Artykuł metodologiczny

Mysi model do przeszczepu trzustki przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietowej

DOI:

10.3791/54998

⸱

16 grudnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Operative Medicine, Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Medical University Innsbruck, 2Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Medical University Innsbruck, 3Department of Cardiac Surgery, Medical University Innsbruck, 4Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wśród przeszczepów narządów litych w jamie brzusznej, przeszczepy trzustki są podatne na poważne uszkodzenia przeszczepu związane z reperfuzją niedokrwienną, co ostatecznie prowadzi do wczesnej utraty przeszczepu. Protokół ten opisuje model przeszczepu trzustki u myszy przy użyciu techniki mankietu bez szwów, idealnie nadającej się do analizy tych wczesnych, szkodliwych uszkodzeń.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele myszy mają kilka zalet w badaniach transplantacyjnych, w tym łatwą obsługę, różnorodność genetycznie dobrze zdefiniowanych szczepów oraz dostępność najszerszego zakresu sond molekularnych i odczynników do przeprowadzania badań in vivo i in vitro. Opierając się na naszych doświadczeniach z różnymi modelami przeszczepu myszy, opracowaliśmy heterotopowy model przeszczepu trzustki u myszy z zamiarem przeanalizowania mechanizmów leżących u podstaw ciężkiego uszkodzenia reperfuzyjnego związanego z ciężkim uszkodzeniem reperfuzyjnym związanym z przeszczepem. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych technik z wykorzystaniem technik szwów, tutaj opisujemy nową procedurę z wykorzystaniem techniki mankietu bez szwów.

W ostatnich latach przeprowadziliśmy ponad 300 przeszczepów trzustki u myszy z ogólnym wskaźnikiem sukcesu >90%, co nigdy wcześniej nie opisano w transplantacji trzustki u myszy. Szkielet tej techniki mankietu bez szwów do rewaskularyzacji przeszczepu składa się z dwóch głównych etapów: (I) naciągnięcia naczynia biorczego na mankiet z polietylenu/poliamidu i zamocowania go za pomocą ligatury obwodowej oraz (II) umieszczenia naczynia dawczego nad naczyniem biorcy i zamocowania go za pomocą drugiej ligatury obwodowej. Wynikająca z tego ciągłość warstwy śródbłonka skutkuje mniejszą liczbą zmian zakrzepowych przy wysokich wskaźnikach drożności i wreszcie wysokich wskaźnikach powodzenia.

W tym modelu, zespolenie tętnicze osiąga się poprzez przeciągnięcie aorty brzusznej przeszczepu dawcy nad zniszczoną tętnicą szyjną wspólną zwierzęcia biorcę. Drenaż żylny przeszczepu uzyskuje się poprzez przeciągnięcie żyły wrotnej przeszczepu przez zerwaną żyłę szyjną zewnętrzną biorcy. Manuskrypt ten zawiera szczegółowe informacje i kluczowe etapy procedur odzyskiwania i implantacji narządów, które pozwolą naukowcom posiadającym umiejętności mikrochirurgiczne na pomyślne przeprowadzenie przeszczepu w swoich laboratoriach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednoczesny przeszczep nerki i trzustki (SPK) reprezentuje obecny standard opieki nad pacjentami cierpiącymi na cukrzycę i schyłkową niewydolność nerek. Udany przeszczep skutkuje długotrwałą niezależnością od insuliny związaną ze stabilizacją lub nawet regresją mikroangiopatii cukrzycowej i lepszą jakością życia1. Jednak w przeciwieństwie do innych powszechnych przeszczepów narządów litych, takich jak przeszczepy nerek i wątroby, przeszczepy trzustki są bardziej podatne na uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienne (IRI). Zgłaszane przypadki zachorowań sięgające 35% zagrażają nie tylko przeżyciu przeszczepu, ale nawet pacjenta2,3.

Stres oksydacyjny, zaburzenia mikrokrążenia, zwiększona ekspresja cytokin prozapalnych i cząsteczki adhezyjne skutkujące w końcu aktywacją śródbłonka i utratą jego integralności, zostały przypisane temu nieallogenicznemu uszkodzeniu przeszczepu4. Jak dotąd dokładne mechanizmy molekularne IRI są w dużej mierze nieznane i mogą się różnić w zależności od narządu.

Pomimo znacznego postępu w wykorzystaniu modeli in vitro, rozwój modeli zwierzęcych jest kluczowy dla pogłębienia wiedzy na temat mechanizmów molekularnych związanych z zmianami przeszczepów związanych z IRI po przeszczepie trzustki. U gryzoni opracowano kilka modeli przeszczepu trzustki5,6, ale tylko jeden jest zgłoszony u myszy7. Piętą achillesową tego bardzo wymagającego zabiegu mikrochirurgicznego jest niski wskaźnik przeżycia wynoszący 46%. Jednak modele mysie stanowią najlepszy model do badań związanych z przeszczepami, ponieważ można do nich zastosować najszerszą gamę narzędzi analizy molekularnej. Opierając się na bogatym doświadczeniu mikrochirurgicznym na myszach z różnymi przeszczepami narządów8,9,10, opracowaliśmy nową, wysoce powtarzalną technikę heterotopowego przeszczepu trzustki szyjnej u myszy z >90% skutecznością przy użyciu techniki mankietu bez szwów. Dzięki tej technice powikłania związane z zespoleniami są zredukowane do minimum i można osiągnąć wysoki wskaźnik sukcesu w porównaniu z modelem szwów11. Do tej pory tylko jeden model myszy o podobnych wskaźnikach sukcesu został opisany przez Liu et al12. Jednak do tej pory nie opublikowano żadnych badań z wykorzystaniem tego modelu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uniknąć reakcji alloimmunologicznych i dokładnie zbadać uszkodzenia przeszczepu związane z uszkodzeniem niedokrwiennym reperfuzji, powinna być używana para syngeniczna dawca-biorca. W tym protokole samce 10-12-tygodniowych myszy C57BL6 (H2b) o wadze od 26 do 28 g wykorzystano jako pary dawca-biorca o dopasowanej wielkości. Wszystkie zwierzęta były trzymane w obiekcie wolnym od barier patogennych i otrzymywały opiekę człowieka zgodnie z "Zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi" opracowanymi przez National Society for Medical Research oraz "Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" przygotowanym przez National Academy of Sciences i opublikowanym przez National Institutes of Health (publikacja NIH nr 86-23, Poprawiony w 1985 r.). Austriackie Ministerstwo Edukacji, Nauki i Kultury zatwierdziło eksperymenty opisane w tym manuskrypcie (BMWF-66.011/0056-II/3b/2011).

1. Zaopatrzenie trzustki

  1. Znieczulić zwierzę dawcy za pomocą dootrzewnowego (i.p.) wstrzyknięcia ksylazyny (5 mg/kg masy ciała) i ketaminy (100 mg/kg masy ciała) za pomocą igły o rozmiarze 27 (G).
  2. Ogol włosy w okolicy brzucha za pomocą golarki elektrycznej i przymocuj mysz do pola operacyjnego w pozycji leżącej za pomocą pasm taśmy.
  3. Trzykrotnie wyszoruj pole operacyjne gazami nasączonymi chlorheksydyną.
  4. Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej z obustronnym przedłużeniem podżebrowym za pomocą nożyczek. Delikatnie zewnętrzizuj wnętrzności po lewej stronie sterylnymi wacinowymi patyczkami i zawiń je w zwilżoną gazę. Podnieś ksyloidę czaszkową za pomocą zacisku na komary, aby zapewnić maksymalne odsłonięcie jamy brzusznej w kolejnych krokach.
  5. Za pomocą igły 19 G wstrzyknąć 400 μl jałowego roztworu heparyny i chlorku sodu w stosunku 1:4 do heparynizacji do żyły głównej dolnej (IVC). Po wyjęciu igły należy poddać zwierzę eutanazji poprzez wykrwawienie przez przecięcie aorty.
  6. Wypreparuj aortę brzuszną między początkiem tętnicy krezkowej górnej a prawą tętnicą nerkową, delikatnie oddzielając tkankę włóknistą za pomocą kleszczy z zakrzywioną końcówką. Podkop aortę i zawiąż ją jedwabną ligaturą 8/0.
  7. Zidentyfikuj więzadło wątrobowo-odnerkowe, które biegnie między dwunastnicą postodźwiernikową a wnęką wątroby. Podziel przewód żółciowy poniżej wejścia do przewodu torbielowatego po podwiązaniu dystalnym, a następnie delikatnie rozetnij i przeciąć żyłę wrotną tak dystalnie, jak to możliwe, aby mieć wystarczającą długość do wykonania zespolenia u biorcy.
  8. Używając kleszczyków z zakrzywioną końcówką, tępo wypreparuj aortę brzuszną, zaczynając od poprzedniej ligatury (patrz krok 1.6). Podkop tkankę okołoaortalną za pomocą kleszczy z zakrzywioną końcówką, zawiąż ją jedwabną ligaturą 8/0 i przetnij nożyczkami.
    1. Za pomocą kleszczy dwubiegunowych skoaguluj wszystkie jego gałęzie lędźwiowe i przeciąć aortę nożyczkami jak najbliżej przepony, aby zapewnić wystarczającą długość do zespolenia naczynia. Na koniec przeciąć już zawiązaną aortę nad lewą tętnicą nerkową.
  9. Ukrwić trzustkę za pomocą strzykawki 19 G z 5 ml roztworu perfuzji histydyny, tryptofanu i ketoglutaranu o temperaturze 4 °C w sposób wsteczny przez aortę brzuszną, aż do uzyskania klarownego ścieku z żyły wrotnej. Stosować niskie ciśnienie, aby uniknąć powstania obrzęku.
    UWAGA: Wykonaj kroki od 1.5 do 1.9 w szybki i ustandaryzowany sposób, aby uniknąć odchyleń spowodowanych ciepłym niedokrwiennym pogorszeniem odzyskanego przeszczepu.
  10. Włóż wnętrzności do jamy otrzewnej za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych.
  11. Za pomocą kleszczyków z zakrzywioną końcówką oddziel trzustkę stopniowo, zaczynając od dwunastnicy zaodźwierniowej i przesuwając się do przodu, aż do więzadła Treitza. Na tych etapach zidentyfikuj beznaczyniowe obszary tkanki łącznej między trzustką a ścianą dwunastnicy.
    1. Dosadnie wypreparuj te obszary za pomocą kleszczy z zakrzywioną końcówką, aby wyizolować naczynia łączące trzustkę z dwunastnicą. Przełóż jedwabną ligaturę 8/0 wokół każdej izolowanej struktury naczyniowej i zawiąż ją.
    2. Na koniec przeciąć strukturę naczyniową nożyczkami w kierunku ściany dwunastnicy. W ten sam sposób użyj jedwabnego szwu 8/0, aby oddzielić trzustkę od krezki, okrężnicy poprzecznej i żołądka.
      UWAGA: Podczas tej procedury podwiązywany jest przewód choledocho-trzustkowy.
  12. Zidentyfikuj więzadło żołądkowo-śledzionowe biegnące od śledziony do żołądka oraz krótkie gałęzie żołądka, podnosząc żołądek czaszkowo i przecinając go nożyczkami. Pozostaw śledzionę przyczepioną do odzyskanego przeszczepu.
    UWAGA: Aby zminimalizować ponowne rozgrzewanie przeszczepu, należy przepłukać trzustkę w sposób ciągły za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 19 G z zimnym roztworem perfuzyjnym histydyny, tryptofanu i ketoglutaranu przechowywanym na lodzie.
  13. Na koniec usuń trzustkę z miejsca dawczego (Ryc. 1B), chwytając śledzionę kleszczami, i przenieś ją do biorcy.
    1. Alternatywnie, aby wywołać ciężkie uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienne, należy przechowywać przeszczep w sterylnym roztworze perfuzyjnym o temperaturze 4 °C przez 16 godzin przed wszczepieniem go zwierzęciu biorcy.

2. Przygotowanie odbiorcy

  1. Znieczulić zwierzę biorcy za pomocą iniekcji dożylnej ksylazyny (5 mg/kg masy ciała) i ketaminy (100 mg/kg masy ciała) za pomocą igły 27 G.
  2. Ogol prawą boczną część szyjki macicy za pomocą golarki elektrycznej i umieść mysz na polu operacyjnym w pozycji leżącej. Napraw mysz za pomocą pasm taśmy. Unikaj nadmiernego rozciągania przednich kończyn, aby uniknąć pogorszenia oddychania.
  3. Trzykrotnie wyszoruj pole operacyjne za pomocą gazy nasączonej chlorheksydyną.
  4. Wykonaj prawe przyśrodkowe, lekko skośne nacięcie skóry od nacięcia szyjnego do odpowiedniego kąta żuchwy.
  5. Dosadnie zidentyfikuj i zmobilizuj boczne gałęzie prawej żyły szyjnej zewnętrznej. Skoaguluj je za pomocą kleszczy bipolarnych i przetransektuj je nożyczkami.
  6. Podnieś prawy płat podżuchwowego śliniaka czaszkowo, zidentyfikuj szypułkę naczyniową i kauteryzuj ją za pomocą kleszczy dwubiegunowych. Usuń płatek, przecinając kauteryzowaną szypułkę nożyczkami.
  7. Analogicznie do kroku 2.5 zidentyfikuj wszystkie przyśrodkowe gałęzie żyły szyjnej zewnętrznej, kauteryzuj je kleszczami dwubiegunowymi i przetnij nożyczkami. Podeprzeć zewnętrzną żyłę szyjną za pomocą zakrzywionych kleszczy końcowych tak czaszkowo, jak to możliwe, i podwiązaj ją za pomocą dwóch jedwabnych ligatur 8/0, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca między ligaturami.
  8. Przeciąć żyłę szyjną zewnętrzną między dwiema wcześniej umieszczonymi ligaturami prostymi nożyczkami.
  9. Przełóż bliższy koniec żyły szyjnej zewnętrznej przez mankiet polietylenowy (średnica wewnętrzna 0,75 mm, średnica zewnętrzna 0,94 mm) i przymocuj uchwyt mankietu za pomocą żylnego zacisku mikrohemostatu.
  10. Zdejmij krawat na końcu kikuta naczynia i przełóż naczynie nad mankietem. Przymocuj żyłę na mankiecie za pomocą okrągłej ligatury jedwabnej 8/0 (Rysunek 1A).
  11. Proksymalnie i dystalnie kauteryzuj powierzchowną część prawego mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego, przeciąć go nożyczkami i usunąć.
  12. Delikatnie zmobilizuj wspólną tętnicę szyjną, podważ ją poniżej rozwidlenia i podwiąż dwukrotnie, uważając, aby nie wiązać rozwidlenia tętnicy szyjnej. Przetnij naczynie między krawatami.
  13. Podobnie jak w kroku 2.9, przełóż bliższy koniec tętnicy szyjnej wspólnej przez mankiet poliamidowy (średnica wewnętrzna 0,57 mm, średnica zewnętrzna 0,6 mm) i przymocuj go za pomocą zacisku mikronaczyniowego tętniczego.
  14. Usuń więzadło na końcu kikuta naczyniowego i delikatnie poszerz światło za pomocą rozszerzaczy naczyń. Przełóż naczynie na mankiet tętniczy i przymocuj je za pomocą jedwabnej ligatury 8/0 (Rysunek 1A).

3. Implantacja

  1. Umieść przeszczep w okolicy szyi biorcy, używając śledziony jako uchwytu, z głową zorientowaną na bok, ogonem wraz ze śledzioną przyśrodkowo, a naczynie brzusznie doogonowo. Użyj bawełnianych patyczków, aby prawidłowo ustawić przeszczep.
  2. Delikatnie przeciągnąć żyłę wrotną przeszczepu trzustki nad zewnętrzną żyłą szyjną zwierzęcia biorcy, która została wcześniej przecięta i przymocowana do odpowiedniego mankietu (patrz krok 2.10). Napraw to za pomocą okrągłej jedwabnej ligatury 8/0.
  3. Przeciągnij kikut aorty brzusznej przeszczepu nad zerwaną wspólną tętnicą szyjną zwierzęcia biorcy. Zamocuj to za pomocą obwodowej ligatury jedwabnej 8/0 (Rysunek 1C).
  4. Zidentyfikuj naczynia śledziony w pobliżu wnęki śledziony i podważ je za pomocą kleszczy z zakrzywioną końcówką. Zawiąż je jedwabnymi ligaturami 8/0 i przetnij naczynia śledziony, aby usunąć śledzionę. Na koniec skróć krawaty.
  5. Za pomocą zacisku z kleszczami najpierw zdejmij zacisk na mankiecie żylnym. Następnie zdejmij zacisk tętniczy.
    UWAGA: Jeśli przeszczep się powiódł, przeszczep trzustki zostanie natychmiast poddany reperfuzji, wykazując jednorodny różowawy kolor i widoczną pulsację tętniczą (Ryc. 1D).
  6. Zwilż przeszczep normotermicznym roztworem soli
    7. fizjologicznej.
  7. Zdejmij uchwyt mankietu żylnego za pomocą prostych kleszczy.
  8. Zamknij ranę pooperacyjną za pomocą biegnącego szwu 6/0.

4. Opieka pooperacyjna (punkt końcowy)

  1. Po zabiegu należy zastosować podskórnie do 0,5 ml soli fizjologicznej (s.c.) w celu uzupełnienia śródoperacyjnego ubytku płynów za pomocą igły 19 G.
  2. Trzymaj zwierzę biorcy na poduszce grzewczej do czasu całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia.
  3. Po przebudzeniu zwierzę biorcy należy zwrócić do obiektu mieszkalnego, gdzie może mieć dostęp do jedzenia i wody ad libitum.
  4. Aby zapobiec bólom pooperacyjnym, należy podawać bezpośrednio po operacji (1) buprenorfinę (0,1 mg/kg m.c.) co 12 godzin przez pierwsze 5 dni i (2) karprofen 4 mg/kg m.c. co 12 h s.c. przez pierwszy tydzień.
  5. W celu oszacowania prawidłowego spożycia składników odżywczych należy codziennie monitorować masę ciała (g) każdego biorcy. Utrata masy ciała o ponad 10-15% w porównaniu z masą ciała w dniu operacji, apatia, kalectwo, bardzo zgięte plecy, a także chirurgiczne infekcje boczne stanowią punkty końcowe.
    1. W takim przypadku, jak również po osiągnięciu klinicznego punktu końcowego, zwierzę należy uśmiercić, stosując końcową inhalację izofluranu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady przeprowadziliśmy ponad 300 przeszczepów trzustki u myszy. Po ustaleniu protokołu całkowite przeżycie wynosiło >90%. Główną przyczyną niepowodzenia było krwawienie pooperacyjne, a następnie zakrzepica przeszczepu, a następnie śmiertelne martwicze zapalenie trzustki. W obu przypadkach punkty końcowe zostały osiągnięte w ciągu 24 godzin, a zwierzęta zostały uśmiercone. W tej serii nie było żadnych zaburzeń neurologicznych, objawów takich jak dysfagia i chirurgiczne infekcje boczne.

Aby zbadać funkcję hormonalną przeszczepionych przeszczepów, a tym samym potwierdzić drożność modelu, hiperglikemia została wywołana u myszy biorców poprzez wstępne leczenie pojedynczą dawką streptozotocyny podawanej dootrzewnowo (312,5 mg/kg masy ciała) na 4 dni przed operacją. Myszy uważano za hiperglikemiczne, jeśli poziom glukozy we krwi wynosił >300 mg/dl. Rysunek 2A pokazuje poziom glukozy we krwi różnych grup. Myszy otrzymujące przeszczepy bez przedłużonego czasu zimnego niedokrwienia wynoszącego 16 godzin osiągnęły normogylcemię w ciągu 24 godzin po przeszczepie i utrzymywały ten stan metaboliczny przez cały okres obserwacji. Natomiast zwierzęta nieprzeszczepione pozostały hiperglikemiczne. Ponieważ interesował nas wpływ uszkodzenia przeszczepu związanego z uszkodzeniem reperfuzyjnym niedokrwienia na czynność układu hormonalnego, dodaliśmy trzecią grupę, w której przeszczepy były wystawione na 16-godzinny przedłużony czas zimnego niedokrwienia (CIT) i 45-minutowy czas ciepłego niedokrwienia (WIT). Myszy otrzymujące te przeszczepy nie osiągnęły normoglikemii i musiały zostać uśmiercone po 48 godzinach z powodu rozwoju ciężkiego zapalenia trzustki, które okazało się śmiertelne w tym modelu13.

Ten model jest przydatny do różnych projektów mających na celu badanie wczesnych uszkodzeń przeszczepu związanych z niedokrwieniem reperfuzji. Dalsze badania obejmowały m.in. konfokalną przyżyciową mikroskopię fluorescencyjną do oceny ilościowej zaburzeń mikrokrążenia, wykonaną 2 godziny po przeszczepie. Kontrast mikronaczyń przeszczepów został zwiększony przez wstrzyknięcie 0,3 ml 0,4% dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (MW 150 000) do żyły prącia. Rysunek 2B przedstawia regularny wzór naczyń włosowatych naiwnej mysiej trzustki i przeszczepionego przeszczepu trzustki, który nie był narażony na długotrwałe CIT (Rysunek 2C). Natomiast Rysunek 2D pokazuje załamanie mikrokrążenia w wyniku wystawienia przeszczepu trzustki na długotrwałe CIT.

figure-results-1
Rysunek 1: Zdjęcia śródoperacyjne. (A) Śródoperacyjny widok naczyń biorczych przygotowanych do zespolenia. Żyła szyjna zewnętrzna (1) została przecięta nad żylnym mankietem z polietylenu i przymocowana okrągłą ligaturą jedwabną 8/0. Analogicznie, tętnica szyjna wspólna (2) została przecięta i unieruchomiona na mniejszym tętniczym mankietu poliamidowym. Podziałka 1 mm. (B) Przeszczep trzustki ex situ. Żyła wrotna (1) i kikut aorty brzusznej (2) potrzebne do zespolenia naczyniowego. Śledziona (3) jest pobierana razem z trzustką i służy jako uchwyt. Śledziona zostanie usunięta przed reperfuzją przeszczepu. Podziałka liniowa 1 cm. (C) Śródoperacyjny widok zespoleń. Żyła wrotna (1) jest naciągnięta na mankiet żyły szyjnej zewnętrznej (2) i przymocowana okrągłym jedwabnym krawatem 8/0. Podobnie kikut aorty aorty brzusznej (3) jest naciągnięty na mankiet tętnicy szyjnej wspólnej (4). Podziałka 1 mm. (D) Śródoperacyjny widok perfundowanego przeszczepu trzustki po 5 minutowej reperfuzji: Po usunięciu żyły, a następnie zacisku tętniczego, pomyślnie przeszczepiony przeszczep trzustki ma jednorodny różowawy kolor. Śledziona została usunięta przed reperfuzją (1: podwiązane naczynie śledzionowe). Podziałka 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Endokrynologiczna funkcja przeszczepu trzustki i konfokalna mikroskopia fluorescencyjna in vivo.Rysunek 2A pokazuje wykres liniowy z poziomami glukozy we krwi przeszczepionych myszy bez CIT (n = 10, PTX bez CIT, niebieska linia), myszy bez przeszczepu (n = 11, brak PTX, czerwona linia) oraz myszy otrzymujących przeszczepy narażone na przedłużony CIT (PTX + 16 h CIT, n = 10, zielona linia). U wszystkich biorców stwierdzono wcześniej hiperglikemię z 312,5 mg/kg m.c. streptozotocyny i.p. Podczas gdy wszyscy biorcy przeszczepów bez CIT byli w stanie przetrwać cały okres obserwacji (50 dni) z nienaruszoną funkcją endokrynną, myszy bez przeszczepu pozostały hiperglikemiczne przez cały okres obserwacji. Myszy otrzymujące przeszczepy wystawione na 16-godzinny CIT nie wyzdrowiały z hiperglikemii i musiały zostać poświęcone 48 godzin po operacji przeszczepu, z powodu utraty masy ciała o ponad 10-15%. Myszy, które przeżyły cały okres obserwacji, zostały uśmiercone w 50 dniu po ostatnim pomiarze glikemii. Mikrokrążenie w przeszczepionych przeszczepach oceniano za pomocą konfokalnej przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej 2 godziny po przeszczepie. Naiwna trzustka służyła jako kontrola. Rysunek 2B pokazuje regularny wzór naczyń włosowatych w naiwnej trzustce. Regularna siatka kapilarna jest również widoczna u przeszczepów przeszczepionych, które nie są poddawane długotrwałemu CIT (Rysunek 2C). Natomiast załamanie mikrokrążenia obserwuje się u przeszczepów po przeszczepach narażonych na długotrwałe CIT (Ryc. 2D). Podziałka 100 μm. Dane na wykresie są wyrażone jako ± odchylenie standardowe. PTX: przeszczep trzustki; CIT: czas zimnego niedokrwienia; bez Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uszkodzenie przeszczepu związane z IRI jest nieodłącznie związane z przeszczepem narządów litych i charakteryzuje się zaburzeniem mikrokrążenia. Nagromadzenie kilku metabolitów w fazie niedokrwiennej i zainicjowanie kaskad zapalnych, w których pośredniczą głównie reaktywne formy tlenu i azotu, powoduje uszkodzenie tkanek podczas reperfuzji przeszczepu4. Kaskada ta może zagrozić nie tylko krótkoterminowemu, ale także długoterminowemu sukcesowi, a co za tym idzie, znacząco wpływa na przeżycie pacjentów14. Do tej pory skojarzone przeszczepienie nerki i trzustki stanowi terapię z wyboru dla pacjentów cierpiących na cukrzycę typu 1 ze schyłkową niewydolnością nerek15. Kilka badań wykazało, że udany połączony przeszczep nerki i trzustki nie tylko przywraca i chroni funkcję przeszczepu nerki u biorców z cukrzycą, ale także stabilizuje lub nawet odwraca wtórne powikłania, w tym neuropatię oraz mikro- i makroangiopatię 16,17,18.

Pomimo ciągłych wysiłków w zakresie redukcji, wymiany i udoskonalania (3 R) w badaniach na zwierzętach, reprodukcja złożonych procesów patofizjologicznych, takich jak IRI, jest po prostu niemożliwa w warunkach in vitro. Dlatego modele zwierzęce są nadal uważane za idealne narzędzie do badań translacyjnych19,20. Modele myszy, takie jak ten opisany tutaj, mają kilka zalet w porównaniu z modelami szczurów lub innych zwierząt. Należą do nich dostępność ogromnej ilości genetycznie dobrze zdefiniowanych szczepów myszy wsobnych (np. szczepów transgenicznych i knock-out), mnóstwo narzędzi do analizy molekularnej, a także łatwa i tania obsługa21. Dużą zaletą opisywanego modelu jest technika mankietu bez szwu. Dzięki zastosowaniu przedstawionej w niniejszym tekście techniki możliwe jest osiągnięcie wskaźników sukcesu na poziomie >90%, co jest znacznie lepsze w porównaniu z poprzednio opisanymi modelami22. Stosując tę technikę bez szwów, znacznie zmniejszyliśmy częste powikłania, takie jak wstrząs hipowolemiczny, zakrzepica i zwężenie zespoleń12. Kolejną zaletą tej metody jest dodatkowe ułożenie przeszczepu w jamie brzusznej, co wiąże się z szybką rekonwalescencją pooperacyjną biorcy. Dodatkowo, lokalizacja szyjki macicy sprawia, że doskonale nadaje się do analiz in vivo, takich jak obrazowanie na żywo przeszczepu przez eksteriorację bez żadnego napięcia22.

Główną wadą tego modelu jest niedrożność przewodu trzustkowego, która nie przypomina rzeczywistości klinicznej. W tym modelu drenaż zewnątrzwydzielniczy jest zarządzany poprzez związanie przewodu chrzęstno-trzustkowego. W dłuższej perspektywie powoduje to wyraźne zwłóknienie i atrofię gruczołu, nie prowadząc do zapalenia trzustki po przeszczepie22. Ze względu na to pogorszenie stanu tkanki zewnątrzwydzielniczej, które zaobserwowaliśmy już w 30 dniu po przeszczepie, uważamy, że ten model nie nadaje się do długotrwałej obserwacji. W przeciwieństwie do tego, niezaburzona funkcja hormonalna sprawia, że kontrola gylcemiczna biorcy jest łatwym narzędziem do codziennej oceny funkcji przeszczepu 13,23,24.

Te cechy sprawiają, że jest to idealny model do analizy wczesnych urazów przeszczepu związanych z długimi okresami konserwacji lub z różnymi rozwiązaniami i technikami konserwacji. Aby osiągnąć optymalny sukces z tym modelem, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych kroków. Sama trzustka jest bardzo podatna na manipulacje. Dlatego delikatne obchodzenie się z patyczkami bawełnianymi podczas odzyskiwania narządów i podczas implantacji minimalizuje uraz mechaniczny. Należy unikać bezpośredniego chwytania gruczołu kleszczami, ponieważ nieuchronnie doprowadziłoby to do poważnego uszkodzenia przeszczepu. Z tego samego powodu śledziona jest odzyskiwana wraz z trzustką i służy jako uchwyt. Jest to również ustalone w praktyce klinicznej. Kolejną pułapką jest zimna perfuzja, którą uzyskuje się przez kikut aorty przy użyciu roztworu perfuzji histydyny, tryptofanu i ketoglutaranu o temperaturze 4 °C. W ten sposób można uniknąć nadmiernego obrzęku gruczołu poprzez delikatne perfuzję przeszczepu. Pozostały roztwór perfuzyjny należy użyć do zwilżenia przeszczepu, aby utrzymać jego niską temperaturę podczas rekonwalescencji narządu.

Jeśli chodzi o przygotowanie biorcy, staranne rozwarstwienie zarówno żyły szyjnej zewnętrznej, jak i tętnicy szyjnej wspólnej stanowi podstawę do udanej rewaskularyzacji. W szczególności konieczne jest całkowite odsłonięcie żyły poprzez usunięcie nie tylko wszystkich dopływów, ale także otaczającej tkanki tłuszczowej, aby uniknąć zewnętrznego ucisku i zwężenia przez pozostałą tkankę tłuszczową. Dobór odpowiednich średnic mankietów ma kluczowe znaczenie. Na podstawie wspólnych doświadczeń, w przypadku myszy o masie ciała od 25 do 28 g odpowiednia jest średnica wewnętrzna 0,57 mm w przypadku mankietu tętniczego i od 0,75 do 0,8 mm w przypadku mankietu żylnego. Precyzyjne, czyste cięcie krawędzi mankietów jest obowiązkowe, aby uniknąć rozerwania kikuta naczynia. Rozszerzenie naczyń, zwłaszcza tętnicy, najlepiej osiąga się przy użyciu rozszerzaczy naczyń z cienkimi końcówkami. Z reguły naczynie powinno być w stanie poszerzyć się do dwukrotnego prześwietlenia mankietu. Podczas procesu odklejania naczynia i mocowania go na mankiecie zalecamy ustabilizowanie zacisków naczyniowych poprzez umieszczenie ich pod płatem skóry, ponieważ ułatwia to ten kluczowy krok.

Jak już wspomniano, technika mankietu bez szwów stanowi łatwą metodę zespolenia naczyniowego i może być wykonana w ciągu 5 minut. Jednak prawidłowe ułożenie przeszczepu w okolicy szyi biorcy ma ogromne znaczenie dla prawidłowej rewaskularyzacji. W związku z tym należy przewidzieć ostateczne prawidłowe umiejscowienie przeszczepu w okolicy szyi, aby umożliwić bezpieczne, proste i pozbawione napięć zespolenie zarówno żyły, jak i tętnicy. Należy unikać zbyt długich naczyń, ponieważ może to prowadzić do zablokowania odpływu z powodu załamania. Z tego samego powodu po reperfuzji należy również usunąć uchwyt mankietu w zespoleniu żylnym. W przypadku miejscowych krwawień z przeszczepu trzustki skuteczną hemostazę można osiągnąć poprzez delikatne uciskanie strony krwawiącej przez 5 minut za pomocą bawełnianych patyczków. Jest to jedyny skuteczny sposób radzenia sobie z tego rodzaju komplikacjami. Kauteryzacja, mimo że wysoce selektywna, powodowała utratę przeszczepu w prawie wszystkich przypadkach z powodu martwiczego zapalenia trzustki.

Podsumowując, opracowaliśmy metodę przeszczepu trzustki u myszy przy użyciu techniki mankietu bez szwów, która jest technicznie i mikrochirurgicznie wykonalna i ma doskonałe wskaźniki sukcesu. Biorąc pod uwagę postępujące zwłóknienie trzustki spowodowane niedrożnością przewodu, model ten najlepiej nadaje się do obszarów badawczych koncentrujących się na wczesnych uszkodzeniach przeszczepu. Niniejszy manuskrypt ma na celu umożliwienie naukowcom bezpiecznego ustanowienia tego modelu w ich laboratoriach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty #2008-1-596 i #UNI-0404/1956 "Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF)" (https://www.tirol.gv.at/en/), oraz przez grant #2013-042018 "MUI-Start Förderungsprogramm" Uniwersytetu Medycznego w Innsbrucku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Adventitia NożyczkiS& TS-00102Kleszcze
proste Dumont # 7FST  11271- 30Zakrzywiona końcówka 0,17 x 0,1 mm
Yasargil Clip Mini Permanent 7mmAesculapFE720K
Mikroklips do naczyńS& TB1 00396 V
Dylatator zbiornikaS& TD-5a.2, 00125
Aplikator klipsówS & TCAF-4 00072do mankietu żylnego
AesculapFE572K do mankietu tętniczego
Rurka polietylenowaPortex LtdŚrednica wewnętrzna 0,75 mm do mankietu żylnego
Rurki poliamidoweVention Medical 141-0051Średnica wewnętrzna 0,8 mm (Alternatywa dla rurki polietylenowej firmy Portex Ltd)
Rurka polimidowaVention Medical141-0033Średnica wewnętrzna 0,57 mm do mankietu
Kleszcze bipolarneMicromed140-100-015
Ligatury jedwabne 8/0Catgut GmbH, Merkuramed17209008
Custodiol HTK solutionDr. Franz Kö hler Chemie59997
Ketamin GraeubaniMedica GmbH32554
Xylasol GraeubaniMedica GmbH50855
tętniczego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. 2011 update on pancreas transplantation: comprehensive trend analysis of 25,000 cases followed up over the course of twenty-four years at the International Pancreas Transplant Registry (IPTR). Rev Diabet Stud. 8 (1), 6-16 (2011).">Gruessner, A. C. 2011 update on pancreas transplantation: comprehensive trend analysis of 25,000 cases followed up over the course of twenty-four years at the International Pancreas Transplant Registry (IPTR). Rev Diabet Stud. 8 (1), 6-16 (2011).
  2. Complications after pancreas transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (1), 112-118 (2010).">Troppmann, C. Complications after pancreas transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (1), 112-118 (2010).
  3. Native and graft pancreatitis following combined pancreas-renal transplantation. Br J Surg. 80 (11), 1429-1432 (1993).">Fernández-Cruz, L., et al. Native and graft pancreatitis following combined pancreas-renal transplantation. Br J Surg. 80 (11), 1429-1432 (1993).
  4. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).">Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  5. A technique of pancreas transplantation in the rat securing pancreatic juice for monitoring. Transpl. Int. 3 (3), 181-182 (1990).">Konigsrainer, A., Habringer, C., Krausler, R., Margreiter, R. A technique of pancreas transplantation in the rat securing pancreatic juice for monitoring. Transpl. Int. 3 (3), 181-182 (1990).
  6. Pancreaticoduodenal transplantation in the rat. Transplantation. 13 (4), 421-425 (1972).">Lee, S., Tung, K., Koopmans, H., Chandler, J., Orloff, M. Pancreaticoduodenal transplantation in the rat. Transplantation. 13 (4), 421-425 (1972).
  7. Model of mouse pancreaticoduodenal transplantation. Microsurgery. 19 (2), 61-65 (1999).">Tori, M., Ito, T., Matsuda, H., Shirakura, R., Nozawa, M. Model of mouse pancreaticoduodenal transplantation. Microsurgery. 19 (2), 61-65 (1999).
  8. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. (92), e50753(2014).">Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. (92), e50753(2014).
  9. Tetrahydrobiopterin compounds prolong allograft survival independently of their effect on nitric oxide synthase activity. Transplantation. 81 (4), 583-589 (2006).">Brandacher, G., et al. Tetrahydrobiopterin compounds prolong allograft survival independently of their effect on nitric oxide synthase activity. Transplantation. 81 (4), 583-589 (2006).
  10. Cervical heterotopic arterialized liver transplantation in the mouse. J Surg Res. 93 (1), 97-100 (2000).">Zou, Y., Brandacher, G., Margreiter, R., Steurer, W. Cervical heterotopic arterialized liver transplantation in the mouse. J Surg Res. 93 (1), 97-100 (2000).
  11. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8 (3), 245-249 (2010).">Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8 (3), 245-249 (2010).
  12. Pancreas transplantation in the mouse. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 9 (3), 254-258 (2010).">Liu, X. Y., Xue, L., Zheng, X., Yan, S., Zheng, S. S. Pancreas transplantation in the mouse. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 9 (3), 254-258 (2010).
  13. Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ischemia reperfusion injury in a mouse model. Am J Transplant. 10 (10), 2231-2240 (2010).">Maglione, M., et al. Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ischemia reperfusion injury in a mouse model. Am J Transplant. 10 (10), 2231-2240 (2010).
  14. Pancreas transplantation and ischemia-reperfusion injury: current considerations. Pancreas. 38 (2), 226-227 (2009).">Drognitz, O., Obermaier, R., von Dobschuetz, E., Pisarski, P., Neeff, H. Pancreas transplantation and ischemia-reperfusion injury: current considerations. Pancreas. 38 (2), 226-227 (2009).
  15. Pancreas transplantation. Lancet. 373 (9677), 1808-1817 (2009).">White, S., Shaw, J., Sutherland, D. Pancreas transplantation. Lancet. 373 (9677), 1808-1817 (2009).
  16. Simultaneous pancreas-kidney transplantation in type 1 diabetes. Clin Transplant. 23 (Suppl 21), 115-120 (2009).">Morath, C., et al. Simultaneous pancreas-kidney transplantation in type 1 diabetes. Clin Transplant. 23 (Suppl 21), 115-120 (2009).
  17. Cross-sectional assessment of the effect of kidney and kidney-pancreas transplantation on resting left ventricular energy metabolism in type 1 diabetic-uremic patients: a phosphorous-31 magnetic resonance spectroscopy study. J Am Coll Cardiol. 46 (6), 1085-1092 (2005).">Perseghin, G., et al. Cross-sectional assessment of the effect of kidney and kidney-pancreas transplantation on resting left ventricular energy metabolism in type 1 diabetic-uremic patients: a phosphorous-31 magnetic resonance spectroscopy study. J Am Coll Cardiol. 46 (6), 1085-1092 (2005).
  18. Cardiovascular disease and neoplasms after pancreas transplantation. Lancet. 352 (9121), 65(1998).">Secchi, A., Caldara, R., La Rocca, E., Fiorina, P., Di Carlo, V. Cardiovascular disease and neoplasms after pancreas transplantation. Lancet. 352 (9121), 65(1998).
  19. Crossing the bridge: large animal models in translational transplantation research. Immunol Rev. 196, 176-196 (2003).">Kirk, A. D. Crossing the bridge: large animal models in translational transplantation research. Immunol Rev. 196, 176-196 (2003).
  20. Of mice and humans: are they the same?--Implications in cancer translational research. J Nucl Med. 51 (4), 501-504 (2010).">de Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: are they the same?--Implications in cancer translational research. J Nucl Med. 51 (4), 501-504 (2010).
  21. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123-1128 (2001).">Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123-1128 (2001).
  22. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141 (5), 682-689 (2007).">Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141 (5), 682-689 (2007).
  23. Crucial role for neuronal nitric oxide synthase in early microcirculatory derangement and recipient survival following murine pancreas transplantation. PLoS One. 9 (11), e112570(2014).">Cardini, B., et al. Crucial role for neuronal nitric oxide synthase in early microcirculatory derangement and recipient survival following murine pancreas transplantation. PLoS One. 9 (11), e112570(2014).
  24. Prevention of lethal murine pancreas ischemia reperfusion injury is specific for tetrahydrobiopterin. Transpl Int. 25 (10), 1084-1095 (2012).">Maglione, M., et al. Prevention of lethal murine pancreas ischemia reperfusion injury is specific for tetrahydrobiopterin. Transpl Int. 25 (10), 1084-1095 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeszczepianie trzustki myszyanastomoza naczyniowapobieranie organuimplantacja organuuszkodzenie reperfuzyjneuszkodzenie przeszczepuumiej tno ci mikrochirurgicznefunkcja endokrynnaczas zimnego niedokrwienia

Powiązane artykuły