół charakteryzujący wewnątrzkomórkowe zdarzenia sygnalizacyjne indukowane w żywych komórkach po ich ekspozycji na komórki poddawane apoptozie lub innym formom śmierci komórki. Protokół podkreśla wiele mechanizmów, dzięki którym ekspozycja na komórki apoptotyczne może modulować wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe w żywotnych komórkach reagujących. Mechanizmy te obejmują: interakcję (poprzez cząsteczki mostkujące lub determinanty powierzchniowe na martwej komórce lub jej zrzuconych pęcherzykach i m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana, w całości lub w części, przez fundusze instytucjonalne od dr José A. Arruda i Sekcji Nefrologii, University of Illinois w Chicago (do J. S. L.); oraz fundusze z Wydziału Medycyny Uniwersytetu McGill i Instytutu Badawczego Centrum Zdrowia Uniwersytetu McGill (dla J. R.)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały do hodowli komórkowych
DMEM, 1x z [4,5 g/L] glukozą, ʟ-glutaminą i pirogronianem soduMediatech (Manassas, VA)10-013-CV
HyClone Fetal Clone II, płodowa surowica bydlęcaGE Healthcare (Logan, UT)SH30066.03dodać 10% (v/v)  do pożywki hodowlanej
Penicylina-Streptomycyna-Glutamina, 100xLife Technologies (Grand Island, NY)10378-016dodać 100 jednostek/ml do pożywki hodowlanej Interferon A i B
γ, rekombinowany u myszy, z Escherichia coliCalbiochem, Millipore (Billerica, MA)407303dodać 10 jednostek/ml do pożywki
A Naczynia z polistyrenu polistyrenowego poddanego kulturze tkankowej Falcon, niepirogenneCorning (Durham, NC)353003sterylne,
Probówki wirówkowe do polistyrenu Falcon o średnicy 100 mm, stożkowe dnoCorning (Durham, NC)352095sterylne, 15 ml
Trypsyna-EDTA, 0,05%, GibcoFisher (Waltham, MA)25300062sterylne, 100 mL
NazwaFirmaKatalogKomentarze
Chemicals and inhibitors
Staurosporine z Streptomyces sp.Sigma (St. Louis, MO)S4400zastosowanie w [1 μ g / mL] przez 3 godziny w celu wywołania apoptozy
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), [1 mg / ml]Milipore (Billerica, MA)EA140stosować przy 50 nM w celu stymulacji komórek reagujących
UltraPure, 0,5 M EDTA, pH 8,0Life Technologies (Grand Island, NY)15575-038użyć 5 mM do odłączenia przylegających komórek
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%MP Biomedicals (Santa Ana, CA)91691049do barwienia
martwych komórekRoztwór paraformaldehydu, 4% w DPBSAffymetrix (Santa Clara, CA)19943użyj 0,4% (v/v) w 1x DPBS do utrwalenia komórek
buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS), 1x, GibcoLife Technologies (Grand Island, NY)14040133roztwór podstawowy
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS), Ca2+- i Mg2+, 1x, GibcoLife Technologies (Grand Island, NY)14190367roztwór podstawowy
Cytochalazyna D, 4 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO), z Zygosporium mansoniiSigma (St. Louis, MO)C8273zastosowanie w [4 μ g / mL] w celu hamowania fagocytozy
dimetylosulfotlenku (DMSO)Sigma (St. Louis, MO)D2650rozpuszczalnik do cytochalazyny D
[nagłówek]
Składniki buforu do lizy komórek
sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS), 10x, pH 7,4BioRad (Hercules, CA)1706435do buforu do lizy komórek
Pirofosforan soduSigma-Aldrich (St. Louis, MO)22136810 mM do buforu do lizy komórek
Deoksycholan soduSigma-Aldrich (St. Louis, MO)D67500,5% w/v do buforu do lizy komórek
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)L3771 0,1% w/v dla buforu do lizy komórek
GlycerolSigma-Aldrich (St. Louis, MO)G551610% do buforu do lizy komórek
Fluorek soduSigma-Aldrich (St. Louis, MO)45002225 mM do buforu do lizy komórek
Kompletna mini tabletka koktajlowa z inhibitorem proteazy bez EDTARoche Diagnostics (Indianapolis, IN)4693159001do buforu do lizy komórek, 1 tabletka na 10 ml buforu
Triton X-100Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)T878710% dla buforu do lizy komórek
Ditiothreitol (DTT)MP Biomedicals (Santa Ana, CA)11DTT000051 mM do buforu do lizy komórek
Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)MP Biomedicals (Santa Ana, CA)48002631 mM do buforu do lizy komórek
Ortowanat soduMP Biomedicals (Santa Ana, CA)215966410 mM do buforu
do lizy komórekNazwaFirmaKatalogKomentarze
Equipment
Sorvall T6000B wirówkaDu Pont (Wilmington, DE)T6000B
Fisher Tissuemat, kąpiel wodnaFisher (Waltham, MA)
Sonic Dismembrator (sonikator), model 100Fisher (Waltham, MA)
Miscellaneous
Komora zliczania komórek, NeubauerHawksley (Lancing, Sussex, Wielka Brytania)AC2000
Annexin V-FITC Zestaw do wykrywania apoptozy IIMillipore (Billerica, MA)CBA059do barwienia PI i Aneksyny V w celu określenia etapu apoptozy
Probówki mikromikromikrocntrifużowe Eppendorf, 1,5 mlSigma-Aldrich (St. Louis, MO)T9661
Przepuszczalny nośnik Transwell, 0,4 μ m membrana poliwęglanowaCorning (Corning, NY)3413sterylna, polistyren, poddana obróbce kultur tkankowych
NazwaFirmaKatalogKomentarze
Przeciwciała
Kinaza syntazy fosfoglikogenu-3&alfa;/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), przeciwciało poliklonalneTechnologia sygnalizacji komórkowej9331królicze przeciwciało poliklonalne
Antobody dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) ( (14C10) ) Technologiasygnalizacji komórkowej2118przeciwciało monoklonalne królika
Sól fizjologiczna Sól fizjologiczna

Bibliografia

  1. Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
  2. Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
  3. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748(2013).
  4. Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
  5. Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
  6. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
  7. Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
  8. Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
  9. Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
  10. Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
  11. Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
  12. Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
  13. Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
  14. Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
  15. Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
  16. Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
  17. Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13(2010).
  18. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
  19. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
  20. Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
  21. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51(2009).
  22. Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
  23. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
  24. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
  25. Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
  26. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
  27. Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki odpowiadaj ceinterakcja kom rkowafosforylacja GSK3indukcja apoptozyindukcja nekrozyprotok hodowli kom rkowejhamowanie fagocytozyinterakcja fizyczna
Identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.