Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej, biofizyki i testów funkcjonalnych do określenia mechanizmów rządzących rozpoznawaniem antygenów nowotworowych przez receptory komórek T

DOI:

10.3791/54991

⸱

6 lutego 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Infection and Immunity and Systems Immunity Research Institute, Cardiff University, 2Department of Oncology, University Hospital of Lausanne (CHUV), 3Ludwig Insitutue for Cancer Research, Lausanne Branch, University of Lausanne

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metody, które powszechnie stosujemy w laboratorium, aby określić, jak natura interakcji między receptorem limfocytów T a antygenami nowotworowymi, prezentowana przez ludzkie antygeny leukocytów, reguluje funkcjonalność komórek T; metody te obejmują produkcję białek, krystalografię rentgenowską, biofizykę i eksperymenty z funkcjonalnymi komórkami T.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie cytotoksyczne limfocyty T CD8+ (CTL) są znane z tego, że odgrywają ważną rolę w kontroli nowotworów. Aby wykonać tę funkcję, receptor limfocytów T z ekspresją powierzchniową komórki (TCR) musi funkcjonalnie rozpoznawać peptydy pochodzące z guza (pHLA) ograniczone ludzkim antygenem leukocytarnym (HLA). Jednak my i inni wykazaliśmy, że większość TCR wiąże się nieoptymalnie z antygenami nowotworowymi. Odkrycie mechanizmów molekularnych, które definiują to słabe rozpoznanie, może pomóc w opracowaniu nowych terapii celowanych, które pozwolą obejść te niedociągnięcia. Rzeczywiście, obecne terapie, którym brakuje tego zrozumienia molekularnego, nie są powszechnie skuteczne. W tym miejscu opisujemy metody, które powszechnie stosujemy w laboratorium, aby określić, w jaki sposób charakter interakcji między TCR a pHLA wpływa na funkcjonalność limfocytów T. Metody te obejmują generowanie rozpuszczalnych TCR i pHLA oraz stosowanie tych odczynników do krystalografii rentgenowskiej, analizy biofizycznej i barwienia komórek T specyficznych dla antygenu za pomocą multimerów pHLA. Korzystając z tych podejść i kierując się analizą strukturalną, możliwe jest zmodyfikowanie interakcji między TCR i pHLA, a następnie przetestowanie, jak te modyfikacje wpływają na rozpoznawanie antygenu komórek T. Odkrycia te pomogły już wyjaśnić mechanizm rozpoznawania wielu antygenów nowotworowych przez limfocyty T i mogą ukierunkować rozwój zmienionych peptydów i zmodyfikowanych TCR w nowych terapiach przeciwnowotworowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krystalografia rentgenowska była i nadal będzie niezwykle potężną techniką pozwalającą zrozumieć naturę oddziaływań ligand-receptor. Wizualizując te interakcje w szczegółach atomowych, możliwe jest nie tylko ujawnienie mechanizmów molekularnych rządzących wieloma procesami biologicznymi, ale także bezpośrednia zmiana interfejsów kontaktowych w celu uzyskania korzyści terapeutycznych. W połączeniu z technikami, takimi jak powierzchniowy rezonans plazmonowy i izotermiczna kalorymetria miareczkowa (by wymienić tylko kilka), takie modyfikacje mogą być następnie analizowane biofizycznie w celu oceny bezpośredniego wpływu na powinowactwo wiązania, kinetykę oddziaływania i termodynamikę. Wreszcie, przeprowadzając eksperymenty funkcjonalne na odpowiednich typach komórek, można uzyskać szczegółowy obraz molekularnego i funkcjonalnego wpływu modyfikacji interakcji receptor-ligand, dostarczając bardzo konkretnych informacji mechanistycznych. Ogólnie rzecz biorąc, tego typu metody zapewniają obraz rozdzielczości atomowej umożliwiający określenie, jak działają systemy biologiczne, z towarzyszącymi implikacjami dla postępów diagnostycznych i terapeutycznych.

Nasze laboratorium rutynowo wykorzystuje te techniki do badania receptorów, które pośredniczą w odporności ludzkich limfocytów T na patogeny i raka, w autoimmunizacji i podczas transplantacji. Tutaj skupiamy się na odpowiedzi ludzkich limfocytów T CD8 + na raka, w której pośredniczy interakcja między receptorem komórek T (TCR) a peptydami pochodzącymi z nowotworu (pHLA) ograniczonymi ludzkim antygenem leukocytów (HLA). Jest to ważne, ponieważ chociaż limfocyty T CD8 + są w stanie celować w komórki rakowe, my i inni wcześniej wykazaliśmy, że przeciwnowotworowe TCR nieoptymalnie wiążą się z pokrewnym pHLA1,2. W związku z tym wiele laboratoriów próbowało zmienić TCR3,4,5 lub ligand peptydowy6,7,8 w celu zwiększenia immunogenności i lepszego celowania w komórki rakowe. Jednak te podejścia nie zawsze są skuteczne i mogą mieć poważne skutki uboczne, w tym toksyczność poza celem4,9,10. Dalsze badania nad mechanizmami molekularnymi, które rządzą rozpoznawaniem antygenów nowotworowych przez limfocyty T, będą miały zasadnicze znaczenie dla przezwyciężenia tych niedoborów.

W obecnym badaniu skupiliśmy się na odpowiedziach na autologiczne komórki czerniaka przez limfocyty T CD8+ specyficzne dla fragmentu dyferencyjnej antygenu melanocytów glikoproteiny 100 (gp100), gp100280-288, prezentowanej przez HLA-A*0201 (najczęściej wyrażana ludzka klasa PHLA I). Antygen ten był szeroko badanym celem immunoterapii czerniaka i został opracowany jako tak zwany "heteroklityczny" peptyd, w którym walina zastępuje alaninę w pozycji kotwiczenia 9 w celu poprawy stabilności pHLA11. Podejście to zostało wykorzystane do zwiększenia indukcji CTL reagujących na czerniaka in vitro i zostało z powodzeniem zastosowane w badaniach klinicznych12. Jednak modyfikacje reszt peptydowych mogą mieć nieprzewidywalny wpływ na swoistość limfocytów T, o czym świadczy słaba skuteczność większości heterolitycznych peptydów w klinice6,13. Rzeczywiście, inna heteroklityczna forma gp100280-288, w której reszta peptydowa Glu3 została podstawiona przez Ala, zniosła rozpoznanie przez poliklonalną populację limfocytów T specyficznych dla gp100280-28814,15. Wcześniej wykazaliśmy, że nawet niewielkie zmiany w resztach kotwiczących peptydów mogą znacząco zmienić rozpoznawanie limfocytów T w nieprzewidywalny sposób6,16. W związku z tym badanie skupiło się na zbudowaniu bardziej szczegółowego obrazu tego, w jaki sposób limfocyty T CD8 + rozpoznają gp100 i jak modyfikacje interakcji między TCR a pHLA mogą wpływać na tę funkcję.

Tutaj wygenerowaliśmy wysoce czyste, rozpuszczalne formy dwóch TCR-ów specyficznych dla gp100280-288 przedstawionych przez HLA-A*0201 (A2-YLE), jak również naturalne i zmienione formy pHLA. Odczynniki te wykorzystano do wytworzenia kryształów białka w celu rozwiązania trójskładnikowej struktury atomowej ludzkiego TCR w kompleksie z heteroklityczną formą A2-YLE, a także dwoma zmutowanymi pHLA w postaci nieligowanej. Następnie zastosowaliśmy podejście polegające na skanowaniu peptydów, aby zademonstrować wpływ podstawień peptydów na TCR, przeprowadzając dogłębne eksperymenty biofizyczne. Na koniec wygenerowaliśmy genetycznie zmodyfikowaną linię limfocytów T CD8 +, przeprogramowaną do ekspresji jednego z TCR specyficznych dla A2-YLE, w celu przeprowadzenia eksperymentów funkcjonalnych w celu przetestowania biologicznego wpływu różnych modyfikacji peptydów. Dane te pokazują, że nawet modyfikacje reszt peptydowych, które znajdują się poza motywem wiązania TCR, mogą mieć nieprzewidywalny efekt domina na sąsiednie reszty peptydowe, które znoszą wiązanie TCR i rozpoznawanie limfocytów T. Nasze odkrycia stanowią pierwszy przykład mechanizmów strukturalnych leżących u podstaw rozpoznawania przez limfocyty T tego ważnego celu terapeutycznego w czerniaku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekspresja białka

  1. Twórz konstrukty genów do generowania rozpuszczalnych TCR i pHLA, jak szczegółowo opisano wcześniej17,18. Zaprojektuj każdą konstrukcję z 5' BamH1 i 3' miejscem restrykcyjnym EcoR1 do wstawienia do wektora pGMT7.
  2. Przekształć E. coli Rosetta (DE3)pLysS za pomocą wektora plazmidowego pochodzącego z pGMT7 zawierającego sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania, inkubując 1 μl plazmidu o stężeniu 50-200 ng/μl z 5 μl E. coli przez 5 minut w temperaturze 4 °C, 2 minuty w temperaturze 42 °C i 5 minut w temperaturze 4 °C, i pozostawić na noc w temperaturze 37 °C na płytce agarowej LB uzupełnionej 50 mg/l karbenicyliny.
  3. Zbieraj pojedyncze kolonie i hoduj w temperaturze 37 °C i 220 obr./min w 30 ml pożywki TYP (16 g/l tryptonu, 16 g/l ekstraktu drożdżowego i 5 g/l HK2O4) uzupełnionej 100 μM karbenicyliną, aż zawiesina osiągnie gęstość optyczną (OD600) między 0,4 a 0,6.
  4. Indukować produkcję białka w podwielokrotności 5 ml przez wprowadzenie 0,5 mM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) przez 3 godziny. Zachować 20 μl zawiesiny z indukcją i bez indukcji do analizy elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i wybarwić żel.
  5. Dodać kultury starterowe do 1 l TYPU uzupełnionego karbenicyliną o wielkości 100 μM i hodować komórki, jak opisano powyżej w kroku 1.3, aż zawiesina osiągnie OD600 między 0,4 a 0,6.
  6. Indukuj ekspresję białka przez 3 godziny za pomocą 0,5 mM IPTG. Odwirować komórki przez 20 minut przy stężeniu 3 000 x g i ostrożnie odlać sklarowany sklarowany stan.
  7. Rozpuścić osad w 40 ml buforu do lizy (10 mM Tris, pH 8,1; 10 mM chlorek magnezu, MgCl2; 150 mM NaCl; i 10% glicerolu), sonikować na lodzie przez 30 minut przy 60% mocy w odstępie 2 s i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut z 0,1 g/l DNazy.
  8. Zawiesinę zawierającą białka w postaci ciał inkluzyjnych (IB) należy traktować 100 ml buforu do przemywania (0,5% Triton X-100; 50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCl; i 10 mM EDTA).
  9. Odwirować próbkę przez 20 minut w temperaturze 4 °C i 8 000 x g i ostrożnie odlać supernatant. Zawiesić osad w 100 ml buforu do resuspensji (50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCl; i 10 mM EDTA, pH 8,1), odwirować jak poprzednio przy 8,000 x g i ostrożnie odlać sklarowany szwaczek.
  10. Na koniec rozpuścić osad w 10 ml buforu guanidyny (6 M guanidyny; 50 mM Tris, pH 8,1; 2 mM EDTA, pH 8,1; i 100 mM NaCl) i zmierzyć stężenie białka przy 280 nm za pomocą spektrofotometru.

2. Ponowne składanie pHLA i TCR

  1. W przypadku fałdowania pHLA zmieszać 30 mg HLA-A2 (lub HLA-A2 ze znacznikiem biotyny) IBs, 30 mg β2m IBs i 4 mg peptydu przez 30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej w końcowej objętości 6 ml buforu guanidyny uzupełnionego 10 mM ditiotreitolem (DTT).
  2. Rozpocząć ponowne fałdowanie białek poprzez rozcieńczenie poprzedniej mieszaniny w 1 l wstępnie schłodzonego buforu do zawijania HLA (50 mM Tris, pH 8,1; 400 mM L-argininy; 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteaminy; i 4 mM cystaminy).
  3. Pozostawić zawijany HLA mieszając w temperaturze 4 °C przez 3 godziny, a następnie przenieść go do probówki dializacyjnej MWCO (odcięcie masy cząsteczkowej) o stężeniu 12,4 kDa i dializować dwukrotnie przez 24 godziny w stosunku do 20 l 10 mM Tris, pH 8,1.
  4. W przypadku fałdowania TCR zmieszać 30 mg IB o łańcuchu TCR α i 30 mg IB o łańcuchu TCR β przez 30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej w 6 ml buforu guanidyny uzupełnionego 10 mM DTT.
  5. Rozpocząć ponowne fałdowanie białek przez rozcieńczenie zdenaturowanej mieszaniny TCR w 1 l wstępnie schłodzonego buforu do ponownego zawijania TCR (50 mM Tris, pH 8,1; 2,5 M mocznika; 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteaminy; i 4 mM cytaminy) przez 3 godziny.
  6. Przenieść ponownie złożony produkt do probówki dializacyjnej MWCO o stężeniu 12,4 kDa i dializować dwukrotnie przez 24 godziny w stosunku do 20 l 10 mM Tris, pH 8,1.
  7. Przefiltruj oba fałdy pHLA lub TCR za pomocą filtra membranowego 0,45 μm dla etapów oczyszczania.

3. Oczyszczanie za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC)

  1. Załadować przefiltrowany preparat do ponownego zawijania (pHLA lub TCR) do kolumny z żywicą anionowymienną o pojemności 7,9 ml i 50 μm, wstępnie zrównoważonej z 20 ml 10 mM Tris, pH 8,1 w elastycznym i intuicyjnym systemie chromatograficznym
    2. .
  2. Eluować białko w dawce 5 ml/min z gradientem soli (0-500 mM NaCl w 10 mM Tris, pH 8,1, ponad 8 objętości kolumny) i zebrać frakcje 1 ml.
  3. Przeanalizować frakcje odpowiadające białku będącemu przedmiotem zainteresowania za pomocą SDS-PAGE, połączyć ze sobą frakcje zawierające interesujące białko i zagęścić je do 500 μL za pomocą 10-kDa MWCO 20 lub 10 kDa MWCO 4 przez wirowanie przez 20 minut przy 4,000 x g, odrzucając przepływ.
  4. Załadować skoncentrowane preparaty białkowe do pętli iniekcyjnej o pojemności 2 ml na kolumnę chromatograficzną o pojemności 24 ml z wykluczeniem, wstępnie zrównoważoną odpowiednim buforem elucyjnym: solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7,4; 150 mM NaCl; 3,4 mM EDTA; i 0,005% środka powierzchniowo czynnego) lub buforem krystalicznym (10 mM Tris, pH 8,1 i 10 mM NaCl).
  5. Eluować białka z szybkością przepływu 0,5 ml/min w objętości 1 kolumny; zebrać 1 ml frakcji zawierających białko będące przedmiotem zainteresowania, zweryfikowane przez SDS-PAGE.
    UWAGA: Metody te zostały wykorzystane do wygenerowania rozpuszczalnych TCR PMEL17 i gp100, a także wszystkich pHLA użytych w tym badaniu: HLA-A*0201 z YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE-7A) lub YLEPGPVAA (A2-YLE-8A).

4. Analiza powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR)

  1. Wykonaj analizę wiązania równowagi lub analizę termodynamiczną przy użyciu systemu analizy interakcji molekularnych wyposażonego w czujnik CM5 chip19.
  2. Aktywuj chip CM5, przepływając mieszaninę 100 mM N-hydroksysukcynimidu (NHS) i 400 mM 1-etylo-3-(3-dimetylopropylo)-karboiimidu (EDC) przez 10 minut przy natężeniu przepływu 10 μl/min i w temperaturze 25 °C.
  3. Załaduj około 5 000 jednostek odpowiedzi (RU) streptawidyny (110 μl z 200 μg / ml w octanie 10 mM, pH 4,5) przez kowalencyjne połączenie z powierzchnią chipa we wszystkich czterech komórkach przepływowych i użyj 100 μl 1 M chlorowodorku etanoloaminy do dezaktywacji pozostałych grup reaktywnych.
  4. Podłącz około 500-600 RU pHLA, przy ~1 μM w komercyjnym buforze (dostarczonym przez producenta), z chipem czujnika CM5 przy wolnym natężeniu przepływu 10 μL/min, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie na powierzchni chipa.
  5. Nasycić powierzchnię chipa 1 mM biotyną w komercyjnym buforze (dostarczonym przez producenta) przez 60 s.
  6. Wstrzyknąć dziesięć seryjnych rozcieńczeń rozpuszczalnych TCR do odpowiednich komórek przepływowych przy wysokim natężeniu przepływu 30 μl/min w temperaturze 25 °C.
  7. Oblicz wartości stałej wiązania równowagi (KD (E)) za pomocą nieliniowego dopasowania krzywej (y = (P1x)/(P2+x)) 20.
    UWAGA: y = jednostki odpowiedzi, x = stężenie analityka, P1 = rmax, P2 = KD.
  8. Wykonaj analizę kinetyczną przy założeniu powiązania Langmuira 1:1 i dopasuj dane za pomocą algorytmu dopasowania globalnego w pakiecie oprogramowania2.
  9. Wykonaj eksperymenty termodynamiczne, powtarzając tę metodę w następujących temperaturach: 5 °C, 12 °C, 18 °C, 25 °C i 30 °C19.
  10. Użyj wartości KD wyznaczonych przez SPR w różnych temperaturach, aby obliczyć ΔG° przy użyciu standardowego równania termodynamicznego (ΔG° = -RTlnKD)19.
    UWAGA: R = stała gazowa, T = temperatura w K, ln = logarytm naturalny.
  11. Oblicz parametry termodynamiczne zgodnie z równaniem Gibbsa-Helmholtza (ΔG° = ΔH − TΔS°)19.
  12. Wykreślić energię swobodną wiązania, ΔG° (ΔG° = -RTlnKD), w zależności od temperatury (K) za pomocą regresji nieliniowej, aby dopasować równanie trójparametrowe (y = ΔH+ΔCp*(x-298)-x*ΔS-x*ΔCp*ln(x/298))19.
    UWAGA: y = temperatura w K, x = ΔG°.

5. Kalorymetria miareczkowa izotermiczna (ITC)

  1. Przeprowadzić eksperymenty ITC przy użyciu izotermicznego kalorymetru miareczkowego. Wstrzyknąć 30 μM pHLA do kuwety kalorymetru i załadować 210 μM rozpuszczalnego TCR do strzykawki. Stosować następujące warunki buforowe: 20 mM Hepes (pH 7,4) zawierające 150 mM NaCl.
  2. Wykonać 20 wstrzyknięć TCR, każde o objętości 2 μl. Oblicz ΔH i KD za pomocą oprogramowania analitycznego.

6. Krystalizacja, zbieranie danych dyfrakcyjnych i udoskonalanie modelu

  1. Wykonaj próby krystalizacji za pomocą robota krystalizacyjnego.
  2. Hodować kryształy przez dyfuzję pary wodnej w temperaturze 18 °C za pomocą techniki siedzącej kropli na 96-dołkowej płytce ze zbiornikiem zawierającym 60 μl buforu krystalizacyjnego (ług macierzysty)21.
  3. Stężyć rozpuszczalny pHLA do około 10 mg/ml (0,2 mM) w buforze krystalicznym, wirując z prędkością 3 000 x g w koncentratorze odśrodkowym o masie cząsteczkowej 10 kda.
  4. W przypadku struktur kokompleksnych należy zmieszać TCR i pHLA w stosunku molowym 1:1, aby uzyskać roztwór białka o stężeniu około 10 mg/ml (0,1 mM).
  5. Dodać 200 nL samego pHLA lub mieszaninę TCR i pH w stosunku molowym 1:1 do 200 nl każdego roztworu zbiornika z ekranu krystalizacji za pomocą robota krystalizacyjnego i naciąć kryształy pod mikroskopem po 24 godzinach, 48 godzinach, 72 godzinach, a następnie raz w tygodniu.
  6. Zbieraj monokryształy, ręcznie montując je w pętlach kriogenicznych pod mikroskopem i chłodzić je kriogenicznie, zanurzając i przechowując w ciekłym azocie (100 K).
    UWAGA: Ładowanie kryształów wymaga trochę praktyki, a decydowanie, które kryształy są wystarczająco dobre do zbierania danych, przychodzi z doświadczeniem. Z reguły im większy i bardziej regularny kryształ, tym lepiej.
  7. Zbieraj dane w strumieniu azotu gazowego o temperaturze 100 K.
    UWAGA: Dane te zostały uzyskane w krajowym ośrodku nauk synchrotronowych Diamond Light Source (DLS) w Wielkiej Brytanii.
  8. Przeanalizuj dane, szacując intensywność odbicia za pomocą xia2, używając zarówno MOSFLM22, jak i XDS packages23, a następnie przeskaluj dane za pomocą SCALA lub AIMLESS 24 i pakietu CCP425.
  9. Rozwiąż struktury za pomocą wymiany molekularnej za pomocą PHASER26.
  10. Dostosuj model za pomocą COOT27 i uściślij model za pomocą REFMAC528.
  11. Przygotuj reprezentacje graficzne za pomocą PYMOL29.
  12. Oblicz kontakty za pomocą programu "kontakt" w pakiecie CCP4. Użyj punktu odcięcia 4 A dla styków van der Waalsa i odcięcia 3,4 A dla wiązań wodorowych i mostków solnych.
  13. Obliczanie komplementarności powierzchni za pomocą programu "SC" w pakiecie CCP4.
  14. Oblicz kąt skrzyżowania kompleksu TCR-pHLA, zgodnie z opisem30.
    UWAGA: Na potrzeby tego badania dane odbicia i końcowe współrzędne modelu zostały zdeponowane w bazie danych PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4 i A2-YLE-5A PDB: 5EU5).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z metod opisanych powyżej, wygenerowaliśmy rozpuszczalne cząsteczki TCR (Tabela 1) i pHLA, aby przeprowadzić dogłębne analizy molekularne rozpoznawania gp100280-288 przez limfocyty T CD8+. Zmodyfikowany system ekspresji E. coli wykorzystano do wygenerowania nierozpuszczalnych IB dla każdego oddzielnego łańcucha zarówno łańcuchów TCR (α i β), jak i pHLA (łańcuch α i β2m). Ta metoda ma tę zaletę, że jest stosunkowo tania i łatwa w konfiguracji oraz generuje duże plony białka (100-500 mg/L hodowli). Ponadto nierozpuszczalne białka są bardzo stabilne, jeśli są przechowywane w temperaturze -80 °C. Następnie zastosowaliśmy dobrze znaną technikę ponownego fałdowania i oczyszczania, aby wygenerować funkcjonalne, jednorodne, rozpuszczalne białka. Metoda ta jest przydatna do generowania białek do eksperymentów biofizycznych, strukturalnych i komórkowych, a także odczynników, które można wykorzystać do diagnostyki lub terapii.

Tutaj użyliśmy tych białek do przeprowadzenia eksperymentów mutagenezy skanowania alaniny w szkielecie peptydowym i oceniliśmy powinowactwo wiązania TCR za pomocą eksperymentów z powierzchniowym rezonansem plazmonowym (SPR) (Tabela 2). Test ten wykazał, które reszty w peptydzie były najważniejsze dla wiązania TCR. Wysokorozdzielcze analizy powinowactwa wiązania przy użyciu tej techniki są niezwykle przydatne do określania mechanizmów biologicznych kontrolujących interakcje białko-białko, a także do analizy powinowactwa do wiązania cząsteczek terapeutycznych.

Następnie skrystalizowaliśmy specyficzny dla czerniaka rozpuszczalny TCR (PMEL17 TCR) w kompleksie ze zmodyfikowanym pHLA pochodzącym z nowotworu (A2-YLE-9V), aby zbadać tryb wiązania w rozdzielczości atomowej (Rysunki 1 i 2 oraz Tabela 3). Eksperymenty te zapewniają bezpośrednią wizualizację interfejsu wiązania między dwiema cząsteczkami, dostarczając kluczowych informacji na temat podstawowych zasad rządzących interakcją. Następnie przeprowadziliśmy analizę termodynamiczną oddziaływania przy użyciu zarówno SPR, jak i ITC, ujawniając wkład energetyczny, który umożliwił wiązanie (ryc. 3). Analizy te zostały dodatkowo wsparte opisem śladu kontaktowego między tymi dwoma białkami w wysokiej rozdzielczości (ryc. 4 i tabela 4).

Następnie rozwiązaliśmy struktury nieligowanych cząsteczek pHLA, prezentując zmutowane formy peptydu, ujawniając, że przełącznik molekularny może wyjaśnić, dlaczego niektóre mutacje zniosły wiązanie TCR (Ryc. 5).

Ogólnie rzecz biorąc, techniki te dostarczyły nowych danych demonstrujących mechanizm wyjaśniający, w jaki sposób limfocyty T rozpoznają antygen pochodzący z czerniaka, który jest ważnym celem terapii przeciwnowotworowych. W szerszym ujęciu, techniki te mogą być wykorzystywane do badania praktycznie każdej interakcji receptor-ligand, odkrywając nowe mechanizmy biologiczne, które mogą być celem nowych postępów terapeutycznych.

figure-results-1
Rysunek 1: Analiza wykresu gęstości. Lewa kolumna pokazuje mapy pominięte, w których model został dopracowany pod nieobecność peptydu. Gęstość różnicowa jest konturowana na poziomie 3,0 sigma, kontury dodatnie są pokazane na zielono, a kontury ujemne są na czerwono. Kolumna po prawej stronie pokazuje obserwowaną mapę przy 1,0 sigma (pokazaną jako szara siatka wokół pałeczkowych reprezentacji łańcuchów białkowych) po późniejszym udoskonaleniu przy użyciu automatycznych niekrystalograficznych ograniczeń symetrii zastosowanych przez REFMAC5. (A) Model dla PMEL17 TCR-A2-YLE-9V z pętlami TCR CDR3 w kolorze niebieskim (łańcuch α) i pomarańczowym (łańcuch β) oraz peptydem w kolorze zielonym. (B) Model dla A2-YLE z peptydem w kolorze ciemnozielonym. (C) Model dla A2-YLE-3A z peptydem w kolorze pomarańczowym (dla A2-YLE-3A w jednostce asymetrycznej znajdowały się 2 cząsteczki, ale były one praktycznie identyczne pod względem map pominięcia i gęstości, więc pokazano tutaj tylko kopię 1). (D) Model dla A2-YLE-5A z peptydem w kolorze różowym. Przedruk za zgodą z odnośnika31. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przegląd PMEL17 TCR w kompleksie z A2-YLE-9V. (A) Rysunkowa reprezentacja kompleksu PMEL17 TCR-A2-YLE-9V. TCR jest w kolorze czarnym; Pokazane są pętle TCR CDR (czerwony, CDR1α; ciemnozielony, CDR2α; niebieski, CDR3α; żółty, CDR1β; aqua, CDR2β; pomarańczowy, CDR3β); a HLA-A*0201 jest przedstawiony w kolorze szarym. Peptyd YLE-9V jest reprezentowany przez zielone pałeczki. (B) Reprezentacje powierzchni i pałeczek pozostałości pętli CDR PMEL17 TCR (oznaczone kolorami jak w A), które stykają się z powierzchnią A2-YLE (A2, kolor szary; YLE-9V, zielone patyczki). linia ukośna wskazuje kąt skrzyżowania TCR względem osi długiej peptydu YLEPGPVTV (46,15°). (C) Ślad styku PMEL17 TCR na powierzchni A2-YLE-9V (A2, szary); fioletowy i zielony (powierzchnia i patyczki) wskazują odpowiednio pozostałości HLA-A*0201 i YLE, z którymi styka się gp100 TCR. Granica 3,4 A dla wiązań wodorowych i 4 A dla styków van der Waalsa. Przedruk za zgodą Odnośnika 31. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza termodynamiczna oddziaływania PMEL17 TCR-A2-YLE. (A) Reakcje równowagowe wiązania TCR PMEL17 na A2-YLE w temperaturze 5, 12, 18, 25 i 37 °C w dziewięciu do dziesięciu seryjnych rozcieńczeniach TCR. Surowe i dopasowane dane SPR (przy założeniu wiązania Langmuira 1:1) są pokazane we wstawce każdej krzywej i zostały wykorzystane do obliczenia wartości Kon iK off przy użyciu algorytmu dopasowania globalnego (BIAevaluation 3.1). Tabela przedstawia stałe wiązania równowagi (KD (E)) i stałe wiązania kinetycznego (KD (K) = Koff/K on) w każdej temperaturze. Wartości stałej wiązania równowagi (K,D, μM) obliczono przy użyciu dopasowania nieliniowego (y = (P1x)/(P2+x)). (B) Parametry termodynamiczne obliczono zgodnie z równaniem Gibbsa-Helmholtza (ΔG° = ΔH° − TΔS°). Wiązanie energii swobodnych, ΔG° (ΔG° = -RTlnKD), zostały wykreślone w zależności od temperatury (K) przy użyciu regresji nieliniowej, aby dopasować równanie trójparametrowe (y = ΔH°+ΔCp°*(x-298)-x*ΔS°-x*ΔCp°*ln(x/298)). Entalpia (ΔH°) i entropia (TΔS°) w temperaturze 298 K (25 °C) są pokazane w kcal/mol i zostały obliczone za pomocą nieliniowej regresji temperatury (K) wykreślonej w stosunku do energii swobodnej (ΔG°). (C) Pomiary miareczkowania metodą kalorymetrii izotermicznej (ITC) dla oddziaływania PMEL17 TCR-A2-YLE. Entalpia (ΔH°) i entropia (TΔS°) w temperaturze 298 K (25 °C) są podane w kcal/mol. Przedruk za zgodą z odnośnika31. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ilustracja 4: pętle CDR PMEL17 koncentrują się na resztach peptydowych Pro4, Val7 i Thr8. (A) Schematyczne przedstawienie styków między peptydem YLE-9V a resztą pętli CDR PMEL17 (oznaczone kolorami jak na rysunku 2A). Liczby u dołu panelu pokazują całkowitą liczbę kontaktów między TCR a peptydem. (B) Styki między PMEL17 TCR a peptydem YLE-9V (zielone pałeczki) pokazujące styki van der Waalsa (czarne przerywane linie) i wiązania wodorowe (czerwone przerywane linie) utworzone przez pętle TCR CDR3α (niebieski), CDR1β (żółty), CDR2β (wodny) i CDR3β (pomarańczowy). W dolnym panelu znajduje się bliski widok styków między YLE Pro4, Val7 i Thr8 odpowiednio oraz pozostałościami pętli TCR CDR (pałeczki oznaczone kolorem jak na rysunku 1A). Granica 3,4 A dla wiązań wodorowych i 4 A dla styków van der Waalsa. Przedruk za zgodą z odnośnika31. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Porównanie konformacyjne peptydów YLE, YLE-3A i A2-YLE-5A przedstawione przez HLA-A*0201. (A) Wyrównanie peptydów YLE (ciemnozielone pałeczki) i YLE-3A (pomarańczowe pałeczki) poprzez nałożenie helisy HLA-A*0201 α1 (szary kreskówka). Reszty w pudełkach wskazują na mutację Glu3 w alaninę. Wstawki pokazują, w jaki sposób podstawienie Glu3Ala powoduje przesunięcie pozycji (strzałka) sąsiedniej reszty Pro4 w strukturze A2-YLE-3A w porównaniu ze strukturą A2-YLE. (B) Wyrównanie peptydów YLE (ciemnozielone pałeczki) i YLE-5A (różowe pałeczki) poprzez nałożenie helisy HLA-A*0201 α1 (szary kreskówka). Reszty w pudełkach wskazują na mutację glicyny 5 w alaninę. Przedruk za zgodą z odnośnika31. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: Ludowa) powiedział: powiedział: ) ) powiedział: .)
TcrCDR1αCDR2αCDR3αCDR1βCDR1βCDR1β
Zobacz materiał PMEL17DSAIYNIQSSQRE (Międzynarodowa BibliotekaCAVLSSGGSNYKLTFGSGHTA (Agencja Nadzorcza)FQGTGA (Biblioteka Federalna)CASSFIGGTDTQYFG powiedział:
Certyfikat gp100TSINNIRSNERE (Międzynarodowa Sieć LotniczaCATDGDTPLVFGMagazyn LNHDA (Lotnisko LNHSQIVND (Oddział PiechotyCASSIGGPYEQYFG powiedział:
MPD (Polskie GniazdoKATARZYNALLKGGEQCGTETNTGNQFYFG powiedział:SGHDY powiedział:FNNNVP powiedział:CASSLGRYNEQFFG powiedział:
Rozdział 296DSASNY (DSASNY)Urząd Skarbowy (IRSNVGE)CAASTSGGTSYGKLTFGMNHEY (MNHEY)Zobacz materiał SMNVEV (Sm.ACASSLGSSYEQYFG powiedział:

Tabela 1: Wyrównanie regionów TCR CDR3 dla PMEL17, gp100, MPD i 296 TCR specyficznych dla gp100. Przedruk za zgodą z odnośnika31.

Sekwencja peptydowapeptydPMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 Powinowactwo KDgp100 TCR TRAV17 TRBV19 Powinowactwo KD
YLEPGPVTA powiedział:YLE (Język angielski)7,6 ±2 μM26,5 ±2,3 μM
YLEPGPVTVYLE-9V6,3 ±1,2 μM21,9 ±2,4 μM
LEPGPVTAYLE-1A15,9 ±4,1 μM60,6 ±5,4 μM
YLAPGPVTAYLE-3ABez zobowiązańBez zobowiązań
YLEAGPVTAYLE-4A19,7 ±1,3 μM144,1 ±7,8 μM
YLEPAPVTAYLE-5A>1 mM>1 mM
YLEPGAVTAYLE-6A11,4 ±2,7 μM954,9 ±97,8 μM
YLEPGPATAYLE-7A31,1 ±4 μM102,0 ±9,2 μM
YLEPGPVAAYLE-8A38,1 ±7,4 μM121,0 ±7,5 μM

Tabela 2: Analiza powinowactwa (KD) wariantów peptydów PMEL17 TCR i gp100 TCR do gp100280-288. Przedruk za zgodą z odnośnika31.

TGL TGL TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.
ParametryPMEL17 TCR-A2-YLE-9VA2-YLEA2-YLE-3AA2-YLE-5A
Kod PDB5EU65EU35EU45EU5
Statystyki zestawu danych
Grupa kosmicznaZobacz materiał P1P1 21 1Zobacz materiał P1P1 21 1
Parametry komórki elementarnej (A)A = 45,52, b = 54,41, c = 112,12, a=85,0°, b=81,6°, g=72,6°A = 52,81, b = 80,37, C = 56,06, b = 112,8°A = 56,08, b = 57,63, C = 79,93, A=90,0°, B=89,8°, G=63,8°A = 56,33, b = 79,64, C = 57,74, b = 116,2°
Źródło promieniowaniaDIAMENT I03DIAMENT I03DIAMENT I02DIAMENT I02
Długość fali (A)0,97630,99990,97630,9763
Mierzony zakres rozdzielczości (A)51.87 – 2.02w godzinach 45.25 – 1.9743.39 – 2.12w godz. 43.42 – 1.54
Zewnętrzna powłoka rozdzielczości (Å)2.07 - 2.022,02 – 1,972.18 – 2.121,58 - 154
Zaobserwowane odbicie128 191 (8 955)99 442 (7 056)99 386 (7 463)244 577 (17 745)
Wyjątkowe odbicia64 983 (4 785)30 103 (2 249)49 667 (3 636)67 308 (4 962)
Kompletność (%)97,7 (96,7)98,5 (99,3)97,4 (96,7)99,6 (99,9)
Liczebność2,0 (1,9)3.3 (3.1)2,0 (2,1)3,6 (3,6)
I/Sigma(I)5,5 (1,9)7,2 (1,9)6,7 (2,3)13 (2,3)
Obroty na minutę (%)5,7 w stosunku do 39,88,8 (44,7)8,7 (41,6)4,5 (35,4)
Scalanie języka R (%)7,8 (39,6)9,8 w stosunku 50,28,7 (41,6)5,0 (53,2)
Statystyki uściślania
Rozdzielczość (Å)Pytanie 2,021,972.121,54
Nie zastosowano odbićNumer katalogowy: 61688Numer katalogowy: 28557Numer katalogowy: 47153Numer katalogowy: 63875
Brak odbicia w zestawie RfreeNumer katalogowy: 3294Rok 1526Numer katalogowy 2514Numer katalogowy: 3406
Rcryst (bez punktu odcięcia) (%)Rozdział 18,1Pytanie 19,7Rozdział 17,217,0
RwolnyRozdział 22,225,5Dnia 21,120,1
Odchylenie średniej kwadratowej od idealnej geometrii
Długości wiązania (A)0,018 (0,019)*0,019 (0,019)*0,021 (0,019)*0,018 (0,019)*
Kąty wiązania (°)1,964 (1,939)*1,961 (1,926)*2,067 (1,927)*1,914 (1,936)*
Całkowity błąd współrzędnych (A)0,1220,1530,1470,055 jedynki
Statystyki Ramachandran
Preferowane791 (96%)371 (98%)749 (99%)384 (98%)
Dozwolone32 (4 proc.)6 (2 proc.)10 (1%)5 (1%)
Odstających2 (0 %)3 (1%)1 (0 %)2 (0 %)

Tabela 3: Statystyki redukcji i udoskonalania danych (wymiana molekularna). Przedruk za zgodą z odnośnika31. Wartości w nawiasach odnoszą się do powłoki o najwyższej rozdzielczości.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: : powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
HLA/reszta peptydowaPozostałość TCRNr vdW (≤4A)Nr obligacji H (≤3,4A)
Gly62αGly983
αSer991
Arg65αSer99cyfra arabska
arg65 OαAsn100 Nδ2cyfra arabska1
Arg65 NH1βAsp58 Oδ21
βSer598
Lys66αGly981
αSer994
αAsn1004
Ala69αAsn100cyfra arabska
βAla56cyfra arabska
Gln72 Nε2βGln51 O31
βGly547
βAla551
Thr73βGln511
Val76βGln513
βGly52cyfra arabska
Lys146βPhe973
βIle983
Ala150βIle981
βAsp1023
Val152 powiedziałβIle981
Glu154αTyr321
Gln155 NαTyr32 OH41
Gln155 Oε1βThr101 N101
Tyr1OHαGly97 O11
αGly981
αSer961
Glu3αTyr1011
Profesjonalista 4αSer961
αSer991
αAsn1004
Pro4 OαTyr101N141
Gli5αTyr1013
βGly100cyfra arabska
Dolina 7βIle987
βGly99cyfra arabska
βGly100cyfra arabska
Cz.8βThr315
βGln511
βPhe971
Thr8 NβIle98 O61

Tabela 4: Tabela styków PMEL17 TCR-A2-YLE-9V. Przedruk za zgodą z odnośnika31.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj protokoły stanowią ramy dla molekularnej i komórkowej analizy odpowiedzi limfocytów T w kontekście każdej choroby ludzkiej. Chociaż rak był głównym celem tego badania, zastosowaliśmy bardzo podobne podejścia do zbadania odpowiedzi limfocytów T na wirusy 32,33,34,35,36,37 i podczas autoimmunizacji 38,39,40. Ponadto wykorzystaliśmy te techniki szerzej, aby zrozumieć zasady molekularne, które rządzą rozpoznawaniem antygenu limfocytów T 2,19,41,42. Rzeczywiście, nieprzewidywalny charakter modyfikacji reszt peptydowych, nawet tych spoza reszt kontaktowych TCR, wpływa na rozpoznawanie limfocytów T, co ma ważne implikacje dla projektowania peptydów heteroklitycznych. Odkrycia te bezpośrednio przyczyniły się do opracowania nowych terapii limfocytami T, w tym szczepionek peptydowych 6,43 i sztucznych TCR o wysokim powinowactwie 3,4,5,20,44, a także ulepszonej diagnostyki 45,46,47.

Krytyczne kroki w ramach protokołu
Wytwarzanie wysoce czystego, funkcjonalnego białka jest niezbędne dla wszystkich metod opisanych w tym artykule.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Trudności w wytwarzaniu białka o wysokiej czystości często wiążą się z ekspresją wysoce czystych, nierozpuszczalnych IB z systemu ekspresji E. coli . Zwykle modyfikacja protokołu ekspresji (np . indukcja przy różnych gęstościach optycznych, użycie różnych szczepów E. coli lub użycie różnych formacji pożywki) rozwiązuje te problemy.

Ograniczenia techniki
Techniki te wykorzystują rozpuszczalne cząsteczki białek (TCR i pHLA), które normalnie ulegają ekspresji na powierzchni komórki. Dlatego ważne jest, aby upewnić się, że wyniki strukturalne/biofizyczne są zgodne z podejściami komórkowymi w celu potwierdzenia znaczenia biologicznego.

Znaczenie techniki w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod
Dzięki zastosowaniu krystalografii rentgenowskiej i biofizyki popartej analizą funkcjonalną, my i inni wykazaliśmy, że TCR specyficzne dla epitopów nowotworowych charakteryzują się na ogół niskim powinowactwem do wiązania48. To niskie powinowactwo do TCR może pomóc wyjaśnić, dlaczego limfocyty T nie są naturalnie skuteczne w usuwaniu raka. Wysokorozdzielcze struktury atomowe kompleksów między przeciwnowotworowymi TCR a pokrewnymi antygenami nowotworowymi zaczynają ujawniać molekularne podstawy tego słabego powinowactwa. Co więcej, badania te są pomocne w określeniu mechanizmów, które leżą u podstaw interwencji terapeutycznych mających na celu przezwyciężenie tego problemu, zasiewając przyszłe ulepszenia16. W tym badaniu zbadaliśmy pierwszą strukturę naturalnie występującego αβTCR w kompleksie z epitopem czerniaka ograniczonym gp100 HLA-A*0201. Struktura, w połączeniu z dogłębnym badaniem biofizycznym, ujawniła ogólny sposób wiązania interakcji. Odkryliśmy również nieoczekiwany przełącznik molekularny, który wystąpił w zmutowanej formie peptydu, który zniósł wiązanie TCR (oceniane za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego) i rozpoznawanie limfocytów T CD8 + (eksperymenty funkcjonalne). Ten nowy mechanizm prezentacji antygenu HLA był możliwy jedynie przy użyciu opisanych metod o wysokiej rozdzielczości.

Przyszłe zastosowania lub wskazówki po opanowaniu tej techniki
Ogólnie rzecz biorąc, nasze wyniki pokazują moc krystalografii rentgenowskiej i metod biofizycznych w połączeniu z solidnymi analizami funkcjonalnymi. Korzystając z tych podejść, możliwe jest przeanalizowanie precyzyjnych mechanizmów molekularnych, które rządzą rozpoznawaniem antygenu limfocytów T. Rzeczywiście, możliwe jest również zastosowanie tego podejścia do rozwiązania struktury nieligowanych TCR, pokazując, w jaki sposób zmiany konformacyjne mogą odgrywać rolę podczas dyskryminacji antygenowej 49,50,51. Lepsze zrozumienie wysoce złożonej i dynamicznej natury, która leży u podstaw interakcji TCR-pHLA, ma również oczywiste implikacje dla projektowania terapii. Możliwość bezpośredniego "zobaczenia" cząsteczek, które są ukierunkowane terapeutycznie, a także wpływu, jaki modyfikacje mają na rozpoznawanie antygenów, z pewnością poprawi rozwój tych leków w przyszłości. W tym badaniu pokazujemy, że nawet zmiany w pojedynczej reszcie peptydowej, która nie jest silnie zaangażowana przez TCR, mogą nieprzewidywalnie przenosić zmiany strukturalne na inne reszty w peptydzie związanym z HLA, co z kolei dramatycznie zmienia rozpoznawanie limfocytów T. Pełniejsze zrozumienie mechanizmów molekularnych wykorzystywanych podczas rozpoznawania antygenu limfocytów T będzie niezwykle korzystne przy projektowaniu przyszłych terapii dla szerokiego zakresu chorób u ludzi.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów ani nie mają sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BM jest wspierane przez stypendium doktoranckie Cancer Research UK. AG jest wspierane przez stypendium doktoranckie Life Science Research Network Wales. VB jest wspierany przez stypendium doktoranckie Cancer Research Wales. DKC jest stypendystą Wellcome Trust Research Career Development Fellow (WT095767). Usługa AKS jest badaczem Wellcome Trust. GHM jest finansowany przez wspólną sieć badawczą Life Science Research Network Wales i stypendium doktoranckie Tenovus Cancer Care. Dziękujemy personelowi Diamond Light Source za zapewnienie udogodnień i wsparcia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
S.O.C. MEDIAInvitrogen
Orbi-Safe Nowy inkubator orbitalnySanyo
carbenicillin Sigma
IPTG Fisher
Quick Coomassie Bejca SafeStain Wirówka Generon
Legend RT Sorvall
Tris Chlorek
 Arcos
NaCl Glicerol Fishera
 Sigma-Aldrich
Sonopuls HD 2070 Bandeliny
 Fisher
TritonSigma-Aldrich
EDTA Guanidyna rybaka
 Fisher
NanoDrop ND1000 Thermo
PeptidesPeptide Protein Research
ditiotreitol Sigma-Aldrich
L-arginina SAFC
cysteamina Cystamine Fishera
 Fishera
 Mocznik Sigma-Aldrich
 Sigma-Aldrich
Metricel 0,45 μ m filtr membranowyPall
POROS 10/100 HQ Biosystemy
Ä Czysty system FPLC KTA GE Healthcare Nauki Przyrodnicze
10 kDa MWCO Vivaspin 20 Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4 Kolumna Sartorius
Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences
Bufor fosforanowy z solą fizjologiczną Oxoid
BIAcore HBS GE Healthcare Life Sciences
Avidity
BIAcore T200Zestaw
CM5
Sigma-Aldrich
Microcal Wiceprezes-ITC GE Healthcare Nauki Przyrodnicze
Hepes Sigma-Aldrich
GryphonArt Robbins Instruments
Intelli-plate Art Robbins Instrumenty
Sita krystalizacji i odczynnikiWymiary
75 cm2 kolba Greiner Bio-One
0,22 μ m filtryMiller-GP, Rurka
Ultra-Clear Beckman Coulter
Optima L-100 XP z wirnikiem SW28Beckman Coulter
CD8 Miltenyi Biotec
 Mikrogranulki anty-PE Invitrogen
 Miltenyi Biotec
CK medium, PHAAlere Ltd
anty-TCRVβ mAb 
dasatinib Axon
MIP-1 i beta oraz TNF i alfa; ELISA R& D Systems
  51Cr Licznik PerkinElmer
1450 MicrobetaPerkinElmer
magnezu FisherDNA Rurki dializacyjne stosowaneBufor Zestaw do biotynylacji sprzęgający chip GE Healthcare Life Sciences Streptawidyna Robot krystalizacyjny molekularne ultrawirówkowa Millipore Mikrokulki Anty-CD3/CD28 Dynabeads BD

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aleksic, M., Liddy, N., et al. Different affinity windows for virus and cancer-specific T-cell receptors: implications for therapeutic strategies. European journal of immunology. 42 (12), 3174-3179 (2012).
  2. Cole, D. K., Pumphrey, N. J., et al. Human TCR-binding affinity is governed by MHC class restriction. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 178 (9), 5727-5734 (2007).
  3. Cole, D. K., Sami, M., et al. Increased Peptide Contacts Govern High Affinity Binding of a Modified TCR Whilst Maintaining a Native pMHC Docking Mode. Frontiers in immunology. 4 (JUN), 168(2013).
  4. Raman, M. C. C., Rizkallah, P. J., et al. Direct molecular mimicry enables off-target cardiovascular toxicity by an enhanced affinity TCR designed for cancer immunotherapy. Scientific reports. 6, 18851(2016).
  5. Liddy, N., Bossi, G., et al. Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nature medicine. 18 (6), 980-987 (2012).
  6. Cole, D. K., Edwards, E. S. J., et al. Modification of MHC anchor residues generates heteroclitic peptides that alter TCR binding and T cell recognition. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 185 (4), 2600-2610 (2010).
  7. Parkhurst, M. R., Salgaller, M. L., et al. Improved induction of melanoma-reactive CTL with peptides from the melanoma antigen gp100 modified at HLA-A*0201-binding residues. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (6), 2539-2548 (1996).
  8. Salgaller, M. L., Marincola, F. M., Cormier, J. N., Rosenberg, S. A. Immunization against epitopes in the human melanoma antigen gp100 following patient immunization with synthetic peptides. Cancer research. 56 (20), 4749-4757 (1996).
  9. Cameron, B. J., Gerry, A. B., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science translational medicine. 5 (197), 197ra103(2013).
  10. Linette, G. P., Stadtmauer, E. A., et al. Cardiovascular toxicity and titin cross-reactivity of affinity-enhanced T cells in myeloma and melanoma. Blood. 122 (6), 863-871 (2013).
  11. Miles, K. M., Miles, J. J., Madura, F., Sewell, A. K., Cole, D. K. Real time detection of peptide-MHC dissociation reveals that improvement of primary MHC-binding residues can have a minimal, or no, effect on stability. Molecular immunology. 48 (4), 728-732 (2011).
  12. Lesterhuis, W. J., Schreibelt, G., et al. Wild-type and modified gp100 peptide-pulsed dendritic cell vaccination of advanced melanoma patients can lead to long-term clinical responses independent of the peptide used. Cancer immunology, immunotherapy CII. 60 (2), 249-260 (2011).
  13. Speiser, D. E., Baumgaertner, P., et al. Unmodified self antigen triggers human CD8 T cells with stronger tumor reactivity than altered antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (10), 3849-3854 (2008).
  14. Schaft, N., Willemsen, R. A., et al. Peptide fine specificity of anti-glycoprotein 100 CTL is preserved following transfer of engineered TCR alpha beta genes into primary human T lymphocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 170 (4), 2186-2194 (2003).
  15. Schaft, N., Coccoris, M., et al. An Altered gp100 Peptide Ligand with Decreased Binding by TCR and CD8α Dissects T Cell Cytotoxicity from Production of Cytokines and Activation of NFAT. Frontiers in immunology. 4 (SEP), 270(2013).
  16. Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. Structural basis for ineffective T-cell responses to MHC anchor residue-improved "heteroclitic" peptides. European journal of immunology. 45 (2), 584-591 (2015).
  17. Boulter, J. M., Glick, M., et al. Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein engineering. 16 (9), 707-711 (2003).
  18. Garboczi, D. N., Utz, U., et al. Assembly, specific binding, and crystallization of a human TCR-alphabeta with an antigenic Tax peptide from human T lymphotropic virus type 1 and the class I MHC molecule HLA-A2. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (12), 5403-5410 (1996).
  19. Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. T-cell receptor specificity maintained by altered thermodynamics. Journal of Biological Chemistry. 288 (26), 18766-18775 (2013).
  20. Cole, D. K., Rizkallah, P. J., et al. Computational design and crystal structure of an enhanced affinity mutant human CD8 alphaalpha coreceptor. Proteins: Structure, Function and Genetics. 67 (1), 65-74 (2007).
  21. Benvenuti, M., Mangani, S. Crystallization of soluble proteins in vapor diffusion for x-ray crystallography. Nature protocols. 2 (7), 1633-1651 (2007).
  22. Leslie, A. G. W., Powell, H. R., et al. Automation of the collection and processing of X-ray diffraction data - a generic approach. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (11), 1924-1928 (2002).
  23. Kabsch, W. Xds. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  24. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  25. Bailey, S. N. Collaborative Computational Project, N. 4. The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (5), 760-763 (1994).
  26. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  27. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (12 I), 2126-2132 (2004).
  28. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 53 (3), 240-255 (1997).
  29. DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphics System. Schrödinger LLC. 1, Available from: http://www.pymol.org (2000).
  30. Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How Tcrs Bind Mhcs, Peptides, and Coreceptors. Annual Review of Immunology. 24 (1), 419-466 (2006).
  31. Bianchi, V., Bulek, A., et al. A Molecular Switch Abrogates Glycoprotein 100 (gp100) T-cell Receptor (TCR) Targeting of a Human Melanoma Antigen. Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8951-8959 (2016).
  32. Matthews, P. C., Koyanagi, M., et al. Differential clade-specific HLA-B*3501 association with HIV-1 disease outcome is linked to immunogenicity of a single Gag epitope. Journal of virology. 86 (23), 12643-12654 (2012).
  33. Gostick, E., Cole, D. K., et al. Functional and biophysical characterization of an HLA-A* 6801-restricted HIV-specific T cell receptor. European Journal of Immunology. 37 (2), 479-486 (2007).
  34. Miles, J. J., Bulek, A. M., et al. Genetic and structural basis for selection of a ubiquitous T cell receptor deployed in Epstein-Barr virus infection. PLoS Pathogens. 6 (11), e1001198(2010).
  35. Holland, C. J., Rizkallah, P. J., et al. Minimal conformational plasticity enables TCR cross-reactivity to different MHC class II heterodimers. Scientific reports. 2, 629(2012).
  36. Kløverpris, H. N., Cole, D. K., et al. A molecular switch in immunodominant HIV-1-specific CD8 T-cell epitopes shapes differential HLA-restricted escape. Retrovirology. 12, 20(2015).
  37. Motozono, C., Kuse, N., et al. Molecular Basis of a Dominant T Cell Response to an HIV Reverse Transcriptase 8-mer Epitope Presented by the Protective Allele HLA-B*51:01. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 192 (7), 3428-3434 (2014).
  38. Motozono, C., Pearson, J. A., et al. Distortion of the major histocompatibility complex class i binding groove to accommodate an insulin-derived 10-mer peptide. Journal of Biological Chemistry. 290 (31), 18924-18933 (2015).
  39. Cole, D. K., Bulek, A. M., et al. Hotspot autoimmune T cell receptor binding underlies pathogen and insulin peptide cross-reactivity. The Journal of clinical investigation. , (2016).
  40. Bulek, A. M., Cole, D. K., et al. Structural basis for the killing of human beta cells by CD8(+) T cells in type 1 diabetes. Nature immunology. 13 (3), 283-289 (2012).
  41. Ekeruche-Makinde, J., Clement, M., et al. T-cell receptor-optimized peptide skewing of the T-cell repertoire can enhance antigen targeting. Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37269-37281 (2012).
  42. Cole, D. K., Miles, K. M., et al. T-cell Receptor (TCR)-peptide specificity overrides affinity-enhancing TCR-major histocompatibility complex interactions. Journal of Biological Chemistry. 289 (2), 628-638 (2014).
  43. Cole, D. K., Gallagher, K., et al. Modification of the carboxy-terminal flanking region of a universal influenza epitope alters CD4+ T-cell repertoire selection. Nature communications. 3, 665(2012).
  44. Varela-Rohena, A., Molloy, P. E., et al. Control of HIV-1 immune escape by CD8 T cells expressing enhanced T-cell receptor. Nature medicine. 14 (12), 1390-1395 (2008).
  45. Holland, C. J., Dolton, G., et al. Enhanced Detection of Antigen-Specific CD4+ T Cells Using Altered Peptide Flanking Residue Peptide-MHC Class II Multimers. The Journal of Immunology. 195 (12), 5827-5836 (2015).
  46. Wooldridge, L., Clement, M., et al. MHC class I molecules with Superenhanced CD8 binding properties bypass the requirement for cognate TCR recognition and nonspecifically activate CTLs. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 184 (7), 3357-3366 (2010).
  47. Laugel, B., Den Berg, H. A. V. an, et al. Different T cell receptor affinity thresholds and CD8 coreceptor dependence govern cytotoxic T lymphocyte activation and tetramer binding properties. Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 23799-23810 (2007).
  48. Bridgeman, J. S., Sewell, A. K., Miles, J. J., Price, D. A., Cole, D. K. Structural and biophysical determinants of αβ T-cell antigen recognition. Immunology. 135 (1), 9-18 (2012).
  49. Willcox, B. E., Gao, G. F., et al. TCR binding to peptide-MHC stabilizes a flexible recognition interface. Immunity. 10 (3), 357-365 (1999).
  50. Borbulevych, O. Y., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational melding permits a conserved binding geometry in TCR recognition of foreign and self molecular mimics. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 186 (5), 2950-2958 (2011).
  51. Armstrong, K. M., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational changes and flexibility in T-cell receptor recognition of peptide-MHC complexes. The Biochemical journal. 415 (2), 183-196 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza biofizycznapeptyd HLAanaliza SPRrenaturacja bia ekchromatografia wykluczania cz steczekchromatografia wymiany anionowejdyfrakcja synchrotronowarozpoznawanie antygenu

Powiązane artykuły