Proponujemy protokół do badania transportu naładowanych i nienaładowanych cząsteczek przez chrząstkę stawową za pomocą niedawno opracowanych metod eksperymentalnych i numerycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Eksperymentalny protokół elementów skończonych do badania transportu neutralnych i naładowanych substancji rozpuszczonych przez chrząstkę stawową
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest wyniszczającą chorobą, która wiąże się ze zwyrodnieniem chrząstki stawowej i kości podchrzęstnej. Zwyrodnienie chrząstki stawowej znacznie upośledza jej funkcję nośną, ponieważ ulega ona ogromnej degradacji chemicznej, tj. utracie proteoglikanów i zaburzeniu włókien kolagenowych. Jednym z obiecujących sposobów badania mechanizmów uszkodzeń chemicznych podczas choroby zwyrodnieniowej stawów jest wystawienie próbek chrząstki na działanie zewnętrznej substancji rozpuszczonej i monitorowanie dyfuzji cząsteczek. Stopień uszkodzenia chrząstki (tj. stężenie i konfiguracja niezbędnych makrocząsteczek) jest związany z utratą energii kolizyjnej zewnętrznych substancji rozpuszczonych, podczas gdy poruszanie się po chrząstce stawowej tworzy inne charakterystyki dyfuzji w porównaniu ze zdrową chrząstką. W tym badaniu wprowadzamy protokół, który składa się z kilku kroków i opiera się na wcześniej opracowanym eksperymentalnym micro-Computed Tomography (micro-CT) i modelowanie metodą elementów skończonych. Transport naładowanych i nienaładowanych cząsteczek jodowych jest najpierw rejestrowany za pomocą mikro-CT, a następnie stosuje się dwufazowe i wielofazowe modele elementów skończonych w celu uzyskania współczynników dyfuzji i stałych gęstości ładunku w strefach chrząstki.
Wprowadzenie
Transport molekularny odgrywa istotną rolę w homeostazie stawów, dostarczaniu leków do chrząstki stawowej i obrazowaniu chrząstki z kontrastem 1,2,3. Czynniki takie jak integracja i nienaruszalność chrząstki, ładunek i wielkość substancji rozpuszczonej, a także osmolalność i stężenie kąpieli w kontakcie z chrząstką mogą wpływać na szybkość transportu 4,5,6. Transport substancji rozpuszczonych, zarówno obojętnych, jak i naładowanych, może być różny między strefami chrząstki stawowej, ponieważ każda strefa składa się z różnych stężeń i orientacji głównych cząsteczek macierzy zewnątrzkomórkowej, a mianowicie proteoglikanów (PG) i kolagenu typu II 1,7,8,9,10,11. Co ważniejsze, transport naładowanych substancji rozpuszczonych może być w dużym stopniu zależny od stężenia proteoglikanów zawierających ujemne stałe ładunki w macierzy zewnątrzkomórkowej, które wzrasta w całej chrząstce stawowej 8,9. Parametry te, w szczególności stała gęstość ładunku (FCD), orientacja włókien kolagenowych i zmienność zawartości wody w chrząstce, mogą ulegać zmianom w miarę postępu choroby zwyrodnieniowej stawów (OA), co wskazuje na znaczenie badania dyfuzji przez chrząstkę.
W obecnym badaniu, protokół oparty na wcześniej przeprowadzonych badaniach eksperymentalnych i obliczeniowych 6,8,9 jest proponowany do dokładnego badania dyfuzji w różnych warunkach brzegowych przy użyciu neutralnych i naładowanych substancji rozpuszczonych w modelu dyfuzji w skończonej kąpieli. Proponowane metody składają się z obrazowania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) systemu obejmującego chrząstkę i kąpiel skończoną, wspieranego przez zaawansowane dwufazowe modele substancji rozpuszczonej i wielofazowe modele elementów skończonych. Modele te umożliwiają uzyskanie współczynników dyfuzji cząsteczek obojętnych i naładowanych oraz FCD w różnych strefach chrząstki stawowej. Korzystając z tych modeli, można lepiej zrozumieć zachowanie dyfuzyjnych neutralnych i naładowanych cząsteczek, które można wykorzystać do zbadania interakcji między chrząstką a nakładającą się na nią skończoną kąpielą.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Przedstawiony tutaj protokół został zaadaptowany z procedur eksperymentalnych i obliczeniowych opisanych w niedawnych publikacjach badawczych 6,8,9. Protokół został zilustrowany na Rysunku 1.
Materiały kadaweryczne zostały pobrane za zgodą wydziału weterynarii Uniwersytetu w Utrechcie.
1. Przygotowanie próbki i kąpieli
- Wywiercić cylindryczne zatyczki kostno-chrzęstne (średnica 8,5 mm) z kondyli kości udowej koni pobranych z trupów, używając specjalnie wykonanego wiertła (Rysunek 1), rozpylając jednocześnie chłodny roztwór soli fosforanowej (PBS), aby zapobiec przegrzaniu i późniejszemu uszkodzeniu chrząstki.
- Zastosować termokurczliwą rurkę plastikową na zatyczkach kostno-chrzęstnych, aby zminimalizować boczna dyfuzję nakładanej kąpieli.
- Umieścić zatyczkę kostno-chrzęstną chrząstką do góry wewnątrz plastikowej rurki termokurczliwej, a następnie poddać działaniu gorącego powietrza. Na powierzchni chrząstki umieścić wilgotne kawałki waty, aby zapobiec uszkodzeniom termicznym.
- Przygotować oddzielnie kąpiele o ograniczonej objętości zawierające substancje naładowane (np. 650 µL, 420 mM, ioksaglan, masa cząsteczkowa (MW) = 1 269 Da, ładunek = -1) oraz obojętne (650 µL, 420 mM, jodiksanol, MW = 1 550 Da).
- Nanieść przygotowane kąpiele na powierzchnię chrząstki za pomocą strzykawki i umieścić korek na owiniętej próbce, aby zapobiec parowaniu podczas eksperymentów w temperaturze pokojowej (RT) (Rysunek 2A). W celu zbadania transportu substancji obojętnej nanieść kąpiel z jodiksanolem, a w celu zbadania transportu substancji naładowanej ujemnie nanieść kąpiel z ioksaglanem na powierzchnię chrząstki.
2. Obrazowanie i przetwarzanie obrazów
- Umieść zawinięte próbki izolowane korkiem w specjalnie wykonanym uchwycie przymocowanym do zmotoryzowanego stołu mikro-CT. Próbkę należy ułożyć tak, aby powierzchnia chrząstki pokryta roztworem środka kontrastowego była skierowana do góry.
- Za pomocą mikro-CT (rozmiar woksela 40 × 40 × 40 µm3, czas skanowania 2 min, napięcie lampy 90 kV i prąd lampy 180 µA) przeprowadź skanowanie pola widzenia obejmującego chrząstkę, płytkę podchrzęstną i ograniczoną kąpiel w kilku punktach czasowych, aż do osiągnięcia stanu równowagi (48 h) (Rysunek 2A). Stan równowagi zostaje osiągnięty, gdy wartości stężeń nie zmieniają się w czasie.
- Zarejestruj obrazy 3D z różnych punktów czasowych w odniesieniu do obrazu początkowego, aby ułatwić pozycjonowanie obszaru zainteresowania (ROI) przy użyciu oprogramowania producenta (np. Analyze).
- Przed przetworzeniem obrazów za pomocą oprogramowania producenta, przekonwertuj zrekonstruowane 3D obrazy mikro-CT na stos 2D plików w formacie Tagged Image File Format (TIFF).
- W oprogramowaniu przeprowadź globalną segmentację (ImageJ>Adjust>Threshold) chrząstki od kości podchrzęstnej i znajdującej się nad nią kąpieli.
- Wyznacz średnią wartość szarości chrząstki w różnych punktach czasowych (ImageJ>Analyze>Measure), korzystając z maski chrząstki wygenerowanej w poprzednim kroku.
- Znając początkowe stężenie w kąpieli oraz początkowe stężenie środka kontrastowego w chrząstce, użyj liniowej krzywej kalibracyjnej, aby przeliczyć średnie wartości szarości na rzeczywiste stężenia substancji rozpuszczonych. Wcześniejsze dane potwierdzają, że wartości szarości zachowują liniową zależność od stężenia środków kontrastowych.
- Przedstaw zależności stężeń substancji rozpuszczonych od eksperymentalnych punktów czasowych na wykresie.
3. Modelowanie obliczeniowe
UWAGA: Przyjęto, że dyfuzja w tym problemie zachodzi w 1D (wzdłuż osi z), co jest zgodne z eksperymentalnym warunkiem brzegowym. W związku z tym geometria mogła zostać stworzona w sposób dowolny.
- Opracowanie modeli wielostrefowych chrząstki opartych na skończonej kąpieli: 1) chrząstka składająca się ze strefy powierzchownej (20% całkowitej grubości chrząstki), strefy środkowej (50% całkowitej grubości chrząstki) oraz strefy głębokiej (30% całkowitej grubości chrząstki) 12 oraz 2) skończona kąpiel w programie FEBio 13,14 (Rysunek 2B).
- Przypisanie właściwości mechanicznych i fizycznych różnych stref chrząstki oraz kąpieli w programie FEBio. Przyjęto, że moduł Younga (10 MPa) jest wystarczająco wysoki, aby przeciwdziałać ciśnieniu osmotycznemu wywieranemu przez znajdującą się powyżej kąpiel, a tym samym chronić chrząstkę przed nadmiernymi odkształceniami.
- Należy zastosować przepuszczalność hydrauliczną 10-3 mm4/Ns i współczynnik Poissona wynoszący 0. W symulacjach należy użyć rzeczywistego współczynnika dyfuzji substancji rozpuszczonej w kąpieli 8,9.
- Generowanie siatki (8-węzłowe trójliniowe elementy sześcienne) i jej zagęszczenie w pobliżu granic (Rysunek 2B) 8,9.
- Model dwufazowy z substancją rozpuszczoną
- Zastosowanie początkowego stężenia substancji rozpuszczonej w kąpieli oraz odpowiadającego mu ciśnienia efektywnego. Opis ciśnienia efektywnego znajduje się w 9,15.
- Uruchomienie modelu w trybie przejściowym w celu uzyskania krzywych zależności stężenia substancji rozpuszczonej od czasu, zgodnie z określonymi współczynnikami dyfuzji w różnych strefach chrząstki.
- Model wielofazowy
UWAGA: Fluktuacje elektryczne między kąpielą a tkanką można wyeliminować poprzez dodanie dwóch jednowartościowych przeciwjonów zarówno do kąpieli, jak i do tkanki.- Dla modeli stanu stacjonarnego: należy zastosować te same efektywne ciśnienia płynu i stężenia w chrząstce i znajdującej się powyżej kąpieli, zwiększając jednocześnie FCD do pożądanej wartości.
- Dla modeli przejściowych: należy stworzyć dobrze wymieszaną skończoną kąpiel, utrzymując współczynnik dyfuzji substancji rozpuszczonej w kąpieli na wystarczająco wysokim poziomie. Następnie należy wprowadzić substancję rozpuszczoną z interfejsu kąpiel-powietrze do kąpieli, aby osiągnąć pożądane stężenie.
- Tryb przejściowy: należy usunąć warunek brzegowy określonego stężenia substancji rozpuszczonej z poprzedniego kroku i przywrócić rzeczywisty współczynnik dyfuzji dla skończonej kąpieli.
- Uruchomienie modelu w celu uzyskania krzywych zależności stężenia substancji rozpuszczonej od czasu w oparciu o zastosowane FCD i współczynniki dyfuzji w różnych strefach chrząstki.
- Interfejs FEBio-MATLAB
- Opracowanie kodu w programie MATLAB do automatycznego przeprowadzania symulacji w programie FEBio i wykreślania krzywych zależności stężenia od czasu (interfejs FEBio-MATLAB) 8,9.
- Zmiana współczynników dyfuzji i FCD w strefach chrząstki przy użyciu interfejsu FEBio-MATLAB. Uruchomienie modeli w programie FEBio i wyodrębnienie krzywych zależności stężenia substancji rozpuszczonej od czasu 8,9.
- Porównanie uzyskanych krzywych zależności stężenia substancji rozpuszczonej od czasu z danymi eksperymentalnymi i wyznaczenie zestawów współczynników dyfuzji oraz FCD w różnych strefach chrząstki na podstawie minimalnego błędu średnio kwadratowego (RMSE) 8,9.
Rycina 1: Układ doświadczalny. A) Procedura pobierania próbek z użyciem specjalnie wykonanego wiertła. B) Procedura obrazowania mikro-CT w celu monitorowania procesu dyfuzji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Schemat. A) Projekt eksperymentalny. B) Wielostrefowy model obliczeniowy składający się z ograniczonej kąpieli oraz strefy powierzchownej, środkowej i głębokiej chrząstki wraz z powiązaną siatką. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki zostały zaczerpnięte z poprzednich prac badawczych 6,8,9,16.
W chorobie zwyrodnieniowej stawów (OA) chrząstka stawowa ulega znacznym zmianom, przede wszystkim utracie glikozoaminoglikanów (GAG) oraz uszkodzeniu włókien kolagenowych. 17<...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiliśmy protokół eksperymentalny połączony z procedurą modelowania elementów skończonych w celu zbadania dyfuzji neutralnych i naładowanych substancji rozpuszczonych w chrząstce stawowej. Zgodnie z naszymi ostatnimi badaniami, zaproponowane modele mogą dokładnie opisywać transport zarówno neutralnych (dwufazowo-rozpuszczonych), jak i ujemnie naładowanych (wielofazowych) substancji rozpuszczonych przez różne strefy chrząstki stawowej 8,9. Powszechnie uważa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby wyrazić swoją wdzięczność Panu/Pani Jeroenowi van den Bergowi i Panu Matthijsowi Wassinkowi z grupy mechaników rozwoju na UMC Utrecht za pomoc w procesie owijania czopów kostno-chrzęstnych. Praca ta została wsparta grantem z Dutch Arthritis Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Hexabrix | Guerbet | 15HX005D | Ujemnie naładowany środek kontrastowy |
| Visipaque | GE healthcare | 12570511 | Nuetral Środek kontrastowy |
| PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem) | Technologie życia | 10010023 | Średnia |
| mikrotomografia komputerowa | Perkin Elmer | Monitorowanie dyfuzji | |
| Osmometr do zamarzania | Zaawansowany Przyrządy | Roztwór pomiarowy osmolalność |
Bibliografia
- Arkill, K. P., Winlove, C. P. Solute transport in the deep and calcified zones of articular cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 16 (6), 708-714 (2008).
- Chin, H. C., Moeini, M., Quinn, T. M. Solute transport across the articular surface of injured cartilage. Arch Biochem Biophys. 535 (2), 241-247 (2013).
- Leddy, H. A., Guilak, F. Site-specific effects of compression on macromolecular diffusion in articular cartilage. Biophys J. 95 (10), 4890-4895 (2008).
- Leddy, H. A., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Annals of Biomedical Engineering. 31 (7), 753-760 (2003).
- Gu, W. Y., Yao, H. Effects of hydration and fixed charge density on fluid transport in charged hydrated soft tissues. Ann Biomed Eng. 31 (10), 1162-1170 (2003).
- Pouran, B., Arbabi, V., Zadpoor, A. A., Weinans, H. Isolated effects of external bath osmolality, solute concentration, and electrical charge on solute transport across articular cartilage. Medical Engineering and Physics. 38 (12), 1399-1407 (2016).
- Kulmala, K. A. M., et al. Diffusion coefficients of articular cartilage for different CT and MRI contrast agents. Medical Engineering & Physics. 32 (8), 878-882 (2010).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Transport of Neutral Solute Across Articular Cartilage: The Role of Zonal Diffusivities. Journal of Biomechanical Engineering. 137 (7), 071001-071001 (2015).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. J Biomech. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Combined artificial neural networks for robust estimation of the diffusion coefficients across cartilage. 22nd Congress of the European Society of Biomechanics, Lyon, France, , (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Combined inverse-forward artificial neural networks for fast and accurate estimation of the diffusion coefficients of cartilage based on multi-physics models. Journal of Biomechanics. , (2016).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The Basic Science of Articular Cartilage: Structure, Composition, and Function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Holzapfel, G. A., Kuhl, E. Ch. 17. Computer Models in Biomechanics. , Springer. Netherlands. 231-249 (2013).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Multiphasic Finite Element Framework for Modeling Hydrated Mixtures With Multiple Neutral and Charged Solutes. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (11), 111001-111001 (2013).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Transport of neutral solute across articular cartilage and subchondral plate. 22nd Congress of the European Society of Biomechanics, Lyon, France, , (2016).
- Pouran, B., Arbabi, V., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Application of multiphysics models to efficient design of experiments of solute transport across articular cartilage. Comput Biol Med. 78, 91-96 (2016).
- Hosseini, S. M., Wu, Y., Ito, K., Donkelaar, C. C. The importance of superficial collagen fibrils for the function of articular cartilage. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 41-51 (2013).
- Alexopoulos, L. G., Williams, G. M., Upton, M. L., Setton, L. A., Guilak, F. Osteoarthritic changes in the biphasic mechanical properties of the chondrocyte pericellular matrix in articular cartilage. Journal of Biomechanics. 38 (3), 509-517 (2005).
- Felson, D. T., et al. Osteoarthritis: new insights. Part 1: the disease and its risk factors. Ann Intern Med. 133 (8), 635-646 (2000).
- Kokkonen, H. T., Jurvelin, J. S., Tiitu, V., Toyras, J. Detection of mechanical injury of articular cartilage using contrast enhanced computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 19 (3), 295-301 (2011).
- Raya, J. G., et al. Diffusion-tensor imaging of human articular cartilage specimens with early signs of cartilage damage. Radiology. 266 (3), 831-841 (2013).
- Tavakoli Nia, H., et al. Aggrecan Nanoscale Solid-Fluid Interactions Are a Primary Determinant of Cartilage Dynamic Mechanical Properties. ACS Nano. 9 (3), 2614-2625 (2015).
- Arbabi, V., Campoli, G., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Estimation of cartilage properties using indentation tests, finite element models, and artificial neural networks. 11th World Congress on Computational Mechanics & 5th European Conference on Computational Mechanics, Barcelona, Spain, , (2014).
- Arbabi, V., Pouran, B., Campoli, G., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Determination of the mechanical and physical properties of cartilage by coupling poroelastic-based finite element models of indentation with artificial neural networks. Journal of Biomechanics. 49 (5), 631-637 (2016).
- Kokkonen, H. T., et al. Computed tomography detects changes in contrast agent diffusion after collagen cross-linking typical to natural aging of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1190-1198 (2011).
- Decker, S. G., Moeini, M., Chin, H. C., Rosenzweig, D. H., Quinn, T. M. Adsorption and Distribution of Fluorescent Solutes near the Articular Surface of Mechanically Injured Cartilage. Biophysical Journal. 105 (10), 2427-2436 (2013).
- Silvast, T. S., Jurvelin, S. J., Tiitu, V., Quinn, T. M., Töyräs, J. Bath Concentration of Anionic Contrast Agents Does Not Affect Their Diffusion and Distribution in Articular cartilage In Vitro. Cartilage. 4 (1), 42-51 (2013).
- Silvast, T. S., Jurvelin, J. S., Lammi, M. J., Töyräs, J. pQCT study on diffusion and equilibrium distribution of iodinated anionic contrast agent in human articular cartilage - associations to matrix composition and integrity. Osteoarthritis and Cartilage. 17 (1), 26-32 (2009).
- Pouran, B., Arbabi, V., Villamar, J., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Contrast agent's transport across healthy articular cartilage under various bath conditions. Orthopaedic Research Society Annual Meeting, Las Vegas, Nevada, , (2015).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Application of a biphasic-solute model in predicting diffusive properties of osteochondral interface. International Workshop on Osteoarthritis Imaging (IWOAI), Oulo, Finland, , (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
